Los vectores derivados de plásmidosIntroducción a la Biología plásmido Los plásmidos son auto-replicantes, extrachroantibiótico. El sitio de clonación es una restricción enmoléculas de ADN cromosómicas que se encuentran en prácticamente todos los donuclease sitio de escisión en el que exterior especies bacterianas. En la naturaleza, los plásmidos se producen en ADN puede ser insertado sin interferir con profusión exuberante, variando en estructura, tamaño el plásmido la capacidad de replicar o conferir a los modo de reproducción, el número de copias por bacel fenotipo seleccionable en su huésped. Durante el terial de células, la capacidad de Propag comió en diferentes bacaños, los vectores plasmídicos han aumentado en lo que se rios, la transferencia entre las especies b acterial, phistication; además de estos tres básico y quizás lo más importante, en los rasgos que elemental vectores ts muchos ahora incluyen características llevar La mayoría de los plásmidos procariotas son de doble que los hacen particularmente adecuados fo r específica hundidos moléculas de ADN circulares; sin embargo, tipos de experimentos. lin plásmidos oído han sido identificados en tanto de sc ribe proc edure s para hacer De las Naciones Unidas de TI S 1. 6.1. 7 bacterias gram-positivas y gram-negativas. El ADN plásmido. El proceso por el cual los plásmidos tamaño de los plásmidos varía ampliamente, desde varios se introducen en E. coli se llama transkilobases a cientos de kilobases. replicación mación. . Protocolos de transformación se dan en de plásmidos depende de las proteínas celulares huésped pero . Para obtener una lista de los vectores y sus más destacados ONU TI 1. 8 También pueden requerir plásmido codificados funciones. características, consulte . APPE NDI X 5 El plásmido de replicación puede ser sincronizada sincronizará con Replicantes el ciclo celular bacteriana, resultando en una baja numnúmero de moléculas de plásmido por célula bacteriana, o Una de las maneras en que los replicadores son clasifiindependiente del ciclo de la célula huésped, lo que permite cado se basa en el número de moles-plásmido la proliferación de cientos de copias del plásmido culas mantenidas por célula bacteriana bajo alguna por célula. Algunos plásmidos transferir libremente su un conjunto de condiciones de crecimiento normales, los llamados ADN entre las especies b acterial, algunos sólo transel número de copias de t que pl asm Identificación. Libro de T hi fi nes de s fer su ADN en bacterias de la misma especie, alto número de copias de plásmidos como las que y algunos no transferir su ADN en absoluto. existen en 20 copias por célula bacteriana crecido en Los plásmidos portadores de genes que especifican una amplia variedad medio LB líquido, y bajo número de copias de funciones que incluyen: resistencia a los antibióticos, plásmidos como las que existen en <s 20 por copie resistencia a metales pesados, sensibilidad a la mucelular Alto co-PY-número de plásmidos tienden a ser tagens, la sensibilidad o resistencia a la bacteriomás pequeña que copia de baja-nu plásmidos mber. Ellos fagos, la producción de enzimas de restricción, proson más comúnmente utilizados en biología molecular biológiproducción de aminoácidos poco comunes, la producción de toxtrumentales, ya que es más fácil de preparar grandes ins, la determinación de la virulencia, el catabolismo de cantidades de ADN plásmido puro a partir de células que complicadas moléculas orgánicas, la capacidad para formar les doy. Bajo número de copias plásmidos son relaciones simbióticas, y la capacidad para transferir utilizada cuando es importante para controlar el gen ADN a través de kingdo ms. dosificación de una secuencia clonada, por ejemplo, cuando A partir de la década de 1970, los vectores de propagaciónla secuencia de ADN o el p rotein que codifica ió n, la manipulación y la entrega de determinada hace que el organismo huésped enfermo (ver Tabla 1.5.1). Secuencias de ADN fueron construidos con fragmentosAlto número de copias de plásmidos tienden a ser nogobiernos de los plásmidos de origen natural, prider control relajado de replicación. Estas reprimordialmente Escherichia coli plásmidos. Todos plásmido plásmidos relajados iniciar la replicación del ADN en un vectores contienen tres características comunes: un Rep proceso controlado por plásmidos codifican funciones licator A marcador seleccionable , Y un la clonación del sitio . ciones (véase el mecanismo de replicación y copia El replicador es un segmento de ADN que contiene Número de Contro l), y la réplica no se deel sitio en el que comienza la replicación del ADN (e ° penden sobre el inicio de host de replicación inestable origen de replicación o Ori ), Y que también enproteínas sintetizadas en el inicio de la bacteriana incluye generación de codificación es lo plásmido-enciclo celular Debido a que su replicación depende ARN y proteínas codificadas son necesarias para sólo en el host de replicación enzimática estable replicación El marcador seleccionable, necesario maquinaria, el número de copias de estos plásmidos para el seguimiento y mantenimiento de la presencia de puede ser mucho mayor, o amplificada, por tratar- pMB1). trabajo ADN recombinante contener uno de los Alto número de copias de plásmidos por lo general no lo hacen replicadores funcionalmente similares derivados de cuenta con ningún mecanismo para asegurar la correcta segregación plásmidos ColE1 o pMB1 (por ejemplo. Las mutaciones que interrumpen o desestabilizar ningún híbrido persistente formado en ori sin la maduración de imprimación . necesarios para el establecimiento de una persistente hiEl número de copias de estos plásmidos se regula Brid entre RNAII y la plantilla de ADN que por un ARN antisentido transcripción. Sin embargo. respectivamente. b Ensit Tem pe ratura s IVE. y el es un requisito previo para la maduración de la RNAII proteína RP. Todas las funciones enzimáticas para réplicay por lo tanto está sincronizado con la replicación del ió n de la lasmid p son proporcionados por el bacteriana el cromosoma bacteriano. tales como cloranfenicol- consumido A Número de copias es para el prototipo de plásmido. generalmente es dominante y es ción de las células que contienen el plásmido con progeneralmente un gen que codifica la resistencia a algunos Tein inhibidores de la síntesis. sino que serie pBluescript populares contienen un ori-ColE1 confiar en mezcla aleatoria de partición al menos ginebra. Interacción de rial de la población. replicación. al Ori . la segregación aleatoria de plásmido la COPEl plásmido de replicación comienza con transcripción s no es suficiente para asegurar ª en cada hija ción de un cebador de ARN aguas arriba del Ori célula adquiere una copia del plásmido. La transcripción RNAII se rompe por loci de partición ( par ) Que se cree que conRNaseH en el Ori secuencia Este procesado tituyen un mecanismo activo para la distribución de Imprimación RNAII se extiende por la DNA polimerasa copias del plásmido en las células hijas también han sido I de iniciar la replicación del plásmido. y los plásmidos pUC se derivan de una copia del plásmido para cada hija.1. Codifica un cebador de ARN. 1. (RNAII.) Por el anfitrión RNA pola mayoría de las bajas-el número de copias de plásmidos portadores de genes lymerase. permitiendo que las enzimas de replicación la mayoría de plásmido RS vecto utiliza en la rutina a ser comandado para la replicación del plásmido. y de estos plásmidos depende de las proteínas inestables codifica dos reguladores negativos de la replicación sintetizado en el inicio del ciclo celular bacteriana iniciación.el plásmido en las células. Reglamento de la identificadas. Además. el ción de los plásmidos de las células hijas. consumido no es conocida. véase la Fig. Los vectores plasmídicos que contienen replicadores derivados de estos plásmidos pueden tener diferentes copiar los números debido a la introducción de mutaciones en el replicador. el producto de la RP gen. CIS y trans su actuación. Como el número de copias huésped disminuye. pUC serie (pMB1 derivado) tiene copia n umbers de 1000-3000.5. la adecuada estructura de RNAII secundaria controla iniciación de la replicación del ADN y es responsable para la determinación del número de moles-plásmido Estructur El ARNi es complementaria exactamente com a culas por célula. IRNA. R NA I principios ROP proteína estabiliza la interacción y el acto de proteínas de ROP en el concierto para interceptar entre el IRNA antisentido y el cebador formación de la adecuada secundaria RNAII RNAII. El replicador de ColE1 es un nucleo de 600Bajo número de copias de plásmidos son por lo general de la ONUtid e fragmento de ADN que contiene el origen de der un estricto control . Mecanismo de replicación Col o espectinomicina. el extremo 5 de la transcripción RNAII. evitando que el número de copia plásmidos. Por ejemplo. Estas síntesis de proteínas Y COPIA DEL NÚMERO DE CONTROL inhibidores de la síntesis de prevenir la replicación proteínas de iniciación necesario para cromosómico Aunque hay muchos replicadores diferentes. RNAII es alargado a través y terque garanticen su mantenimiento en la bacaguas abajo de la minated Ori . La estabilización de los loci que codifican una una estructura específica secundario en la naciente mecanismo para la matanza de postsegregational RNAII transcripción con la plantilla de ADN de replásmido libre de células hijas y un sistema para resulta en la formación de un híbrido persistente sereficiente para resolver los multímeros de plásmidos de modo que interpolación RNAII y la plantilla de ADN tal que pueden ser adecuadamente repartió han sido RNAII queda emparejado con la plantilla de ADN identificadas. mantenida entre formación de la estructura secundaria específica 15 y 25 copias por célula bacteriana. La iniciación de la replicación replicación Ori ). IRNA base de Ambos plásmidos ColE1 y pMB1 son de alta pares con el extremo 5 de RNAII. proporciona una referencia única restricción ción sitios para el mapeo de restricción rápida del Marcadores seleccionables insertar. lo que representa Los marcadores se utilizan a veces en el plásmido selección para un aumento de 2 veces en el número de copias en plastio ns. si un en el clonaje y cierre de ADN extraño en Ning celda que contiene un plásmido derivado de pMBI es este sitio no interferir con otras características críticas posteriormente transformada con un ColE1-detor del vector. plásmido que contiene un gen que complementa Observar leuB . Interesa que. que estos plásmidos carecen de una único dentro de la secuencia del vector para que corte mecanismo para garantizar que cada plásmido en una célula Ting el vector con una endonucleasa de restricción replica una vez por ciclo celular. fragmentos. el ARNi / RNAII la interacción como resultado una mayor marcador que se pueda o ccasionally utilizado es el número de copias del plásmido. es un vector de plásmido se mantenga en un bacteriana suele ser necesario seleccionar para la presencia de celular al mismo tiempo. el pUC inmunidad a la infección por fago lambda serie de plásmidos tienen pMB1 replicadores que hacer (Lambda represor).Procesamiento de RNAII para formar el cebador está regulada por una segunda transcripción. ColE1 replicación requiere el formación de un cebador de ARN para iniciar ADN tesis SYN. Margen seleccionable replicadores de plásmidos es si dos plasres de la levadura y los sistemas de mamíferos son genereplicadores son mediados compatible . Por ejemplo. coli (Ver se dice que son incompatible uno con el otro. Adaptado de Gerhart et al. y segundo. 1994). Los sitios en el trans en otros plásmidos con el mismo cebador polienlazador son casi siempre diseñados para ser ARN. La incompatibilidad de ColE1 y pMB1 Toda y de pl como cont millas d vec tor s en un am ULT i pl e plásmidos es una consecuencia de dos hechos: primero. leuB E. Los plásmidos En los casos donde se necesita un vector que serán son generalmente incompatibles si comparten cualquier utilizada en ambos E. coli y de acogida a otro. Para los experimentos que implican la introducción de Incompatibilidad de plásmidos vectores plasmídicos en otros sistemas de bacteriaPara los experimentos que requieren que más de ría. otra característica crítica de ADN plásmido en estos huéspedes. y generalmente permite una gran cantidad de . por ejemplo. plásmidos derivados son incompatibles con una CLONACIÓN SITIO otro pero son compatibles con p15A Plasfrecuencias medias. Si no de forma estable pueden coexistir. coli no puede crecer MID con intactas pMB1 replicones. que se inicia aguas arriba de la Ori . las células seleccionadas para contener el polienlazador asegura que la enzima apropiada Plásmido ColE1 por lo general han perdido la pMBI sitios estará disponible para la clonación de ADN más plásmido. recesivo no contienen un intacta RP generación e. Proc ess ción adecuada de la AII RN transcripción depende de la formación de un híbrido entre RNAII persistente y el Ori Un DN te mp La Te. Además. Vectores plásmido de levadura y vectores plasmídicos y por lo tanto.La gran cantidad de sitios en la RIVED plásmido. clonación sitio (MCS) o polienlazador clonación de reque la replicación del ADN plásmido de estos plásmidos región que puede incluir> 20 en tándem dispuestas Se negativamente controlada por IRNA que actúa en sitios de endonucleasas de restricción. Por lo tanto.iniciación de ADN que lleva línea de síntesis Figura 1. pertenecen a la misma incompatibilidad para la expresión en células de mamífero cultivadas).1 ColE1 la replicación de iniciación y el control de número de copias. tal como levadura o células de mamíferos. La copia NUMBE r de plásmidos ColE1 está determinada por el equilibrio entre éxito RNAII eventos de procesamiento y los inhibida por RNAi. Struhl. RNAII (en negrita). el dúplex de ARN / ADN se mantiene en el Ori y R Nase H puede escindir la transcripción RNAII para generar el cebador para la síntesis de ADN. a continuación. es función requerida para la regulación del plásmido necesario para el vector de plásmido para llevar a seleccionarreplicación Por ejemplo. Si la transcripción IRNA forma un dúplex con RNAII. Si las formas adecuadas RNAII estructura secundaria. y la selección para mutación adicional (s) en el origen son la principal crecimiento de estas cepas en ausencia de leucina factor en el número u ARLT-copia de alta (1 000 a permite el aislamiento de lonies co transformada con un 3000) de esta serie plásmido (K. El cebador de ARN se deriva de procesamiento Pro de una transcripción. RNAII no puede asumir el estructura secundaria necesaria para crear el híbrido persistente en el Ori una segunda m aturat de iones de la AII RN imprimación se inhibe. ColE1 y pMB1marcadores capaces de ambas máquinas.5. en ausencia de leucina. IRNA es complementaria a el extremo 5 de RNAII. IRNA. Dos plásmidos erally distinto de los utilizados en E. sin publicar. Grupos . con la misión por la Annual Review of Microbiology . Una vez la formatio n de las colonias azules en Xgal / IPTG el tipo de vector requerida se determina entonces placas indicadoras. En las tipos completamente diferentes de los vectores que está ld ser fondo genético apropiado. como No {0}1. Otra dominante seleccionavector plasmídico. Sin embargo. ejemplo. Los genes de codificación Principal resistencia a unao el análisis de ADN del inserto. vectores de medias. T7. 1 bacteriófagos ARN polimerasa también está presente. frecuencias medias que contienen ADN de inserción. lo que permite la rápida identificación de ras. si el ( ) Ha hecho posible para cribar rápidamente ONU TI 1 5. coli. Vectores tienen los lazos del replicador. 40 y cebadores.1 que contiene el plásmido se crecen en la selección Algunos polylinkers están rodeados por 8-pb-cortador tiva medio. y la correctaen placas indicadoras Xgal / IPTG. Clonación en estos polylinkers decidir sobre un vector particular depende impide la producción de un funcional lacZ tanto en los detalles del vector auxiliar FEAfragmento. la producción de utilizado para la generación de grandes cantidades de ADN. Las secuencias que flanquean el directamente debe haber una forma de seleccionar para el plásmido-CONsitio poliligador son a menudo útiles para la manipulación Taining células. El mo st común ser utilizado. Típicamente. que pueden ser utilizados para con el ADN del plásmido mediante la técnica decebado reacciones en cadena de polimerasa (PCR) o se describe en y luego se sembraron en LB Secuenciación de ADN reacciones. en el lacZ gen fragmento. y seleccionable También se han desarrollado que permiten la selección directa Marcador ió n de los plásmidos Con Taining inserta por ubicación Vectores plasmídicos PARA del poliengarce en el ccdB (Control de la célula producción de las muerte) gen que causa la muerte celular en E. Sólo las células bacterianas cualquier fragmento de ADN insertado en el Ker polylin. sitios están flanqueados por secuencias para los cuales existe kanamicina y cloranfenicol son los más oli son complementarios disponibles comercialmente comunes indicadores bacterianos seleccionables para plasgonucleotides. o-T3-promo de clones es necesario. el fenotipo de resistencia a antibióticos sitios de restricción. viating la necesidad de histoquímica y genéticos Con el fin de hacer más fácil para identificar Plasmétodos de detección. tetraciclina.A fin de garantizar que un vector plasmídico flexibilidad en la manipulación e clo º ne ADN. para la rutina ERS que flanquean los sitios de clonación polienlazador. Estos experimentos subclonación el advenimiento de la PCR promotores puede ser utilizado in vitro o in vivo. Las funciones especializadas de plásmido ejemplo de esto es la inserción del polienlazador de vectores son generalmente la clave para seleccionar el muchos vectores de clonación básicos. para los ex amplia el tipo de promotor utilizado para plásmidos que contienen insertos como colonias blancas expresar una proteína recombinante. De las Naciones Unidas de TI un 0. al super-infección de . oba partir de ADN insertado en el polienlazador. Tales cebadores son ONU TI 1. Sin embargo. o por -galactosidasa activa la enzima que da lugar a realización de una pantalla de dos híbridos en levadura. Muchos polienlazador antibióticos tales como ampicilina. por ejemplo a la inversa M13. a través de un número de correo de los transformantes de larg para producir grandes cantidades de transcripciones de ARN identificar las posibles moléculas recombinantes. la ragment f lacZ permite fo r formación de un expresar una proteína de fusión en bacterias. ADN de cadena sencilla La interrupción de la ccdB gen por Intr oducción de una inserción en el poliengarce permite que las células Los plásmidos se han desarrollado que contienen sobrevivir. y por lo tanto recombinantes sólo crecerá un origen de replicación del fago filamentoso en bajo iciones cond donde el ccdB gen es el exAdemás de un plásmido Ori .{/0} {1} {/1} Estos sitios se producen Tipo conferido es dominante sobre el antibióticoinfrecuentemente en ADN y así permitir la fácil fenotipo sensible de células que no poseen la escisión de un fragmento intacto en SERT del el vector de plásmido. Muchos vectores plasmídicos se han desarrollado a ser baja generación o cuando de un gran número con bacteriófago SP6. 14 como plásmidos. Por ejemplo. polienlazador. es tomada por un d mantenido en células bacterianas. los polylinkers El principal factor en la elección de un plásmido de algunos vectores han sido diseñados de manera que vector es de comprender y anticiparse a la exintroducción de ADN en los resultados poliengarzadores experimentos para que el clon recombinante en un fenotipo puntuable. las células se transforman 20. 8 placas que contienen el antibiótico apropiado (ver herramientas útiles para la amplificación o secuenciación de recetas en ). Estos "fagémido" A presió. la serie pUC para vector correcto para un experimento.n vectores ( ) Pueden ser cultivadas y reproducidas UNI T 1. 6 puede codificar una función que va a inhibir la célula método simple fo r después de la expresión crecimiento o matar la célula huésped. En el vector reportero. o incluso q ya sea llevado por el huésped bacteriano o codificado se toda la co repique región. no se transforman así orientación opuesta de modo que es posible y con frecuencia dan rendimientos más bajos de ADN. Devel UNI T 8. gen reportero para la inserción del promotor La cantidad de proteína producida exterior fragmento || fragmentar En los vectores que están diseñados para ex será determinado por tanto la tasa de transcripción depresión en células eucariotas. fueron Mientras que las características de la expresión de la proteína o la secuencia de fusión impide la función de la Los sistemas varían considerablemente. Hay por lo general (+) y () versiones la capacidad de seleccionar y / o pantalla para las inserciones. coli son. esbozado para la expresión de proteínas en E. además de regular gen. Por lo general. Fusiones de genes proporcionar una rápida y ONU TI 9. Cuanto mayor sea la copia numcleotide mutagénesis dirigida ( ). pWE15. porque ª de acogida e celu lar maquinaria hacer más fácil la construcción y ulation manip de la recooptado para producir grandes cantidades de la paraportero de genes fusiones. 1 bre el ADN del vector se produce más.5. Si va a ser necesario manipular pUC19 (Fig. donde un promotor de la interextranjera proteína. al extremo amino de en el vector de expresión en sí.2) son ejemplos de fagémidos la secuencia clonada posterior a la inserción que incorporan el fago filamentoso f1 Ori . 4 utilizar más pequeños vectores. coli incluyendo cloranfenicol acetiltransferasa. en el poliengarce. donde el fago Ori es en Plásmidos grandes. mayores de 15 kb. el tamaño final del vector.ELEGIR un plásmido vector una célula que contiene el plásmido con un tipo salvaje Algunas de las características básicas a considerar cuando se fago auxiliar. fig. más cuando se inserte Durante muchos años. plásmidos que llevan una lambda experimentos donde se espera que la eficiencia de la clonación fago cos sitio (por ejemplo. Esto es necesario Los vectores plasmídicos se han diseñado para simsario. Cuando Ized característica de vectores plasmídicos. el 5 untra NSLA te d la región y ATG e ar Lugar Este promotor se apaga en presencia proporcionada por el gen de interés. considere ª bo lo pBluescriptI. Expresión de un marcador. Vectores plasmídicos PARA común a todos ellos. existen dos tipos de reportero de fusitio de clonación está aguas abajo de un pro-inducible nes.5. Hay una variedad de genes indicadores usados lated altamente promotores inducibles. En la traducción promotor (CVR).3). y / o la proteína extraña ( ). las propiedades básicas proteína en los ensayos pertinentes. y seleccionar un vector plasmídico incluyen el tamaño de ADN monocatenario (ADNmc) se produce y se el vector. DESVENTAJAS ssDNA producir a partir de cualquiera de cadena de ADN. El la elección de un vector plasmídico. coli vectores de expresión es el híbrido trp / lac es proporcionada por el gen marcador. de estos vectores. el polienlazador la proteína extraña a partir del promotor trc es sitio de clonación está localizado directamente aguas arriba del inducida por la adición de IPTG. Selección o pantallas para la identificación ió n de los clones recombinantes son útiles para la ex Vectores cósmidos. el codón de iniciación ATG E. exprepatrón conferida por un promotor en particular. y secretada. el gen represor es construcciones pueden fusionar una gran parte. el polienlazador. pero desarrollo de protocolos de secuenciación y mutagénicos alto número de copias vectores puede no ser aplicaque el uso de doble cadena de plantillas ha hecho ble a todas las situaciones (ver Mecanismo de Replila producción de ssDNA una menor frecuencia utilción y control de número de copia). Para Sider. el fago Ori ser co m es un ct iv e. su número de copias. pBluescriptII. muchos E. fusiones de transcripción y traducción. promotor. . ah plan de EAD para asegurarse de que Vectores plasmídicos PARA n los sitios ecessary seguirán estando disponibles en el CLONACIÓN grandes insertos polienlazador. 1. de hecho estos del lacI represor. una poliadenilación ción del gen y la eficacia de la traducción señal está situado aguas abajo del reportero del ARNm. Uno de los promotores comúnmente utilizados en Por fusiones transcripcionales. la cantidad de cizallamiento de que puede EST se utiliza para accionar un gen marcador fácilmente anotó ser tóxico para la célula. y fagómido pBS sitios están presentes en el poliengarce y el orden vectores derivados de lo general clonin g vector de los sitios. Los vectores de expresión son FUSIONES gen reportero generalmente diseñados de tal manera que la producción del p rotein extranjera está fuertemente regula aislados. 1. sión vectores están configurados de modo que el polienlazador En general. que contiene el operador laco fusiones. Por consiguiente. ssDNA era el sustrato de elección la planificación de un experimento y siempre que sea posible para la secuenciación del ADN ( ) Y oligonucleótidos ONU TI 7. 5. pRS303. marcadores capaces. Etiqueta SEcuencias puede estar situado 5 o 3 para el poliYe como t pl como midv ec t o s co nt a en el ba sa mí enlazador. Muchos vectores de levadura las secuencias de etiquetas o fusión para permitir la eliminación "lanzadera" son vectores que pueden ser mantenidos en de estas secuencias de la proteína purificada. pero no replicador de levadura. Tanto el ARS y 2 (μ) m vectores promediocon sitios específicos de la proteína de escisión adyacentes a edad 10 a 30 copias por célula. ya sea la creación de amino-o carboxi-terminal características SIC E. El epítopo FLAG. y otros elementos del la proteína recombinante se requieren. si el ensayo será marco de la fusión a la proteína en favor de los intereses en los tres realizado in vivo o in vitro. de manera autónoma RepliONU TI 16. Vectores plasmídicos PARA Los vectores plasmídicos que llevan un seleccionable EXPRESIÓN EN CULTIVADAS marcador que funciona en células de mamífero son . Un ejemplo de un reportero De las Naciones Unidas de TI S 9. 6 .9 7C codón uptsream del sitio de clonación polienlazador.5. Estos vectores tienen una E.6). generalmente clonado Hay una amplia variedad de vectores de levadura los genes de levadura que se utilizan para complementar mutación disponibles que tienen una amplia gama de funciones especializadas Figura 1. se dependiente de la cepa. y verde (también eficiente del sitio de unión al ribosoma y el inicio ATG ver ).vectores de expresión de proteínas están diseñados para opluciferasa. coli (Por ejemplo. y la clonación sitio ( ). etiquetado o proteínas de fusión que facilitan purifi- Vectores plasmídicos para la levadura catión de la proteína recombinante. El replicador. Para muchos experimentos. coli Plas- A mediados de réplica. y Hay dos tipos principales de replicadores usados UNI T 1 0. son generalmente el vectores de la elección. que se utilizan para la introducción para restaurar la capacidad de crecer en ausencia de de genes en el cromosoma de la levadura. y nes en una vía biosintética.-Gluteriales células. ARS que contienen plásmidos frepurificado utilizando una columna de afinidad adecuada cuentemente contienen secuencias de levadura centroméricas a diseñado para unirse firmemente la etiqueta o la región de fusión. los sitios de clonación en el polienlazador son elección del gen reportero dependerá de la célula diseñado de modo que es posible hacer una entipo o nismo org. senal-etiquetados proteínas de fusión. Seis polihistidina marcador seleccionable.5. 4 los residuos ( ). la levadura seleccionarreplicador de bacterias. por lo tanto fácilmente manipulable adn plásmidos bacterianos. se muestra en la Figura 1. Tagged o los cromosomas y la levadura natural 2 (μ) m plasproteínas de fusión puede ser rápida y eficazmente replicador de media. los altos niveles de pureza marcador seleccionable. la expresión de proteínas recombinantes prose lleva a cabo. 7 algunas de las secuencias que se añade a cando las secuencias (ARS) derivados de la levadura proteínas para ayudar en la purificación.6 Mapa de pRS303 (adaptado de Sikorski y Heiter de 1989. Escuelas S. sí e Esta característica puede llegar a ser esencial si la etiqueta Fig. No es necesario para el plásmido proteínas en la levadura. y algunos vector reportero también tendrá que ser compatible vectores de expresión están diseñadas para crear con el sistema. Por lo tanto. vector pEGFP. con frecuencia pMB1 derivados. 1. como pUC. tienen una uracilo a una ura3 levadura. a diferencia de la mayoría de seleccionar las bacterias Los marcadores seleccionables en levadura son para el marcadores. cerevisa e y E. datos administrativos o cualitativa que se desea. ONU TI 1 3. la mayoría de los marcadores recesivos parte. la integración de las secuencias en el vectores utilizados en estos ensayos para llevar a un mamífero de genoma de la levadura. en vectores de levadura plásmido. alcalina secretada timize traducción de la proteína extraña en bacfosfatasa. Estos vectores de expresión incluyen un proteína fluorescente curonidase. con por misión).-galactosidasa. y la clonación de fragmentos muy grandeIan marcador seleccionable o para replicar en mammentos (cientos de kilobases) de la genómica las células de Malí. la levadura inteEl URA3 marcador transportado en un plásmido se utiliza rejilla plásmido vectores. ciones-por ejemplo. 1 1B glutatión(s) -Transferasa proteína ( son. y si-cuantitativa marcos de lectura. un replicador de levadura. coli vectores-replicante. Por ejemplo. El Por lo general.5. garantizar su mantenimiento estable en la población Muchos vectores de expresión de proteínas se crean ió n de las células. Por el contrario. la hormona del crecimiento humano. 1990. coli muchos o no se puede replicar y mantenerse de forma estable las bacterias no pueden ser eficientemente transformado por en la cepa particular. pcDNA3. Sin embargo.5. algunos tienen estos casos apareamiento bacteriano se utiliza para introducir una gama de huéspedes estrecho y sólo puede replicarse en una ADN plásmido en el huésped deseado bacteriana. pBR322 es uno de los vectores de clonación clásicos . Desafortunadamente. 1.8 Mapa de pRR54 (un dapted de Rober ts et al. y el ensayo pertinente son algunos vectores plasmídicos que llevan el simio Figura 1.7). la cantidad de un antibiótico usado para Figuras 1. algunas cepas bacterianas útil para técnicas particulares descritas en el son inherentemente resistentes a los antibióticos particulares. 1. El El método preferido para la introducción de plásLo primero a considerar al seleccionar un plásmido ADN mediados en células huésped bacterianas varía ampliamente vector para el uso en un noE.. Por ejemplo. y la única manera de dice. El tra (O estándar de muchas E. alojar donde el vector se mantiene y se pRR54. con por misión). el ADN del plásmido se tran en sfected células o la generación de células de mamíferos estable las células de mamíferos.5. Secuencia en Sutcliffe. coli huéspedes bacterianos.1.. coli vectores no puede ser principalturba ) Genes codifican el trans Proteínas de acción contenidas en otras bacterias. De las Naciones Unidas de TI S 9. Sin embargo.11 mapas actuales de Plasseleccionar contra no plásmido que contienen células es frecuencias medias que están en uso generalizado o son ejemplos suele ser mayor que la cantidad utilizada para E.2-1.9 Mapa de pBR322 (Bolivar et al 1977. este manual. la ColE1 manipulado a una bacteria receptora requiere replicadores tipo tienen un rango de hospedadores. mientras que otros son profesionales miscuous El apareamiento para transferir un vector plasmídico a partir de un E. algunos SPE-gram-positivos ¿Llamaron? " oriT donde el ADN se escinde y CIES también). 5 células depende de si el experimento en1.Células de mamífero necesaria para la generación de estable transEl tipo de vector que se utiliza en mamíferos líneas génicas ( . por lo tanto Escuelas CIS un d trans -Actuando funciones.9 5 distribución contiene un constructo adecuado para la expresión en Marcador Muchos vectores de mamíferos no pueden reprecélulas de mamíferos se pueden utilizar en transitoria comolicate en células de mamífero. no sería tiempo más tarde (24 a 96 h). Sin embargo. A diferencia de E.5. Además. Cualquier vector plasmídico que es muchas bacterias gram-negativas (especies bacterianas y en que se moviliza debe contener el CIS De acción sitio el caso de RSF1010. coli de acogida es la de si con la cepa acterial b. transferencia está en itiated. y durante un período de Lin es llevar a la construcción de interés ( varias semanas el ADN de interés se selecciona UNI TS ). EN EL licators tienen diferentes rangos de acogida. un número de necesaria para transferir el ADN plasmídico a partir amplio rango de hospedantes.5. cepa específica. han sido bien caracterizadas y localizado en un plásmido auxiliar que es distinta de utilizado para construir vectores que pueden replicarse en el vector de plásmido. Con el fin de generar un mamífero estable involucra transfección transitoria en mamíferos línea celular. como replicadores y RK2 una bacteria a otra. Tenga en cuenta que la tendencia en el desarrollo por lo tanto es importante para determinar si el de vectores es para incluir funciones múltiples en una marcador seleccionable transportado en un vector plasmídico único vector. las células se recogen algunos en el genoma de los mamíferos. y son generalmente RSF1010. las categorías vector descrito. fig. el vector de plásmido mantener el ADN de interés y el seleccionable llevando el ADN de interés se transfecta en marcador es para el vector de integrar al azar células de mamíferos. Prácticamente cualquier vector plásmido que conpara basado en la expresión de la transmisión vectorial 9.5. y muchos de estos ejemplos abarcan es funcional en una cepa particular. Los genes de resistencia a antibióticos se utilizan como SE- MAPAS de los plásmidos marcadores en lectable no E. y puede ser fácilmente introducido en las células huésped. En los ensayos de transitorios. E. fig.8).5. Figura 1. 1978). coli de los plásmidos cuyas funciones especiales que sean selección. y puede replicarse en una amplia variedad de huésped (por ejemplo. Representante plásmido diferente procedimientos químicos o electroporación. 14. 1978). {0}Otros usos:{/0} pBeloBAC11 es un ejemplo de la familia de características de la región de clonación son (1) y T7 bacteriana-artificial-el cromosoma vectores basados SP6 secuencias promotoras que flanquean la clonación . Transcripciones de ARN el poliengarce mismo pero en orientación opuesta cualquier DNA clonado en el polienlazador así puede cione Bajo condiciones approp riate (ver ser producidas por escorrentía transcripción in vitro. el pBluescript SK () vector tivates y permite que las colonias teniendo plásmidos (Fig.. Secuencia la región alfa del lacZ gen permite en Sutcliffe. oris y repe los genes son necesarios para Ori y el amplificador gen de resistencia a icillin permiten replicación unidireccional del plásmido. permitir que el ADN para ser cortado y envasado en 1. las colonias que llevan plásmidos pWE15 es un ejemplo de un vector cósmido que contiene un fragmento insertado en el utilizado para la clonación de fragmentos de ADN de 35 a 45 kb colonias poliengarzadores forma blanca en lugar de azul (Véase la figura 1..5.3. Hay una sola única Bam HI clonación plásmidos recombinantes confieren resistencia a la ampicilinasitio flanqueado por secuencias del promotor de T3 y T7. Transcripción ERS son los mismos que los utilizados en el M13mp ción de estos promotores se lee en el serie (fig. No 1 sitios que flanquean el sitio de clonación puede Figura 1. 1983). B.5. coli ge nome. Wahl et al. 1. utiliza para identificar cósmidos solapantes para croONU TI 1. El cos sitios seres. 1. Bolívar et al. 1977.2) mantener un muy alto número de copias cabezas de fagos por el apropiado lambda pro(1000 a 3000 por genoma). La F1 (+) fagos filamentosos los genes que codifica la resistencia a la ampicilina y origen de replicación en pBluescript SK permite + Tetraciclina La inserción de ADN en una restricción para la recuperación de la hebra sentido del lacZ sitio en cualquiera de los genes de resistencia a medicamentos por lo general INACgen como ADN de cadena simple. insertado en el lacZ alfa región. f1 (). y replicación y selección en bacterias.4 para obtener una descripción).insertado en la región alfa del lacZ ge ne una segunda partir de la cual muchos otros vectores se derivan.5. El derivado de ColE1 licator. Estos plásmidos pMB1 derivados (véase la fig. La pol il i nkbacteriófagos ARN polimerasas. ONU TI un 0. El SV40 parABC mente loci apuñalar a mantener el número de copias promotor (incluido en el SV40 Ori ) Que acciona en uno a dos por E. 4 pBluescript es un fagémido comúnmente utilizado caminar mosome y la construcción de cósmido vector de clonación que contiene un poliengarce encontigs. Esto T3 y T7 secuencias promotoras que flanquean el contiene un replicador amplificable y pMB1 sitios de clonación.11 Mapa de pTrc99A. De tipo salvaje y proteínas. Ther e ar e dos el gen de la neomicina fosfotransferasa permite sitios únicos de clonación ( Hin dIII y Bam HI) enselección en células eucariotas.10) con el origen f1 en la dirección opuesta con tales inserciones a ser identificados por su orientación. C. La posición del poliengarce en (Véase la figura 1. identificación de insertos basado en un azul / blanco pUC19 pertenece a una familia de plásmido vectorcolor de la pantalla bajo la s condiciones adecuadas. facilita la recuperación del incapacidad para crecer en medio con ese antibiótico otra cadena.2). Además salvaje producción de sondas de ARN correspondiente plásmidos de tipo confieren un LacZ fenotipo de a los extremos del ADN inserto.9. res que contiene un poliengarce insertado dentro Los promotores de T3 y T7 son reconocidos por la región alfa del lacZ gen. ).).5.. importancia y puede ser amplificado con cloranfenicolEstos promotores son particularmente útiles para procol (Norrander et al. potencialmente ser utilizada para extirpar una inserción intacta genes esenciales que componen el factor F reprefragmento del vector. 1987. células JM101.5. pUC19 y pUC18 tienen polienlazador desde ambos lados. y éstas pueden ser + células apropiadas (por ejemplo.. 1. de modo que el plásmido (véase la Fig. coli . oriT . El gen EGFP es una modificación del medio silvestre replicación y par codifica un lugar que estipo de buenas prácticas agrarias para garantizar la expresión en mamíferos hances estabilidad del plásmido. 1 9 9 6). y CIES. al. 1.8. coli y un mediados contiene bacterias. licator para la propagación en E.). para 0.5. gen de resistencia a la kanamicina para la selección de bacLa serie pTrc del plásmido de expresión vectorrios.6. para II. 1. actividad promotora en células de mamíferos a través Ori para la producción de DNA de cadena simple. coli y se utilizan puede ser escindida por enzimas específicas.. y el rrnB 1989). Ya ng et un l.5. es decir. para I. tiene mutaciones silenciosas base que correspuede ser acoplado en diversas bacterias gram-negativas SPEponder a humanos de uso de codón de preferencias. siempre y cuando la movilización adecuada secuencias que flanquean la región de codificación han sido maquinaria se proporciona en tra ns porque conconvierte en una traducción consenso Kozak mantiene la origen de la transferencia conyugal. inserción en tres marcos de lectura. 1992).en el replicador de F bajo número de copias factor de sitios. La ampicilina pEGFP-1 es un vector seleccionable para el monitoreo de gen de resistencia para la selección en E.5. el lacZ de unión a ribosoma manipulatio n de ADN en Saccharomyces ceresitio (RBS). un pUC-dea ampicilina / carbenecillin selección de plasRIVED Ori para la propagación en E. Shizuya et. y la pro-T7 fluorescencia de la proteína verde fluorescente promotor de secuencia para la transcripción in vitro de (GFP) derivado (Clontech. trfA la olylinker p puede ser evaluada sobre la base de EGFP codifica trans -Actuando funciones necesarias para actividad. Este plásmido las células. el MCS de pUC18 que permite visiae (Véase la Fig. Roberts et al.. (2) No Me sitios de restricción que flanquean el clon (Ver fig. permitiendo un F1 Ori para la producción de ssDNA. . Estos vectores tienen una columna vertebral derivado terminadores de la transcripción (véase polienlazador SEdesde pBLUESCRIPT en que las características cuencias a continuación el diagrama vectorial de la figura. L a V del Tratado CE o en contra ta ins un neo pRR54 es un ejemplo de una amplia gama de hospedadoresmicina aguas abajo de genes de resistencia del SV40 vector plásmido movilizable. coli .. Este vector conpromotor temprano para la selección de forma estable transdistribución contiene replicador y stablilization secuencias deformado células de mamífero. Tiene un polienlazador están derivadas del RK2 naturales de amplio rango de hospedantes situado aguas arriba del gen EGFP.5. E. para || Tras el término se indica el número de partos. BAC Ing sitios de escisión potencial de la inserción y vectores se usan para la clonación de ADN a gran fragmento (3) y la presencia del loxP una segunda CoSN los sitios que tos (100 a 500 kb) en E. 1. parB .Y parC gen s son e ° utilizarse como puntos de referencia fijos en la construcción de un la restricción ordenada por el mapa de fin de etiquetado y otros vectores plasmídicos. . incluyendo un ColE1 repdigestión de restricción parcial. ver fig. etc. generado por escisión a loxP o CoSN puede ser oris .5. función de secuencias promotoras introducidos en oriV es el origen he getative ción de la réplica. . coli . 1990. repe . Sikorski y Hieter. y 306) se ha creado para facilitar trp / lac promotor. El vector columna vertebral contiene plásmido lleva el gen de lactamasa. ADN insertado en el polienlazador. Los extremos comúnmente en las estrategias de mapeo del genoma. La F1 Ing. res facilita la expresión regulada de los genes en Una serie de vectores lanzadera levadura (pRS304.4. El iniciación de la señal. Estos vectores de llevar el híbrido fuerte 305. cuencias clonado en este vector. 1988. y alto nivel de expresión de la proteína-codificación SEplásmidos. E. 134:1141 corriente de citomegalovirus fuerte potenciador de 1156. y Boyer. terminado por una señal de poliadenilación de SV40 MC. en espede los lacI alelo en el plásmido asegura comq cepas específicas de levaduras. la hormona del crecimiento señales de terminación de genes para El ARN antisentido de control en las bacterias. F. Betlach. El Regulada tac promotoras útiles para los vectores características de este vector incluyen un neomicina de rela expresión de proteínas no fusionadas y fundida en ES resistencia genética impulsada por la temprana SV40 proEscherichia coli . Este vector también contiene algunas de las características más estándar de .7). SN 1978. Microbiol. Estos plásmidos contienen un la represión completa del híbrido trp / lac promotor secuencia de replicación autónoma.. Rev. para más detalles). E. promotor (contenido dentro del SV40 Ori )Y Bolívar. Gene 1. .{/0}{1} {/1} Bacteriol. pRS303 coche proteínas de fusión (usando uno de los sitios de clonación rios de la HIS3 marcador que complementa un noen el marco de traducción correcto).. fagos. H. Los miembros de la expresión de proteínas sed unfu (resultante de esta serie de plásmidos difieren sólo en la levadura inserción en el Suboficial I sitio) o para la expresión de marcador seleccionable incorporado. PJ.5. {0}J. NS.5. Greene. Rodríguez. así como durante la clonación y el crecimiento en cualquier cepa huésped una secuencia de centrómero... RL. ACY y Cohen. Gene 69:301-315. Que asegura (Ver Amann et al. y Simmons. debido a la inclusión del 2:95-113. El vector puede replicarse como un episoma Chang. mantenimiento estable en células de levadura. HW 1977. OR 1994. KJ 1988. 48:713-742.. y Abel. Heynecker. CEN6 . Wagner.necesario fo r replicación y mantenimiento en 1. para la selección en células de mamífero (véase la fig. La presencia volver his3 mutación cromosómica. y caracterización de amplificable mulitcopy Vehículos de clonación de ADN derivados de la P15A El sitio de clonación poliengarce se encuentra abajo miniplasmid críptica. Oc hs.11).. SV40 Ori .1 es una clonación seleccionable y exAmann. LITERATURA CITADA pcDNA3. Construcción de vectores de clonación útiles.construcció en las células que expresan el antígeno T de SV40 grande. Annu. B. Estos vectores son igualmente útiles para levadura se han introducido.Estrechamente depresión vector para el uso en células de mamífero. secuencias del promotor y aguas arriba de las especies bovina Gerhart. Además.