Bioquímica IIPractica # 6 “Enzimas Mitocondriales” Terán Olvera María Gabriela 3º semestre QFBt. Yesica López Fecha de entrega: 14-11-2013. Durante cada reacción redox secuencial de la CTE (cadena de transporte de electrones). que reducen la afinidad aparente de una enzima por el sustrato. La succinato deshidrogenasa. transfiere los electrones de uno en uno al Cit a y al Cu A. un análogo estructural del succinato. además de los átomos de hierro del hemo de los citocromos a y a3. La citocromo oxidasa. Este proceso. El citocromo c. La enzima también se inhibe por el malonato. suelen tener una estructura semejante a la del sustrato. En la transferencia de cada par donado por el FADH2 producido por la oxidación del succinato se forman aproximadamente 1. La succinato deshidrogenasa se activa por concentraciones elevadas de succinato. El otro átomo de cobre (Cu A) se encuentra a corta distancia del hemo del cit a. El complejo que atraviesa la membrana en los mamíferos puede contener entre seis y trece subunidades.5 moléculas. Las coenzimas reducidas. La oxidación de un alqueno requiere un agente oxidante más fuerte que el NAD+. que transfiere los electrones que proceden de las coenzimas reducidas hasta el oxígeno. Las pruebas experimentales más recientes indican que aproximadamente se sintetizan 2. que también se denomina sistema de transporte electrónico. Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos. de los que el más importante es la síntesis de ATP. ATP se inhibe por el oxalacetato. cataliza una reacción redox que convierte el succinato en fumarato. Entre estas moléculas hay productos de reacción o análogos que no se metabolizan o derivados del sustrato. Los electrones se ceden a continuación al cit a3 y al Cub. Cu 1+ y Cu2+. . una proteína que está unida débilmente a la membrana interna sobre su superficie externa. lo que se produce en el lado de la matriz interna de la membrana. dependiendo de las especies. sino que está firmemente unida a la membrana mitocondrial interna. son las principales fuentes de electrones. en orden creciente de afinidad electrónica. La succinato deshidrogenasa no se encuentra dentro de la matriz mitocondrial. Durante esta transferencia se produce una disminución del potencial de oxidación-reducción. Otros procesos que impulsan el transporte electrónico bombean Ca2+ dentro de la matriz mitocondrial y generan calor en el tejido adiposo. El átomo de hierro del cit a 3 está íntimamente asociado con un átomo de cobre denominado CuB. La energía que se libera durante la transferencia electrónica está acoplada a varios procesos endergónicos. es decir.Introducción Transporte Electrónico La cadena de transporte electrónico (CTE) mitocondrial. La succinato deshidrogenasa es una flavoproteína que emplea el FAD para impulsar la oxidación del succinato a fumarato. Puede contener también dos átomos de cobre. Cuando el donador de electrones es el NADH y el oxígeno es el aceptor de electrones. Los átomos de cobre se alternan entre los estados de oxidación + I Y +2. El malonato se une al lugar activo de la enzima pero no puede convertirse en producto.5 moléculas de ATP por cada par de electrones que se transfieren entre el NADH y el O 2 en la CTE. es un conjunto de transportadores electrónicos situados en la membrana interna. una enzima del ciclo del ácido cítrico de Krebs. el ciclo del ácido cítrico y la oxidación de los ácidos grasos. es un complejo proteico que cataliza la reducción de cuatro electrones del O2 para formar H20. en el que se utiliza oxígeno para generar energía a partir de las moléculas de alimento. suele denominarse respiración aerobia. Esta reacción está inhibida por el malonato. Durante la oxidación del NADH hay tres pasos en los que la variación del potencial de reducción es suficiente para sintetizar ATP. que proceden de la glucólisis. un electrón pierde energía. como el citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.1M pH 7. Material Sustancias 10 Tubos de Ensayo Buffer de Fosfatos 0.Cuadro 1. podré identificar algunas enzimas con citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.Muestras los componentes supramolecures de la cadena de transporte electrónico. mediante el uso de sus aceptores electrónicos coloreados Hipótesis Con el uso de los aceptores electrónicos coloreados. Material Metodología .4 2 Matraces Erlenmeyer de PBS Cianuro de Potasio 150ml 2 Vaso de Precipitado de p-fenilendiamina Succinato de Sodio 500ml Azul de Metileno 1 Un mortero con mano Aceite Mineral Pipetas de 5ml Agua Destilada 4 Pipetas de 2ml 5 Tubos de centrifuga (falcón) 1 Gradilla Perilla 1 Piseta Objetivo Poder identificar algunas enzimas. fenilendiamina al 1% (100ml) .Solución de Azul de metileno al 0.0 1. Reactivo (ml) B 1 2 3 PBS 1.1-Modo de preparación de los tubos .0 1.Solución salina de Fosfatos PBS (500ml) pH.1.05 M 0.0 Cianuro de Potasio 0.0 Extracto Enzimático 1.0 Agua Destilada 2.0 1.0 0.Solución de Cianuro de Potasio 0.0 1.0 0. 7.4 .Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa Se prepararó las siguientes soluciones . Se colocó en un mortero con arena lavada y se maceró cuidadosamente hasta formara una masa suave adicionando el PBS hasta completar un volumen de 15ml Se pasó la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y se mantuvo en el refrigerador por 15minutos. 1 Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas Se tomó una muestra de aproximadamente 5g de tejidos hepático.0 1. Nota: Se mezcló bien el contenido de cada tubo y se incubó a 37º C apareciera el complejo coloreado.05M (50ml) .Solución de Succinato de Sodio al 1% (100ml) .0 1.0 p-fenilendiamina 0.0 1.0 0.0 1. Se tranfirio el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml. limpio.0 Tabla.01% (100ml) -Aceite Mineral (200ml Se preparon los tubos como indica la tabla No.0 1.Solución de p.0 0. Se pasó a los tubos y se centrifugo a 1500rpm por 10 minutos.0 1.0 1.Preparación de los tubos Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa Tabla. 0 hasta que 1.02. y sin retirarlos del baño se agregó el extracto enzimático. la primera tiene una apariencia de leche cortada y la última capa homogénea del mismo color.0 Nota: Sodio Antes se agregó el extracto incubando a 37º 10 minutos.5 1.0 Se preparon de la tabla No.0cambie de 1.Reactivo (ml) B 1 2 3 4 Tabla.5 0. pfenilendiamina y el extracto enzimático a cada uno de los tubos.0 Extracto Enzimático 1. TABLA.2-Modo de preparación de los tubos PBS los tubos según las 3. Tubo 3: Se presentaron dos capas con una coloración morada-pastel. Observaciones . además de ser homogénea. hubo ciertos cambios de coloración en algunos tubos: Blanco: Es transparente Tubo 1: Presentó un color rosa claro Tubo 2: Es transparente Tubo 3: Presentó un color café claro 1 B B 1 2 2 3 3 Reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa Al llevar los cuatro tubos a baño maría algunos tubos experimentaron cambio de coloración: Blanco: Es transparente Tubo 1: Presentó una coloración moradopastel con un aspecto como de leche cortada.5 0.5 2.0 Aceite Mineral Se tomó el 1.5 1.0 1.5 0.0 Malonato de Sodio 0.5 %0. sin ningún precipitado. Azul de Metileno 0.0 tiempo en el extracto enzimático coloración.0indicaciones2.0 1.0 C durante 1.5 1. Succinato %0.0 y se dejo 1. Tubo 2: Presentó una coloración moradopastel muy tenue.0 0. 1.0 1. 1.0 enzimático.1 Reacción catalizada por la citocromo oxidasa Observaciones Cuando se agregó las diferentes soluciones de PBS.0 1. inmediatamente se agitó bien y se colocó el aceite mineral .0 1. cianuro de potasio.0 0.5 0.0 Resultados 0. únicamente hubo un cambio de coloración al agregar el azul de metileno. succinato de sodio.G. el cuál explica (2005. al tubo que contenía p-fenilendiamina. Conforme a los resultados obtenidos del cuadro cuatro. transparente. B 3 4 TABLA. Tubo 4: Hubo un cambio. debido por la translocación de los protones. se pudo apreciar un cambio de coloración a un azul más intenso. su coloración fue azul rey. extracto y enzimático y aceite. se observó en el tubo una coloración moradapastel con un aspecto de leche cortada. transparente. transparente. esto sucede. se precipitó el aceite. transparente. se observó cierto cambios de coloración en algunos tubos: Blanco: No hubo cambios de coloración. mostró una coloración rosa claro y el tercer tubo mostro una coloración café claro cuando se agregaron las sustancias de la tabla 1. Según lo reportado en otros equipos a los cuarenta y cinco minutos.R. esto pudo ser porque pudo haber reaccionado la p-fenilendiamina con el PBS. Al llevar los tubos a baño maría. cuando se agregaron las sustancias correspondientes a la tabla dos. Algo que cabe mencionar. se precipitó el aceite. su coloración fue azul rey muy ligero. B 2 1 1 2 3 4 Después de 45 minutos.) que el complejo de citocromo oxidasa. fue que se agregó el aceite mineral antes de incubarse. por lo tanto no ocurrió la reacción. cuando se prepararon los tubos.2 Discusión En el cuadro tres.A.Cuando se agregó el PBS. dándole una coloración azul agua. y así se puede determinar así la presencia del citocromo oxidasa. hubo cambios de coloración muy leves. que hace que nos dé ese aspecto de con un aspecto de leche cortada. se precipitó el aceite. su coloración fue azul rey. Tubo 1: Hubo un cambio. Castro N. Tubo 2: Hubo un cambio. oxidando la fenilendiamina. se precipitó el aceite. su coloración fue azul rey. porque ocurre una reacción de redox. se conservó el color azul agua y se precipitó el aceite. y Moreno S. Tubo 3: Hubo un cambio. tomó una coloración azul y en todos los tubos se precipito el aceite mineral. por lo que les resulto la prueba catalizada por succínico deshidrogenasa. Nota: Se agregó el aceite mineral antes de haberse incubado a 37⁰C. se presentó una coloración homogénea morado-pastel. por lo que la reacción de p-fenilendiamina con el extracto enzimático (tejido hepático). son inhibidas por el cianuro de potasio y el malonato. experimentaron cambios es su coloración y en su aspecto. Cuando se compara con la muestra blanco. En el tubo dos. azul de metileno. que el H2 cedido de por el succinato puede ser transferido al FADH 2 al azul de . tomó una coloración café claro. Un error cometido. Pueden actuar a nivel intracelular o extracelular. debido a que su trabajo es catalizar la reacción. Son moléculas estrictamente proteicas. de alto peso molecular y conformación tridimensional característica. debido a esto las enzimas sufren desnaturalización. Conclusión Se pudieron identificar las enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa. Son sumamente específicas..Qué es una enzima y cuáles son sus características? Es catalizador de origen biológico y naturaleza proteica.metileno cambia su estado de redox. en donde primeramente se oxida y después se reduce. Lo sintetizan tanto los seres Autótrofos como Heterótrofos. Actúan en baja concentración. dependiendo de la reacción. su actividad está regulada y actúan en el mismo lugar donde se segregan. acelera la reacción al disminuir la energía de activación. Cuestionario 1.. . No sufren modificaciones durante la reacción.Qué características tienen las enzimas mitocondriales? Son responsables de la oxidación de ácidos grasos. transportes de electrones y síntesis de ATP. No se necesita gran cantidad de ellas para realizar la acción de manera eficiente. usando un método cualitativo. No afectan el equilibrio de la reacción. se recuperan intactas. tomando así una coloración más intensa o en donde puede llegar a veces a ser incolora. Son Proteínas Globulares que regulan la mayor parte de las reacciones metabólicas de los seres vivos. sobre este sistema enzimático. 2. tienen un trabajo específico y solo son usadas para ello. observándose cambios de coloración y se identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias como el cianuro de potasio y p-fenilendiamina. Características Las enzimas catalizan la formación o rotura de enlaces covalentes Su elevada especificidad es su mayor característica. ya que son activas a concentraciones pequeñas. mediante las reacciones de aceptores electrónicos coloreados. su composición y forma no son transformadas en ninguna parte de la reacción. no dializan y sufren saturación. pero si su velocidad. 4. Citrato sintetasa: Condensa el acetil CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato. ∝ -acetoglutarato se convierte en succinil-CoA.Describa algunas enzimas presentes en el ciclo de Krebs. 6.3.. ∝ -Acetoglutarato deshidrogenasa: Esta enzima hace una descarboxilación oxidativa por la que el. permiten la extracción de energía mediante la formación de FADH2 y NADH. Fumarasa: Cataliza la hidratación reversible del fumarato a l-malato. Succinil-CoA sintetasa: Es la enzima que cataliza esta reacción reversible. hidratación y segunda oxidación.¿Cuál es la función de observar la cinética enzimática. Formando fumarato. Succinato Deshidrogenasa: Ocurre en tres pasos: primeramente oxidación. .. Acotinasa: Cataliza la transformación intermedia del ácido tricarboxilico cis-aconitato..¿Qué función tiene el citocromo Oxidasa y Succinato Deshidrogenasa? Citocromo Oxidasa: Cataliza la transferencia de electrones al oxígeno para dar agua constituye lo que se conoce como complejo 4 de la cadena de transporte electrónico y está presente en todos los organismos aerobios. L-malato deshidrogenasa: La enzima L-malato deshidrogenasa ligada NAD. en donde indican la participación de un nucleósido trifosfato en la reacción. Succinato deshidrogenasa: Es una flavoproteína que oxida el fumarato a partir de succinil CoA. Estos tres pasos cumple la función de regenerar oxalacetato. ∝ -acetoglutarato.. Isocitrato deshidrogenasa: Cataliza la descarboxilación oxidativa del isocitrato dando lugar a la formación de.Describa estructuralmente el ciclo de Krebs 5. que normalmente no se disocia del centro activo. cataliza la oxidación del L-malato deshidrogenasa. Antioxidantes y Calidad de Vida 1994.Bioquímica la base molecular de la vida.ula. Nelson D.ugr. 304-307. Distinguir entre isoenzimas Conocer las diferencias entre la actividad en un tejido o en otro.htm .La cinética enzimática permite: Distinguir unas enzimas de otra. Mckee James. al. función y especies reactivas del óxigeno.mx/Bioquimica/PDF/2005/03/j_104-105_ProblemaBioq. (2003). (1994).unam. Álvarez S.L. y Cox M.forest. 608-613. (2005).pdf Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://www. pg. La mitocondria: estructura. Lehninger Principios de Bioquímica. Permitir conocer su afinidad con el sustrato. 3ª Edición.ve/~rubenhg/enzimas/#inhibición enzimática Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://www. Omega.sid. Mc Graw Hill.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-catalasa_oxidasa. 4ª edición. 311-320. Recuperado 11 de noviembre del 2013: http://computo. Bibliografía Mckee T.pg.M.1:26.