IntroducciónEn la primera mitad del siglo XX los métodos de purificación proteica eran en extremo crudos comparados con los estándares de la actualidad. La purificación de las proteínas era una tarea ardua que tenía tanto de arte como de ciencia. En general, el desarrollo de un procedimiento satisfactorio de purificación para una proteína determinada era cuestión de años de trabajo con cantidades enormes de material de partida. No obstante, para 1940 se habían obtenido en forma pura unas 20 enzimas. Desde entonces se purificaron y detallaron en distinto grado decenas de moles de proteínas. Las técnicas modernas de separación tienen tal grado de discriminación que uno puede obtener en cantidad una serie de proteínas con propiedades tan similares que hace unos pocos años su mezcla se consideró una sustancia pura. No obstante, el desarrollo de un procedimiento eficiente de purificación de una proteína dada puede ser todavía un desafío intelectual y demandar mucho tiempo (G.Voet, 2004) Las proteínas se purifican por procedimiento de fraccionamiento. En una serie de pasos independientes, las propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés se aprovechan para separarla de manera progresiva de otras sustancias. La idea no es necesariamente minimizar la perdida de la proteína, sino eliminar en forma selectiva los otros componentes de la mezcla, de manera que solo quede la sustancia requerida (MacFaddin, 2003) En 1926 Sumner cristalizo ureasa en forma pura, y demostró que las proteínas pueden tener actividad catalítica de enzimas (Bruce Alberts, 2013). La ureasa, enzima número 3.4.1.5 en la Unión Internacional de Bioquímica, cuyo nombre sistemático es amidohidrolasa de urea, tiene un peso molecular de 483000 Dalton. La ureasa consta de seis subunidades estructurales iguales. Es una enzima muy específica, que existe en varios tipos de tejidos vegetales; por ejemplo, en el frijol de soya (H.Herrera, 2003).Esta enzima Cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico, hidróxido de amonio (Granados, 2001) según la reacción (1) Por ello se utiliza mucho como agente catalítico para la medición cuantitativa de urea. El hidróxido de amonio que se forma en una base puede titularse con ácido clorhídrico y puede relacionarse, estequiométricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra y así cuantificarla (H.Herrera, 2003).La reacción de neutralización es: (2) NH4OH + HCl → NH4Cl + H2O En el presente trabajo esta parte experimental se utilizó para determinar la actividad enzimática, definida como cantidad de producto formado o cantidad de sustrato degradado por unidad de tiempo. Para obtener la concentración de urea presente en los extractos se utilizó el método de Bradford donde se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso desplazando el máximo Este parámetro es una medida de la actividad existente después de cada paso de purificación expresada como porcentaje de la actividad del extracto crudo. 2001).Este ensayo requiere un solo reactivo y unos 5 minutos. Los detergentes y los pH alcalinos interfieren con el ensayo (Morales. Este parámetro se obtiene dividiendo a actividad total por la proteína total. La cantidad de proteína presente en una fracción se obtiene determinando la concentración de proteína en una alícuota de cada fracción y multiplicándola por el volumen total de la fracción. comparado con el ensayo de Lowry que requiere 3 reactivos y 40 minutos. Rendimiento. La actividad del extracto inicial se toma como el 100%. Un gran número de métodos bioquímicos requieren del uso de marcos de referencia para calcular las concentraciones de las muestras problema. Objetivos específicos Extraer la ureasa del frijol de soya mediante los solventes orgánicos etanol y acetona. por la actividad específica del extracto inicial (Berg. calculada después de cada paso de purificación. Actividad total. Grado de purificación.. 2005) Para determinar el éxito de un protocolo de purificación de proteínas.de absorbancia de 465nm a 595nm. Este parámetro mide el incremento en pureza y se obtiene dividiendo la actividad específica. 2007) Objetivo general Determinar el grado de purificación de la enzima ureasa a partir de frijol de soya mediante la evaluación de la actividad catalítica y la concentración. La actividad enzimática de la fracción se obtiene midiendo la actividad enzimática en una alícuota de cada fracción multiplicándola por el volumen total de la fracción. se puede controlar en cada paso el procedimiento midiendo los siguientes parámetros: Proteína total. Determinar la actividad enzimatica de la ureasa de los extractos etanólicos y acetónicos mediante la titulación con ácido clorhidrico Cuantificar la ureasa contenida en el extracto etanólico y acetónico mediante el método de Bradford . Actividad específica. En el caso de proteínas se realiza la curva patrón de suero albumina de bovino (UNAM. Estos marcos de referencia tendrán una concentración conocida y mediante una extrapolación de la curva estándar se podrá determinar la concentración del compuesto que contiene la muestra problema. Se tomaron 50 ml de la solución final en un matraz aforado de 50ml. completando un litro. Luego se aforó a 50 ml con agua destilada. Después se agregó 30 ml de alcohol etílico al 30% y se agitó en baño de hielo la mezcla durante una hora. 50 mL de urea 0.Se realizaron dos soluciones (A y B).2. Se decantó el líquido sobrenadante y se disolvió el precipitado con 10ml de buffer fosfatos 100mM. Luego se tomó 5 ml de esa solución y se almacenó en un matraz aforado de 10 ml. llevando el volumen final a 1 litro.pH 7. Bioseparación de ureasa de frijol de soya Se pesaron 10g de frijol de soya y se molió en un molino de cuchillas con malla #20.6 g de NaH2PO4. Solución B(Na2HPO4: Se disolvió 53. Solución A(NaH2PO4 0. Actividad enzimática de la ureasa Se prepararon tubos de acuerdo a la siguiente tabla . Se tomaron 0.2M):Se disolvieron 27. pH 7.25 M: Se agregaron 20 ml de agua destilada en un matraz aforado de 50 ml y se agregó 750.65 g de Na2HPO4.87 mg de nitrato de plata en 1 litro de agua destilada. 50 mL de buffer de fosfatos 100 mM.1 M.2.Se recogió el filtrado y de éste se almacenaron 2 ml a 4°C.75 mg de urea y se homogenizó. 100 mL de HCl 0.H2O en agua destilada. 5 mL de Hg (NO ) 1. Seguidamente se centrifugó a 3000RPM por 30 minutos. Luego se filtró(Whatman #41) la mezcla resultante al vacio.al resto se le agregó 50 ml de acetona. el cual se preparó mezclando 169.306 ml de HCl y se aforó a 100ml con agua destilada. Se mezclaron 140 ml de solución A y 360 ml de solución Luego se aforó a 1 litro con agua destilada. Al carecer de este reactivo se sustituyo por nitrato de 2 3 2 plata.Metodología Preparación de soluciones 30 mL de alcohol etílico al 30%: Se agregaron 9 ml de alcohol absoluto en un matraz aforado de 50 ml y se agregó 21 ml de agua destilada.0 mM.7H2O en agua destilada. agitándose constantemente el matraz para apreciar mejor los cambios del indicador que señaló el punto final (cambio de verde limón a fuscia). EA = Extracto con Acetona(crudo y diluído 1:10). Tabla 1:Cantidades de reactivos y pasos necesarios para medir la actividad de la ureasa Reactivo EE EA C+ B Urea 0. Tabla 2. Cuantificación de proteínas Curva estándar de proteína Se realizó una curva estándar de albúmina sérica bovina hasta una concentración máxima de 100ug/mL en intervalos de 10ug.5 4.5 1.5 Incubar 30 minutos.0 mM (gotas) 2 3 2 4 4 4 4 EE(2)= Extracto Etanólico(diluído 1:10 y 1:100).1M..5 7. Después de valoró con una disolución de HCl 0. Se transfirió el contenido de cada tubo a un matraz Erlenmeyer de 25ml y se agregó 5 gotas de indicador (azul de metileno y rojo de metilo).5 1. Finalmente se representó la cantidad de sustancia de urea hidrolizada (mmol)/mL/minuto en función del volumen (mL) de extracto de harina de soya empleados. Luego se anotó el volumen de HCl utilizado en la muestra para cada matraz y se restó el volumen de cada blanco al resultado anterior.25 M (mL) 7.5 7. pH 7.2 (mL) 4.5 4. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Concentración ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL BSA 1 mg/mL 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (uL) Buffer fosfatos 100 mM. C+ = Control positivo (ureasa comercial) y B = Blanco (agua destilada).5 1. a 50 C 0 Muestra (mL) 1. a 50 C 0 Hg (NO ) 1.Cantidades de reactivos para la cuantificación de proteínas. todos los tubos. todos los tubos. se preparó tres tubos por columna para hacerlo por triplicado .5 Incubar 5 minutos. de acuerdo a la tabla siguiente y por triplicado.5 Buffer fosfatos 100 mM. pH 500 495 490 485 480 475 470 465 460 455 450 7.5 7.2 (mL) * cada columna es un tubo.5 4. EA. C+ y B Se agitó invirtiendo los tubos suavemente. Se adicionó la mezcla de cada tubo a una celda cuadrada desechable de metacrilato y se realizó la lectura en espectrofotómetro a 595nm Resultados Ilustración 1: Muestras tituladas con HCl . Reacción de Bradford (Curva estándar y muestras): Se preparó cada tubo de la curva estándar y de las muestras de acuerdo a la siguiente tabla: Tabla 3. Preparación de tubos para la reacción de Bradford. procurando no hacer espuma. Luego se incubó al menos 5 minutos(no más de 1 hora) en oscuridad a temperatura ambiente. Tubo Volumen adicionar Curva estándar ó Muestra * 500 uL Reactivo 500 uL Bradford * Las muestras son EE. 5x10-3) / densidad ureasa(1340 g/L) osea ([ureasa]*1.5+1. convertirlo a ml.5+4.ml HCL corregido(restando blanco).1M ---es 2 por la estequiometria de la reacción ---Ml totales del tubo= 7.2 tablas (el típico de biosep y los datos de la titulación)y dos graficas(actividad especifica y curva estándar) Tabla típica de biosep Actividad Proteína Actividad Factor de Muestra Rendimiento (nkat) (mg) específica Purificación EC A 1 P1 100 A1/P1 1.volumen total(13.0 EE A 2 P2 100(A2/ A1) A2/P2 [A2/ P2]:[A1/ P1] Para Actividad(nkat): (VR)(13.5ml) U= umol/min 1kat=60x106 U 1x10-9kat=1nkat Muestra ml HCL ml HCl Volúmen ml ureasa VR consumidos corregidos total(ml) EE 13.5 =13.5ml). se obtendrán los litros de ureasa. Gráfico de actividad espécifica: ´´Representar la cantidad de sustancia de urea hidrolizada (mmol)/mL/minuto en función del volumen (mL) de extracto de harina de soya empleados´´ Yo creo que se grafica VR por ml ureasa.ml ureasa se obtiene asi conc ureasa(de curva estándar)*L de extracto(1.1M) / (2*13.5ml*30 min) (--molaridad de HCl= 0. Fórmula para el cálculo de velocidad de reacción: VR= (ml HCl consumidos * molaridad del HCl)/(2* ml totales del tubo *30 min) VR=(( ml HCL consumidos * 0.ml HCL consumidos.5 EA blanco Tabla de datos de biosep: muestras.5ml ---tiempo de reacción:30 minutos) .5x10-3)/1340g/L. Ag+ o Cu++.5ml). la neta nose. siendo un representante de un gran número de enzimas cuya actividad depende de la existencia de grupos -SH intactos formando parte de la cadena peptídica de la enzima como cisteína.o bien se pone la concentración de ureasa en el eje X. formando una mercáptida: (4) . en particular en el caso de la ureasa. se obtiene multiplicando la concentración de ureasa(obtenida del grafico de albumina) por el volumen agregado(1. como el glutatión o la cisteína pero una alteración más estable.5 ml de extracto y eso nos daría el grafico una línea vertical (hacia arriba) y eso no sirve de nada) Discusión Parte de la titulación La ureasa posee 3 o 4 grupos sulfhidrilos activos.Solo falta los ml HCL consumidos y se obtiene así: mL consumidos=ml gastados menos los ml gastados en el blanco La VR va en el eje Y. Por ejemplo: (3) Estas formas E—S—S—E inactivas muy probablemente pueden ser reactivadas mediante el efecto de compuestos ricos en -SH. En el eje X creo que va la cantidad de ureasa. 2008) La oxidación de estos grupos puede ocasionar una inactivación reversible de la enzima. (se que dice que grafiquemos en función del volumen (mL) de extracto de harina de soya empleados(eje x). es la reacción de los grupos -SH con ciertos iones de metales pesados como Hg++. (Tangarife.pero usamos siempre 1. o mmol/ml.Pero esto solo es válido en presencia de un exceso de sustrato (A. La obtención de una línea recta que pasa por el origen de coordenadas indica que existe una proporción directa entre la velocidad de la reacción y la concentración de la enzima. pasa de un color amarillo a rojo. entonces. en su punto de viraje. lo que implica que el número de milimoles del ácido es igual al de milimoles de hidróxido.1M).5.. un milimol de HCl neutraliza un milimol de NH4OH. En los dos experimentos realizados se tituló con HCl y de acuerdo al volumen utilizado de este se pudo calcular los moles de urea hidrolizados. Según la estequiometría de la reacción de neutralización.etc. para obtener el número de milimoles de HCl que neutralizan el NH4OH. Esto fundamentado en lo que presenta “Mora”. y se observa mejor el cambio de color. El azul de metileno se utiliza como medio de contraste. que vira cuando el hidróxido de amonio es neutralizado por el ácido clorhídrico. De acuerdo con la estequiometría de la reacción de hidrolisis. La solución indicadora que se emplea en la titulación consiste en una mezcla de rojo metilo y azul de metileno. Dado que la molaridad es igual a mol/L. 2007). los rendimientos y factores de purificacion obtenidos(relación con la extracción realizada. Este mismo autor también indica que el HCl utilizado en el blanco reacciona con el buffer de fosfatos. de tal forma que la solución vita de un color verde limón a fucsia. a partir de un milimol de urea se producen dos milimoles de NH4OH.) Conclusión . que esas dos magnitudes son directamente proporcionales. (José Bermejo. la cantidad de milimoles de HCl que neutralice el NH4OH producido representa el doble de milimoles de urea hidrolizada (Mora. o sea. se multiplican los ml de HCl que se consumen por la molaridad del HCl utilizado (0. a un pH de 5. y el volumen utilizado se resta a cada una de las muestras del experimento para que solo aparezca en los cálculos la cantidad de HCl utilizado para reaccionar con el cloruro de amonio. 2004) Falta discutir parte de la cuantificación. 2007).Los principales inhibidores de su actividad enzimática son los iones metálicos pesados tales como la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+2) e igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea. El rojo de metilo es propiamente el indicador. (Véase ilustración 1) Parte del gráfico de la titulación En la gráfica 2 se muestra el comportamiento que donde la velocidad de la reacción en función de (la concentración de la enzima o ml de enzima) tiene un carácter lineal.Fersht. 1986). Esta relación constituye todo el fundamento de los estudios cinéticos (Cardellá. Mora.. Cardellá. Bruce Alberts. Facultad de Odontología. B. Introducción a la biología celular.A. (2005). (2013). Editorial reverté S. Guía para prácticas de laboratorio de bioquímica. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Bioquímica. H. Tangarife. G. Editorial Reverté. B. (2007). UNAD. J. EUNED. (2004). S. Granados. Editorial Médica Panamericana. Serie de biología fundamental: estructura y mecanismo de los enzimas. J. N. Morales.Herrera R. (2007).. J.Voet. Editorial de la Universidad de Costa Rica. Ciencias médicas. José Bermejo.Bibliografía A. (2001). Química de alimentos. Prácticas de bioquímica. G. Manual del técnico superior de laboratorio de análisis clínicos. Bioquímica humana. . Editorial Médica Panamericana. (2003). Bioquímica. (1986). Editorial Médica Panamericana. D. Carlos H. S. UNAM. Cinética enzimática de la ureasa. (2001). (2007).Fersht. Diaz de Santos. Técnicas de diagnóstico en virología. J. (2008). Q. R. D. (2004). J. MAD. MacFaddin. C. UNAD. Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. (2003). Berg.