Practica No.1 Observación de la Acción de Aglutininas presentes en suero humano sobre eritrocitos de diferentes tipos sanguíneos. AGLUTININAS Y AGLUTINÓGENOS Cuando se transplantan tejidos suele ocurrir que el organismo receptor reacciona destruyendo el tejido transplantado, debido a la acción de su sistema inmunológico, especialmente secretando anticuerpos. Las sustancias extrañas que provocan la producción de anticuerpos se llaman antígenos. La reacción antígeno-anticuerpo (la unión entre ambos) ayuda a eliminar las células extrañas de diversas formas, por ejemplo, haciendo que ellas sean más "apetecibles" para los glóbulos blancos, o aglutinándolas. Un buen ejemplo de este tipo de rechazos es el que ocurre cuando se hacen transfusiones sanguíneas inadecuadas, vale decir, entre grupos sanguíneos incompatibles. Grupos Sanguíneos: El grupo sanguíneo de una persona está determinado por la presencia de unas proteínas de la superficie de los glóbulos rojos, llamados aglutinógenos, que actúan como antígenos. En una familia de aglutinógenos tenemos: los aglutinógenos Ay los aglutinógenos B. Los anticuerpos que reaccionan con los aglutinógenos se llaman aglutininas, y son de dos tipos: anti A y anti B Losaglutinógenos se encuentran en la superficie de losglóbulos rojosde algunas personas, en tanto que las aglutininas las encontramos en el plasma,dando origen a cuatro grupos sanguíneos: A, B AB y O * Grupo A: presentan aglutinógenos A en la superficie de sus eritrocitos, su plasma tiene la aglutinina anti B. * Grupo B:posee aglutinógenos B en la superficie de sus hematíes y su plasma presenta la aglutinina anti A. * Grupo AB: posee ambos aglutinógenos en sus eritrocitos, A y B; su plasma carece de aglutininas. * Grupo O: sus eritrocitos carecen de aglutinógenos en tanto que su plasma contiene ambas aglutininas Otra familia de aglutinógenos son los factores Rh, cuya presencia o ausencia en la superficie de los eritrocitos es independiente de que el grupo sea A,B,AB u O. Uno de los factores Rh determina que las personas sean Rh positivo o Rh negativo, según esté o no presente. Las personas Rh positivas, presentan el factor Rh y carecen de aglutininasanti Rh. Desarrollo de la Práctica: Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Muestra 1 -----» Sin anticoagulante ------» 10 mín. ------» Separación del Coágulo ---» Centrifugar para separar fracciones ------» Separar suero y Rotular. Muestra 2 -----» Con E.D.T.A. ----» 1 ml + 4 ml de SSF -----» Homogenizar -----» Centrifugar a 3500 rpm/5 min ------» Decantar sobrenadante -----» Agregar 4 ml de SSF ------» Homogenizar -------» Centrifugar a 3500 rpm/5 min -----» Decantar sobrenadante ------» Agregar 4 ml de SSF y Homogenizar ------» Centrifugar a 3500 rpm/5 min -----» Agregar 4 ml de SSF , Homogenizar y Rotular . Ejecutar las siguientes reacciones usando suero y eritrocitos lavados. Mesa Suero (1 Eritrocitos Solución Salina Fisiológica ( Hemólisis (S) gota ) ( 1 gota ) 3 gotas ) Aglutinación (A) 1 1 1 Ok Tipo Sanguíneo: 1 2 Ok 1 3 Ok 1 4 Ok 2 2 2 Ok Tipo Sanguíneo: 2 3 Ok 2 4 Ok 2 5 Ok 3 3 3 Ok Tipo Sanguíneo: 3 4 Ok 3 5 Ok 3 6 Ok 4 4 4 Ok Tipo Sanguíneo: 4 2 Ok 4 3 Ok 4 5 Ok 5 5 5 Ok Tipo Sanguíneo: 5 1 Ok 5 2 Ok 5 3 Ok 6 6 6 Ok Tipo Sanguíneo: 6 3 Ok 6 4 Ok 6 5 Ok Preguntas de Control : 1.¿Qué otro tipo de aglutinógenos presentan los eritrocitos además de los del sistema ABO de Landsteiner? Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 2.¿De que tipo de aglutininas son las que presenta el suero de pacientes contra eritrocitos de diferente tipo sanguíneo? 3.¿De acuerdo a los resultados obtenidos trata de explicar qué sucedería a un paciente si se le administran eritrocitos de diferente tipo sanguíneo como hemoterapia? Conclusiones : Bibliografía sugerida y complementaria : http://www.medicinapreventiva.com.ve/laboratorio/grupos.htm medicinabasica.blogspot.com/2009/.../grupos-sanguineos.html www.bioapuntes.cl/apuntes/grupos.htm Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.2 Determinación de Hemoglobina Fundamento. El Fe (II) de todas las formas de hemoglobina, con excepción de la sulfohemoglobina es oxidado por el ferrocianuro a Fe (III) convirtiéndolas en metahemoglobina que, a la vez, reacciona con cianuro ionizado (CN) formándose cianometahemoglonina, un derivado muy estable que absorbe luz a 540 nm la intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina total en la muestra. pH 7.2 HbFe(II) + Fe(III)(CN)6 ---------------->HbFe(III) + Fe(III)(CN)5 HbFe(III) + CN -------------->HbFe(III)CN Muestras: Sangre capilar o venosa. La sangre venosa debe anticoagularse con EDTA, mezclándola de inmediato. Interferencias: Concentración alta de lípidos Demasiado anticoagulante Medicamentos y colorantes Técnica: 1.Pipetear en tubos rotulados: TUBOS BLANCO MUESTRA PATRÓN Reactivo de Trabajo 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml ( Drabkin) Muestra ------- 10 µl ------- Patrón ------- ------- 10 µl 2.Mezclar y reposar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. 3.Leer la absorbancia (A) de las muestra y el patrón a 540 nm frente al balnco de reactivo. El color es estable varias horas. Para periodos superiores a las 6 horas mantener los tubos refrigerados a 2-8°C. Cálculos Con patrón: A Muestra Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA x C patrón = g/dL hemoglobina total A Patrón Con Factor: A muestra x 36.8 = g/dL hemoglobina total Valores de Referencia Hombres 13.5 – 18 g/dL Mujeres 11.5 – 16.5 g/dL Recién nacidos 13.6 – 19.6 g/dL Niños, 6 meses 12.8 – 16 g/dL Niños, 1 año 11.0 – 13.0 g/dL Jóvenes, 14 años 11.5 – 14.8 g/dL La edad, la raza, el ejercicio, la época estacional y la altitud pueden influenciar estos valores. Es recomendable que en cada laboratorio y en cada ciudad se establezcan los rangos de referencia. Determinación de hematocrito ( Técnica Micro ) Método del Microhematocrito Fundamento. El hematocrito expresa en porcentaje (%) el volumen que ocupan los eritrocitos en una muestra sanguínea centrifugada en velocidad y tiempo constante. Significado clínico. El valor de referencia es de 37 a 47% en mujeres y 42 a 52% enhombres. Su aumento indica policitemia (aumento del número de eritrocitos); sudisminución se presenta durante la anemia, hipovolemia y durante el embarazo. Procedimiento. -Llenar un capilar de 75 mm hasta ¾ partes por capilaridad con la sangrepreviamente homogenizada. -Sellar el extremo vacío del tubo con un encendedor. -Colocar el tubo capilar sellado en la microcentrífuga con la parte sellada haciael lado opuesto al centro de la centrífuga. - Centrifugar 5 minutos (10.000 rpm) o 10 minutos (5.000). -Calcular el microhematocrito con ayuda del lector de microhematocrito o deacuerdo a la siguiente fórmula: -Hto= Vol. de eritrocitos (mm) / Vol Total de sangre (mm) x100 -Reportar en % Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Valores de Referencia: Valores de referencia: H♂= 47 +- 2.5 M♀ = 42+- 2.5 Es recomendable que en cada laboratorio y en cada ciudad se establezcan los rangos de referencia. Preguntas de control: 1. Cual es la concentración de hemoglobina ideal para un donante de acuerdo a la NOM 003 SSA2 1993 y cual es el valor del hematocrito. 2.De acuerdo a estos dos criterios, toma los resultados de cada compañero, realiza una tabla y obtén el porcentaje de candidatos a disponentes sanguíneos en el salón. Número de Alumnos Hombres Mujeres Totales % de candidatos a disponentes de acuerdo al criterio de Hb y Hto % de Excluidos como candidatos de acuerdo al criterio de Hb y Hto. % Total Hombres y Mujeres candidatos a ser disponentes sanguíneos 3. Cuales son los factores que hacen variar los valores de referencia del hematocrito: Valores Altos Valores Bajos Conclusiones: Practica No.3 Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Diagnóstico Serológico de la Enfermedad de Chagas Tripanosomiasis americana La tripanosomiasis es una enfermedad producida por Trypanosomacruzi, parásito caracterizado por presentar una etapa de amastigote intracelular. La enfermedad se trasmite cuando concurre contaminación fecal proveniente de chinches triatomas en piquetes recientes, sobre mucosas o piel erosionada. Cuando Trypanosomacruzi ha penetrado, tienen un período de incubación de entre 5 a 15 días, posteriormente se desarrolla la enfermedad que tiene varias fases: fase aguda, fase latente o indeterminada y fase crónica. En cada fase de la enfermedad el sistema inmunológico responde de diferente manera, en la fase aguda predominan las inmunoglobulinas IgM y más tarde se detecta IgG y IgA, después en la declinación de la enfermedad es elevan las IgG y las IgM e IgA se mantienen en concentraciones normales. Las pruebas serológicas se diseñan en base a la detección de anticuerpos o inmunoglobulinas específicas contra el parásito, aunque existen algunas que detectan otros adyuvantes inmunológicos, son varias las pruebas de uso corriente que se usan para la detección de enfermedad de chagas: 1. Fijación de complemento 2. Prueba de hemaaglutinación indirecta 3. Inmunofluorescencia Indirecta 4.Prueba de Hemaaglutinación Directa. Técnica SerodiaChagatest Fundamento: Aglutinación directa de partículas sensibilizadas con antígeno de superficie de Trypanosomacruzi. Serodia Chagas es una prueba para diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos anti - Trypanosomacruzi, utilizando como soporte partículas de gelatina, sensibilizadas con antígeno de superficie de Trypanosomacruzi inactivados. Serdodia test se basa en el principio de que las partículas sensisbilizadas se aglutinan ante la presencia de anticuerpos anti Trypanosomacruzi en la sangre del paciente ( suero o plasma ). Se requieren poliplacas con fondo de “U” , limpias y micropipetas de 25 µL dispensadoras con puntillas estériles, y pipetas volumétricas de 1 y 5 ml . Se puede realizar la prueba de manera cualitativa y cuantitativa, aunque en banco de sangre la positividad es sinónimo de rechazo de candidatos a disponentes sanguíneos. Reactivos: Partículas sensibilizadas ( liofilizadas ) Partículas de Control ( liofilizadas ) Diluyente de Muestra Solución reconstituyente Control Positivo Eventualmente: Control Negativo Las partículas sensibilizadas y de control deben reconstituirse media hora antes de la prueba y a temperatura ambiente entre 15 y 30 °C. y deben mantenerse en refrigeración. 1. Obtener suero del paciente y centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos al menos dos veces para evitar contaminación por eritrocitos y grasa. 2. Si existe sospecha de positividad las muestras se inactivan a 56°C durante 30 minutos en una incubadora en seco o baño maría. Las muestras de plasma no se deben inactivar. 3. Procedimiento del test cualitativo No. de Pozo 1 2 3 Diluyente de Muestra ( µL ) 75 25 25 Muestra ( µL) 25 25 25 Dilución de la Muestra 1:4 1:8 1:16 Partículas de Control ( µL) ----- 25 ---- Partículas Sensibilizadas ( µL) ----- ----- 25 Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Dilución Final 1:16 1:32 Homogenizar la placa con un agitador vibratorio o manualmente e incubar a 37°C o temperatura ambiente en un lugar libre de vibraciones y movimientos durante 2 horas. Interpretación Interpretación de Resultados Comportamiento de las partículas Lectura Interpretación Partículas concentradas en forma de botón en el centro del pocillo con borde - Negativo externo suave y redondeado Partículas concentradas en forma de anillo compacto, con un borde externo + No concluyente suave y redondeado - Anillo grande definido con borde externo multiforme no suave y + Positivo aglutinación periférica Partículas firmemente aglutinadas distribuidas cubriendo el fondo del ++ Positivo pocillo en forma uniforme Preguntas de Control. 1. Nombre común y científico que recibe la chinche trasmisora de la tripanosomiasis y cual es la localización geográfica en México. 2. Dibuja la fase de tripanosoma que podemos observar mediante gota gruesa o frotis sanguíneo teñido con hemocolorantes. 3. Medidas profilácticas a emplear para la tripanosomiasis americana. 4. Esquematiza la reacción realizada para el diagnóstico de Enfermedad de Chagas 5. Abre el siguiente enlace y obtén información referntea : 1) Métodos actuales que se utilizan para la detección de Enfermedad de Chagas (5) y 2) Menciona que es la TransSialidasa. http://www.hemobaires.org.ar/pdfs/mesa%20redonda%20Dra%20Blejer.pdf Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.4 Diagnóstico Serológico de Brucelosis Brucellaabortus(8), B. suis(4), B. melitensis(3) La brucelosis es una enfermedad aguda o crónica causada por bacterias del género Brucella, que se manifiesta principalmente por escalofríos, fiebre y debilidad. Ocasionalmente hay períodos febriles ondulatorios, por lo cual se le conoce a la enfermedad como fiebre ondulante. La enfermedad es endémica de animales y los humanos se enferman accidentalmente por vía bucal, percutánea y respiratoria. Las bacterias pasan rápidamente a ganglios linfáticos regionales y a la sangre donde son atacados por polimorfonucleares y linfocitos. La respuesta inmunológica es celular y humoral. La infección genera una respuesta vigorosa de anticuerpos por lo que la elevación del título de anticuerpos es empleada en el diagnóstico clínico de la enfermedad. Métodos de diagnóstico de brucelosis: 1. Aglutinación directa ( reacciones febriles-método de Hudleson ). 2. Hemaaglutinación Pasiva 3. Pruebas spot o Prueba rápida con sangre total 4. Fijación en superficie o prueba de tira de Castañeda 5. Prueba de globulina antihumana de Coombs para anticuerpos de Brucella en brucelosos crónica 6. Prueba de Fijación de Complemento 7. Prueba de anticuerpos fluorescentes 8. Intradermoreacción 9. Determinación del índice opsónico 10. Prueba de aglutinación directa con Antígeno Rosa de Bengala Prueba de Rosa de Bengala ( LICON ) Prueba de aglutinación rápida en placa para la deteccióntemprana de aglutininas específicas de Brucella (Brucellamelitensis, abortus y suis). PRINCIPIO Se utiliza un antígeno de Brucellaabortus biotipo 1(cepa 99S o cepa 1119-3) acidificado regulado yteñido con Rosa de Bengala a un pH de 3.65 +/- 0.05para la detección de aglutininas específicas deBrucella. Esta prueba puede ser utilizada para undiagnóstico temprano. REACTIVOS • Antígeno Rosa de Bengala • Control Positivo de Brucella • Control Negativo de Brucella RECOLECCION DE MUESTRA Y PREPARACIÓN Se recomienda que únicamente se utilice suero. Evitela hemólisis o lipemia de las muestras ya que estopuede interferir con los resultados. Conservar lamuestra de 2-8°C (275-288 °K) si no se va a realizarel estudio en el momento. PROCEDIMIENTO 1. Llevar a temperatura ambiente el reactivo,controles y muestras de suero. 2. Utilizando la pipeta automática adicione 30 μL dela muestra del paciente en un círculo de la placa. 3. Mezcle suavemente el Antígeno Rosa de Bengalahasta que se encuentre totalmente homogéneo,después coloque 30 μL en la placa de prueba, enel mismo circulo donde se coloco la muestra delpaciente, mezcle ambas con un aplicador. (usarun aplicador diferente para cada muestra). Repitaeste paso para cada muestra de paciente ycontroles. 4. Agitar la placa con movimientos rotatorios por 4minutos. 5. Con la ayuda de una fuente de luz directa lea elresultado. Importante: Después de este tiempola lectura ya no es válida. RESULTADOS La lectura debe llevarse a cabo exactamente a los 4minutos tomados a partir de que se comenzó amezclar. Este es un tiempo límite óptimo en el que seda un espacio para la observación de ciertasaglutininas que se revelan lentamente y que de otramanera se pueden omitir, además de que se puedenpresentar reacciones no específicas. * No Aglutinación - Suero Negativo * Cualquier cantidad de Aglutinación - Presencia deanticuerpos específicos. Suero Positivo Esta es sólo una prueba cualitativa de screening, lacual si resulta positiva debe ser confirmada medianteotra prueba cuantitativa para brucelosis como: Aglutinación Lenta Estándar o Aglutinación Lenta enPresencia de 2-Mercaptoetanol. Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA SENSIBILIDAD 25 UI/mL. Preguntas de Control. 1.Que diferencias existen entre las pruebas de Reacciones febriles ( brucella ) y la técnica de Rosa de Bengala. 2. En que parte del cuestionario (anamnesis) podrá tener relación las preguntas con la posibilidad o sospecha de contagio de Brucelosis. 3. Esquematiza la reacción que se lleva a cabo en las pruebas positiva y negativa con Rosa de Bengala. 4. ¿Cuales son los métodos de diagnóstico de la Brucelosis? Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.5 Diagnóstico Serológico de Sífilis Treponema pallidum Técnicas Luéticas y No Luéticas La sífilis es una enfermedad venérea contagiosa causada por la espiroqueta treponema pallidum, móvil, no cultivable, parásito estricto, altamente infectante. El contacto sexual es, el modo ideal de trasmisión aunque también puede contagiarse por besos con personas con lesiones orales activas y por vía intraplacentaria. Existen tres etapas identificables: Sífilis primaria y secundaria que ocurren al principio de la infección y la fase de terciaria ocurre posteriormente después de un período de latencia prolongado y refleja una respuesta inmunitaria que daña los tejidos en donde se encuentran las espiroquetas. En la sífilis se encuentran una gama de anticuerpos inespecíficos o REAGINAS y anticuerpos específicos contra T. pallidum. Los Anticuerpos reagínicos o de Wasserman están dirigidos contra una sustancia derivada del corazón de ternera denominada cardiolipina. El diagnóstico de infección por Treponema pallidum puede establecerse por observación del microrganismo en microscopia de campo obscuro en muestra directa; por estudio citológico, bioquímico e inmunológico de LCR en casos de neurosífilis y por estudios serológicos encaminados a la búsqueda de Antiglobulinastreponémicas y/o no treponémicos. Las pruebas no treponémicasson : 1. V.D.R.L. ( VenerealDiseaseResearchLaboratory ) 2. Prueba de reagina automatizada ( ART ) y 3. La prueba rápida de reaginas plasmáticas ( RPR ). Pruebas no específicas para Treponema pallidum aunque si exclusiva para Treponema, aunque dan resultados positivos en pacientes con Varicela, hepatitis, Mononucleosis infecciosa, lepra, tuberculosis y leptospirosis, y en algunos casos de drogadicción por vía intravenosa y en enfermedades vasculares de la colágena. Las pruebas treponémicas( usan antígeno treponémico ) son: 1. Fijación de complemento con proteína de Reiter( RPCF ) 2. Inmovilización de T. Pallidum. 3. Aglutinación de T. Pallidum( búsqueda de Ac aglutinantes en suero ) 4. Inmunofluorescencia, Anticuerpo treponémico fluorescente ( FTA-ABS) 5. Prueba de absorción de ABS fluorescentes ( FTA-SAB) 6. Hemaaglutinación: Análisis de microaglutinación para T. pallidum( MHA-TP ) 7. Preuba de hemaaglutinación para T. Pallidum( TPHA ) Técnica RPR Carbón ( Centis Diagnósticos ) APLICACIÓN PROPUESTA El presente método se emplea en la determinación de reaginasplasmáticas en suero humano. FUNDAMENTO DEL MÉTODO El método se fundamenta en una reacción de floculación de unasuspensión estabilizada de cristales de colesterol, cardiolipina, lecitinay partículas de carbón para facilitar la lectura de la reacción. Estereactivo actúa como antígeno frente a unos anticuerpos presentes en losenfermos de sífilis. Dichos anticuerpos reciben el nombre de reaginasluéticas y su detección forma parte de la serología luética notreponémica. PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD El reactivo R1 es una suspensión de partículas de carbón, debehomogeneizarse, con una suave agitación, antes de ser utilizado, puestiende a sedimentar en reposo. Para la utilización del R1, se deben dispensar 20 μL en cadapocillo. Para ello puede utilizarse una micropipeta ajustada a estevolumen o bien dispensarse a través de la aguja suministrada quese adapta a la botella de plástico. El trasvase del reactivo a la botellade plástico se puede realizar mediante aspiración con la aguja. Cualquier alteración en el volumen del reactivo podría afectar elresultado. MUESTRA Utilizar suero. Los sueros mantienen su actividad durante 7 díasconservados de 2 a 8 °C ó 3 meses conservados a -20 °C.No utilizar sueros hemolizados ni contaminados. No utilizar suerosaltamente lipémicos pues podrían dar una aglutinación no específica.Las muestras con restos de fibrina deben ser centrifugadas antes delensayo. Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA TÉCNICA Método cualitativo 1.-Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente. Lasensibilidad del ensayo disminuye a temperaturas bajas. 2.-Depositar 50 μL de la muestra a ensayar y una gota de cada uno delos controles positivo y negativo, sobre círculos distintos de un porta. 3.-Homogeneizar el reactivo R1 con agitación suave. Invertir el frascodispensador y presionar ligeramente para eliminar las burbujas de aire. 4.-Situar la micropipeta en posición vertical y perpendicular al porta ydispensar una gota (20 μL) de la suspensión de carbón junto a cada unade las gotas anteriores. 5.-Mezclar las gotas mediante agitación con un palillo y extenderlas portoda la superficie interior del círculo. Emplear palillos distintos paracada muestra. 6.-Colocar el porta en el agitador rotatorio (80-100 r.p.m.) durante 8minutos. El exceso de tiempo de reacción puede dar lugar a laaparición de falsos positivos. RESULTADOS La lectura debe llevarse a cabo exactamente a los 2 minutos tomados a partir de que se comenzó amezclar. * No Aglutinación - Suero Negativo * Cualquier cantidad de Aglutinación - Presencia deanticuerpos específicos. Suero Positivo CONTROL DE CALIDAD Se recomienda utilizar el control positivo y negativo para controlar lafuncionalidad del reactivo, así como modelo de comparación para lainterpretación de los resultados. Sensibilidad diagnóstica: 86 % en sífilis primaria y 100 % en sífilissecundaria. Especificidad diagnóstica: 98 % Interferencias: Interfiere el factor reumatoideo a partir de 300 UI/mL. No interfieren: Bilirrubina hasta 342 μmoles/L Hemoglobina hasta 10 g/L Lípidos hasta 10 g/L PRECAUCIONES El Control positivo es un suero humano. Aunque no se ha detectado la presencia de antígeno HBs, ni anticuerpos anti-HIV, debe ser manipulado con la misma precaución que un suero muestra. Contiene pequeñas cantidades de azida sódica. Evítese el contacto con la piel dañada y las mucosas. ADVERTENCIA Temperaturas elevadas del medio ambiente pueden provocar la desecación de la muestra de reacción sobre el porta dando lugar a un aspecto de “aglutinación” que puede confundirse con un falso positivo. Se recomienda realizar el ensayo dentro de una cámara húmeda. Preguntas de Control: 1. Explica el fenómeno de reacción inmunológica llamado “Prozona” y porque puede influir en la interpretación de los resultados de la prueba. 2. Busca una fotografía donde se observen las lesiones primarias causadas por Treponema pallidum y los daños histológicos a largo plazo y pégalas en este espacio. Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 3. Investiga en que tipo de medios es posible cultivar Treponema pallidum y si encuentras una foto del cultivo anéxala aquí. 4. Esquematiza las reacciónes para la determinación de sífilis mediante las técnicas de R.P.R. y la de V.D.R.L. Practica No.6 Reacciones Febriles Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Reacción de Widal ,Huddleson y WeilFelix Determina y cuantifica a través de pruebas serológicas, lostítulos de anticuerpos contra antígenos bacterianos para evaluar la presencia deenfermedades como fiebre tifoidea, brucelosis, entre otras; que se caracterizan porprovocar en el paciente un síndrome febril. REACTIVOS: Un equipo para Reacciones Febriles que contiene los siguientes antígenos: 1. Tífico “O” (antígeno somático) 2. Tífico “H” (antígeno flagelar) 3. Paratífico “A” (antígeno flagelar) 4. Paratífico “B” (antígeno flagelar) 5. Brucellaabortus 6. Proteus OX-19 7. Suero control positivo 8. Suero control negativo Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuenciade ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Sonreacciones de aglutinación entre los antígenos de Salmonella, Brucella yProteus y los anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero delpaciente. 1. - Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante.La reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra unasuspensión de antígenos conocidos de Salmonella typi, S.paratyphi A yS.paratyphi B. 2.- Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucellaabortus, B.suis o B.melitensis). 3.- Reacción de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo,tienen componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK).En esta prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo. PROCEDIMIENTO 1. Extraiga sangre sin anticoagulante y una vez que se coagule bien,centrifugar 5 minutos a 3000 rev/ minuto. 2. Con ayuda de una pipeta pasteur transfiera el suero a un tubo limpio yprocede de la siguiente manera: EXCAVACIÓN SUERO (ml) ANTIGENO (1 gota ) Títulos 1 0.08 Tífico “O” 1:20 2 0.08 Tífico “H” 1:20 3 0.08 Paratífico “A” 1:20 4 0.08 Paratífico “B” 1:20 5 0.08 Brucellaabortus 1:20 6 0.08 Proteus OX-19 1:20 7 0.02 Suero control positivo 1:20 8 0.02 Suero control negativo 1:20 3. Mezclar con aplicadores de madera y poner en el rotor por 7 min. Verificarque prueba te da positiva; es decir cual prueba manifiesta franca aglutinación. Realiza la observación al microscopio con objetivo seco débilpara determinar la aglutinación. 4. Una vez que establezcas que antígenos dan positivo, solo a estos lesrealizaras las pruebas con los siguientes volúmenes de suero. Por ejemplo,si te dio positivo el antígeno “O” Suero (ml ) Tífico “O” Títulos 0.04 Una gota 1: 40 0.02 Una gota 1: 80 0.01 Una gota 1: 160 0.005 Una gota 1: 320 5. Mezclar con aplicadores de madera, agitar por 7 minutos en el rotor yverificar hasta que títulos manifiesta franca aglutinación, para que reportesel resultado final de cada prueba. Recuerda verificar la aglutinación almicroscopio con objetivo seco débil. 6. La siguiente tabla te ayudara a realizar la interpretación de los resultados ylos controles precisamente te ayudaran para verificar el equipo y además,como se debe ver una prueba positiva (aglutinada) de una negativa (noaglutinada). Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Preguntas de control : 1. ¿Cómo podemos determinar si la infección esta activa o es por la presenciade anticuerpos de memoria? 2. ¿Por qué se dice que las reacciones febriles son poco específicas? 3. ¿Por qué se emplea un antígeno Proteus OX19 para detectar los anticuerpos contra ricketsias? 4. Dibuja una bacteria con sus partes y señala a que organelos corresponden los antígenos “O” , “H” y “V” Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.7 Detección de Hepatitis HBs Introducción Se define como hepatitis la lesión inflamatoria difusa del hígado producida por variados agentes etiológicos que clínicamente puede ser asintomática o cursar con grados variables de insuficiencia hepática. Bioquímicamente presenta en forma constante, elevación de aminotransferasas. Dentro de las diferentes causas se encuentran agentes infecciosos, trastornos metabólicos, y agentes físicos.1 Existen otros virus además de los hepatotrópicos convencionales, que pueden causar un síndrome de hepatitis aguda como manifestación clínica inicial; pueden ser de la familia herpes (EBV, CMV, HSV, VZV, y HHV6), el de la rubéola, sarampión, Coxsackie, la fiebre amarilla y ébola, capaces de presentar formas de hepatitis primaria o secundaria. El EBV es la causa más común de hepatitis aguda dentro de esta categoría. Existen siete tipos diferentes de virus hepatotrópicos capaces de producir hepatitis; se les designa como A, B, C, D, E, F, G, aunque hay evidencias de la existencia de más virus que pueden causar inflamación y necrosis del hígado. Todos los virus hepatotrópicos tienen la capacidad de causar infección aguda del hígado pero sólo el B, C, y D, ocasionan formas crónicas de la enfermedad. HEPATITIS B La infección por hepatitis B representa un reto pues se ha calculado que existen 300 millones de portadores crónicos en el mundo. La Organización Mundial de la Salud ha calculado que en el área Latinoamericana y del Caribe se presentan alrededor de 400,000 nuevas infecciones por el virus de la hepatitis B (HBV) cada año; si consideramos que aproximadamente 5-10% de todos los adultos infectados se convertirán en portadores del HBV, habría que aceptar que cada 12 meses hay 20,000 a 40,000 nuevos casos de hepatitis B. La infección por HBV ocurre en todo el mundo. Alrededor de 45% de la población mundial vive en áreas geográficas con alta endemicidad (> 8% de la población está crónicamente infectada), 43% en áreas de endemicidad moderada (2 a 7% de la población está crónicamente infectada) y 12% en áreas de baja endemicidad (< 2% rónicamente infectada). México se considera una zona de baja endemicidad. Desde 1980 el número de casos anuales de hepatitis aguda B informados al Center forDisease Control (CDC) de Atlanta disminuyó proximadamente 50%, debido básicamente a cambios en el comportamiento de los drogadictos y varones homosexuales y a la vacunación contra hepatitis B. Epidemiología El HBV está presente en títulos elevados en la sangre y en los exudados de los pacientes con infección aguda o crónica. Se encuentran títulos moderados en semen, secreción vaginal y saliva; otros líquidos corporales que no contienen sangre o suero, como la materia fecal y la orina, no son fuentes de HBV. Las tres principales formas de transmisión son: percutánea (uso de drogas intravenosas, exposición a sangre, líquidos corporales entre los trabajadores de la salud y transfusiones sanguíneas), sexual (heterosexual, homosexual) y madres infectadas (exposición a la sangre de la madre en el momento del parto). La transmisión entre hermanos y otros contactos interfamiliares puede ocurrir a través de lesiones de la piel como eccema, al compartir objetos contaminados con sangre como son cepillos de dientes, navajas de rasurar o piquetes. HEPATITIS C Virología Denominada anteriormente hepatitis no A-no B, es causada por el virus ARN lineal, que mide 32 nm, con envoltura lipídica, se inactiva con solventes lipídicos, calentamiento, tratamiento con formol, y exposición a luz ultravioleta; es monocatenario, de polaridad positiva, constituido por 9,400 nucleótidos, que posee una única estructura (gen) de lectura abierta que codifica una lipoproteína viral de 3,000 aminoácidos, aproximadamente; se han identificado cinco genotipos distintos aunque todos ellos parecen ser similares desde el punto de vista antigénico, pertenece al tercer género dentro de la familia flaviviridae. El genoma del HCV se compone de una región no codificable adyacente a los genes que codifican las proteínas estructurales (core de la nucleocápside y envoltura viral). Los genes 5’no codificante y del core se conservan en todos los genotipos tienen un papel importante en la replicación, pero la síntesis de las proteínas de la envoltura es codificada por la región hipervariable, que varía entre los diferentes especímenes e incluso en el mismo virus. Esto permite al virus evadirse de los mecanismos inmunitarios del huésped dirigidos contra las proteínas de envoltura viral. Epidemiología Es la principal causa de hepatitis postransfusional y el motivo de 20 a 50% de los casos de hepatitis viral aguda esporádica, su prevalencia se desconoce. En el mundo industrializado se estima que entre .5 a 1.5% de los donantes de sangre son antiHCV positivos, porcentajes similares a los informados en una población de donantes mexicanos (.7%); la principal vía de transmisión es percutánea, aunque el contacto sexual y familiar tienen cierta importancia. Los factores de riesgo identificados en México son: transfusión sanguínea y derivados (70%), esporádica (25%), el 5% restante se divide entre trabajadores de la salud, contactos sexuales y del medio familiar, transmisión materno filial (0 a Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 13%); se comenta que la transmisión sólo ocurre cuando las madres tienen un título de 10 copias del genoma por mililitro, transplante de órganos, punciones contaminadas (3 a 10%), drogadicción endovenosa y otros grupos no identificados. Diagnóstico Aunque el virus de la hepatitis C aún no se ha visualizado, su existencia se sospechó desde los años 70. En 1989 se estableció la prueba para determinar el anticuerpo a HCV (anti HCV), pero las primeras pruebas carecían de sensibilidad y especificidad. Las pruebas de segunda generación (ELISA II y RIBA II) tienen excelente sensibilidad y especificidad. La diferencia básica entre las pruebas de primera y segunda generación es el número de antígenos virales utilizados. Un inmunoensayo de tercera generación está en venta en ciertos países, la prueba incluye todos los antígenos virales de la prueba de segunda generación, y un nuevo antígeno de la región NS5 y se ha observado que tiene mayor sensibilidad que el inmunoensayo de segunda generación. El RIBA II incluye los dos antígenos originales C33-cy y c22-3. Los antígenos virales son inmovilizados en un medio de nitrocelulosa; la positividad se manifiesta con dos o más bandas oscuras, si sólo una banda aparece, la prueba se denomina “incierta”, la intensidad de las bandas es de 1 (+) a 4 (+). La posibilidad de detectar el RNA del virus ha permitido entender mejor la patogenia de esta enfermedad viral. Técnica. Obtener una muestra de Suero del paciente y centrifugar dos veces para eliminar restos de eritrocitos y grasa. Esquematizemos la técnica de E.L.I.S.A. para entender la reacción y seguimos paso a paso las instrucciones del inserto, como algunas marcas comerciales tienen cubetas especiales en donde se lleva a cabo la reacción y tienen en primera instancia el antígeno purificado de HBs adsorbido el riesgo en el manejo se minimiza, sin embargo el suero del paciente se debe manejar siempre como material de riesgo. Algunas marcas comerciales manejan un “peine” sobre el cual se maneja el antígeno de superficie HBs y los reactivos se encuentran en cubetas especiales para facilitar la reacción y el paso de un reactivo a otro. Preguntas de Control. 1. ¿Que es la Hepatitis? 2. ¿Que ventajas ofrece la técnica de E.L.I.S.A. sobre la técnica de Hemaaglutinación y Fijación de Complemento?¿ 3.¿ Cual es la sintomatología de la hepatitis, los signos clínicos de la enfermedad y los estudios de laboratorio que ayudan a realizar un diagnóstico preciso? Coloca en el buscador Google Videos, las siguientes palabras Hepatitis | A,B,C,D,E | Contagio, síntomas, tipos, tratamiento: Dr. Bueno para ayudarte a conocer más sobre hepatitis 4.¿Cuál es la prevalencia de los diferentes tipos de hepatitis en México del 2000 al 2007? Si encuentras un gráfico anéxalo para que la información sea más significativa y su comparación más fácil. 5. Esquematiza la reacción realizada en la determinación de Hepatitis C Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.8 Detección de HTLV-III Diagnóstico de V.I.H. SERODIA® - HIV-1/2 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO SERODIA HIV-1/2 se produce mediante el uso de un soporte de partículas de gelatina sensibilizadas con antígenos HIV-1 y HIV-2 inactivados, en forma separada. La prueba se basa en el principio que las partículas sensibilizadas se aglutinan por la presencia de los anticuerpos anti-HIV-1 y anti-HIV-2 en plasma/suero humano. CARACTERÍSTICAS Equipo SERODIA HIV-1/2 ofrece las siguientes características: 1. Prueba de procedimiento simple: La prueba no requiere equipamiento especial y el procedimiento utiliza microplacas estándar en forma de “U”. 2. Corto tiempo de reacción: El procedimiento permite la interpretación visual a las dos horas de incubación. 3. Altamente específico: El equipo utiliza partículas artificiales como soporte, desarrolladas en forma específica por Fujirebio. Estas partículas no presentan la aglutinación no específica que se observa en general con otros soportes. COMPONENTES DEL EQUIPO A: Solución reconstituyente (Líquido) Usada para reconstitución de partículas sensibilizadas y partículas no sensibilizadas. B: Diluyente de suero (Líquido) Usada para dilución de muestras. C.1: Partículas sensibilizadas HIV-1 (Liofilizado) Preparación liofilizada de partículas de gelatina recubiertas con antígeno HIV-1 inactivado. Se reconstituye agregando la solución reconstituyente. La solución reconstituida de partículas sensibilizadas contiene partículas de gelatina al 1% sensibilizadas con antígeno HIV-1 inactivado. C.2: Partículas sensibilizadas HIV-2 (Liofilizado) Preparación liofilizada de partículas de gelatina recubiertas con antígeno HIV-2 inactivado. Se reconstituye agregando la solución reconstituyente. La solución reconstituida de partículas sensibilizadas contiene partículas de gelatina al 1% sensibilizadas con antígeno HIV-2 inactivado. D: Partículas no sensibilizadas (Liofilizado) Preparación liofilizada de partículas de gelatina coloreada. Se reconstituye agregando la solución reconstituyente. E: Control positivo (Líquido) Preparación líquida de suero de conejo inmunizado contra antígenos HIV-1 y HIV-2 inactivados. El reactivo suministra un título de anticuerpos de 1:128 (en la dilución final) para partículas sensibilizadas de HIV-1, y 1:256 (en la dilución final) para partículas sensibilizadas con HIV-2, cuando probadas por el Procedimiento de Prueba de Control Positivo PREPARACIÓN 1. Preparación de las muestras: Se deben remover los eritrocitos o cualquier otro componente visible presente en las muestras de suero o plasma mediante centrifugación antes de la prueba, para evitar interferencias en losresultados. 2. Reconstitución de las partículas liofilizadas:Reconstitución de las partículas sensibilizadas y de las partículas no sensibilizadas con 0,6 ml y 1,0 ml de solución reconstituyente, a temperatura ambiente (15-30ºC), 30 minutos antes de iniciar laprueba. PROCEDIMIENTO El procedimiento de la prueba es el siguiente: 1. Prueba cualitativa (ver Tabla 1) 1) Coloque 3 gotas (75 ul) de diluyente de suero en el pocillo 1, y 1 gota (25 ul) en los pocillos 2, 3 y 4 con un gotero calibrado. 2) Con una micropipeta, agregue 25 ul de la muestra en el pocillo #1. Mezcle los contenidos del pocillo #1 llenado y descargando la micropipeta 6 ó 7 veces. Después, transfiera 25 ul de la solución diluida del pocillo #1 al pocillo #2 con la micropipeta. Repita la operación de transferencia-mezcla para los pocillos #2, #3 y #4 para obtener una serie de soluciones en duplicado. Finalmente, mezcle los contenidos del pocillo #4 y deseche 25 ul de la solución remanente en la pipeta. 3) Coloque 1 gota (25 ul) de partículas no sensibilizadas en el pocillo #2, 1 gota (25 ul) de partículas sensibilizadas HIV-1 en el pocillo #3 y 1 gota (25 ul) de partículas sensibilizadas HIV-2 en el pocillo #4 con el gotero suministrado con el equipo Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 4) Mezcle bien los contenidos de los pocillos con un agitador vibrador (en un rango de velocidad de 4 a 6 cuando utiliza el MEZCLADOR DE UNA PLACA de Fujirebio). Si no tiene un agitador vibrador disponible, el procedimiento puede realizarse manualmente, golpeteando los 4 bordes de la microplaca varias veces para mezclar bien. Luego, cubra la placa y déjela en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas antes de la lectura. Tabla 1. Procedimiento de la prueba cualitativa (resumen) Pocillo No. 1 2 3 4 Diluyente de suero (ul) 75 25 25 25 Muestra (ul) 25 25 25 25 Dilución del suero 1: 4 1: 8 1: 16 1: 32 Partículas no sensibilizadas (ul) 25 Partículas sensibilizadas HIV-1 (ul) 25 Partículas sensibilizadas HIV-2 (ul) 25 Dilución Final 1: 16 1: 32 1: 64 Mezclar empleando un agitador vibrador, cubrir la placa e incubar durante 2 horas. Interpretación INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Coloque la placa suavemente sobre el visor de placas (con luz indirecta), compare los patrones de aglutinación con aquellos del control reactivo e interprete de acuerdo con los criterios presentados en la Tabla 3. Tabla 3. Interpretación de los resultados Patrón establecido de las partículas Lectura Interpretación Partículas concentradas en forma de botón, en el centro del pocillo, con una borda - Negativo circular externa suave Partículas concentradas en forma de un anillo * No concluyente compacto con una borda circular ± externa suave Anillo grande definido, con una borda externa rugosa multiforme y aglutinación periférica + Positivo Partículas aglutinadas que se despliegan cubriendo el fondo del pocillo de uniformemente ++ * Muestras que presentan un resultado no concluyente (±) deben ser ensayadas nuevamente, siguiendo la Tabla 1 y los resultados del ensayo deben interpretarse de acuerdo con los criterios de la Preguntas de Control. 1. ¿Cuál es la seroprevalencia de VIH seropositivos en Veracruz? 2. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio que deben hacerse a un paciente seropositivo para serodia VIH para confirmar la positividad a VIH? Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 3.Esquematiza la reacción SERODIA VIH. 4. Menciona las medidas profilácticas a seguir en el laboratorio de banco de sangre para evitar el contagio accidental por VIH, Hepatitis, y otros infecciosos que se encuentran en sangre y derivados. 5. Señala la Norma Oficial Mexicana en la que se señala el manejo en el diagnóstico, seguimiento, tratamiento de casos, etc. de casos de V.I.H. seropositivos. Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.9 Pruebas Pretransfusionales Típificación y Contratipificación “Determinación de grupo sanguíneo ABO y Rh” Introducción: Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la sangre que dependen de los antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos y en el suero de la sangre. Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos en cuanto al sistema ABO: grupo A, grupo AB, grupo B y grupo O; y en dos con respecto al sistema Rh: Rh negativo o Rh positivo. Lo que a la postre trae ocho grupos posibles por las combinaciones posibles entre ambos sistemas. Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reacción inmunológica que puede desembocar en muerte. Las personas con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el suero de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tiene la combinación contraria, glóbulos rojos con antígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre. Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus glóbulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. A causa de estas combinaciones, el tipo O puede ser transfundido sin ningún problema a cualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO. Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles. El grupo O- es compatible con todos, por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universal. Por otro lado, una persona cuyo grupo sea AB+ podrá recibir sangre de cualquier grupo, y se dice que es un receptor universal. Método directo 1.Centrifugar los 3 tubos Vacutainer con muestra sanguínea anticoagulada con EDTA y el tubo Vacutainer con muestra sanguínea sin anticoagulante, a una velocidad de 2500r.p.m. por 10 minutos, pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado. 2.Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera: en cada tubo rotular dos números en la muestra, uno correspondiente del 1 al 4, el otro numero corresponde al que ya traía la muestra, y con el tipo de antisuero: Anti-A, Anti-AB, Anti-B ó Anti-D. Ejemplo:1, 13, Anti-A ;1,13, Anti-AB, etc. El procedimiento se repite para las tres muestras restantes. 3.En cuatro tubos limpios hacer una dilución de 2-5 % de eritrocitos con agua destilada, de cada muestra. La dilución tomara un color rojo tenue, similar a la sangría. 4.Colocar en cada tubo rotulado una gota de la dilución de eritrocitos preparada y una gota de antisuero, según corresponda. 5.Al concluir lo anterior, llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos a una velocidad de 1000 r.p.m. para observar mejor la reacción antígeno-anticuerpo(formación de un botón). 6.Por ultimo leer los tubos, observando si hubo reacción o no, y correlacionando los datos obtenidos con el método inverso para determinar el grupo sanguíneo. Metodo inverso ( Contratipificación ) 1.Centrifugar los 3 tubos Vacutainer con muestra sanguínea anticoagulada con EDTA y el tubo Vacutainer con muestra sanguínea sin anticoagulante, a una velocidad de 2500r.p.m. por 10 minutos, pues se utilizaran plasma y eritrocitos por separado. 2.Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera: en cada tubo rotular dos números en la muestra, uno correspondiente del 1 al 4, el otro numero corresponde al que ya traía la muestra, y con el tipo de eritrocitos con antígeno conocido: A1, A2, B y O.Ejemplo:1,13, A1;1,13, A2; etc. El procedimiento se repite para las tres muestras restantes. 3.Colocar en cada tubo rotulado dos gotas ya sea de plasma o suero según corresponda y una gota de los eritrocitos con antigeno conocido. 4.Al concluir lo anterior, llevar los tubos a la centrifuga y centrifugar por solo 15 segundos a una velocidad de 1000 r.p.m. para observar mejor la reacción antigeno-anticuerpo (formación de un botón). Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 5. Por ultimo leer los tubos, observando si hubo reacción o no, y correlacionando los datos obtenidos con el método inverso para determinar el grupo sanguíneo. Interpretación: Para el método directo la lógica fue: si en un tubo hay formación de botón(reacción antígeno-anticuerpo) quiere decir que los eritrocitos ensayados tienen el antígeno que reacciona con los anticuerpos presentes en el antisuero para ese tubo; y si no presentan aglutinación querrá decir que no corresponde el antígeno del eritrocito con el anticuerpo del antisuero, o que el antígeno esta ausente en esos eritrocitos. De ahí que pueda observarse que una muestra sanguínea muestre un solo tipo de antígenos del sistema ABO sobre su membrana (A o B),ambos antígenos (AB), o ninguno de ellos (O). lo mismo sucede para el sistema Rh ; al presentarlo (Rh +) o no (Rh -). Para el método inverso el razonamiento fue: si en un tubo hay formación del botón(reacción antígeno-anticuerpo) quiere decir que el plasma del paciente ensayado tiene los anticuerpos que reaccionan con los eritrocitos con antígeno conocido, los cuales sirven de reactivo para esta prueba. Por lo tanto una reacción positiva en este método definitivamente indica que el paciente no tiene eritrocitos con antígenos que reaccionarían con los anticuerpos de su plasma. De ahí que el método se le nombre inverso. Preguntas de Control. 1. Esquematiza la tabla de resultados en la siguiente tabla: A = Aglutinación NA = No Aglutinación/Resuspensión Muestra Método Directo Método Inverso Grupo y rH (Usando Antisueros) (Uso de Sangre de Tipos conocidos) Anti A Anti B Anti AB Anti D Tipo A Tipo B Tipo AB Tipo O 1 0 2 A 3 B 4 AB 2. Investiga la importancia de los subtipos sanguíneos en inmunohematología. 3. Observa la siguiente tabla y podrás identificar si el andamio anterior fue llenado correctamente. Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.10 Pruebas Pretransfusionales Prueba de Coombs Directa e Indirecta. Los anticuerpos antieritrocitos llamados anticuerpos anticuerpos univalentes o incompletos pueden ser descubiertos mediante la prueba de antoglobulina de Coombs. Este método para detectar aglutininas incompletas fue desarrollado entre otros, por Coombs y Col., quienes emplearon antiinmunoglobulinas como segundo anticuerpo, para la reacción cruzada directa de aglutininas incompletas con antígenos rH y ABO de las células sanguíneas. La prueba es ahora comúnmente conocida como prueba de Coombs y se emplea en el estudio de sistemas antígeno-anticuerpo en banco de sangre e inmunohematología. Existen dos tipos de pruebas de Coombs: la directa y la indirecta. La prueba directa utiliza antiglobulina humana para detectar eritrocitos sensibilizados “in vivo” , también se puede emplear anticuerpo anticomplemento para investigar complemento unido a células sensibilizadas. Los eritrocitos de pacientes con enfermedad hemolítica secundaria, ya sea a anticuerpos autoinmunes o anticuerpos resultantes de incompatibilidad eritrocítica por transfusión dan resultados positivos en la prueba de Coombs. Una prueba de Coombs directa positiva indica que los glóbulos rojos del paciente están recubiertos por anticuerpos IgG específicos monovalentes/univalentes/incompletos, lo cual se observa con frecuencia en lactantes con enfermedad hemolítica del recién nacido, en pacientes con anemia hemolítica autoinmune y en receptores de trasfusiones de sangre incompatible. La prueba de Coombs indirecta permite investigar anticuerpos incompletos antieritrocitos libres en el suero del paciente, para lo cual se lavan eritrocitos del grupo “O” y se incuban con el suero a investigar para posteriormente adicionar la antiglobulina humana y observar si existe o no aglutinación. Una prueba de Coombs indirecta positiva indica la presencia de anticuerpos aglutinantes en el suero del paciente, esta prueba se usa para : Detectar anticuerpos IgG incompletos en el suero, para la detección de variantes rH poco reactivas, demostración de autoanticuerpos en el suero de enfermos con anemia hemolítica autoinmune, reacciones antígeno- anticuerpo en que intervienen plaquetas y leucocitos y para demostrar la presencia de hipogammaglobulinemia y agammaglobulinemia. Técnica Coombs Directo Coombs Indirecto Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Preparación de Células de Control para Coombs. 1. Lavar 1 a 2 ml del paquete celular con solución salina fisiológica por cuatro veces. 2. Prepara una solución Anti-DRhO 1: 8 Salino = SSF Proteico = Albúmina bovina al 22% 3. Colocar en relación 1 : 1 Eritrocitos lavados al 5% y Solución Anti DRhO 4. Mezclar suavemente e incubar a 37°C por 30 minutos 5. Centrifugar y lavar dos veces con SSF 6. Verificar la sensibilización usando Suero de Coombs. 7. Conservar a 2 a 6° C / hasta por cinco días. Si se presenta hemolisis parcial se pueden centrifugar y lavar con SSF. Preguntas de Control. 1. Investiga como se realiza la prueba de Coombs para casos de rH poco reactivos. 2. Esquematiza la elaboración del Suero de Coombs. 3. Señala la importancia de la Prueba de Coombs en Banco de Sangre Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Practica No.11 Pruebas Pretransfusionales Pruebas Cruzadas Las pruebas cruzadas al igual que todas las demás vistas, son requisito obligado para poder aplicar terapia transfusional, para lo cual se toma una muestra de sangre del paciente y de la bolsa de transfusión una muestra de sangre del Donador previamente analizada ( segura ) y tipificada. Las pruebas se dividen en tres fases: Prueba Mayor, Prueba Menor y Autotestigo, y se realizan en dos diferentes tipos de medios, un medio salino y un medio albuminoso y pueden realizarse con ayuda de un coadyuvante de la reacción Ag-Ac como la Bromelina o Papaína Activada. Muestra A ( Paciente o Receptor) y Muestra B ( Disponente o Donador ) 1 ml con EDTA y 4 ml sin E.D.T.A. Obtener Suero y Eritrocitos lavados al 5 % del paciente-receptor y disponente-donador de la manera habitual. Prueba Mayor: Consiste en poner en contacto Suero del Receptor con eritrocitos lavados del donador. Prueba Menor : Consiste en poner en contacto Suero del Donador con eritrocitos lavados del paciente. Autotestigo: Consiste en poner en contacto Eritrocitos lavados del receptor y Suero del mismo receptor. Realizaremos el diagrama de flujo de la práctica, para lo cual, necesitaremos rotular tubos de ensaye limpios y secos con las siguiente siglas: PMS = Prueba Mayor en medio Salino pms = Prueba Menor en medio Salino PMA = Prueba Mayor en medio Albuminoso pma = Prueba Menor en medio albuminoso ATs = Autotestigo en medio salino Ata = Autotestigo en medio albuminoso ESQUEMATIZEMOS EL FLUJOGRAMA DE TRABAJO Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA los resultados de esta práctica se reportan en términos de Compatibilidad o Incompatibilidad, lo cual se observa si existe homogeneidad en los tubos de prueba ( Compatibilidad ) o si existe hemólisis o aglutinación en los tubos de prueba ( Incompatibilidad ) . El reporte debe ser preciso y claro, sin tachaduras o enmendaduras: PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD CRUZADA NOMBRE DEL RECEPTOR (PACIENTE) :___________________________________________________ NOMBRE DEL DONADOR : ______________________________________________________________ RESULTADOS Prueba Mayor :Compatible Prueba Menor :Compatible Lugar y Fecha : ______________________________________ ______________________________________ Nombre y Firma del Analista : Revisor : ______________________________ Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Este docuemnto de Historia Clínica lo maneja la Secretaria de Salud de Veracruz (SESVER)en el Hospital Regional de Poza Rica y otros hospitales de 3er. Nivel , es requisito que el médico autorice el mismo para proceder a la toma de muestras para análisis de sangre. Nosotros llenaremos la historia clínica con los datos tomados de pacientes entre 30 y 45 años, hombres o mujeres. Historia Clínica para Selección del Disponente No. Disponente: Fecha Historia Nombre Género Edad Fecha de Nacimiento Edo. Civil Fem. Masc. Dirección: C.P. Teléfono Escolaridad: Prof. □Med. Sup. □ Sec. □ Prim. □ Lee/escribe □ Analfabeta □ Ocupación Paciente Parentesco Tipo de Donación Institución de Procedencia No. de Identificación (01) DONACIONES PREVIAS 1.01 DonacionesPrevias: _________________________________________________________ 1.02 F.U.D.: ___________________________________________________________________ 1.03 No. de donaciones al año: ____________________________________________________ (02) INDICADORES GEOGRAFICOS 2.01 Originario de: ______________________________________________________________ 2.02 Residencia Actual: __________________________________________________________ 2.03 Residencia los últimos 5 años:_________________________________________________ 2.04 En los últimos 5 años residente o procedente de zonas endémicas de: _________________ 2.05 Viaje reciente a zonas endémicas de: ___________________________________________ 2.06 Especifique lugar y fecha: _____________________________________________________ (03) ANTECEDENTES 3.01 Contacto con enfermos de hepatitis: SI NO ¿Cuándo? _____________________ 3.02 ¿Alguna vez le han hecho detección de VIH o Ags HB? SI NO ¿Cuándo? _____________________ 3.03 ¿A su pareja? SI NO ¿Cuándo? _____________________ (04) ANTECEDENTES PERSONALES 4.01 Alcoholismo SI NO Especificar 4.02 Toxicomanías SI NO _______________________________________ 4.03 Etretinato SI NO _______________________________________ 4.04 Tx. Dental reciente SI NO _______________________________________ 4.05 Qx. Mayor reciente SI NO _______________________________________ 4.06 Qx. Menor reciente SI NO _______________________________________ 4.07 Alergias SI NO _______________________________________ 4.08 Inmunizaciones SI NO _______________________________________ _______________________________________ (05) ANTECEDENTES PATOLOGICOS Especificar Especificar Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA 5.01 Cardiopatías SI NO ___________________ 5.12 Diabetes SI NO ______________ 5.02 Enf. Renales SI NO ___________________ 5.13 Hipertensión arterial SI NO ______________ 5.03 Coagulopatías SI NO ___________________ 5.14 Tuberculosis SI NO ______________ 5.04 Cáncer SI NO ___________________ 5.15 Epilepsia SI NO ______________ 5.05 Neoplasia Hemaológica SI NO ___________________ 5.16 Lipotimias frecuentes SI NO ______________ 5.06 Anemia SI NO ___________________ 5.17 Hepatitis SI NO ______________ 5.07 Infecciones Bacteriológicas SI NO ___________________ 5.18 Ictericia / acolia / coliuria SI NO ______________ 5.08 Chagas SI NO ___________________ 5.19 Trans. Ment. / Sx. Demencial SI NO ______________ 5.09 Lepra SI NO ___________________ 5.20 Toxoplasmosis SI NO ______________ 5.10 Paludismo SI NO ___________________ 5.21 Transplante SI NO ______________ 5.11 Brucelosis SI NO ___________________ 5.22 Otras SI NO ______________ (06) ANTECEDENTES GINECOBSTETRICOS 6.01 F.U.R. ___________ 6.02 GESTAS ___________ 6.03 PARA ___________ 6.06 F.U.P. ___________ 6.04 CESAREAS ___________ 6.07 F.U.C. ___________ 6.05 ABORTOS ___________ 6.08 F.U.A. ___________ Inducido ___________ Espontáneo ________ 6.09 Isoinmunización M-F ________________________________________________________________ 6.10 Globulina ANTI-D ________________________________________________________________ (07) PRACTICAS DE RIESGO DISPONENTE PAREJA SI NO Cuándo SI NO Cuándo 7.01 Transfusiones previas 7.02 Exdonador remunerado 7.03 Uso de drogas IV 7.04 Heterosexual promiscuo 7.05 Homosexual 7.06 Bisexual 7.07 Prostitución 7.08 Contacto sexual con hemofílicos / hepatitis / desconocido 7.09 Internamiento en Inst. penales o mentales 7.10 Acupuntura / tatatuajes / perforaciones 7.11 Lesiones con objetos hemocontaminados 7.12 Enfermedades de transmisión sexual No. de parejas sexuales 7.13 Ultimo año:__________ 7.14 Ultimos 5 años:___________ (08) EN LOS ULTIMOS 6 MESES SI NO (10) EN LA ULTIMA SEMANA SI NO 8.01 Tos / disnea persistente 10.01 Toma de medicamentos 8.02 Pérdida de peso de +10% 10.02 Infecciones agudas 8.03 Diarrea crónica 8.04 Diaforesis profusa (11) EN LAS ULTIMAS 48 HORAS SI NO 8.05 Astenia / adinamia 11.01 Fiebre y/o escalofrío 8.06 Adenomegalias 11.02 Ejercicio intenso / traumatismo 8.07 Herpes mucocutaneo 11.03 Ayuno de más de 12 horas 8.08 Fiebre continua de + 10 días 11.04 Vigilia de más de 16 horas 8.09 Odinofagia de + 10 días 11.05 Ingesta de alcohol (09) EN EL ULTIMO MES SI NO 9.01 Síndrome diarréico 9.02 Isitretinoina Declaro que después de haber recibido información respecto a lo que implica la Donación de Sangre o componentes (por aféresis), acepto en forma voluntaria someterme a dicho procedimiento sin presión alguna, consiente de los riesgos y beneficios, declaro además que todos los datos que di en la Historia Clínica son verdaderos, por lo que me responsabilizo de las consecuencias en caso de haber dado datos falsos. Y DOY MI CONSENTIMIENTO PARA QUE SE ME REALICE LA PRUEBA DE DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) ___________________________________ _____________ ______________________ Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA Nombre y firma del médico responsable de la Historia Clínica Nombre y firma del disponente DECLARO BAJO PROTESTA DECIR VERDAD Observaciones: EXPLORACION FISICA PESO TALLA TEMP. T.A. F.R. F.C. EDO. DE VENAS EDO. MENTAL ICTERICIA PIEL Y MUCOSA AREA CARDIACA CsPs HEPATOMEGALIA ESPLEANOMEGALIA OTROS DIAGNOSTICO: Apto _______ No apto _______ Diferido ________ OBSERVACIONES: _______________________________________________________________________________________________ ELABORÓ: (ALUMNO) :___________________________________________________________ Q.B.P. ALFREDO REYES LOYA