Bacteriología Dr.César Cevallos Columbus UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN–TACNA FACULTAD DE CIENCIAS: E.P. BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA Curso: Bacteriología PRÁCTICAS DE LABORATORIO Nº 07 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio spp INTRODUCCIÓN Las especies de Vibrio se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos aerobios, con una estructura celular curva, tienen motilidad y poseen un flagelo polar, no forman esporas, miden de 0. 5 a 0.8 μm de diaá metro por 1.4 a 2.6 μm de largo. Las especies de Vibrio crecen en presencia o ausencia de oxíágeno. Todas estas especies producen la enzima citocromo C oxidasa (excepto la especie Vibrio metschnikovi), fermentan la glucosa y algunos producen gas. El cloruro de sodio estimula el crecimiento y algunas especies son estrictamente halofíálicas. El geá nero Vibrio contiene maá s de 30 especies y 12 de eá stas son especies patoá genas para el ser humano. El patoá geno maá s reconocido de la familia Vibrionaceae es Vibrio cholerae por la diarrea fatal que puede llegar a producir, otras especies del geá nero Vibrio, como V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. mimicus se asocian tanto a infecciones intestinales como a extraintestinales. Las especies de la familia Vibrionaceae son capaces de crecer en la mayoríáa de los medios rutinarios de laboratorio, incluyendo agar sangre y agar MacConkey. Las colonias producidas en estos medios son muy similares a las producidas por especies de la familia Enterobacteriaceae. Sin embargo, debido a que algunas especies son especíáficamente halofíálicas, es necesario agregar una concentracioá n final de 1% NaCl a aquellos medios que carecen de sal. Usualmente es necesario hacer un enriquecimiento de estas bacterias a partir de los diferentes tipos de muestras en Agua Peptonada Alcalina (APA) a 35oC por 6-12 horas en aerobiosis para aumentar la recuperacioá n en los medios de aislamiento primario. El medio de aislamiento primario maá s recomendado para la recuperacioá n de las especies de Víbrio es el agar TCBS. Las placas de agar TCBS se incuban hasta por 48 horas antes de descartarlas. Es importante examinar cuidadosamente el crecimiento y el color de las colonias en las placas de agar TCBS. Tabla: Apariencia de colonias de especies de Vibrio en agar TCBS OBJETIVO 1. Aislar e identificar especies de Vibrio que producen toxiinfeccioá n por agua o alimentos marinos contaminados. 1 Bacteriología Dr. César Cevallos Columbus 2. Conocer y aplicar las pruebas de identificacioá n bioquíámica maá s importantes para el reconocimiento de especies de Vibrios. MATERIAL PARA LA PRÁCTICA: 1.- Muestra: pescado entero, cangrejos o jaibas. REACTIVOS: 2.- Placas de agar Mac Conkey Reactivo de Kovacs 3.- Placas de agar TCBS Rojo de Metilo 4.- Tubos con TSI Revelador de VP 5. Tubos con Citrato de Simons OTROS MATERIALES: 6.- Tubo con caldo Triptona Asas bacterioloá gicas 7.- Tubos con caldo urea Mecheros 8.- S.S.F esteá ril Pipetas de 1 mL 9.-Tubos con Agua Peptonada Alcalina 01 Frasco para CO2 10.- Caldo MRVP Incubadora PROCEDIMIENTO DIA 1 • Muestra de estudio: pescado de mar, cangrejos o jaibas, choros • Proceder eviscerado del pescado. • Lavar con S.S.F.E la piel, víásceras y agallas por separado, en placas Petri. • Trasladar 0.5 mL de los lavados a Tubos con APA (4.5 mL) • Incubar a 35-37°C por 18 a 24 hs. DIA 2 • Hacer tincioá n Gram a cada una de la muestra en tubos con APA. • Sembrar las muestras en Agar Mac Conkey y en Agar TCBS • Incubar a 35 – 37°C por 18 a 24 hs. DIA 3 • Realizar lecturas de colonias. • Realizar Gram de las colonias sospechosas. • Prueba de la catalasa • Prueba de la oxidasa • Sembrar colonias sospechosas en: Agar TSI Agar Citrato de Simmons. Caldo Tripotona Caldo Urea 4 tubos de Caldo Soja Tripticasa: 02 tubos al 0% de NaCl y 02 tubos con 3% de NaCl. INCUBAR a 35-37°C por 24hs. DÍA 4 • Hacer lecturas bioquíámicas. CUESTIONARIO: 1. ¿Queá otras pruebas bioquíámicas se pueden realizar para identificar a las diferentes especies de Vibrio? 2. ¿Por queá el agar TCBS es selectivo? 3. ¿Podríáa usted afirmar que todas las bacterias que crecen en el agar TCBS pertenecen a la familia Vibrionaceae? 4. ¿Coá mo se puede diferenciar usted especies de la Familia Enterobacteriaceae de la familia Vibrionaceae? 2 Bacteriología Dr. César Cevallos Columbus 3