Año de la Diversificación Productiva y delFortalecimiento de la Educación UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO CIENCIAS AGROPECUARIAS INGIENERIA AGROINDUSTRIAL Curso: Biotecnología de los Productos Agroindustriales Ciclo: IX GUADALUPE-PERU 2015 Determinar la biomasa de una solución celular desconocida mediante el método de turbidimetría. II. OBJETIVOS Determinar la concentración de células por conteo en cámara Neubauer. FUNDAMENTO Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. INTRODUCCION La biomasa es la cantidad de materia viva producida en un área determinada de la superficie terrestre. III. Expresándolas en unidades de células/mL. ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción. en este caso los microorganismos. Reconocer la técnica de contaje en Cámara Neubauer. Muy útil para establecer las tazas de producción. siendo una variable ecológica importante porque representa la cantidad de energía almacenada en un segmento partículas de una comunidad biológica. porque su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células. de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO DETERMINACION DE BIOMASA I. de personas o masa de seres vivos. La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso. o por organismos de un tipo específico. A la vez también se puede referir como la cantidad de células. La determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso. DETERMINACION DE BIOMASA Página 2 . s/mL.m. Métodos directos de determinación de biomasa: Se basan en el número de células o en el peso celular. para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. por ejemplo. incluidos los hongos filamentosos. dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes: 1. La principal desventaja de estas técnicas es que su determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos. 2. ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). DETERMINACION DE BIOMASA Página 3 . Los métodos para estimar el número de microorganismos pueden medir la cantidad de células. no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Métodos espectrofotométricos. mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos. Además. polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras. material inerte. Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en una determinada muestra. Métodos gravimétricos (Peso Seco) La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen. Una variedad de análisis están disponibles para la determinación de Biomasa de muestras biológicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomyces cerevisiae). la masa celular o la actividad celular. pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A. en los que es difícil cuantificar las células individuales. Se expresan en g. Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Los métodos gravimétricos son simples.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico. Esto es importante en ciertas circunstancias. antes de utilizar la turbidez como método de recuento. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad. Fuchs-Rosenthal. el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Mal assez. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras Existen diversos tipos de cámaras para el recuento de microorganismos tales como la cámara de Neubauer. Además. medio de cultivo) y de interferencias con partículas. a. y el DETERMINACION DE BIOMASA Página 4 . Se trata de métodos rápidos. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. generalmente). El recuento de microorganismos en cámaras no es un método muy exacto debido a las irregularidades en la distribución de la muestra. en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Bürker. Petroff H ttrser.1 mm respecto a la superficie. etc.1 milímetro. Thoma. Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibración (tipo de cultivo. Ttirk. 3. pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y no permite distinguir células vivas de células muertas. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez.25 mm. Es un cuadrado de 3 x 3 mm. permitiendo la estimación de tal parámetro a partir de una sola medida de la turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría. de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0. obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células/ml. Sin embargo. Esta recta contiene datos sobre el número de células. CÁMARA DE NEUBAUER. Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. con una separación entre dos líneas consecutivas de 0. 1 micro litro. Es recomendable llenarla con micro pipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical. la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0. Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.1 milímetro cúbico. es decir 0. Esta cámara se utiliza para conteo celular. Tampoco se debe inundar. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. la concentración en la suspensión celular será: concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4). Conteo en cámara de Neubauer. El llenado debe ser continuo en un solo intento. DETERMINACION DE BIOMASA Página 5 . Proceda a llenar la cámara. este debe quedar centrada. Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas. sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC. DETERMINACION DE BIOMASA Página 6 . para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo. Método por Turbidimetría La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros. B. lo que garantiza un conteo aleatorio. de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos. se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. independientemente del tamaño celular. En la figura 1. Por esta razón. Conteo por Cámara Neubauer. generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central.. Representación de la cuadricula 10 X. Sin embargo. bacterias. si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras. en soluciones diluidas. debemos ubicarnos en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. independientemente del tamaño celular del microorganismo. la absorbancia es directamente proporcional al peso seco.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Figura 1. etc. Esto quiere decir que. METODOLOGIA a.del Absorbancia Peso Secoen función del Número de Microorganismos Totales IV. Absorbancia en función del Peso Seco C. Sin embargo. D. Absorbancia enFigura función4.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Figura 2. el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0. K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Materiales y Equipos Levadura Saccharomyces cerevisiae Cámara Neubauer Jeringa DETERMINACION DE BIOMASA Página 7 . La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias.3. Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (µg/ml-mg/ml). ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Figura 3. Se realizará la cuantificación de células en las zonas de los cuadrados más pequeños de 0. y posteriormente. Una vez que la muestra ingrese por la cámara de Neubauer. Se colocará la laminilla cubreobjetos sobre el portaobjetos en la zona central. y se colocará en el borde del cubreobjetos.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Laminilla cubreobjetos Lámina Portaobjetos Tubos de ensayo Microscopio Espectrofotómetro b. Se contarán las células que estén dentro de los cuadrados las que se noten bien y las células que estén en el lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4. Metodología Método directo (Cámara de Neubauer) Con una jeringa se tomará una cantidad de la solución previamente preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilución a la 10 -1 y se dejará caer unas gotas en la cámara de Neubauer. se colocará en el microscopio.05 mm. DETERMINACION DE BIOMASA Página 8 . sin que pase a los canales laterales. Se dejará que la solución ingrese a la cámara por capilaridad. se dejará reposar. Con la ayuda de una jeringa se obtendrá una pequeña muestra del tubo de ensayo. para apreciar una zona cuadriculada. tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. DETERMINACION DE BIOMASA Página 9 . se deberá calcular el número de células/ mL (por cuadrado). 1/100) De la muestra original se tomó 5 ml en dos tubos para determinar la concentración en peso seco y peso húmedo. 1/50. a partir de la cual se procedió a preparar diluciones ( 4/5. Luego tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviación estándar para luego hacer una comparación. se determinó el número de células por mililitro. y por medio de la siguiente fórmula. Para determinar la concentración por conteo celular se tomó una muestra de la dilución 1/100. 1/10. 2/5. Con todas las diluciones y muestra original se procedió a colocarlas uno por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotómetro. A la vez se deberá calcular la desviación estándar de las 25 celdas. Con estos datos se pasó a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco. absorbancia vs peso húmedo y absorbancia vs conteo celular. 3/5. Método indirecto a) Para determinación de turbidimetría Se preparó una solución acuosa con levadura. 1/30.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Luego de calcular las células en los cuadrados intermedios. extremos y los determinados al azar. 875 32. en Cámara Neubauer FILAS 1 5 7 9 13 17 19 21 25 NUMERO DE CELULAS EN CADA UNA DE LAS 25 CELDAS 22 33 33 38 39 32 21 34 30 33 33 33 32 27 42 31 24 30 34 37 29 37 36 39 34 35 36 40 33 32 39 32 30 29 42 43 42 36 46 36 51 29 28 38 36 29 35 34 34 38 25 32 35 33 40 32 30 32 31 36 26 32 23 32 39 22 33 33 31 20 31 26 PROME DIO 34 34. Desviación estándar y coeficiente de Variación DETERMINACION DE BIOMASA Página 10 .375 35. Figura 5. Resultados de Cámara de NEUBAUER Tabla 1: Conteo de Células en 25 celdas. V.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Se preparó una solución desconocida con la finalidad de determinar el porcentaje de error (%Error). en la realización de la práctica.875 33 27.125 Tabla 2: Concentración de las células en las 25 celdas. Metodología de Turbidimetría.75 32.625 33. utilizando los diferentes métodos empleados.125 35. RESULTADOS Y DISCUSIONES a. mostrando diferencia a la utilizada para el recuento de levaduras en laboratorio. 2005).43197379 Coeficiente de variación DISCUSIONES Según Aquiahuati. desviación estándar y coeficiente de variación en las 25 celdas. Según Rodríguez et al. los métodos para estimar el número de microorganismos medirán la cantidad de células. la cámara de Neubauer permite hacer un recuento superficial de las células de levadura. Los métodos que cuantifican la DETERMINACION DE BIOMASA Página 11 . Según Madigan. (2004). en donde observamos que hicimos un conteo de 25 celdas. Esto se puede contrastar en la tabla 1. sin embargo no permite distinguir las células viables de las no viables. et al (1998). Esto se observa en los datos hallados en la Tabla 2 donde determinamos la concentración de células.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Concentración de células = Desviación estándar 2. mediante el método de conteo directo en cámara de Neubauer se debe utilizar fórmulas que expresen la concentración de células. 25 0. Según nuestra de práctica Sacharomyces la determinación de CONCENTRAC ION 0. dice cuanto tienden a alejarse de los valores puntuales del promedio en una distribución.33 0. Es así que en la tabla la desviación estándar de las 25 celdas nos da obteniendo una desviación pequeña indicando que los datos están agrupados cerca de la media.177 2. Resultados de Turbidimetría DETERMINACION DE BIOMASA Página 12 . Según Valencia (20019.5 ABSORBAN CIA 0. El coeficiente de variación indica un método de comparación de datos que tienen medidas de media diferentes o unidades diferentes. hongos filamentosos. b.02 0. la desviación estándar es el promedio con respecto de la media aritmética. en cuantificar las células lo expuesto por el autor en hicimos conteo de levadura cerevisae por mililitro. para su biomasa utilizando el método directo por recuento en el microscopio.755 todos los microorganismos.422 1.313 2.2 0. mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para incluidos los los que es difícil individuales.01 0.503 2.205 0.48 2.1 0.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO cantidad de células son útiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras. . Por lo que la turbidimetría no es un método útil para medir la contaminación de líquidos para un número relativamente pequeño de bacterias y o levaduras. ya que dentro de la determinación de biomasa.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Discusiones Según Gil (2003). Se comprobó en la práctica con éxito en el experimento ya que tanto la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad VI. su coeficiente de variación se encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa. el recuento de células por área presentes en una solución. CONCLUSIONES DETERMINACION DE BIOMASA Página 13 . nos señala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario más de un millón de células por ml.3 %). Según Rodríguez. su variación podía ser significativamente cuando es menor (CV= 12. indicando que la exactitud de la determinación varía con los laboratorios y el personal. como para ser medida por un espectrofotómetro. et al ( 2005). VII. con la finalidad de poder observar de manera más clara las levaduras. RECOMENDACIONES Se recomienda calibrar bien el microscopio. Calibrar el espectofómetro antes de tomar las medidas. De esta manera haremos el conteo. ya que ellas formaran parte del siguiente cuadro. DETERMINACION DE BIOMASA Página 14 .UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Se logró determinar la concentración de células de la levadura Sacharomyces cerevisae en las 25 celdas la que nos dio células /mL gracias a la cámara Neubauer. Se pudo determinar el promedio de levaduras (Sacharomyces cerevisae) contadas en las 25 celdas. Una inadecuada distribución de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores. Para obtener una muestra homogénea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las celdas y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotómetro. de manera homogénea para que esta se encuentra debidamente preparada y ser llevada adecuadamente a la lámina portaobjetos. las cuales no se tomarán las células que estén la parte derecha del cuadro ni las de la parte inferior del mismo cuadro. El llenado en las celdas de la cámara de Neubauer se debe hacer correctamente para evitar que se pierda parte de la muestra. usando la cámara de Neubauer. Del mismo modo calibrar la balanza analítica par que nuestro porcentaje de error sea mínimo. que es un método eficaz para el conteo de dichas levaduras. ya que este pudo haber sido utilizado con otras sustancias en experimentos anteriores. Verificar que mediante el uso de la jeringa se pueda hacer un correcto llenado de la muestra en la cámara de Neubauer. El llenado correcto de la muestra en la cámara. por el método de conteo directo. se debe realizar de modo que no se derrame en la lámina cubre objeto la solución. de esta forma facilitaremos el conteo de las células. Se debe agitar la dilución a emplear (10-1). Miraren el microscopio y contabilizar bien la células. Unidad Iztapalapa. SILVA. Pág. GARCÍA. J. Departamento de Biotecnología. (2000).. Pág. ISAC. Escuela superior de agricultura de Barcelona. Manual de Prácticas. Sevilla. Elementos clave en la uniformidad de distribución de abonos. GAMBOA. VALENCIA. Bacteriología General: Principios y prácticas de laboratorio. et al (1998). (2003). (2001). 63-68. Prentice Hall. J. H.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO VIII. 20 – 28. E. Manual de Prácticas: Laboratorio de Microbiología Celular. España.L. 155 – 156. Sus desventajas se dan porque no se diferencian los microorganismos vivos de los muertos. C. MADIGAN M. P. (2004). Sevilla-España. UNAM. Departamento de Biotecnología. Universidad autóctona de México. 1era Edición.C. S. Determinación de la biomasa en procesos biológicos. (1986). LEBRATO. E. Metropolitana. 63-68. Universidad Autónoma Metropolitana. son el equipo sencillo y escaso que se requiere. J. Editorial MAD. BIBLIOGRAFIA AQUIAHUATI M. ARNÁIZ. 2001 ANEXOS Las ventajas de este tipo de recuentos de Conteo. Manual del Técnico Superior de Laboratorio de Análisis Clínicos. 1era Edición. “Biología Celular”. RODRÍGUEZ. Departamento de Biología.L. Pág. GIL. (2004).. Unidad Iztapalapa. HERNÁNDEZ. Brock Biología de los microorganismos Octava Edición. Facultad de Ciencias. Manual de Prácticas de Microbiología Básica. es tedioso y no es útil para recuento de poblaciones con baja concentración de bacterias. la rapidez para obtener los resultados y la facilidad para observar la morfología de los microorganismos presentes.. Editorial Universidad de Costa Rica. M. DETERMINACION DE BIOMASA Página 15 . GARCÍA. F. Universidad Nacional de Colombia. (2005).. Orientación que se debe seguir para el conteo de microorganismos usando la cámara de Neubauer DETERMINACION DE BIOMASA Página 16 . Figura 1. Representación de la cuadrícula de la cámara de Neubauer con el ocular de 10X.UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO No se usa en hifas o mohos. Figura 2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Figura 3. Cuadrículas de la cámara Neubauer DETERMINACION DE BIOMASA Página 17 . Orientación para el conteo de microorganismos usando la cámara de Neubauer. Figura 4.