I.INTRODUCCION La absorción de radiación ultravioleta o visible proviene de la excitación de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorción molecular es por tanto valiosa para la identificación de los grupos funcionales de una molécula. Sin embargo, son más importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorción ultravioleta y visible para la determinación cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o también llamados cromóforos. La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físicoquímicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos. En esta práctica se determinara la absorbancia del bromocrosol verde, se realizara distintas medidas con distintos volúmenes; con la ayuda del instrumento llamado espectrofotómetro. I.1 Objetivos - Objetivo general Determinar la concentración del bromocrosol verde a través del espectrómetro visible. - Objetivos específicos Determinar las concentraciones y absorbancias de cada una de las muestras realizadas. Construir la gráfica de la relación absorbancia vs concentración. Determinar la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración. II. REVISIÓN DE LITERATURA II.1 ESPECTROFOTOMETRÍA UV – VISIBLE La espectrofotometría de absorción fue uno de los primeros métodos físicos que se aplicó al análisis cuantitativo y la determinación de estructuras, La espectrofotometría UV-vis supera en costo y sencillez al resto de métodos ópticos a otro estado energético distinto (l). Este último presenta el inconveniente de que el oxígeno atmosférico absorbe en esa región y por ello no es considerado en el análisis por espectrofotometría UV . de los movimientos vibracionales de las moléculas. absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos niveles: El .visible. .1.de análisis cuantitativo y es también una técnica auxiliar útil para la elucidación de estructuras. La región del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta próximo o cercano (que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagnético) y el ultravioleta lejano o de vacío (10 a 200 nm). de la rotación de las mismas. 1990). las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. las moléculas absorben un fotón de una radiación tal que: Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que.1 FUNDAMENTO Como es sabido. II.Em. A través de esta interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético (m). Para conseguir esto. en definitiva no son mas que el registro de las distintas u(0k) a las que se producen estos tránsitos energéticos. La división entre las regiones ultravioleta próximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que el ojo humano sólo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm (OLSEN. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía de los electrones. desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.2 LEY DE BEERT . La compensación de la reflexión y la absorción en la ventana puede evitarse definiendo I 0 como el poder de radiación que pasa a través de una muestra testigo (blanco) contenida en la misma celda de la muestra. Espectro de radiación La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos). que también se llama longitud de paso óptico. Un esquema podría ser el siguiente: Figura N°1.etc. la fracción de la radiación absorbida es función de la concentración de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la muestra.LAMBERT Cuando una onda electromagnética de cierta longitud de onda incide sobre una sustancia. de esta forma: . dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones. La transmitancia T se define como la relación de las intensidades de la radiación no absorbida I. II. se debe a la transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas. las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes de onda. y de la radiación incidente. Si ahora se estipula que I0 es el poder de radiación a x=0. Donde k es una contante de proporcionalidad característica de la naturaleza de la especie absorbente y de la energía de los fotones. al resultado se le llama espectro de absorción de esa especie molecular y es una huella dactilar para propósitos de identificación.La absorbancia (A) es el logaritmo del recíproco de la transmitancia Si el porcentaje de T es 100T. puede escribirse matemáticamente de la forma siguiente. el porcentaje de absorción será 100(1T). como antes se ha mencionado. Reordenando la ecuación anterior. La reducción de la intensidad en la trayectoria x. e I representa el poder de la radiación a cualquier distancia x en el medio absorbente. Las primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular sólo absorbe luz en regiones específicas del espectro y en grado variable característicos de dicha especie. A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una especie absorbente. -dI. Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de las sustancias pueden ser cualitativas o cuantitativas. y que I representa el poder de la radiación . el grado de absorción con respecto a la distancia atravesada es directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones I. Las aplicaciones cuantitativas dependen de la relación entra la absorbancia y la concentración de la solución. Este es el enunciado matemático de que la fracción del poder de radiación absorbido es proporcional al espesor atravesado. Beer determinó que al aumentar la concentración del absorbente. Por lo tanto la forma combinada de la ley es: Donde a incorpora el factor de conversión del logaritmo base 10 a logaritmo natural. Esta es la ecuación de Lambert la cual indica que para una cierta concentración de sustancia absorbente. proporcional a la concentración de la sustancia que absorbe. La ecuación puede integrarse con respecto al total del trayecto de la radiación. . Esta expresión es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir como: Donde ϵ es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm -1 y mol-1. a su vez. se producía el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del trayecto de absorción de la radiación. De esta forma. la intensidad de la luz transmitida disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en forma aritmética. la constante de proporcionalidad k es.transmitida que emerge del medio absorbente a x = l. l es la longitud del paso óptico (longitud de la celda) y C es la concentración de la sustancia absorbente en unidades de mol L -1. especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple. 1 y 2. medible directamente.Figura N°2. la absorbancia A. obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones. siempre que sus respectivos espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. Existen. se cumplirá que: II. lo que constituye el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo.VISIBLE . es proporcional a la concentración molar de la muestra c. de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes.3 CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV . sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer. Así. para una mezcla de dos componentes. La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva. que absorben radiación de una misma longitud de onda. Absorción de la radiación Si se opera a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor l. utilizando para ello el mando “A-T”. Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente. Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando “Ajuste del cero”. que normalmente es el disolvente de la muestra. que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir sobre la muestra. . II. encendido instantáneo.). Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente. atendiendo al rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no automáticos). 900 a 340 nm).1 INSTRUCCIONES GENERALES ESPECTROFOTÓMETRO DE MANEJO DE UN Encendido de lámparas Lámpara de tungsteno (zona del Visible. Adaptación del espejo a la lámpara adecuada. 340 a 200 nm aprox. hasta que aparezca cero en la pantalla. Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra. La absorbancia de la muestra se compara con la de una “referencia” que consta estrictamente de disolvente.La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro. necesita un calentamiento previo.3. Lámpara de Deuterio (zona del UV. basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer.00 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. II. Si los espectros de los componentes puros X e Y se cruzan a una longitud de onda.4 PUNTO ISOSBESTICO En la mayoría de los casos durante la duración de una reacción química. este es una buena prueba de que existe más de una especie. . cualquier espectro registrado durante la reacción química pasará por ese mismo punto. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave. para los casos en donde hay más especies se aplica el mismo concepto). este punto se conoce como punto isosbéstico. Absorbancia/Transmitancia de la muestra Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.Figura N°3. Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo. una especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y (en el caso que sólo estén involucradas 2. Agua Destilada . .(1) Vaso precipitado de 250 ml .(1) Matraz .2 Equipo .(1) Pipeta .(1) Gradilla . donde se observa el cambio de una especie a otra dejando evidencia el punto isosbéstico III.En la figura se muestra un ejemplo de los espectros de absorción que corresponde al verde de bromocresol. 2007). MATERIALES Y MÉTODOS 3.Libreta de apuntes . este es el punto isosbéstico y corresponde a la longitud de onda en que las dos formas tienen la misma absortividad (HARRIS.Bromocrosol verde 3gr.Lapicero 3. se puede observar que hay una longitud de onda en que los tres espectros se cortan. Figura N°4. Espectros de absorción del bromocrosol verde a diferentes valores de pH.(4) Tubos de Ensayo .1 MATERIALES . 3 Software - Microsoft Excel 2013 - Microsoft Word 2013 3. 6. . y se agregó las cantidades de 1.Laptop . Posteriormente y previas explicaciones del docente a cargo.Cámara digital 3. se encendió el espectrofotómetro y se calibró colando agua en la cubeta transparente del espectofrotómetro. y luego se agregó 3 gramos de Bromocrosol verde y lo mezclamos hasta que se disuelva completamente.2. 2 ml de agua destilada respectivamente). 4 y 8 ml de la mezcla y agregamos agua destilada en cada uno de los 4 tubos de ensayo hasta que en cada uno halla la cantidad de 10 ml (agregamos 9. Luego se usó 4 tubos de ensayo con su respectiva gradilla.2 MÉTODOLOGÍA 3. 8.1 TRABAJO DE LABORATORIO Se comenzó añadiendo al matraz 250 ml de Agua destilada..Espectrofotómetro 1200 RS FARLAB . 2. Si la muestra que analizamos con el espectrofotómetro no nos dio un dato de absorbancia. 3. Con dicha ecuación podremos determinar la concentración para la absorbancia requerida.4 Consideraciones . Finalmente se colocó cada muestra de los 4 tubos de ensayo en la cubeta transparente del espectofrotómetro para medir la absorbancia.5ml del total del volumen . .5ml se tuvo que retirar 6. Al construir la gráfica hallamos la línea de tendencia generada por un ajuste de curva lineal.Trabajo de Gabinete Con los datos obtenidos del trabajo de laboratorio de concentración y absorbancia. no considerar para encontrar el ajuste de curva. construimos una gráfica de absorbancia vs concentración en Microsoft Excel.Debido a que la cubeta transparente del espectofotrómetro solo utiliza 3. . 3.000012 g/ml .1 Determinación de la concentración inicial m = 3g (Bromocrosol verde) v = 250 ml (Agua) m N1= v 3g N1= = 0.2 Volumen total V1 = 1 ml (Mezcla) + 9 ml (Agua) = 10 ml V2 = 2 ml (Mezcla) + 8 ml (Agua) = 10 ml V3 = 4 ml (Mezcla) + 6 ml (Agua) = 10 ml V4 = 8 ml (Mezcla) + 2 ml (Agua) = 10 ml VT = 10 ml IV.1 Para la concentración 1 N2-1 = g x 1 ml ml 10 ml 0.012 g/ml 250 ml IV. RESULTADOS IV.IV.012 = 0.3 Determinación de las distintas concentraciones N1 * V1 = N2 * V2 Donde: N1 = Concentración inicial V1 = Volumen de cada concentración N2 = Concentración final V2 = Volumen total IV. 0048 g/ml IV.000012 g/ml N2-2 = 0.0096 g/ml N2-5 = x ABSORBANCIA 1.938 No se efectuó la lectura 1.4 Para la concentración 4 N2-4 = IV.3 Para la concentración 3 N2-3 = g x 4 ml ml 10 ml 0.3.294 1.3.0024 g/ml N2-3 = 0.012 = 0.012 = 0.0048 g/ml N2-4 = 0.540 Gráfica N°1.012 = 0.0096 g/ml Calculo de la absorbancia Tabla N°1.0024 g/ml IV.3.424 1.IV.4 g x 8 ml ml 10 ml 0.2 Para la concentración 2 N2-2 = g x 2 ml ml 10 ml 0. Concentración y absorbancia de la muestra en estudio CONCENTRACIÓN N2-1 = 0. Representación de la absorbancia vs concentración . 0071 * (1. y = 0.01x .002134 g/ml .540) – 0.0088 Y = 0. la concentración N2-5 es 0.01 R² = 0.0. podemos hallar el valor de la concentración teniendo como dato la absorbancia.Absorbancia vs Concentración f(x) = 0.002134 g/ml Por lo tanto.0088 Donde: x = absorbancia y = concentración (g/ml) Y = 0.95 Dada la siguiente ecuación de la gráfica.0071x – 0. c5= 0. cuya relación debe mostrar un comportamiento lineal. para la obtención de la curva de calibración. CONCLUSIONES . obtuvimos una ecuación lineal de las concentraciones c1= 0. 2005). con la finalidad de obtener los resultados dentro de los límites permitidos. se representan gráficamente las absorbancias y las concentraciones de las muestras.V. a5=1. Según SIERRA (2010).000012g/ml. se debe seleccionar la longitud de onda más adecuada para realizar las medidas que corresponden a un máximo de absorbancia.9549 de la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración.938. a2= 1.0048 g/ml. concordando con el autor. puesto que se trabajó dentro de la medida adecuada.00024g/ml. VI.540. c2= 0. DISCUSIÓN Según la Ley de Beer (WALTON.000012g/ml. con sus respectivas absorbancias a1= 1.424. a3= 1. c3= 0. Para la práctica se se escogió una longitud de onda de (240 nm) por lo tanto el valor de R² = 0.294. concordando con el autor. 000012g/ml para una absorbancia de 1.424. a3= 1. Se determinaron las concentraciones de cada una de las muestras realizadas siendo estas c1= 0. a mayor concentración mayor será la absorbancia. a5=1. Se determinó la ecuación de la gráfica de la relación absorbancia vs concentración. No se trabajó con la concentración c4=0. c5= 0. a2= 1.00024g/ml. VII. c2= 0. RECOMENDACIONES Diluir completamente la muestra.294. siendo esta y=0.000012g/ml.0048 g/ml.540.0096 g/ml.000012g/ml.- Se determinó la concentración del bromocrosol verde a través de espectrofotómetro visible.540. .0088.938. a partir de la cual se calculó la absorbancia teniendo como dato la concentración. siendo éstas a1= 1. c3= 0.0071x . Se determinó que la relación de la concentración vs absorbancia es directamente proporcional. debido a que el espectrofotómetro no efectuó la medición. es decir.0. Se obtuvieron las absorbancias de cada una de las muestras. siendo este 0. 593 p. España. Vigilar que al momento del análisis de la muestra en el espectrómetro. Esperar que el dato proporcionado por el espectrómetro se vuelva constante para considerarlo valido. Editorial Continental S. . Análisis químico cuantitativo. WILLARD H. Métodos ópticos de análisis. España. 2007.A.F. Editorial Reverte S. 1986. 418 p. Madrid. et al. para que así no haya interferencia en el análisis. México D. 1990. México. Editorial Reverte S. España. Madrid. en la habitación no se produzca cambios bruscos en la circulación de las masas de aire.A..A. 3 ed. 756 p. HARRIS D. VIII. Métodos instrumentales de análisis. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS OLSEN E. UMHE. Editorial Reverté S. ANEXOS Figura N°5. Barcelona. Manual de técnicas instrumentales.A. México. 146 p. Círculo editor Universo. J. Madrid. Mezcla del bromocrosol verde con agua . 2005.CONNOR. MIÑONES.htm. 4 de junio del 2015) IX.F. 4 ed.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel _Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05. México D. 1980. Ley de Lambert-Beer [En línea]: (http://repositorio. España. 228 p. 1 ed. K. España. Análisis químico e instrumental moderno. 385 p. 1978. 2013. Curso de análisis farmacéutico.innovacionumh. WALTON H. Editorial Reverté. Figura N°6. 1 ml respectivamente . Pruebas para el análisis con volúmenes de 8ml. 2ml. 4ml. Figura N°7. Espectrofotómetro UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES ANALISIS INSTRUMENTAL ESPECTROSCOPÍA DE RADIACIÓN UV-VIS . Mayori CRISTANCHO ARIZA. Luis OSORIO PEDRAZA.DOCENTE : Ing. DIONISIO MONTALVO.2015 JUNIO 2015 . Krystell FERNÁNDEZ ESCOBAR. Franklin ALUMNOS : BARRUETA PAUCAR. Maribel CICLO : I . Angie MANRRIQUE GUERRA. Erick POMA CATALÁN.