UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE SAN JUAN DEL RÍO DIVISIÓN DE QUÍMICAProcesos Biotecnológicos Practica # 1Preparación de medios de cultivo para microbiología Ingeniería Química 12/06/2013 OBJETIVO El alumno aprenderá la preparación de los diferentes medios de cultivo [1] e.). El ambiente bioquímico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo. MARCO TEORICO: El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. caldo ordinario).INTRODUCCION: Para cada bacteria a ser cultivada es necesario proveer el ambiente bioquímico y biofísico apropiado. tampones. y dependiendo de las necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propósitos y utilizaciones. semisólido) y a la finalidad de su uso. nutrientes orgánicos (hidratos de carbono. se utilizan para la selección [2] . Composición de un medio de cultivo: componentes indispensables: agua. agente solidificante (agar- agar). indicadores de pH. nutrientes inorgánicos ( P. extracto de levadura) medios sintéticos Existen medios de cultivo cuya composición permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo. etc. N. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y también son utilizados para la identificación de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. en placa) medios semisólidos En función de su composición: medios complejos (caldo ordinario. etc. Los Medios de Cultivo se clasifican de acuerdo a su estado físico (líquido. Mg. S. sólido.) componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl). vitaminas. etc. La preparación de los medios de cultivo es un proceso que también se menciona en este trabajo. Tipos de medios de cultivo: En función de su consistencia: medios líquidos medios sólidos (en tubo. aminoácidos. Otros en cambio. repartir en su caso en tubos a razón de 2-4 ml por tubo. Una vez esterilizado. anaerobios). los tubos se disponen en posición inclinada para su solidificación.tapar el matraz con tapón de algodón graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C. Medios sólidos en tubo (agar inclinado) . En caso de desear proporcionar condiciones anaeróbicas. Medios líquidos – una vez disueltos los componentes del medio en el matraz. El medio se reparte en tubos.tras la ebullición del medio con agar. Alternativamente. etc. DESARROLLO: [3] . Para asegurar la completa disolución del agar. Los tubos se cubren con tapón (de aluminio). Los medios semisólidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos: Medios sólidos en placa . y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estériles en tubos de plástico estériles. 15-20 min). éste se reparte en los tubos de cristal. Medios semisólidos – se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar-agar).de determinados grupos de organismos. medios selectivos enriquecimientos medios para test bioquímicos Preparación de un medio de cultivo: Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua destilada Ajustar el pH del medio. existen diversas metodologías para ello. cubrir con tapón y llevar a esterilizar en el autoclave. o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos.). se puede esterilizar el medio en el matraz. Esterilización de medios de cultivo: Una vez preparado el medio. Una vez estéril repartir el medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su solidificación. Para llevar a autoclavar. de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. el medio se calienta hasta ebullición al mismo tiempo que se somete a agitación previamente a su esterilización en el autoclave. si procede Para la preparación de medios sólidos se adiciona agar-agar como agente solidificante. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios. Verificar cuidadosamente el vire en la tira de cinta testigo 10. agua destilada Solución de hipoclorito de sodio al 2 ppm PROCEDIMIENTO: 1. 5.5 g de la fórmula de Agar Nutritivo en la balanza y agregar al matraz Erlenmeyer de 1000 ml que contiene los 500 ml H3O destilada. Verter los 500 ml de H3O destilada en el matraz Erlenmeyer de 1000 ml. hasta que la solución no presente partículas y del color ámbar vire a un color con tendencia transparente. 10 Solución salina al 0.9% Agua destilada Sal y manitol Agar MIO. 2. 7. Elaborar un tapón de algodón y un gorro de papel estraza para el matraz de 1000 ml. de presión durante 15 minutos. procurando que este embone perfectamente. Colocar el matraz recién esterilizado sobre la mesa de trabajo.2 2 1 1 1 1 1 1 1 Materiales y equipos Cajas petri estériles Potenciómetro Tubos de ensaye con tapón Mecheros Matraz Erlenmeyer de 250 ml Probeta de 100ml Balanza granataria Parrilla Espátula Autoclave Cinta testigo Tubos de ensayo medianos Pipeta graduada de 10 ml Pipeta graduada de 1 ml Probeta de 100 ml Frasco de dilución Balanza Granataría Reactivos Buffer pH 4. 6. [4] . Medir 500 ml de H3O destilada 3. Tomar la franela y doblarla a lo largo para rodear la boquilla del matraz Erlenmeyer. 7. Pesar 11. Marcando el matraz con una tira de cinta testigo. 4. 8. Colocar el tapón de algodón y el gorro de papel estraza. Calentar sobre la llama del mechero tipo Fisher con movimientos circulares. 9. TSI Caldo lactosado Agar Nutritivo Agar Salmonella o TCBS Caldo de infusión cerebro corazón Algodón. Esterilizar en el autoclave a 121 °C / 15 lbs. papel manila. RESULTADOS: Preparación general de medios de cultivo [5] . AGAR NUTRITIVO: Vaciar los gramos pesados y 500 ml de agua destilad en el mismo matraz Erlenmeyer Leer la etiqueta del Agar Nutritivo Pesar 11.6 Si pH de 6.8± 0. Puntos críticos en la preparación de los medios de cultivo pH Temperatura Pesaje de los medios Condiciones de esterilización [6] .5 gramos del Agar Nutritivo Vaciar 500 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer Dejar enfriar y medir el pH Hasta su completa disolución Calentar el Agar nutritivo con agitación suave Una vez obtenido el pH deseado 6.2 No Agregar NaOH para neutralizar Agregar HCl para acidificar Colocar el tapón de algodón y el gorro de papel estraza al ME y marcarlo con cinta testigo Esterilizar en autoclave a una presión de 15Lb durante 15 min Colocar en la mesa de trabajo para su uso. Nota: estos también pueden clasificarse según el estado de agregación en solidos (agares) y líquidos (caldos). bioquímicas Caldo tetrationato Cary-Blair B. que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.B.E G. G..A. 3.COMPETENTES DEL MEDIO DE CULTIVO Agar nutritivo CUESTIONARIO 1.¿Cuál es la diferencia entre un medio líquido y un sólido? La diferencia principal entre ellos es que un medio solido contiene agar el cual le da la consistencia sólida al medio. Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. [7] . modificando el aspecto final del medio. A. además de sus usos ya que estos tienen diferentes objetivos.A..BP.S. 2. y A..¿Qué norma mexicana nos indica el procedimiento para la realización de medios de cultivo? NOM-065-SSA1-1993. Generalidades.V.¿Cuántos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos? Medio Medios basales Medios enriquecidos Medios selectivos o inhibitorios Medios Diferenciales Medios de enriquecimiento Medios de transporte Medios de conservación Ejemplo A. M.B. 4..¿Qué pasa si el medio de cultivo se excede en el calentamiento? Los medios que contiene azucares como parte de sus componentes principales generalmente se caramelizan al someterlos a altas temperaturas. Se emplean fundamentalmente para: Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos. Medios líquidos.Ch.N.. 6. Los principales cuidados que hay que tenerse a la hora de utilizarse el potenciómetros es que el electrodo no debe de tocar el fondo del recipiente donde se coloque ni ser golpeado y que este se deberá de calibran con las soluciones buffer de pH 4. 7. el azul violeta.Diferencie entre los términos: Desarrollo y Crecimiento 8. azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.Defina que es un medio de cultivo Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar.Usos y cuidados del potenciómetro. 5. violeta de genciana y otros colorantes los cuales tienen la capacidad de teñir las paredes de las células esto debido a que algunas de ellas tienen una sustancia llamada peptidoglucano o mureína la cual provoca la retención o no del colorante. factores decrecimiento. Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas. agua y pH adecuado. Conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que permiten que los microorganismos crezcan y se reproduzcan. así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Las bacterias Gram positiva se visualizan de color moradas y las Gram negativa se visualizan de color rosa o rojo o grosella.. [8] . y soluciones para ajustar el pH de los medios. 7.Investiga la técnica Gram La tinción Gram es una técnica utilizada para la identificación de bacterias Gram positivo y Gram negativo mediante el uso de ciertos colorantes como la safranina. PASOS A SEGUIR PARA REALIZAR UNA TINCIÓN GRAM Tinción Con violeta cristal.. multiplicar y aislar los microorganismos. como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Aportan carbón y nitrógeno y elementos minerales.. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología. Medios sólidos. Su uso principal es medir el pH de las soluciones como caldos. violeta de genciana.¿Qué sucede si el medio está muy frío y se desea vaciar? Este no caerá debido a que se ha gelificado totalmente. Generalmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular. 9.. y 10 antes de ser utilizado.. Para realizar el lavado. se procede a enjuagar la lámina con agua.. se recomienda sea al 1% . se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente.. El chorro debe ser un chorro delgado. La solución de cristal violeta. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo. De esta manera. hasta que ya no escurra más líquido azul. procedemos a teñir nuevamente. dejar actuar durante 1 minuto.Enjuague Al transcurrir el minuto. etanol al 95 %. se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra. se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto más. hasta lograr que éste salga totalmente transparente. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. el frotis se decolora con etanol al 75 %. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente. se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tinción de contraste Una vez que la lámina ya secó. [9] . es decir. ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante. hasta que ya no escurra más líquido azul. aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. Decoloración Pasado el minuto de haber actuado el mordiente. acetona o alcohol-acetona. ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos. que son críticos en el crecimiento de los MO. esto nos permitirá delimitar que medio el más adecuado para su crecimiento. Pues en este caso necesitábamos un pH de 6. Teniendo en cuenta aspectos representativos del tipo demedio ya sea sólido. Hay factores como la temperatura y pH que son críticos en su preparación pues la mayoría de veces de estos depende el obtener un buen medio de cultivo y que cumpla con las especificaciones requeridas. Es por eso que para su preparación se necesita conocer el tipo de MO con el que hemos de trabajar. de igual manera el pH ya que si este tiende a acido no proliferan ningún tipo de bacterias. ya que las altas temperaturas afectan las azucares q contienen algunos medios.CONCLUSIONES *Cervantes Alonso Ana Laura Previo a la preparación de un medio de cultivo es necesario conocer el tipo de MO con el que se ha de trabajar. *Rodríguez Fajardo José Jonny Las condiciones de temperatura y pH son condiciones críticas en la preparación de los medios de cultivo. pero no así los hongos y levaduras. En la preparación del agar nutritivo se ajustó su pH a 6. así como el pH.2 BIBLIOGRAFÍA NOM-065-SSA1-1993. En el caso de nuestra practica se preparó un agar nutritivo al cual se le ajusto el pH de ácido a prácticamente neutro de 6. Microbiología industrial presentación de power point. En la práctica ajustamos el pH del agar nutritivo usando NaOH para neutraliza hasta alcanzar un pH de 6.6. temperatura de preparación. que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. así que se ajustó el pH del agar nutritivo a 6.com/ensayos/Medios-De-Cultivo/839009. etc. Por eso la importancia de trabajar bajo las especificaciones que marca la norma y el etiquetado de cada medio.html [10] . pues en ellos se especifican factores como la temperatura. pues este defina las características del medio.8.buenastareas. http://www.5 para poder cumplir con los requerimientos especificados para su uso que son de un pH de 6.6 con NaOH. *Morales Ortiz Erick Los medios de cultivo son agentes nutritivos que permiten la recuperación y proliferación de los MO por lo que su preparación debe ser cuidadosa siempre cuidando que cumpla con las especificaciones establecidas en la norma y su etiquetado. pues estas se caramelizan. Otro factor a tomar en cuenta para la preparación del medio es el tipo de MO con el que se pretende trabajar.8 ± 0. Generalidades. semisólido o un caldo. Sanabria Celestino Kennedi La preparación de un medio de cultivo es fundamental en la proliferación de MO por lo que tiene que hacerse cuidadosamente.6 para que fuera apto para el crecimiento de MO según marca la etiqueta del frasco del agar. pH y las fuentes de nutrientes que contiene. es/frvalera/manualDePracticas. http://egg.umh.pdf [11] .
Report "Practica # 1 Preparación de Medios de cultivo para microbiología"