Instituto Tecnológico de CelayaDepartamento de Ingeniería Bioquímica PRACTICA 8: TINCION DE CAPSULA. OBJETIVO. Observar la cápsula bacteriana, componente extracelular de algunas bacterias, mediante técnicas especiales. INTRODUCCION Generalmente, la capsula se pone de manifiesto mediante una coloración negativa o una modificación de ella debido a que no absorbe los colorantes normales de pared en bacterias. TINCION NEGATIVA. Mediante este procedimiento, las células sin teñir resaltan sobre un fondo teñido utilizando un colorante acido; la nigrosina, un colorante negro, es el más comúnmente utilizado. El método sirve para observar bacterias o estructuras que difícilmente se tiñen con las técnicas directas. Figura 1. Tinción negativa para observación de Cápsula por tinta china. a) Diplococcus pneumoniae. b) Tinción de un quiste c) Tinción de bacilos capsulados. d) Tinción negativa de Staphylococcus aureus. e) Levadura encapsulada llevando a cabo gemación. CÁPSULAS Y GLUCOCALIX (película viscosa) Algunas bacterias se encuentran rodeadas de una capa de apariencia mucoide, en el exterior de la envoltura celular. Estas estructuras usualmente consisten de polisacáridos; sin embargo, en ciertos bacilos, están compuestas de polipéptidos (por ejemplo, el ácido poliglutámico) segregados por la bacteria. Cuándo se ven más definidas y rígidas, se describen como la cápsula. Cuando se observan menos definidas, se describen como glucocalix (película viscosa). Las cápsulas tienen diferentes funciones, dependiendo de la especie bacteriana y el ambiente en que se encuentre. 1. Puede servirles como protección ante la desecación y radiación. 2. La protege del ataque de virus bacterianos y del efecto de metales pesados que le sean tóxicos. 1 Es una reserva de nutrientes que puede ser reabsorbida. Tinción de Cápsula. mucoides. evitando la ingestión por los neutrófilos y los macrófagos. por pares o cadenas cortas. las células se ven claras. gram-positiva. LM X1000. se hace una tinción por el método de la tinta china. Para determinar la presencia de material capsular en los microorganismos. se cubre con metanol y se fija a la llama. Colonias rosas. se añade una gota de tinta china y se mezcla con la suspensión bacteriana. bordes irregulares. Para ello se prepara una suspensión del microorganismo problema (en una gota de glucosa al 6 %) sobre un portaobjetos. mientras que otras no (Klebsiella pneumoniae virulenta y avirulenta).Instituto Tecnológico de Celaya Departamento de Ingeniería Bioquímica 3. Medio de cultivo Mac Conkey. Pero pueden observarse con las tinciones negativas. Los colorantes empleados en este tipo de tinciones no son capaces de penetrar la célula ni fijarse en ella. Durante el cultivo in vitro la síntesis de la cápsula a menudo se pierde. 5. c) Klebsiella pneumoniae. 4. Son factores de virulencia asociados con la invasividad de los tejidos del huésped. convexas. Está relacionada con la capacidad infectiva hacia otras especies (animales o vegetales) su virulencia y su capacidad de resistencia a ser fagocitada. Además promueve la adhesión a superficies donde encuentra condiciones adecuadas para su crecimiento. Además las condiciones de cultivo y fisiológicas pueden activar o reprimir la síntesis de este material. a) Klebsiella spp. sin calentar. b) Klebsiella pneumoniae Tinción de cápsula por Tinción Muir. Una vez seca la extensión al aire. Tinción negativa para observación de Cápsula por Muir. A continuación se tiñe con azul de metileno durante 1-2 min. Figura 2. Permite el reconocimiento célula-célula Estas estructuras no son esenciales a la viabilidad celular y en algunas especies habrá cepas que producirán cápsula. se lava con agua y se seca. La preparación se observa con el objetivo de inmersión de manera que si 2 . Bacteria que se presenta libre. Las cápsulas varían en grosor y pueden fácilmente representar varias veces el volumen del organismo. sin teñir y el fondo se observa coloreado. 6. Como consecuencia. Las cápsulas no tiñen bien con las tinciones habituales (Gram). Desechar la preparación en un vaso con cloro 1:5. Colocar otro portaobjetos limpio en ángulo de 60° sobre la preparación y extender la mezcla a lo largo del portaobjetos. de un portaobjetos limpio. los microorganismos deben cultivarse en medios enriquecidos y en condiciones que favorezcan la producción de esta estructura. 1. Portaobjetos junto a la gota 2.O. Fucsina fenicada. La cápsula no está teñida y aparece como un halo alrededor de la célula. en proceso de identificación. Para estudiar la formación de cápsula. Figura 2. Método de la tinta china. tal como describe Cowan & Steel’s (1993). Observar directamente al microscopio. El fondo de la preparación queda negro. Figura 3. sin extender. procurando que no queden burbujas de aire. Asada de cultivo 4. el fondo se tiñe de azul grisáceo con el mordiente de Muir y las células se tiñen en rojo con una solución de fucsina. Aplicación de gota de tinta 3. 5. 1. También puede aplicarse el método de Muir. MATERIALES. -sión sobre borde del porta. las células bacterianas se ven azules y rodeadas de un halo azul pálido. Tinta china o nigrosina Metanol azul de metileno M. Portaobjetos (4). METODO DE LA TINTA CHINA. Preparación de frotis. 4. Para la realización del ensayo se recomienda utilizar cultivos en medio sólido como Agar Mac Conkey o Agar Soya Tripticaseína (TSA) durante 1-3 días a 35 ºC. Colocar una gota pequeña de tinta china cerca del cultivo cerca de un extremo. utilizando la técnica del frotis sanguíneo. Colocar una asada de cultivo sobre la gota de tinta y mezclar. 2. Figura 1. Contacto con gota y exten- 5. 3. Etanol Mordente de Muir METODOLOGIA (Método de la tinta china).Instituto Tecnológico de Celaya Departamento de Ingeniería Bioquímica el microorganismo tiene cápsula. 3 . METODO DE MUIR. Dejar que el frotis se seque o cubrir con cubreobjetos. Microscopio. Extensión tinta-muestra. 3. Lavar con agua y con etanol durante 30 segundos o hasta que el frotis tome un color rojo pálido. Barcelona. 4. 1.. 6. 4. pero no en medios con glucosa. 4. España. Lavar y dejar escurrir o secar en papel secante. R. 5. Cubrir la laminilla con fucsina fenicada fuerte y calentar ligeramente durante 1 min. 2. 1. RESULTADOS MEDIO COLONIA TINCIÓN GRAM CÁPSULA (Presencia/ausencia) Figuras CUESTIONARIO. ¿Qué efecto tiene la composición de medio en la producción de este tipo de estructura? 2. mesenteroides en los medios propuestos de las prguntas 2 y 3? 5.).. Vera-García (Introducción a la microbiología (2a ed. REFERENCIAS Gamazo. 21-24. C. Ed. Lavar rápidamente con etanol. y Díaz. 3. ¿Qué hipótesis propone para explicar porqué Lactobacillus mesenteroides puede sintetizar cápsula en presencia de sacarosa. Masson. Lavar perfectamente con agua. ¿se puede correlacionar siempre la presencia de una capsula en una especie patógena? 7. A continuación se tiñe con azul de metileno durante 1-2 min. 3. Cubrir con el mordente de Muir durante 30 segundos. sin calentar. Contrastar con azul de metileno durante 30 segundos. Editorial Universidad Estatal a Distancia (EUNED) 4 . las capsulas de azul. se lava con agua y se seca. Las bacterias se tiñen de rojo. 2.Instituto Tecnológico de Celaya Departamento de Ingeniería Bioquímica Una opción alterna es: 1. ¿Qué aspecto tendrían las colonias de L. se cubre con metanol y se fija a la llama. ¿Qué función desempeñan las capsulas en la infectividad de un organismo? 6. 7. Dejar secar la preparación con nigrosina. López-Goñi. Explique el experimento de transformación con neumococo y la relación de presencia de cápsula con la justificación de patogenicidad de cepas. Una vez seca la extensión al aire. I. Proponga un experimento para evaluar su hipótesis. (2005) Manual práctico de microbiología. Observar directamente al microscopio METODOLOGIA (Método de Muir). después lavar perfectamente con agua. Pp.