ANUARIO DE INVESTIGACIÓNEN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES ANUARIO DE INVESTIGACIÓN EN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES A N U A R I O D E I N V E S T I G A C I Ó N E N E T N O M E D I C I N A , M E D I C I N A S C O M P L E M E N T A R I A S Y U T I L I Z A C I Ó N D E P L A N T A S M E D I C I N A L E S 2008 2008 José Federico Rivas Vilchis, Ed. J o s é F e d e r i c o R i v a s V i l c h i s , E d . ISBN : 970-31-0546-7 1 2 ANUARIO DE INVESTIGACIÓN EN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES 2008 José Federico Rivas Vilchis, Ed. 3 4 Rector General Dr. José Lema Labadie Rector de la Unidad Iztapalapa Dr. Oscar Monroy Hermosillo Director de la División Ciencias Biológicas y de la Salud Dr. J. Francisco Flores Pedroche Jefe del Departamento Ciencias de la Salud Dr. Rubén Román Ramos 5 ANUARIO DE INVESTIGACIÓN EN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES 2008 6 COMITÉ EDITORIAL Editor ejecutivo José Federico Rivas Vilchis Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa Editores asociados Fabio de Sousa Menezes University of Dublin, Ireland Raúl G. Enríquez Habib Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México; México Enrique Jiménez Ferrer Centro de Investigación Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social, México Rubén Román Ramos Universidad Autónoma Metropolitana – Iztapalapa, México Max Sánchez Araujo Universidad Francisco de Miranda, Coro, Venezuela Diseño y formación: Miguel Linerio Morales © Universidad Autónoma Metropolitana – Iztapalapa 2008 Todos los derechos reservados Cuarta edición 2008 ISBN: 970-31-0546-7. Rivas Vilchis, José Federico Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa Tels. : +55-58044920, +55-58044728. FAX: +55-58044727 Dirección electrónica:
[email protected] Hecho en México Contenido Parte I. Plantas medicinales: utilización médica Toxicological Study on Bikihwan: the oriental medicinal prescription for anticancer therapy. Seung-Hoo Yoo, Dae-Hwan Youn, Jungsun Kim, Yeon-Weol Lee, Chong-Kwan Cho, Hwa-Seung Yoo. 11 Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry, planta medicinal mexicana con potencial terapéutico. María Gabriela Rojas-Bribiesca, Rubén Román-Ramos, Jaime Tortoriello-García, Macrina Fuentes Mata, Margarita Avilés Flores. 19 Diabetes mellitus y plantas medicinales en México. Francisco Javier Alarcón-Aguilar, Erica Hernández Galicia y Rubén Román-Ramos. 27 Parte II. Estudios de actividad biológica y farmacológica Chemical composition and cytotoxic activity of Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae). Patricia Fontes Esteves, Ricardo Machado Kuster, Nancy dos Santos Barbi, Fabio de Sousa Menezes. 41 Actividad hematopoyética de Amphipterygium adstringens (Cuachalalate) in vitro e in vivo. Rodolfo Velasco-Lezama, Catalina Pliego-Villanueva, Rafaela Tapia-Aguilar, Elisa Vega-Ávila y Rubén Román-Ramos. 49 Rastreo de actividad antifúngica en especies medicinales, a través de estudios de microbiología. Ofelia Romero-Cerecero, Rubén Román-Ramos, Enrique Jiménez-Ferrer, Jaime Tortoriello- García. 57 Antioxidant activity of isoquercetin and Hyptis fasciculata on yeast cells. Carmelita Gomes da Silva, Raul Raulino, Debora Malta Cerqueira, Marcos Dias Pereira, Anita Dolly Panek, Joaquim Francisco Mendes da Silva, Elis Cristina de Araujo Eleutherio, Fabio de Sousa Menezes. 69 Actividad antibacteriana de las semillas de Plantago major L. Elisa Vega-Avila, Shindu Irais Gómez-Covarrubias, Rafaela Tapia-Aguilar, Rodolfo Velasco- Lezama. 77 7 8 Parte III. Efecto placebo en terapéuticas complementarias ¿Determina el diseño del placebo los resultados de los ensayos clínicos de acupuntura? Meta-análisis de 100 ensayos clínicos. Max Sánchez-Araujo. 83 Efecto placebo y acupuntura: ¿mecanismos comunes en analgesia? Miguel J. Reyes-Campos, Livia G. Díaz-Toral, José L. Flores-Sáenz, José F. Rivas-Vilchis. 89 Apéndice Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial: Principios Éticos para las Investigaciones Médicas en Seres Humanos 97 9 Prefacio Diversos retos que afronta la salud de la humanidad -algunos de ellos resultado del aumento de la expectativa de vida, el sedentarismo, la polución ambiental y la corrupción de los hábitos de alimentación hacen necesario que los diversos estados nacionales procuren la utilización de todos los recursos a su alcance para cubrir las necesidades sanitarias de sus poblaciones. En esta cuarta edición del Anuario de Investigación en Etnomedicina, Medicinas Complementarias y Utilización de Plantas Medicinales – 2008 se ponen a disposición de los lectores interesados investigaciones en el campo de las medicinas complementarias. Este número del anuario se recogen diversos estudios llevados a cabo en instituciones de investigación y educación superior de diversos países del mundo sobre la utilización clínica y la farmacología y química de plantas. En la primera parte se presentan tres estudios enfocados en el empleo médico de las plantas medicinales. A continuación se presentan cinco estudios relativos a la composición química, actividad biológica y farmacológica de plantas medicinales. Por otra parte, el estudio del efecto placebo tiene inmediatas implicaciones clínicas, metodológicas y éticas. Los mecanismos biológicos y fsiológicos del efecto placebo son ahora estudiados por importantes grupos de investigación en diversos países. La utilización del placebo en la investigación en medicinas complementarias genera problemas metodológicos que siguen siendo motivo de continuas discusiones teóricas. Algunos de estos aspectos se discuten en la tercera parte de este anuario de investigación. Finalmente consideramos importante la difusión de la versión más reciente de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. La World Medical Association accedió con extrema gentileza a cedernos los derechos para reproducirla. 10 11 Toxicological Study on Bikihwan: the Oriental Medicinal Prescription for Anticancer Therapy Estudio toxicológico de Bikihwan: la prescripción para el tratamiento del cáncer en medicina oriental Seung-Hoo Yoo 1 , Dae-Hwan Youn 2 , Jungsun Kim1, Yeon-Weol Lee 1 , Chong-Kwan Cho1, Hwa-Seung Yoo 1 *. 1 Department of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, South Korea 2 Meridian &Acupoint, College of Oriental Medicine, Dongshin University Autor para correspondencia: Dr. Hwa-Seung Yoo East-West Cancer Center, Dunsan Oriental Hospital of Daejeon University 1136 Dunsan-dong, Seo-Gu, Daejeon, 302-122, South Korea Tel: 82-42-470-9132 Fax: 82-42-470-9006 e-mail:
[email protected] Abstract Background: Many herbs and prescriptions had been used to treat cancer in oriental medicine traditionally. Bikihwan (BKH) was one of the well-known prescriptions, but it hasn’t been studied systemically about its toxicity. BKH include some toxic herbs so we need to ensure that it is safe enough to be administered in clinical way. The aim of this study is to characterize the potential toxic effect of BKH through oral administration and verify the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) of BKH in male ICR rats. Methods and Results: 60 male ICR rats had been consumed BKH water extracts per 0, 250, 2,500 and 25,000 mg/kg/day for 1-week single oral dose toxicity test and per 0, 25, 125, 250 and 500 mg/kg/day for 13- weeks repeated oral dose toxicity test. In single and repeated dose toxicity studies, there aren’t any signifcant clinical differences compared with controls in survival, water and food consumption, and chemical tests. Signifcantly higher value of body and liver weight in the male ICR mice administered BKH water extracts per 25 mg/kg/day compared with that of the control group was shown in repeated dose toxicity studies temporarily. And the mice those are administered BKH extracts per 125, 250 and 500 mg/kg/day is presented signifcantly higher value of creatinine statistically. Conclusions: Short term use of BKH isn’t harmful to male mice but long term use of it may cause renal toxicity. NOAEL of BKH in male mice is 125 mg/kg/ day. Keywords: Bikihwan, toxicity, in vivo, no-observed- adverse-effect level. Resumen Antecedentes: se han empleado en medicina tradicional oriental muchas plantas y prescripciones para tratar el cáncer. Una de las prescripciones más conocidas es Bikihwan (BKH), pero no ha sido estudiada su toxicidad en forma sistemática. BKH incluye algunas plantas tóxicas de tal manera que es necesario conocer su seguridad para su administración clínica. El objeto de este estudio es caracterizar el efecto tóxico potencial de BKH tras su administración oral y verifcar el nivel de efectos adversos no observados (NOAEL, siglas en inglés) del BKH en ratas macho ICR. Materiales y métodos: 60 ratones macho ICR recibieron extractos acuosos de BKH en dosis de 0, 250, 2,500 y 25,000 mg/kg/día, en una dosis única para una prueba de toxicidad de una semana y 0, 25, 125, 250 y 500 mg/kg/día durante 13 semanas en dosis orales para una prueba de toxicidad por dosis repetidas. 12 Resultados: en estudios de toxicidad de dosis única y dosis repetidas, no se observaron diferencias clínicas signifcativas cuando se compararon los controles y tratados respecto a la supervivencia, consumo de agua y alimentos y pruebas químicas. Se observaron temporalmente valores signifcativamente más elevados de peso corporal y del hígado en los ratones macho ICR que recibieron extractos acuosos de BKH 25 mg/kg/día comparado comparado con los controles en los estudios repetidos de toxicidad. Y los ratones que recibieron extractos de BKH a dosis de 125, 250 y 500 mg/kg/día presentaron valores de creatitinina más elevados de manera estadísticamente signifcativa respecto a los controles. Conclusiones: el empleo a corto plazo de BKH no tiene efectos deletéreos para los ratones machos, pero el empleo a largo plazo puede causar toxicidad renal. El NOAEL del BKH en ratones macho es 125 mg/kg/ día. Palabras clave: Bikihwan, toxicidad in vivo, nivel de efectos advernsos no observados. Introduction Bikihwan (BKH) was an herbal mixture that was used for eliminating some pathological masses in the right side of abdomen. We could see that kind of symptoms in liver cancer like Hepatocarcinoma or Cholangiocarcinoma. 1 BKH is consist of Rhizoma Coptidis, Cortex magnoliae, Fructus Evodiae, Radix Scutellariae, Fructus Amomi, Poria, Radix Ginseng, Rhizoma Alismatis, Herba Artemisiae Capillaris, Rhizoma Zingiberis Siccatum, Cortex Cinnamomi and Semen Tiglii. Some herbs were known to have anti-cancer effects. Panax Ginseng was a widely used respective anti- cancer herb in the world. 2-4 Semen Tiglii was supposed to inhibit the growth of tumor cells, decrease the size of tumor in rats and activates the function of Natural Killer (NK) cell. 5 It was supposed that Cortex Cinnamomi also have anti tumor effects causing apoptosis of F9 embryonic carcinoma cells by proliferation inhibitory factor, retinoic acid. 6 Semen Tiglii was effective on esophageal cancer, gastric cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, acute leukemia, lung cancer and breast cancer. 7 Phobal ester without lipid compound known to be strong anticancer material in Semmen Tiglii had made less growth in S-180, Ehrlich JTC-26 cancer cell lines. 8 It was also observed that Semen Tiglii makes A549 tumor cells decreased and suppresses the growth of sarcoma- 180, Lewis lung carcinoma. 9 1% BKH extracts make the survival rate of cancer cell lines, K562 from human leukemia, Raji from Burkett lymphoma and MO4 from lymphoblastic lymphoma reduced up to 96%. 10 As you see, the needs for defning the safety of BKH for clinical use were increased but systematic non-clinical toxicity studies had been performed on BKH yet. 11-13 Semen Tiglii, Herba Artemisiae Capillaris and Radix Scutellariae are supposed to be herbs that cause drug- induced hepatotoxicity, so the studies about the safety of BKH have much more needs to be proven. 14 Here, we evaluated the safety of the BKH, to build the safety evidence for clinical trial. This study is performed to estimate the safety of BKH. The safety of was tested in male ICR mice orally for a week and 13 weeks. Methods Chemicals The crude herbs of BKH were obtained from Dunsan Oriental Hospital (Daejeon, Korea). The 3,856 g BKH (Rhizoma Coptidis 1,280 g, Cortex magnoliae 640 g, Fructus Evodiae 480 g, Radix Scutellariae 320 g, Fructus Amomi 240 g, Poria 160 g, Radix Ginseng 160 g, Rhizoma Alismatis 160 g, Herba Artemisiae Capillaris 240 g, Rhizoma Zingiberis Siccatum 80 g, Cortex Cinnamomi 64 g, Semen Tiglii 64 g and Rhizoma Atractylodis Macrocephalae 32 g) except Semen Tiglii and 64 g Semen Tiglii was washed several times with distilled water, and then boiled with 80 °C for 6 hrs separately. Solid particles and aggregates were removed by centrifugation at 3,000 × g for 30 min and the supernatants were lyophilized. Finally, 13.2 g BKH lyophilized extract except Semen Tiglii and 0.3 g Semen Tiglii lyophilized extract were obtained each other and used in this experiment. The lyophilized extract was stored at -20 °C until used. Experimental Design 54 male ICR mice (5-week old upon receipt, Samtako, Korea) were used after acclimatization for 8 days. The animals were housed individually in suspended wire cages (500×300×200 mm) in a temperature (20-25 °C) and humidity (45-40%) controlled room. Light: dark cycle was 12 h: 12 h and feed (Pellet, Samyang, Korea) and water were supplied free to access during the study. A no-observed-adverse-effect level (NOAEL) was sought for mice. 54 male ICR mice (5-week old upon receipt, Samtako, Korea) were equally distributed into each group (6 per group on single oral dose toxicity test, 6 per group on repeated toxicity study). The expected human exposure to BKH is approximately less then 250 mg/kg/day. Based on the use of BKH in animal studies and clinical applications, dose levels of 0, 250, 2,500 13 and 25,000 mg/kg/day on single oral dose toxicity test and 0, 25, 125, 250, and 500 mg/kg/day on repeated toxicity study were selected. Representative dose preparations for each level were analyzed for homogeneity of distribution, concentration and stability during the study. An appropriate amount of the test or vehicle control substance was administered orally to each mouse for 1 week on single oral dose toxicity test, and 13 weeks on repeated toxicity study. Mice were observed for mortality, signs of gross toxicity and behavioral changes at least once daily during the study. Body weights were recorded during the acclimation period and weekly during the exposure period. Individual food and water consumption was also recorded weekly. Ophthalmological examination was conducted by observing the appearance of eye at the last week of this experiment. Blood was collected from all mice near the end of the study before being sacrifced. Blood was evaluated for clinical pathology and gross necropsy and histopathologic evaluations were performed on organs and tissues. Hematology, biochemistry parameters and Urine Analysis All mice were fasted approximately 18 hours before blood collection. Blood samples were collected from descending aorta under ether anesthesia at the end of the experiment. Urine examination including specifc gravity, pH, leukocyte, nitrite, protein, glucose, ketone, urobilinogen, bilirubin, blood was evaluated by using Bayer Diagnostics Multistix 10SG (Not. 5J06C, U.S.A.) REF 2300(03536597) strip and urine measurement (Clinitek 500, U.S.A.). Morphologic pathology evaluations In repeated toxicity studies, whereas complete post morphologic evaluations were immediately performed on mice that were found dead to avoid autolysis of the organs, overnight fasted surviving animals were weighed and humanely killed at the end of the experiment using anesthetic ether. Gross pathologic evaluation were performed and weight of liver, kidney, heart, spleen, lungs, testis and brain were measured and recorded immediately afterwards. Relative organ weight (organ to body weight ratio) were also calculated and recorded for the organs. Histopathological examination was performed on routinely prepared sections of tissues (liver, kidney, heart, spleen, lungs, testis and brain). The tissues were fxed in 10% formalin immediately after removal and weighing to avoid autolysis and standard hematoxylene- eosin staining was performed. Statistical Analysis We used Mann-Whitney U-test to compare the homogeneity of variance in the numerical data (Body weight, food and water consumption, hematology, blood chemistry and organ weights). If there was the homogeneity of variance in the data between groups, one way ANOVA test was conducted. For these analyses, SPSS 10.1 was used and statistical signifcance was decided by p-value<0.05. Results 1. BKH-consumption group in single oral dose toxicity test for 1 week shows no mortality and signifcant differences comparable to the control group Average overall (Test Days 1–7) food and water consumption data indicated that there were no statistically signifcant differences among treated groups compared with the controls and they all survived during that experiment. There were no ophthalmologic fndings or clinical observations noted during the study that were considered to be of biological signifcance, too. Average overall body weight and body weight gain data indicated that the treated rats regardless of dose level were comparable to the controls. Absolute and relative organ weights of treated mice indicated that there were no statistically signifcant differences among treated groups compared with the controls. We also found no signifcant hematological and biochemistry change attributable to BKH after the dosing period. Also, there were no signifcant differences between the control group and any treatment group in the urinalysis during the dosing period. 2. BKH-consumption group in repeated dose toxicity study for 13 weeks shows body and organ weight gain that have statistical meaning in some cases. Average overall body weight and body weight gain data indicated that the treated rats regardless of dose level were comparable to the controls. We observe a signifcantly higher value of body weight in mice of the BKH-R5 group at 2 week compared with control group and BKH-R4 and BKH-R5 group are signifcantly increased on liver weight, compared with the control group. (Fig. 1, Table 1) 14 Figure 1. Body weight changes in mice administered orally with BKH for 13 weeks. Data are mean ± S.D (n=6). The point of BKH- R2 group, that is administered 25mg/kg/day is higher than the points of rest of the groups in 2 weeks after starting this trial. Though it has statistical meaning, that group gets similar level of body weight at the end of this trial. 3. BKH-consumption group in repeated dose toxicity study for 13 weeks shows signifcantly higher value of creatinine comparable to the control one that have statistical meaning. In blood chemistry, we observe signifcantly higher value of creatinine in mice of the BKH-R3, BKH-R4, and BKH-R5 group. We found no signifcant hematological change attributable to BKH after the dosing period without the value of creatinine. There were also no signifcant differences between the control group and any treatment group in the urinalysis during the dosing period. (Table 2) Discussion BKH is the herbal drug developed for improving abdominal pain, jaundice, weight loss and anorexia, the symptoms of abdominal mass like hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.15 BKH includes 14 herbs and some of them have been known to have anti tumor effects; Radix Ginseng, Radix Scutellariae and Cortex Cinnamomi are.16,17 Semen Tiglii, the main component of BKH is known to its effectiveness on esophageal cancer, gastric cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, acute leukemia, lung cancer and breast cancer. It is observed that Semen Tiglii makes A549 tumor cells decreased and suppresses the growth of sarcoma 180, Lewis lung carcinoma. BKH itself has reported anti-cancer effect. 1% BKH extracts make the survival rate of cancer cell lines, K562 from human leukemia, Raji from Burkett lymphoma and MO 4 from lymphoblastic lymphoma reduced up to 96% and this result repeated in another study. 15 Actually, BKH have been used usually in cancer patients by clinicians only based on oriental medicinal theory. Considering the broad usage of BKH in oriental clinical therapy, it is necessary that studies about the safety of BKH are performed. There are some reports about the toxicities of herbs used in BKH; Radix Ginseng. There are a few reported cases of ginseng toxicity or descriptions of side effects attributed to either the quantity or quality of ginseng when taken at the recommended dasages. 18,19 There are some case reports of herbal-induced hepatitis about Radix Scutellariae in English language literature. Radix Scutellariae is reported 6 cases, and is supposed to activate hypersensitivity reaction to induce hepatotoxicity. Herba Artemisiae Capillaris are supposed to induce hepatotoxic injury in Korean language literature. Semen Tiglii already has been known to its toxicity for a long time. In oriental medicine, Semen Tiglii is considered having huge toxic property and some side 20 25 30 35 40 45 50 55 60 BKH-R1(0) BKH-R2(25) BKH-R3(125) BKH-R4(225) BKH-R5(500) Week 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 B o d y W e i g h t s ( g ) 15 Table 1. Absolute organ weights of mice with orally BKH for 13 weeks. The liver weight of BKH-R4 and BKH-R5 groups are big- ger than others statistically. Group/ Dose (mg/ kg/day) Body weight Liver Kidney Spleen Testis Brain Lung Heart Lt. Rt. Lt. Rt. (g) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) BKH-R1 Mean. 46.0 2544.5 357.0 344.6 150.5 118.9 113.9 500.4 243.7 198.2 (0) S.D. 9.65 584.09 102.34 87.67 35.65 13.10 18.70 21.82 42.30 43.74 BKH-R2 Mean. 46.0 2544.5 357.0 344.6 150.5 118.9 113.9 500.4 243.7 198.2 (25) S.D. 9.65 584.09 102.34 87.67 35.65 13.10 18.70 21.82 42.30 43.74 BKH-R3 Mean. 46.0 2258.7 428.9 392.5 128.4 323.6 137.1 498.5 232.3 192.3 (125) S.D. 2.53 139.43 57.45 46.08 26.31 447.80 22.14 22.06 36.40 22.08 BKH-R4 Mean. 46.7 1983.8* 377.3 345.7 153.5 130.7 121.4 503.8 250.8 186.1 (250) S.D. 1.86 232.37 32.80 29.76 59.10 12.40 13.27 12.18 40.18 22.83 BKH-R5 Mean. 43.5 1916.2* 348.4 328.2 126.4 118.2 111.4 530.1 240.7 178.7 (500) S.D. 1.87 89.42 35.12 34.42 15.55 19.48 22.59 39.62 14.83 22.96 *, signifcantly different from values of control group at P < 0.05 with Scheffe test. Lt. : left, Ft.: right, S.D: Standard Deviation, BKH-R: Bikihwan repeated toxicity group effect like diarrhea, anorexia and dyspepsia. So it has been studied how to reduce the toxicity. It is suggested that eliminating the oil or mixing with Rhizoma Rhei is the way to attenuate the toxicity of Semen Tiglii. But other herbs in BKH haven’t been studied yet. We thought that the trial about toxicity of BKH is more useful than that about toxicity of each herb in BKH because it is mixture of herbs and there are no studies about interaction with one herb and another. We usually use BKH clinically, not each herb separately. For its broad uses in hepatocarcinoma, splenomegaly, peritoneal seeding and metastatic mass, we decided to perform this trial to fgure out whether BKH is safe or not and to fnd out its NOAEL. Subsequently, BKH was tested in an oral 1-week single oral dose toxicity test in male ICR mice and 13-week repeated toxicity study in those. Dose levels of single oral dose toxicity test are 0, 250, 2,500 and 25,000 mg/kg/day and those of repeated toxicity study are 0, 25, 125, 250, and 500 mg/kg/day. In single dose toxicity study, there are no specifc changes or abnormalities. In repeated dose toxicity studies, all of the 30 male ICR mice had been alive during consuming, looking well. They eat food and water well and showed no differences. But a signifcantly higher level of body weight in mice of the BKH-R5 group at 2 week compared with control group was shown. It might be an important signal but it was temporary; those mice in BKH-R5 group got similar body weight like other mice. Signifcantly increasing liver weight in mice of the BKH-R4 and BKH-R5 group compared with the control group were also shown. Changes of liver weight might mean hepatic injury in chronic disease or severe fatty liver. But it is hard to adapt this case to that because this trial wasn’t chronic one and they had no increasing level of liver function test. In acute liver injury, the level of AST and ALT are usually increasing enormously. In blood chemistry, a signifcantly higher value of creatinine in mice of the BKH-R3, BKH-R4 and BKH-R5 groups were shown. Creatinine is one of the valuable components to evaluate renal function. So this result means that BKH have kidney toxicity over 125 mg/kg/ day. Consequently, BKH isn’t harmful in short term consuming but can make kidney bad when it has been consumed over 125 mg/kg/day for a long time. So NOAEL of BKH is 125 mg/kg/day in male. During this experiment, we have a question about the result. The mice had eaten BKH showed weight gain after the test. We don’t know why this phenomenon happens. In some oriental medicine record, Semen tiglii makes a mouse fat. But it didn’t show the reason and there haven’t been performed any experiment about this. We had better choose another animal than mice. BKH had been used to treat abdominal mass traditionally, and has been a main cancer-fghting drug to treat in oriental medicine. Many oriental medicinal clinicians have used BKH in many ways, but any systemic studies about its safety haven’t been performed. Here, we performed the short-term and long-term study about toxicity of BKH water extracts, and we suggested that BKH have to use carefully and evaluation of renal function is required during consuming 16 it. And further study of its safety in human bodies need to be performed. References 1. SI Han, BK Kang. Antitumor effects of BKH on cancer cell lines from human leukemia and lymphoma. WonKwang university. 1990; 9-10. 2. Yance DR Jr, Sagar SM. Targeting angiogenesis with integrative cancer therapies.Integr Cancer Ther. 2006; 5(1):9-29. 3. Kiefer D, Pantuso T. Panax ginseng. Am Fam Physician. 2003; 68(8):1539-1542. 4. Chang YS, Seo EK, Gyllenhaal C, Block KI. Panax ginseng: a role in cancer therapy? Integr Cancer Ther. 2003; 2(1):13-33. 5. HJ No, BH Jeon, G Moon, SJ Moon. Trial study about the cytotoxic and antitumor effects and activity of Natural Killer cells and tumor cells of Semen Tiglii with Rizoma Rhei. J. of. Kor. Oriental Oncology. 1996; 2(1):86-87. 6. EK Baek, DG Kim, JW Lee, WS Kim, BH Jeon, WH Woo, WT Jeong. Antitumor effects of Cinnamaldehyde in Cortex Cinnamomi extracts on F9 embryonal carcinoma cell line. Korean J. Oriental Medical Pathology. 1999; 13(2):105. 7. Jiao zhong hua. 30 case series to use Semen Tiglii in malignant tumors. J. of Chinese medicine in Shan dong. 1990; 14(5):36-39. 8. JH Kim, SJ Lee, YB Han. Identifcation of Active Comonent Isolated from Crton tiglium and Coptis Japonica Aqueous Mixture (CP2) and Studies of its Cytotoxic Effect. Yakhak Hoeji. 1994; 38(1):31. 9. SG Jo, G Moon, SJ Moon. Experimental study about antitumor effects and cytotoxicity of manufactured Semen Tiglii and Semen Tiglii with Rhizoma Coptidis. J. of. Kor. Oriental Oncology. 1995; 1(1):207. 10. DK Kang, BK Kang. Antitumor effects of SBH and BKH on cancer cell lines from human leukemia and lymphoma. WonKwang University. 1990; 105-106. 11. Coon JT, Ernst E. Panax ginseng: a systematic review of adverse effects and drug interactions. Drug Saf. 2002; 25(5):323-344. 12. Kitts D, Hu C. Effcacy and safety of ginseng. Public Health Nutr. 2000; 3(4A):473-485. 13. Ernst E. The risk-beneft profle of commonly used herbal therapies: Ginkgo, St. John’s Wort, Ginseng, Echinacea, Saw Palmetto, and Kava. Ann Intern Med. 2002; 136(1):42-53. 14. Christine A Haller, Jo Ellen Dyer, Richard Ko, Kent R Olson. Evidence-Based Case Reviews: Making a diagnosis of herbal-related toxic hepatitis. West J Med. 2002; 176(1):42-43. 15. SH Choi. Defnition and pathologic theory of cancer in oriental medicine. J. of. Kor. Oriental. Oncoloy. 1995; 1(1):17. 16. Catheine E., Ulbricht, Ethan M. Basch. Natural Table 2. Blood Chemical values of mice with orally BKH for 13 weeks. The creatinine level of BKH-R3, BKH-R4 and BKH-R5 are higher than others statistically. Group/ Dose (mg/ kg/day) Total protein Albumin A/G ratio Creatinine BUN Totalcholesterol Triglycerides GOT GPT (g/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (U/L) (U/L) BKH-R1 Mean. 4.1 1.5 0.6 0.5 27.3 127.0 109.7 159.2 46.8 (0) S.D. 0.56 0.28 0.10 0.4 0.77 13.68 14.64 9.84 5.26 BKH-R2 Mean. 4.4 2.0 0.9 0.3 24.5 132.3 144.0 215.2 61.7 (25) S.D. 0.29 0.09 0.17 0.08 2.11 7.83 23.45 35.10 11.32 BKH-R3 Mean. 4.3 1.9 0.8 0.2* 25.5 124.0 94.8 173.3 60.0 (125) S.D. 0.21 0.10 0.05 0.04 1.89 15.34 17.95 16.89 6.84 BKH-R4 Mean. 4.4 1.9 1.1 0.2* 25.8 114.0 107.3 195.7 61.8 (250) S.D. 0.48 0.10 0.47 0.01 1.11 11.53 7.85 38.32 7.64 BKH-R5 Mean. 4.0 1.9 1.5 0.3* 27.0 128.5 115.2 141.2 36.5 (500) S.D. 0.47 0.10 0.80 0.03 1.82 13.14 13.85 22.56 5.80 *, signifcantly different from values of contol group at P < 0.05 with Scheffe test. Lt. : left, Ft.: right, S.D: Standard Deviation, BKH-R: Bikihwan repeated toxicity group 17 standard herb & supplement reference: evidence- based clinical reviews. Mosby, Inc. Philadelphia, PA, USA. 2005; 382-383. 17. Scheck AC, Perry K, Hank NC, Clark WD. Anticancer activity of extracts derived from the mature roots of Scutellaria baicalensis on human malignant brain tumor cells. BMC Complement Altern Med. 2006; 6:27. 18. Hess FG, Parent RA, Stevens KR, Cox GE, Becci PJ. Effect of subchronic feeding of ginseng extract G115 in beagle dogs. Food Chem. Toxicol. 1983; 21:95-97. 19. Siegel RK. Ginseng abuse syndrome. Problems with the panacea. JAMA 1979; 241(15):1614- 1615. 18 19 Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry: planta medicinal mexicana con potencial terapéutico Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry: Mexican medicinal plant with therapeutical potential María Gabriela Rojas-Bribiesca 1,3 , Rubén Román Ramos 2 , Jaime Tortoriello García 3 , Macrina Fuentes Mata 4 , Margarita Aviles Flores 4 . 1 Doctorado en Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma Metropolitana. 2 Departamento de Ciencias de la Salud, División de Ciencias de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa. 3 Centro de Investigación Biomédica del Sur-IMSS, C.P. 55130 Xochitepec, Morelos. 4 Instituto Nacional de Antropología e Historia, Matamoros 14 Acapantzingo, 62440 Cuernavaca, Morelos, Mexico Autora para correspondencia: María Gabriela Rojas Bribiesca Centro de Investigación Biomédica del Sur-IMSS, C.P. 55130 Xochitepec, Morelos. Dirección electrónica:
[email protected] Resumen En México las plantas medicinales han sido utilizadas durante cientos de años por la población para el tratamiento de afecciones gastrointestinales, respiratorias, urinarias, genitales y de la piel en las que, de acuerdo con la sintomatología descrita, pudiese estar involucrado un padecimiento infeccioso. La especie Distictis buccinatoria (DC) A.H. Gentry (Bignoniaceae), popularmente conocida como Tonacaxochitl es una planta nativa de México que ha sido utilizada desde los tiempos prehispánicos con fnes medicinales. Actualmente, los terapeutas tradicionales en el estado de Morelos, México, utilizan el cocimiento de las fores para tratar la tos, anginas, infamación y faringitis. Estudios previos llevados a cabo en esta planta, han demostrado que D. buccinatoria posee actividad antimicrobiana in vitro contra las bacterias gram-positivas Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, y contra los dermatoftos Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum. En la presente investigación se evaluó la actividad antibacteriana de los extractos de hexano, diclorometano y metanol de las fores y las hojas de esta especie contra aislados clínicos de Staphylococcus aureus con resistencia a algunos antibióticos utilizados en la práctica médica. Los resultados obtenidos evidenciaron que los extractos orgánicos de esta planta medicinal inhiben el desarrollo in vitro de todos los aislados clínicos de Staphylococcus aureus ensayados. La actividad más fuerte se encontró en el extracto de diclorometano de las fores, con un valor de Concentración Mínima Inhibitoria (MIC, siglas en inglés) de 0.5 - 2 mg/mL contra todas las bacterias estudiadas. Conclusiones: D. buccinatoria, posee actividad antimicrobiana contra los aislados clínicos de Staphylococcus aureus, y constituye una alternativa útil para el tratamiento de problemas de las vías respiratorias e infecciones causadas por esta bacteria. Nuestros resultados muestran una fuerte correlación entre los usos de esta planta en la medicina tradicional mexicana y los datos experimentales obtenidos. Sustentando también la importancia que tiene la etnofarmacología como guía en la selección de plantas para la obtención de compuestos bioactivos. Palabras clave: Distictis buccinatoria, plantas medicinales, actividad antimicrobiana, aislados clínicos, resistencia antibiótica. Abstract In México, medicinal plants have been used in rural areas for thousands of years to treat illness in which according to the symptomatology described 20 gastrointestinal, respiratory, urinary, and skin infections could be included. Distictis buccinatoria (DC.) A.H. Gentry (Bignoniaceae), locally know as Tonacaxochitl, is a native Mexican plant that has been used since pre-Hispanic times for medical purposes. Nowadays, traditional healers in the state of Morelos in Mexico use the decoction of its fowers to treat cough, tonsil infammation and pharyngitis. Previous reports carried out in this plant have shown that D. buccinatoria possesses in vitro antimicrobial activity against the Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, and antifungal activity against the dermatophytes Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum. In this investigation, the antibacterial activity of the hexane, dichloromethane, and methanol extracts from the fowers and leaves of this medicinal plant were evaluated against Staphylococcus aureus clinical isolates which possesses resistance against some antibiotics used in medical practice. The obtained results showed that the organic extracts of this medicinal plant inhibited the in vitro growth of all the Staphylococcus aureus clinical isolated assayed. The strongest activity was displayed by the dichloromethane extract from the fowers with Minimal Inhibitory Concentration (MIC) values of 0.5 - 2 mg/mL for all the bacteria assayed. Conclusions: D. buccinatoria showed antimicrobial in vitro activity against the Staphylococcus aureus clinical isolates, and constitute an useful alternative for the treatment of respiratory illness and infections caused by this bacterium. Our results show a strong correlation between the reported uses of this plant in mexican folk medicine and the obtained experimental data. They also support the importance of ethnopharmacology as a guide in the selection of plants for the discovery of bioactive compounds. Keywords: Distictis buccinatoria, medicinal plants, antimicrobial activity, clinical isolates, antibiotic resistance. Introducción En el transcurso de la historia, las enfermedades infecciosas y parasitarias han sido una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Con la aparición de los antibióticos y su distribución comercial a partir de 1940, se ofrecieron nuevas y mejores posibilidades para su tratamiento (1). Sin embargo, a pesar de los grandes avances en el campo de la medicina, hoy día las enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos, virus y parásitos siguen constituyendo un problema de salud pública, siendo los países en vías de desarrollo los principalmente afectados debido a la baja disponibilidad de servicios de salud adecuados, de medicamentos y al surgimiento de cepas resistentes (2). Los datos de información epidemiológica proporcionados en el año 2005 por la Secretaría de Salud de los Estados Unidos Mexicanos, durante el período 2000-2004, revelan que las enfermedades respiratorias agudas ocuparon el primer lugar de las veinte principales causas de enfermedad a nivel nacional por grupo de edad de la población general, seguida por las infecciones intestinales y las mal defnidas, siendo la faringitis y amigdalitis la séptima causa (3). Debido a que el uso de los antibióticos suele presentar problemas como inducción de resistencia bacteriana, hipersensibilidad, alergias y efectos secundarios, la búsqueda y desarrollo de nuevos agentes terapéuticos es fundamental para el cuidado de la salud y todas las posibles estrategias deben ser exploradas. En este sentido, la naturaleza nos ha dotado con una gran variedad de productos con actividad biológica, por lo que en los últimos años se ha incrementado el interés por estudiar los productos naturales como una fuente potencial de nuevos productos antimicrobianos. Así, en la última década la utilización y la investigación de plantas medicinales en el mundo han tenido un gran auge, encontrándose que en los países desarrollados se comercializan de manera importante diversos medicamentos herbolarios denominados “ftofármacos”. Hoy día, los ftofármacos son utilizados y aceptados ampliamente por la sociedad por lo que las instituciones de investigación e industrias farmacéuticas se han dado a la tarea de desarrollar tecnologías y métodos que permitan conocer las propiedades farmacológicas y la naturaleza química de los compuestos activos de las plantas a fn de ofrecer productos estandarizados y con dosifcaciones adecuadas (4-6). En México, las plantas medicinales constituyen el recurso terapéutico tradicional más ampliamente utilizado durante cientos de años por las diversas culturas de nuestro país, existiendo una extensa bibliografía al respecto (7-9). Así, el uso de plantas en forma de infusiones, decocciones, cataplasmas, compresas, alcoholatos etcétera, es una práctica muy extendida en el tratamiento de diversos padecimientos, incluyendo aquellos en los que, de acuerdo a la sintomatología descrita, pudiese estar involucrado un padecimiento infeccioso (10,11). De acuerdo con una encuesta realizada en México a nivel nacional bajo el programa IMSS-COPLAMAR durante el periodo 1983-1985, se 21 determinó que el 78% de las 140 plantas medicinales más frecuentemente empleadas en 2242 comunidades rurales, son especies utilizadas para curar o prevenir enfermedades gastrointestinales, respiratorias y de la piel (12). Sin embargo, la investigación científca sobre el potencial terapéutico de estas plantas es aún limitado. Debido a esto, es importante el estudio de plantas medicinales con potencial antimicrobiano, tomando como antecedente los datos etnomédicos. Enfermedades infecciosas Las enfermedades infecciosas y parasitarias, tales como las infecciones respiratorias agudas, tuberculosis, diarrea, HIV/SIDA y malaria, son una causa importante de morbilidad y mortalidad en el mundo entero. De acuerdo a la información proporcionada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), se sabe que durante el año 2003, las enfermedades agudas de las vías respiratorias causaron 3, 963,000 muertes (13). Las infecciones de vías respiratorias son de las enfermedades infecciosas más prevalentes en el mundo. La neumonía adquirida en la comunidad, afecta a 3-4 millones de personas actualmente en Estados Unidos y una quinta parte necesitará hospitalización, lo que supone más de 600,000 altas anuales. Considerando que entre el 50% y el 80% de estas neumonías se tratan en forma ambulatoria, las estadísticas son probablemente mucho más altas. A su vez, la sinusitis y la faringoamigdalitis causan unas 40 millones de visitas anuales en la atención primaria de los Estados Unidos (14). En México, durante el año 2000, las infecciones respiratorias agudas fueron la primera causa de los 15 casos nuevos de enfermedad más importantes (15). Durante el periodo 1999-2001, la neumonía e infuenza fueron la octava causa de defunciones generales a nivel nacional, y las enfermedades intestinales infecciosas ocuparon la onceava posición, sin considerar las muertes debidas a otras infecciones lo que elevaría la cifra total (16). Los datos de información epidemiológica del año 2005 revelan que por grupo de edad de la población general, en el período 2000-2004, las enfermedades respiratorias agudas ocuparon el primer lugar de las veinte principales causas de enfermedad a nivel nacional seguida por las infecciones intestinales y las mal defnidas, encontrándose también dentro de estos primeros veinte casos de morbilidad la faringitis, la amigdalitis y algunas otras enfermedades infecciosas (3). Dada la frecuencia con que se presentan las enfermedades respiratorias y diarreicas en los países en vías de desarrollo, la prescripción inadecuada y la automedicación de antibióticos genera la aparición de cepas resistentes, fenómeno que se ha hecho muy evidente en el ámbito hospitalario, a pesar de que existen guías y normas para el manejo de los mismos (17). En la última década ha aumentado en todo el mundo la resistencia de los patógenos a los antimicrobianos, hecho de especial trascendencia en las infecciones de vías respiratorias en que la mayoría de las veces el tratamiento antibiótico es empírico (14). De acuerdo con algunos autores, la rapidez con que surgen los microorganismos multiresistentes no es igual a la velocidad con que surgen nuevos antibióticos, razón por la que se considera que pronto habrá difcultades para contar con antibióticos útiles para el tratamiento de pacientes infectados con este tipo de microorganismos. El Staphylococcus aureus, es uno de los microorganismos que se aisla con mayor frecuencia en las infecciones nosocomiales y las adquiridas en la comunidad, presenta una patogenicidad variable que le permite causar desde infecciones de las vías respiratorias y de la piel hasta infecciones con compromiso vital tales como endocarditis, septicemias, meningitis, entre otros (18). Plantas medicinales El conocimiento y utilización de las plantas por los pueblos del mundo tiene una larga e interesante historia, reconociéndose que desde siempre el ser humano ha encontrado en las plantas un fel aliado para satisfacer muy diversas necesidades: alimento, techo, abrigo, armas, así como la recuperación y el mantenimiento de la salud. Mediante el estudio de restos fósiles, se ha determinado que en la era paleolítica (60000 años atrás) el hombre ya utilizaba diversas plantas como medicinas (19). Actualmente, la gran mayoría de lo países desarrollados y en desarrollo siguen haciendo uso de ellas y los médicos tradicionales y sus plantas medicinales han dejado de ser califcados negativamente, estableciéndose programas y proyectos para la investigación, aplicación e industrialización de los productos derivados de plantas. Esto ha conducido a que muchas de las drogas utilizadas en la terapéutica moderna tienen sus orígenes en la medicina tradicional de diversas culturas antiguas (20). En México las plantas medicinales son el recurso material más amplio y valioso de la medicina indígena tradicional (21). Su estudio es un tema recurrente en la historia de México, tarea muy compleja si se piensa en la enorme riqueza cultural y forística del país (tercero en el mundo en biodiversidad y segundo en el hemisferio occidental de lenguas y culturas distintas). Se tiene estimado que en nuestro país existen cerca de 30,000 especies de plantas de las cuales, en 1994 el Instituto Nacional Indigenista documentó 3,000 con usos medicinales, esto es el 10% del total de la riqueza forística del país (9). 22 Los datos sobre las características vegetales, formas de uso, propiedades terapéuticas, recolección y comercio de numerosas plantas medicinales utilizadas en nuestro país, han dado origen a diversos textos. Entre los más conocidos podemos citar los siguientes: el Códice Florentino o Historia de las cosas de la Nueva España realizado por Fray Bernardino de Sahagún, el Libellus de Medicinalibus Indorum Herbis del indígena Mexicano Martín de la Cruz y Juan Badiano, conocido como el Códice Badiano, otra fuente importante son las obras completas de Francisco Hernández denominadas Historia Natural de Nueva España. En las últimas décadas hubo un resurgimiento en cuanto al interés sobre el registro y documentación de las plantas medicinales utilizadas por nuestras culturas, siendo algunos de los textos más conocidos: Las Plantas medicinales de México escrito por Maximino Martínez; Las Monografías de Nombres, Sinonímias y Usos de las Plantas Medicinales de México de José Luis Díaz; el Atlas de las plantas de la Medicina Tradicional Mexicana escrito por Arturo Argueta y colaboradores, así como diversos listados de plantas de herbarios y jardines botánicos especializados en el tema. Distictis buccinatoria, (DC.) A. H. Gentry. La especie Distictis buccinatoria, (DC.) A. H. Gentry perteneciente a la familia Bignoniaceae es una planta de origen mexicano, los reportes que se tienen en fuentes bibliográfcas que hacen referencia a la época prehispánica (22,23) demuestran que desde entonces ha sido utilizada en nuestro país con fnes medicinales. En la bibliografía especializada en plantas medicinales de México no se encuentran registros sobre ella. Sin embargo, aún hoy día esta especie sigue siendo usada por terapeutas tradicionales de la zona de Tetela del Volcán en el Estado de Morelos, para el tratamiento de afecciones respiratorias (Comunicación verbal). En la literatura científca se reporta que D. buccinatoria posee actividad antimicrobiana in vitro contra las bacterias Gram-positivas Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecalis, contra los dermatoftos Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum, y actividad citotóxica contra la línea celular cancerosa KB (24). El objetivo de la presente investigación fue evaluar el potencial antimicrobiano de Distictis buccinatoria contra aislados clínicos de Staphylococcus aureus con patrón de resistencia, obtenidos de exudados faríngeos de pacientes que cursaron al menos 5 veces en un año con infección de la garganta. Material y métodos Material vegetal Se colectaron fores y hojas de Distictis buccinatoria en el municipio de Tetela del Volcán, Morelos. Se prepararon ejemplares de herbario, para su identifcación y clasifcación en el herbario del Instituto Nacional de Antropología e Historia Morelos (INAHM), quedando registrada bajo el código INHAM-2007. El material vegetal se extendió en camas de secado en un cuarto oscuro y bien ventilado hasta su completa deshidratación y se trituró con ayuda de un molino eléctrico. Preparación de extractos Extractos de forK. Doscientos cincuenta gramos de fores secas y molidas fueron extraídas secuencialmente dejándolas macerar con n-hexano durante 24 - 48 horas a temperatura ambiente, después de lo cual, se fltró el disolvente y se evaporó a presión reducida en un rotavapor, se añadió nuevamente el disolvente al material vegetal, repitiendo el proceso 5 veces. Se extendió el material vegetal en una campana de extracción para evaporar los restos del disolvente. Para la obtención del extracto de diclorometano, el material vegetal libre de restos de hexano, fue extraído mediante el procedimiento y número de extracciones descrito anteriormente utilizando diclorometano como disolvente. Finalmente, se realizó el proceso de extracción nuevamente con metanol para obtener el extracto correspondiente. Los extractos obtenidos fueron colocados en frascos de vidrio y se mantuvieron en una campana de extracción, hasta que se evaporaron completamente los restos del disolvente. Se determinó el rendimiento para cada uno de los extractos (Cuadro 1). Extractos de hoja. Doscientos cincuenta gramos de hojas secas y molidas, fueron extraídas utilizando la metodología descrita en el párrafo anterior. Se determinó también el rendimiento para cada uno de ellos (Cuadro 1). Cepas bacterianas Las cepas de aislados clínicos de Staphylococcus. aureus utilizadas en el ensayo fueron obtenidas en clínicas del IMSS en la ciudad de Cuernavaca Morelos. Dichas cepas fueron aisladas de exudados faríngeos de pacientes con infecciones recurrentes (5 o más por año) de vías respiratorias altas (faringitis, faringoamigdalitis) y presentaban resistencia a varios antibióticos (Cuadro 2). 23 Ensayo antimicrobiano Para la evaluación antibacteriana de los extractos de hexano, diclorometano y metanol de las hojas y fores de Distictis buccinatoria se utilizó el método de doble dilución en agar como se describe de manera previa (25). Los extractos se disolvieron en Dimetilsulfoxido (DMSO; Merck) y agua; se prepararon diluciones seriadas dobles, las cuales se incorporaron en cajas Petri al medio de cultivo licuado (agar Muller-Hinton). El rango de concentración ensayado estuvo comprendido en el rango de 0.25 - 8 mg/mL. Las bacterias se mantuvieron en cajas Petri con agar tripticasa de soya (TSA Merck). Para el desarrollo de la prueba se inocularon caldos Muller-Hinton (BHM Merck) con cada una de las bacterias a ensayar, los cuales fueron incubados en una estufa bacteriológica a 37 ºC. Una vez desarrolladas las bacterias, se ajustó la concentración de los inóculos a una turbidez de 0.5 de McFarland lo que corresponde a una concentración de 108 UFC/mL. La densidad del inóculo fue corroborado espectrofotométricamente (absorbancia de 0.08-0.10 a una longitud de onda de 625 nm). Cada inóculo se diluyó (1:20) y se aplicó en la superfcie del agar con una pipeta calibrada, en un volumen de 0.002 mL, para obtener una gota que se dispersó en forma de círculo con un diámetro de 5 a 8 mm y que contenía 10 4 UFC. Las placas se incubaron por 24 horas a 37 ºC. Como estándar de referencia se utilizó Gentamicina y como controles de la prueba Dimetilsulfoxido y el medio de cultivo. Las observaciones se llevaron a cabo por duplicado y los resultados se expresaron como la concentración más baja de extracto que produjo la completa supresión del crecimiento bacteriano (CMI). Resultados y discusiones En el cuadro 1, se muestran los rendimientos de los extractos por extracción sucesiva con hexano, diclorometano y metanol de las fores y hojas de Distictis Buccinatoria, los cuales fueron calculados en relación al peso seco del material vegetal que se utilizó para el proceso de extracción. De los extractos orgánicos obtenidos mediante el proceso de extracción secuencial de las hojas y fores de D. buccinatoria, el metanol fue el disolvente que proporcionó un mayor rendimiento en ambos casos. El rendimiento de los extractos hexánico y metanólico obtenidos de las hojas fue mayor que el obtenido de los extractos de las fores. Parte aérea Extracto Rendimiento % a Flor Hexano 0.99 Flor Diclorometano 1.36 Flor Metanol 8.33 Hoja Hexano 0.95 Hoja Diclorometano 2.08 Hoja Metanol 9.42 Cuadro. 1. Rendimiento de los extractos. a Residuo seco del extracto en relación al peso seco del material vegetal Clasifcación Patrón de Resitencia Staphylococcus aureus CL20-211 (A) *Dc, Am, Pn Staphylococcus aureus CL20-523 (B) Dc, Am, Pn Staphylococcus aureus CL20-604 (C) Pn, Amp, Er Staphylococcus aureus CL20-625 (D) Pn, Amp, Te Staphylococcus aureus CL20-630 (E) Er, Dc, Am, Pn, Er Cuadro. 2. Aislados clínicos de Staphylococcus aureus con patrón de resistencia a antibióticos. * Antibióticos: DC= dicloxacilina; Am = amikacina; Pn = penicilina; Amp= ampicilina; Te= tetraciclina. 24 En el cuadro 3 se muestran los resultados de la evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos de las hojas y fores de D. buccinatoria contra aislados clínicos de Staphylococcus aureus, así como los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenidos para los extractos correspondientes. De los 6 extractos ensayados, cinco de ellos (83%) inhibieron el desarrollo de al menos 5 de los aislados clínicos de Staphylococcus ensayados con valores de CMI entre 0.5 y 8 mg/mL, siendo el extracto de diclorometano el que resultó ser más activo con un valor de CMI de 0.5 mg/mL para todas las cepas ensayadas. Aunque en algunos autores consideran como activos solo aquellos extractos que presentan valores de CMI, semejantes a los antibióticos utilizados como estándar, en nuestra experiencia, y de acuerdo a estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio, se ha podido evidenciar que extractos vegetales con valores de CMI entre 2.5 y 15 mg/mL, han conducido a al aislamiento de compuestos con una fuerte actividad antibiótica (10, 24) y a la producción de ftofármacos que al ser probados en la clínica han demostrado una gran efectividad y tolerabilidad terapéutica sin presentar efectos colaterales (26, 27) de acuerdo a este criterio, se consideraron como activos aquellos extractos que presentaron valore de CMI, igual o menor a 8 mg/mL. Los resultados obtenidos contra estos aislados clínicos de Staphylococcus aureus resultan especialmente importantes y sugieren que esta especie puede constituir una alternativa en el tratamiento de procesos infecciosos causados por cepas de este microorganismo, con resistencia a algunos de los antibióticos utilizados en la clínica. Así mismo, estos hallazgos, convalidan el uso médico que dan a esta especie los terapeutas tradicionales del estado de Morelos, quienes utilizan las fores de este vegetal para el tratamiento de enfermedades de la garganta y la tos, ya que el Staphylococcus aureus es un patógeno muy frecuente en estos padecimientos. Conclusiones Los resultados obtenidos en las evaluaciones antimicrobianas llevadas a cabo con los extractos orgánicos de las fores y hojas de Distictis buccinatoria permitieron concluir que esta planta medicinal iinhibe el desarrollo in vitro de aislados clínicos de Staphylococcus aureus provenientes de exudados faríngeos que presentan resistencia a algunos de los antibióticos utilizados en la clínica lo que permite proponer a esta planta medicinal como una especie con potencial terapéutico para la posible obtención de un ftofármaco para el tratamiento de infecciones causadas por este patógeno. Así mismo demuestran la importancia de la etnobotánica como guía en la selección de productos naturales para la obtención de bioproductos útiles para el cuidado de la salud. Actualmente se están llevando a cabo estudios farmacológicos y ftoquímicos con la fnalidad de establecer la actividad antiinfamatoria de esta especie y aislar y purifcar los metabolitos responsables de las actividades biológicas de esta especie medicinal. Parte Ensayada Extracto CMI mg/mL Aislados clínicos de Staphylococcus aureus a A B C D E Flor Hexano 8 8 8 8 8 Flor Diclorometano 1 0.5 0.5 1 2 Flor Metanol >8 >8 >8 >8 >8 Hoja Hexano 1 1 0.5 1 2 Hoja Diclorometano 2 1 1 1 2 Hoja Metanol 2 2 2 2 4 Gentamicina b 5 5 5 5 5 Cuadro. 3. Actividad antibacteriana contra cepas de aislados clínicos de Staphylococcus aureus con patrón de resis- tentencia a antibióticos. a Aislados clínicos de Staphylococcus aureus (CL20): A=211; B=523; C= 604; D= 625; E= 630 b Antibiótico de referencia (µg/mL) 25 Referencias 1. Bertram GK. (2001). Farmacología básica y clínica octava edición. Editorial El Manual Moderno. México, D.F. p. 849. 2. Okeke IN, Laxmaninarayan R, Bhutta ZA, Duse AG, Jenkins P, O`Brien TF, Pablos MA, Klugman KP. (2005). Antimicrobial resistance in developing countries. Part 1: recent trends and current status. Lancet Infect Dis. 5: 481-493. 3. SSA. SUIVE (2006). Dirección General de Epidemiología. Febrero de 2006. Tasa de morbilidad de los principales casos nuevos de enfermedades, 200 a 2004. www. dgepi.salud. gob.mx. 4. Fostel JM, Lartey PA. (2000). Emerging novel antifungal agents. Drug Discovery Today. 5: 25- 32. 5. Raskin I, Ribnicky, DM, Komarnytsky S, Llic N, Poulev A, Borisjuk N, Brinker A., Moreno DA, Ripoll C, Yakoby N, O´Neal JM, Cornwell T, Pastor I, Fridlender B. (2002). Plants and human health in the twenty-frst century. Trends Biotechnol. 20: 522-531. 6. Clardy J, Walsh C. (2004). Lessons from natural molecules. Nature. 432: 829-837. 7. Martínez M. (1944). Las plantas Medicinales de México. Editorial Botas, 3ª ed. México D.F. 630 pp. 8. Martínez M. (1944). Las plantas Medicinales de México. Editorial Botas, 3ª ed. México D.F. 630 pp. 9. Argueta A, Cano L, Rodarte M. (1994). Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana. Tomo 1-3. Instituto Nacional Indigenista, México D.F. 1786 pp. 10. Navarro V, Villarreal ML, Rojas G, Lozoya X. (1996). Antimicrobial evaluation of some plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of infectious diseases. J Ethnopharmacol. 53:143-147. 11. Rojas G, Lévaro J, Tortoriello J, Navarro V. (2001). Antimicrobial evaluation of certain plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of respiratory diseases. J Ethnopharmacol. 74: 97-101. 12. Lozoya X, Aguilar A, Camacho R. (1987). Encuesta sobre el uso actual de plantas en la medicina tradicional mexicana. Revista Médica del IMSS. 25: 283-291. 13. World Health Organization. (2004). The World Health Report. Changing History. Statistical annex. Deaths by cause, sex and mortality stratum in WHO Regions, estimates for 2002. WHO, Geneva, Switzerland. pp. 120-121. 14. Calbo E, Garau J. (2004). Telitromicina. Revista Española de Quimioterapia. 17: 15-25. 15. SSA. (2001). Boletín de Información Estadística No. 20. Vol. II, Daños a la salud, Tasa de morbilidad de los 15 casos nuevos de enfermedad más importantes, 2000. México D.F. (medios magnéticos). 16. INEGI. (2003). Estadísticas vitales, 1990- 2001. Base de datos. 17. Solórzano F, Miranda MG. (1998). Resistencia de bacterias respiratorias y entéricas a antibióticos. Salud Pública de México. 40: 510-516. 18. Vasso S, Chin CM, Tambyah PA. (2005). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Endocarditis after transurethral prostatic resection. Urology. 65: 21-23. 19. Fabricant DS, Farnsworth NR. (2001). The value of plants used in traditional medicine for drug discovery. Environ Health Perspect. 109: 69-75. 20. Patwardhan B. (2005). Ethnopharmacology and drug discovery. J Ethnopharmacol. 100: 50-52. 21. Lozoya X, Zolla C. (1984). La Medicina Invisible. Introducción al Estudio de la Medicina Tradicional de México. Folios 2ª Ed., México D.F. 274 pp. 22. De la Cruz, M. (1964). Libellus de Medicinalibus Indorum Herbis: Manuscrito Azteca de 1552 según traducción latina de Juan Badiano I.M.S.S., México D. F. pp. 121, 213. 23. Navarro FJ. (1992). Historia Natural o Jardín Americano [Manuscrito de 1801]. Universidad Nacional Autónoma de México, Instituto Mexicano del Seguro Social, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado. México D.F. p. 176, 226. 24. Rojas MG, Navarro V, Alonso D, Ríos MY, Tortoriello J, Roman-Ramos R. (2007). Antibacterial, antifungal and cytotoxic activities of Distictis buccinatoria. Pharmaceutical Biology. 45,4: 289-294. 25. Rojas G, Lévaro J, Tortoriello J, Navarro V. (2001). Antimicrobial evaluation of certain plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of respiratory diseases. J Ethnopharmacol. 74: 97-101. 26. Herrera-Arellano A, Rodriguez A, Martínez MA, Martínez E, Zamilpa A, Alvarez L, Tortoriello J. (2003). Effectiveness and tolerability of a standarized phytodrug derived from Solanum chrysotrichum on Tinae pedís: A controlled and randomized clinical trial. Planta Med 69: 390-395. 26 27. Herrera-Arellano A, Jiménez E, Vega AM, Martínez MA, Hernández M, Zamilpa A, Tortoriello J (2004). Ciinical and mycological evaluation of therapeutic effectiveness of Solanum chrysotrichum standardized extract on patients with Pityriasis capitis (dandruff). A double blind and randomized clinical trial controlled with ketoconazole. Planta Med 70: 483-488. 27 Diabetes mellitus y plantas medicinales en México Diabetes mellitus and medicinal plants in México Francisco Javier Alarcón-Aguilar, Erica Hernández-Galicia y Rubén Román-Ramos Departamento de Ciencias de la Salud, División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. Autor para correspondencia: Francisco Javier Alarcón-Aguilar Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, DF, México 09340 Tel. +55-58046483, Fax. +55-58044727 Correo electrónico:
[email protected] Resumen Se destaca la importancia que tiene la diabetes mellitus (DM) en México, haciendo una descripción general de este padecimiento y resaltando la necesidad de incrementar la búsqueda de nuevas alternativas para su control. Se analizan los datos etnobotánicos acerca de las plantas medicinales usadas en el control empírico de la DM, así como los resultados obtenidos hasta ahora en el estudio de sus propiedades hipoglucemiantes, haciendo hincapié en las plantas usadas en México. Aunque en nuestro país se tienen reportadas más de 250 plantas antidiabéticas, sólo 13 han sido estudiadas con cierta profundidad, enfocándose hacia la purifcación y caracterización química de las sustancias responsables de su actividad hipoglucemiante; además, también se han reportado estudios dirigidos a la validación experimental de las propiedades medicinales de varias plantas antidiabéticas. En este sentido, nuestro grupo de investigación ha estudiado el efecto antihiperglucémico agudo de 62 plantas, 33 de las cuales mostraron reducciones signifcativas de la glucemia en conejos sanos con hiperglucemia temporal (P<0.05), inducida con dos cargas de glucosa por vía subcutánea. Hasta la fecha, al menos 17 agentes hipoglucemiantes potenciales aislados de 13 especies antidiabéticas mexicanas han sido caracterizados químicamente. El análisis de estos resultados refeja varios aspectos importantes para el estudio de las plantas medicinales usadas en el control de la DM. Es recomendable la realización de estudios toxicológicos que permitan fundamentar su estudio clínico. Además, conjuntamente con la investigación dirigida al aislamiento, purifcación y caracterización química de las sustancias responsables de la actividad hipoglucemiante, se considera importante iniciar programas dirigidos al cultivo, mantenimiento y conservación de estas plantas medicinales. Abstract. In this work, the importance that the diabetes mellitus (DM) has at present is remarked, making a general description about this ailment and remarking the necessity to increase the research of new alternatives for its control. An analysis of the most recent ethnobotanical information about the medicinal plants used for the DM control, as well as of the results obtained in the investigation of the hypoglycemic activity of such plants, was made. Special importance was given to those plants studied in Mexico. Although in Mexico more than 250 anti-diabetic plants have been reported, only 13 have been chemical and pharmacologicaly researched; Furthermore, various studies have been made to validate experimentally the hypoglycaemic activity of various other plants. In this respect, our investigation group has studied the acute anti-hyperglycaemic effect of 62 plants, out of which 33 showed signifcant reductions of the glycemia in healthy rabbits with temporary hyperglycemia (P<0.05), induced by two subcutaneous injections of glucose. Up to date, at least 17 promising hypoglycaemic agents have been isolated and chemically characterized from 13 Mexican anti-diabetic pants. Analysis of these results showed various important facts for the study of 28 the medicinal plants used in the control of the diabetes mellitus. Toxicological studies that permit to establish the bases for its clinical study are recommended. Furthermore, in conjunction with studies looking for the isolation, purifcation, and chemical characterization of the hypoglycaemic principles, it is considered primordial to start programs to crop, maintain and preserve these medicinal plants. Introducción La diabetes mellitus (DM) es un trastorno metabólico común asociado con una morbimortalidad importante (Zimmet et al. 2001). La DM se caracteriza por una hiperglucemia crónica que resulta de defectos en la secreción de insulina y/o defciencias en la acción de esta hormona, llevando a una alteración en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas (Committee Report 2002). El tratamiento farmacológico de la DM se basa en la administración de agentes hipoglucemiantes orales e insulina (ADA 1997). Sin embargo, por la vía empírica también se utilizan numerosas plantas antidiabéticas (Aguilar et al. 1994, 1998). A pesar de que en México se reportan más de 250 plantas usadas por la población en el control de este padecimiento, la mayoría de las investigaciones realizadas hasta 1990 estuvieron dirigidas al estudio experimental y clínico de únicamente dos especies: Tecoma stans (tronadora) y Opuntia streptacantha (una especie de nopal) (Lozoya 1980, Frati et al. 1991). Cabe destacar que en los últimos 10 años diversos grupos de investigación del país en la Universidad Nacional Autónoma de México, en el Instituto Mexicano del Seguro Social y en la Universidad Autónoma Metropolitana, entre otros, comenzaron una serie de estudios dirigidos principalmente a la validación experimental de la acción hipoglucemiante de las plantas usadas en México para el control de la DM, aspecto primario en el desarrollo de medicamentos en el que, en general, se busca demostrar si una o varias sustancias poseen efectos farmacológicos importantes. En estas investigaciones se ha llegado a evaluar experimentalmente el efecto hipoglucémico agudo de extractos y fracciones obtenidos de algunas plantas antidiabéticas, e inclusive, se han aislado y/o a caracterizado químicamente algunos agentes hipoglucemiantes potenciales. En este trabajo se analiza la información etnobotánica acerca de las plantas usadas empíricamente por la población mexicana en el control de la DM y se analizan los resultados obtenidos en la investigación de sus propiedades antidiabéticas, tomando como referencia las investigaciones realizadas en otros países con plantas antidiabéticas. Generalidades acerca de la diabetes mellitus (DM) La DM es la enfermedad endocrina con los índices más altos de prevalencia y mortalidad por lo que representa uno de los problemas de salud más importantes (Committee Report 2002). La cantidad de pacientes diabéticos aumenta año con año y oscila del 2 al 6% de la población. En México, estudios recientes reportan una incidencia del 12% y se calcula que para el año 2025 se llegará al 18% de la población. La DM se encuentra entre las 10 primeras causas de muerte. Sin embargo, es importante señalar que en los países industrializados, así como en las grandes ciudades de los países en vías de desarrollo, la DM como causa de muerte se ubica en tercer lugar, sólo después de las enfermedades cardiovasculares y oncológicas (Committee Report 2002; Barceló y Rajpathak 2001). La DM se puede defnir como un grupo de enfermedades metabólicas caracterizado por un estado de hiperglucemia crónica que obedece a un défcit en la actividad insulínica. La insulina es una hormona que sintetizan y secretan las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas. El défcit en la actividad de la insulina origina anormalidades en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas, lo cual fnalmente se traduce en hiperglucemia, hiperaminoacidemia e hipertrigliceridemia (Saltiel y Kahn 2001). Las principales anomalías de la DM origina varios signos y síntomas característicos como polidipsia, polifagia, poliuria, hiperglucemia, pérdida de peso sin causa aparente y, en algunos casos graves, cetonemia y cetonuria. A largo plazo, estas anormalidades pueden llevar al desarrollo de complicaciones agudas y crónicas, tales como: coma cetoacidótico o diabético, coma hiperosmolar, macro- y microangiopatía, retinopatía, nefropatía e infecciones recurrentes. Dichas complicaciones son las principales causas de la invalidez y la mortalidad de los pacientes con DM (Nathan 1993). A la DM se le suele clasifcar en 4 tipos: tipo 1 (conocida anteriormente como DM insulino dependiente), tipo 2 (conocida anteriormente como DM no insulinodependiente), otros tipos específcos de diabetes y diabetes gestacional. Cabe señalar que desde el punto de vista clínico los dos primeros son los más importantes, ya que de todos los casos de diabetes diagnosticados por año, cerca del 10% pertenecen al tipo 1, alrededor del 80% pertenece al tipo 2 y el 10% restante a los otros dos grupos (ADA 1997, Mancillas et al. 2002). El tratamiento de la DM se realiza con base en 4 factores fundamentales: educación del paciente, dieta, 29 ejercicio físico y administración de medicamentos hipoglucemiantes como los derivados de las sulfonilureas, biguanidas, tiazolidinedionas e insulina (White 1996; Gómez y Rull 1997; Wildasin et al. 1997). Sin embargo, por la vía empírica también se acude a la medicina tradicional. De acuerdo con datos de la Organización Mundial de la Salud, más del 70% de la población mundial tiene que recurrir a la medicina tradicional, como única alternativa a su alcance, para resolver sus principales necesidades de salud. Dentro de la medicina tradicional la DM se trata con la administración de plantas medicinales, las cuales son conocidas popularmente como plantas antidiabéticas (Farnsworth et al. 1985). Plantas antidiabéticas estudiadas en el mundo Marles y Farnsworth (1994) reportan que son utilizadas en el mundo más de 1200 plantas medicinales en el control de la DM. Algunas de estas plantas han sido objeto de estudios farmacológicos exhaustivos dirigidos hacia la validación de sus propiedades antidiabéticas. Sin embargo, a más de las dos terceras partes de las plantas reportadas como antidiabéticas no se les ha realizado estudio alguno (alrededor de 800 especies vegetales de las 1200 reportadas en el mundo como antidiabéticas). De acuerdo con el tipo de estudios realizados con las plantas estudiadas (alrededor de 400 especies), Bailey y Day (1989), así como Marles y Farnsworth (1994 y 1995), las clasifcaron en tres categorías: 1) Plantas antidiabéticas a partir de las cuales se ha logrado aislar un agente hipoglucemiante potencial. 2) Plantas antidiabéticas cuyo efecto hipoglucémico ha sido estudiado a nivel experimental y/o clínico, pero a partir de las cuales no se ha logrado aislar la sustancia responsable de la actividad hipoglucemiante. 3) Plantas antidiabéticas cuyo efecto hipoglucémico fue estudiado experimental y/o clínicamente, pero cuyos resultados fueron negativos o contradictorios. De acuerdo con estos datos, más de 300 mostraron acción hipoglucemiante y de ellas se han aislado alrededor de 150 compuestos hipoglucemiantes. Así mismo, en el 19% de las 400 plantas estudiadas los resultados fueron negativos o contradictorios. Cabe señalar también que la inmensa mayoría de los estudios realizados con estas plantas ha sido a nivel experimental, estudiando efectos agudos (90%), mientras que a nivel toxicológico y clínico sólo se ha evaluado una minoría (sólo el 10%). Por su parte, en menos del 10% de las plantas estudiadas se han realizado estudios dirigidos a la determinación de su actividad biológica a largo plazo. De acuerdo con Marles y Farnsworth (1994, 1995), las familias botánicas que contribuyen con más especies antidiabéticas en todos los países son las siguientes: Fabaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Liliaceae, Poaceae y Euphorbiaceae, entre otras. Así mismo, entre las plantas más ampliamente utilizadas en el mundo se mencionan: Momordica charantia L. (Cucurbitaceae), Catharanthus roseous (Apocynaceae), Anacardium occidentale (Anacardiaceae), Aloe vera (Liliaceae), Syzygium cumini (Myrtaceae), Tecoma stans (Bignoniaceae), Urtica dioica (Urticaceae), Lupinus albus y Trigonela foenum-graceum L. (Fabaceae), Allium cepa y A. sativum (Liliaceae). M. charantia es la planta más ampliamente estudiada en el mundo. Su efecto hipoglucémico agudo y crónico, así como sus efectos toxicológicos in vivo e in vitro, se han estudiado a nivel experimental y clínico; y a partir de sus fores, frutos y hojas. Además, varias sustancias han sido propuestas como las responsables de su actividad, tal como la charantina (Ali et al. 1993; Tennekoon et al. 1994). De Chataranthus roseous, a partir de la cual se aislaron los conocidos alcaloides antineoplásicos vincristina y vinblastina, se han aislado ya varias sustancias hipoglucemiantes. De Tecoma stans se han aislado los alcaloides tecomina y tecostanina (Hammouda y Amer 1960; Hammouda et al. 1964) y de T. foenum-graceum, además de estudiar sus propiedades antidiabéticas, se ha estudiado su utilidad como hipocolesterolemiante (Abdel et al. 1997; Molham y Amala Raman 1998). Marles y Farnsworth (1994) también reportan la naturaleza química de los compuestos hipoglucemiantes que más frecuentemente se han aislado de plantas antidiabéticas. Dentro de los principales se mencionan carbohidratos (sacáridos o glúcidos), alcaloides, glucopéptidos, terpenoides, péptidos y aminas, favonoides, esteroides y algunos otros compuestos de naturaleza lipídica. Es importante subrayar que más del 10% de las plantas reportadas en el mundo como antidiabéticas existen en México. Sin embargo, a pesar de que estas plantas representan una alternativa viable en el control de la DM al alcance de la mayoría de la población y de que representan también una fuente potencial de materia prima para la obtención de nuevos medicamentos hipoglucemiantes orales, su investigación experimental y clínica en nuestro país es reciente. Plantas antidiabéticas en México Las investigaciones etnobotánicas realizadas en México reportan el uso empírico de 269 plantas antidiabéticas, varias de las cuales se han usado 30 desde tiempos ancestrales y otras fueron incorporadas al saber tradicional apenas durante el siglo XX (Martínez 1969; Aguilar et al. 2002; Hernández et al. 2002a). Cabe señalar que la mayoría de las especies antidiabéticas mexicanas son especies endémicas y aproximadamente el 12 % de ellas están incluidas en las 1,200 plantas reportadas por Marles y Farnsworth (1995). De acuerdo con Aguilar y Xolalpa (2002), así como Hernández et al. (2002), entre las familias botánicas que contribuyen con más especies antidiabéticas mexicanas se encuentran Asteraceae, Leguminosae y Cactaceae (Figura 1). Las especies vegetales con mayor número de citas bibliográfcas, de investigaciones etnobotánicas realizadas en diferentes localidades del país que hacen referencia a su uso como remedio antidiabético y que se pueden considerar como las más ampliamente utilizadas por la población mexicana en el control empírico de la DM (Hernández et al. 2002a) son Opuntia sp, Tecoma stans y Aloe barbadensis (Figura 2). Como se indicó anteriormente, las plantas mexicanas más ampliamente investigadas hasta 1990 eran únicamente el nopal Opuntia streptacantha y la tronadora Tecoma stans. Es apenas en los últimos 12 años que varios investigadores de diversas instituciones y universidades del país (Instituto Mexicano del Seguro Social, Universidad Autónoma Metropolitana, Universidad Nacional Autónoma de México, entre otras) se abocaron al diseño de modelos adecuados y a la realización de estudios dirigidos hacia la validación experimental y clínica de las plantas antidiabéticas mexicanas. En estos últimos 12 años, las investigaciones en México se han centrado hacia los siguientes objetivos generales: 1. Validar el efecto antihiperglucémico de plantas reportadas como antidiabéticas. 2. Estudiar el mecanismo de acción hipoglucemiante de las plantas con mayor efecto antihiperglucémico. 3. Iniciar el aislamiento y la caracterización química de los principios activos. A continuación se comentan algunos de los resultados más sobresalientes obtenidos dentro de las actividades de investigación del Laboratorio de Farmacología de la Universidad Autónoma Metropolitana, unidad Iztapalapa, en el cumplimiento de estos tres objetivos. 1. Validación del efecto antihiperglucémico de plantas reportadas como antidiabéticas. Con base en la información etnobotánica se seleccionaron las 62 plantas antidiabéticas más citadas y que estuvieran ampliamente distribuidas en el país, dando prioridad a las especies endémicas, así como a las comestibles. El modelo experimental para la evaluación de estas plantas consistió en un modelo in vivo de conejos con hiperglucemia temporal, la cual fue inducida mediante la administración de dos inyecciones subcutáneas de solución glucosada al 50%, al inicio del experimento y 60 minutos después. Es decir, se realizaron pruebas subcutáneas de tolerancia a la glucosa con doble carga, previa administración intragástrica de las preparaciones tradicionales de las plantas antidiabéticas seleccionadas. Como controles se usó agua y tolbutamida. La signifcancia de las diferencias entre las medias de los grupos control y los tratados con plantas antidiabéticas fueron evaluadas mediante un análisis de varianza, usando la Nueva Prueba de Amplitud Múltiple de Duncan y un nivel mínimo de signifcancia del 95%. En el cuadro 1 se enlistan las 62 plantas antidiabéticas estudiadas en este modelo experimental (Román et al. 1991, 1992a, 1995; Alarcón et al. 1998). Figura 1. Familias botánicas que contribuyen con el mayor número de especies antidiabéticas en México. 0 5 10 15 20 25 30 35 Familia Figura 2. Plantas antidiabéticas mexicanas más ampliamen- te citadas. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Especies 31 De estas 62 plantas se ha logrado convalidar actividad en 33. En la Figura 3 se muestra el porcentaje de disminución del área bajo la curva producido por las 21 plantas más efcaces. Como se puede observar, las plantas más efcaces, con descensos del área bajo la curva de tolerancia a la glucosa que oscilaron entre un 20 y un 32% fueron: Guaiacum coulteri, Cucurbita fcifolia, Psacalium Cuadro 1. Plantas estudiadas en conejos con hiperglucemia temporal. No. NOMBRE CIENTÍFICO FAMILIA NOMBRE POPULAR PARTE USADA 1 Acourtia thurberi (Gray.) Rev. Et King. Asteraceae Matarique Raíz 2 Aloe bardabensis Mill. Liliaceae Zábila Tallo 3 Allium cepa L. Liliaceae Cebolla Bulbo 4 Allium sativum L. Liliaceae Ajo Bulbo 5 Artemisia mexicana Willd. Asteraceae Estafiate Planta completa 6 Astianthus viminalis H.B.K. Bignoniaceae Azuchil Hojas 7 Bauhinia divaricata Linn. Leguminosae Pezuña de vaca Hojas 8 Bidens pilosa L. Asteraceae Aceitilla Planta completa 9 Brassica oleracea L. Cruciferae Col Hoja 10 Brassica oleraceae L. var. botrytis Cruciferae Coliflor Inflorescencia 11 Buddleia americana Linn Loganiaceae Tepozán Hojas 12 Calea zacatechichi Schltdl. Asteraceae Prodigiosa Hoja, tallo y raíz 13 Cecropia obtusifolia Bertol. Moraceae Guarumbo Hojas 14 Citrus aurantium L. Rutaceae Naranja agria Fruto fresco 15 Cnidoscolus multilobus (Lex.) L.M. Euphorbiaceae Chaya Hojas 16 Coix lachryma -jobi Linn. Gramineae Lágrimas de San Pedro Hoja, tallo y raíz 17 Crataegus pubescens (H.B.K.) Steud. Rosaceae Tejocote Raíz 18 Cucumis sativus L. Cucurbitaceae Pepino Fruto 19 Cucurbita ficifolia (L.) Bouché. Cucurbitaceae Chilacayote Fruto 20 Cuminum cyminum L. Umbelliferae Comino Semilla 21 Cynodon dactylon (L.) Pers. Gramineae Grama Hoja, tallo y raíz 22 Eriobotrya japonica (Thund) Lindl. Rosaceae Níspero Hojas 23 Eucaliptus globulus Labill. Myrtaceae Eucalipto Hojas 24 Euphorbia preslii Euphorbiaceae Golondrina Planta completa 25 Euphorbia prostata Aiton. Euphorbiaceae Golondrina Planta completa 26 Exostema caribaeum (Jacq.) Roem. & Schult. Rubiaceae Quina Corteza 27 Eysenhardtia polystachya (Ortega) Sarg. Leguminosae Palo dulce Tallo 28 Guaiacum coulteri A. Gray Zygophillaceae Guayacán Tallo 29 Guazuma ulmifolia Lam. Sterculiaceae Guacima Hojas 30 Jatropha dioica Sessé ex Cerv. Euphorbiaceae Sangre grado Raíz 31 Lactuca sativa L. var. Romána. Asteraceae Lechuga Romána Hojas 32 Lepechinia caulescens (Ort.) Epl. Labiatae Salvia Flores, hojas y tallo 33 Mangifera indica L. Anacardiaceae Mango Hojas No. NOMBRE CIENTÍFICO FAMILIA NOMBRE POPULAR PARTE USADA 34 Marrubium vulgare Linn. Labiatae Marrubio Hoja, tallo y raíz 35 Mentha piperita L. Labiatae Hierbabuena Planta completa 36 Musa sapientum L. Musaceae Plátano Flores frescas 37 Olea europaea L. Oleaceae Olivo Hojas 38 Opuntia ficus indica (L.) M. Cactaceae Nopal Tallo fresco 39 Opuntia streptacantha Lemaire. Cactaceae Nopal-Xoconostle Tallo 40 Parmentiera edulis D.C. Bignoniaceae Chote Fruto fresco 41 Pavonia schiedeana Steud. Malvaceae Cadillo Hoja y tallo 42 Persea americana (L.) Mill. Lauraceae Aguacate Semillas 43 Phaseolus vulgaris Linn. Leguminosae Frijol Vainas 44 Physalis philadelphica Brot. Solanaceae Tomate verde Cáscara 45 Psacalium decompositum (Gray) . Asteraceae Matarique Raíz 46 Psacalium peltatum (H.B.K.) Cass. Asteraceae Matarique Raíz 47 Psidium guajava L. Myrtaceae Guayaba Fruto 48 Randia echinocarpa Moc. & Sessé Rubiaceae Granjel Fruto 49 Rauwolfia tetraphylla L. Apocynaceae Paulillo Hojas 50 Rhizophora mangle L. Rizophoraceae Mangle rojo Tallo 51 Salpianthus macrodonthus Stand. Nyctaginaceae Catarinilla Raíz, hojas 52 Senna skinneri Benth. Leguminosae Paracata Hojas 53 Serjania triquetra Radlk. Sapindaceae Palo de 3 costillas Tallo 54 Solanum verbascifolium Linn. Solanaceae Malabar Hoja y tallo 55 Spinacea oleracea L. Chenopodiaceae Espinaca Hojas 56 Taraxacum officinale Weber. Asteraceae Diente de león Completa 57 Tecoma stans (L.) H.B.K. Bignoniaceae Tronadora Hoja y tallo 58 Teucrium cubense Jacq. Labiatae Agrimonia Hoja y tallo 59 Trigonella foenum – graecum L. Leguminosae Fenogreco Semillas 60 Tournefortia hirsutissima L. Boraginaceae Lágrimas de San Pedro Tallo 61 Turnera diffusa Willd Turneraceae. Damiana Hojas 62 Urtica dioica Wedd. Urticaceae Ortiga Hojas 32 peltatum, Lepechinia caulescens, Marrubium vulgare, Opuntia streptacantha, Guazuma ulmifolia, Solanum verbascifolium y Phaseolus vulgaris. Todas ellas causaron descensos altamente signifcativos (P<0.05) con respecto a los datos del control (agua) e incluso fueron superiores a los producidos por la tolbutamida (Figura 3). Las cuatro primeras fueron seleccionadas para continuar con el estudio dirigido hacia la dilucidación de su mecanismo de acción hipoglucemiante, es decir, el siguiente de nuestros objetivos generales. Vale la pena mencionar que rastreos farmacológicos de este tipo, en los que se usa un modelo experimental para evaluar el efecto sobre la glucemia de varias plantas medicinales, sólo se han realizado dos: usando conejos con hiperglucemia temporal y usando ratones sanos y diabéticos. En este último modelo se estudió el efecto hipoglucémico de 20 plantas antidiabéticas mexicanas, convalidándose actividad en la mayoría (Pérez et al. 1984). 2. Estudio del mecanismo de acción hipoglucemiante de las plantas con mayor efecto antihiperglucémico. Los animales de experimentación empleados para esta parte del trabajo fueron conejos y ratones (Román et al, 1992b; Alarcón, 1997). En ambas especies se indujo diabetes experimental mediante la administración intraperitoneal de aloxana, fármaco que destruye de manera selectiva las células beta del páncreas de estos animales. El diseño experimental consistió en la administración del lioflizado obtenido a partir de las preparaciones tradicionales de Cucurbita fcifolia, Guaiacum coulteri, Lepechinia caulescens y Psacalium peltatum a conejos y ratones sanos, con diabetes moderada (glucemias en ayuno de 150 a 350 mg/dl) y con diabetes grave (glucemias en ayuno superiores a 350 mg/dl). Estas plantas mostraron descensos signifcativos de la glucemia en conejos sanos con hiperglucemia temporal, tanto en el pico hiperglucémico como en el área bajo la curva de tolerancia a la glucosa (Figura 4). Por su parte, en animales con diabetes moderada, las cuatro plantas mostraron evidente efecto hipoglucémico (Figura 5). Así, tanto en ratones sanos como en ratones con diabetes moderada estas cuatro plantas produjeron reducciones signifcativas de la glucemia, de manera similar a las reducciones producidas por la tolbutamida. Sin embargo, en animales con diabetes grave, ni la tolbutamida, ni las plantas antidiabéticas estudiadas lograron reducir la hiperglucemia (Figura 6). Figura 4. Curvas de tolerancia a la glucosa en conejos sa- nos, después de la administración intragástrica de las plantas antidiabéticas con mayor actividad (*diferencia signifcativa con respecto al control, P<0.05). Figura 5. Curvas glucémicas en conejos con diabetes mo- derada, después de la administración gástrica de las plantas antidiabéticas con mayor actividad (*diferencia signifcativa con respecto al control, P<0.05). Figura 3. Porcentaje de disminución del área bajo la curva de las 21 plantas más efcaces. Con respecto al control con agua, todas mostraron descensos estadísticamente signif- cativos (P<0.05). P la n t a s e s t u d ia d a s Porcentaje de disminución 0 5 10 15 20 25 30 35 G lu c e m ia ( m g / d l) Tiempo (min) Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum 0 0 50 150 100 200 300 250 60 120 180 240 300 G lu c e m ia ( m g / d l) Tiempo (min) Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum 0 0 50 150 100 200 300 250 60 120 180 240 300 33 El extracto acuoso obtenido de las tres especies resultó ser el más activo por lo que se procedió a su fraccionamiento y a la separación de los compuestos que lo conforman. Con los datos obtenidos hasta ahora se puede decir que la naturaleza química de los principios activos es del tipo de los carbohidratos. Sin embargo, la estructura química de los mismos aún no se ha dilucidado. A este respecto, cabe señalar que de 13 especies mexicanas con propiedades antidiabéticas se han propuesto 17 agentes hipoglucemiantes potenciales (Cuadro 2) (Hammouda y Amer 1960; Hammouda et al. 1964; Inman et al. 1999; Alarcón et al. 2000a, 2000b; Andrade et al. 2000; Pérez 1997; Perez et al. 2000a, 2000b; Meckes et al. 2001; Andrade y Wiedenfeld, 2001; Román et al. 2001; Perez y Vargas 2002; Alarcón et al. 2003b). Resultados similares se han obtenido en ratones con diabetes moderada y grave para estas plantas (Alarcón 1997). Debido a que las plantas antidiabéticas sólo muestran actividad en animales con diabetes moderada, es decir en animales que aún contienen células funcionales beta, pero no en animales carentes de dichas células, se puede deducir que estas plantas requieren de la presencia de insulina para poder ejercer su acción hipoglucemiante. Aunque aún no es posible afrmar que las plantas antidiabéticas aumentan la síntesis y secreción de insulina, o si incrementan la sensibilidad de los receptores a esta hormona, estos resultados dejan entrever que el uso de estas plantas en el control de los pacientes con DM debe restringirse, previos estudios toxicológicos, únicamente a aquéllos con diabetes tipo 2. 3. Aislamiento y caracterización química de los principios activos. Tres de las plantas con mayor actividad fueron seleccionadas para cumplir con el tercero de nuestros objetivos generales: iniciar el aislamiento y la caracterización química de los principios activos. Las plantas estudiadas fueron P. decompositum, P. peltatum y L. caulescens (Román et al. 2001; Alarcón et al. 2000a, 2000b; Contreras et al. 2002). Con algunas variantes, la metodología empleada en esta parte del trabajo consistió en la obtención de extractos con disolventes de polaridad creciente (hexano, cloruro de metileno, metanol y agua), fraccionamiento por cromatografía en columna y/o capa fna del extracto con mayor actividad y separación de los compuestos activos por cromatografía en capa fna usando placas preparativas (Figuras 7 y 8). Figura 6.Curvas glucémicas en conejos con diabetes grave, después de la administración gástrica de las plantas antidia- béticas con mayor actividad. Las plantas no mostraron activi- dad hipoglucemiante en este modelo. Figura 7. Metodología empleada para la obtención de los ex- tractos orgánicos y acuoso. Figura 8. Metodología empleada para el análisis cromatográ- fco de los extractos por CCF. G lu c e m ia ( m g / d l) Tiempo (min) 0 0 100 300 200 400 600 500 60 120 180 240 300 Agua Tolbutamida C.ficifolia G.coulteri L.caulescens P.peltatum Obtención de los extractos 1 Kg de planta seca Maceraciones sucesivas con solven- tes de polaridad creciente (Hexano, diclorometano, metanol y agua) Evaporación en un rotavapor Resuspensión en solución salina o aceite de maíz Análisis cromatográfco del extractor por ccf Re suspensión del extracto en metanol Fracción acuosa Análisis cromatográfco por ccf con grupo amino Separación cromatográfca por ccf preparativa con grupo amino Recuperación de las muestras Re suspensión Fracción metanólica 34 Como resultado de este análisis general, podemos decir que de las 269 plantas antidiabéticas reportadas en México y de las 80 que han sido estudiadas, alrededor de 40 han mostrado efecto hipoglucémico importante y que el resto muestra resultados negativos o contradictorios. Con los datos obtenidos hasta ahora no se puede afrmar de manera categórica la ausencia de efecto hipoglucémico en este último grupo de plantas, ya que en la mayoría de los experimentos se ha evaluado únicamente el efecto hipoglucémico agudo. No se descarta la posibilidad que el efecto hipoglucémico de algunas de estas plantas sólo se pueda apreciar en estudios crónicos, como es el caso de Aloe barbadensis (Ali-Ajabnoor 1990). A este respecto, cabe señalar que apenas en el 5% de las 80 plantas estudiadas se han realizado estudios con administración crónica de la planta. Por otro lado, únicamente en el 10% de las plantas estudiadas se han efectuado estudios clínicos, lo que refeja, a su vez, el mínimo número de estudios realizados en los que se han valorado los probables efectos toxicológicos producidos por estas plantas en el ámbito experimental (sólo en tres especies). Por su parte, en cuanto al aislamiento y caracterización química de las sustancias responsables de la actividad hipoglucemiante, en poco más del 16 % se ha propuesto un agente hipoglucemiante potencial. A continuación se hace una breve descripción de algunas otras investigaciones que actualmente se están llevando a cabo con cinco plantas antidiabéticas mexicanas que han mostrado efectos farmacológicos importantes. Cuadro 2. Agentes hipoglucemiantes potenciales que se han propuesto de plantas antidiabéticas mexicanas. FAMILIA NOMBRE CIENTÍFICO NOMBRE POPULAR PARTE USADA SUSTANCIA ACTIVA REFERENCIAS Asteraceae Brickellia veronicaefolia Gray. Hierba dorada Hojas 5,7,3´-trihydroxi-3,6,4´- trimetoxiflavona (flavonoi- de). Perez et al. 2000b Asteraceae Psacalium decom- positum (Gray). Matarique Raíz Cacalol (furoeremofilano) y una fracción acuosa (polisacárido). Inman et al. 1999, Alarcón et al. 2000a, 2000a Cactaceae Opuntia fcus- indicaL. Nopal Cladiodos Polisacárido Alarcón et al. 2003b O. streptacantha Nopal Cladiodos Polisacárido Alarcón et al. 2003b Bignoniaceae Astianthus vimina- lis H.B.K. Azuchil Hojas Iridioides Meckes et al. 2001 Bignoniaceae Parmentiera edu- lis D.C. Cuajilote Fruto Lactucin-8-O-metilacrilato (guaianolida). Perez et al. 2000a Bignoniaceae Tecoma stans (L.) H.B.K. Tronadora Hoja Tecomina y tecostanina (alcaloides). Hammouda y Amer 1960; Hammouda et al. 1964. Equisetaceae Equisetum myrio- chaetum Schlecht. Cola de Caballo Tallo Caemferol-3-O-soforo- sida-4´-O-β-D-glucósido (glucósido) Andrade et al. 2000 Ericaceae Agarista mexicana (Hemsl) Judd. Palo santo Hojas 23,24 dimetil-24-etil-stig- mast-25-ene y 12-ursene (triterpenos) Perez y Vargas 2002 Labiatae Lepechinia cau- lescens (Ort) Epl. Salvia Flores Fracción acuosa Román et al. 2001 Moraceae Cecropia obtusifo- lia Berthold. Guarumbo Hojas Isoorientin (flavonoide) y 3-ácido cafeoilquinico (ácido clorogénico). Andrade y Wiedenfeld 2001 Nyctaginaceae Salpianthus are- narius (H.B.K.) G. Ort. Catarinilla Flores Saliriol. Pérez 1997. Palmae Acrocomia mexi- cana Karw. Cocoyol Raíz Coyolosa. Pérez 1997. 35 Investigaciones con otras plantas antidiabéticas mexicanas Cucurbita fcifolia Bouché (Cucurbitaceae). La planta es conocida popularmente como chilacayote y se cultiva principalmente por sus frutos comestibles, aunque también se usan como medicinales (Xolalpa 1990). La planta se encuentra reportada para el tratamiento de heridas, febre y hemorroides (Hernández 1959; Esteyneffer 1978), pero el uso más actual es para el tratamiento de la DM tipo 2. C. fcifolia ha mostrado actividad hipoglucemiante en conejos con hiperglucemia temporal, en conejos con diabetes inducida con aloxana y en pacientes con diabetes tipo 2 (Román et al. 1991, 1992b; Acosta-Patiño et al. 2001). Sin embargo, en los estudios previos realizados en conejos se usó el jugo fresco de la pulpa obtenida de frutos maduros, mientras que en los estudios realizados en humanos se evaluaron frutos inmaduros. El efecto hipoglucémico agudo del lioflizado obtenido del jugo de frutos maduros de C. fcifolia fue también estudiado en ratones sanos y con diabetes inducida con aloxana (Alarcón et al. 2002a). La administración intragástrica e intraperitoneal de esta preparación produjo disminuciones signifcativas de la glucemia de manera dosis dependiente en ratones sanos. En ratones diabéticos, la administración de C. fcifolia también mostró efecto hipoglucémico agudo. Además, la administración intragástrica diaria de esta preparación a ratas diabéticas también mostró reducciones altamente signifcativas de la glucemia después de 14 días de tratamiento. Sin embargo, el lioflizado del jugo obtenido del fruto maduro de C. fcifolia produjo signos de toxicidad en estos animales (Hernández et al. 2002b). Así, es necesario continuar con la investigación toxicológica de esta preparación para determinar su seguridad en el control de la diabetes tipo 2. Además, es necesario iniciar los estudios dirigidos al aislamiento y caracterización química de las sustancias hipoglucemiantes y hacia la dilucidación de su mecanismo de acción. Ibervillea sonorae Greene (Cucurbitaceae) (Syn. Maximowiczia sonorae S. Wats.). Es una planta usada como medicinal por varias etnias del Norte de Sinaloa y Sonora, conocida en México como guareke (Lopez & Hinojosa 1988, Xolalpa 1994). En la actualidad, su uso en el control de la diabetes tipo 2 se encuentra muy difundido en nuestro país. La administración oral del lioflizado de la decocción de la raíz de I. sonorae no mostró descensos signifcativos de la glucemia en ratones sanos. Sin embargo, su administración por vía intraperitoneal produjo descensos signifcativos de la glucosa de manera dosis dependiente. El extracto también redujo la glucemia de ratas con diabetes moderada pero no de ratas con diabetes grave (Alarcón et al. 2002b). Es necesario remarcar que la investigación química, farmacológica y toxicológica de I. sonorae se debe continuar para fundamentar su uso en el control de la diabetes mellitus. Además, debido al uso indiscriminado de la raíz de esta planta, lo que merma indiscutiblemente la distribución de la especie, es importante iniciar programas dirigidos a la preservación y mejoramiento de este importante recurso medicinal. Opuntia fcus-indica L. y Opuntia streptacantha Lem. (Cactaceae). Estas dos especies vegetales son las más ampliamente usadas en el control de la diabetes tipo 2 en México y son también las más estudiadas, tanto a nivel experimental como a nivel clínico. Diversas preparaciones tradicionales de ambas especies han sido evaluadas en conejos con hiperglucemia temporal, en conejos con diabetes inducida por aloxana, voluntarios sanos y pacientes con diabetes tipo 2 (Ibañez y Román 1979; Frati et al. 1991; Alarcón et al. 1998; Ramos et al. 2000). En estos estudios, los resultados parecen sugerir que el efecto producido por O. fcus-indica podría ser explicado por un mecanismo que reduce la absorción intestinal de glucosa (efecto fbra). Por su parte, el mecanismo de acción hipoglucemiante sugerido para O. streptacantha parece estar asociado con la existencia de una sustancia hipoglucemiante que produce su actividad por absorción. A pesar de que estas acciones han sido estudiadas convenientemente, la naturaleza de los compuestos hipoglucemiantes no se ha establecido. En 1999 se aislaron dos polisacáridos, uno de O. fcus- indica (POLOF) y otro de O. streptacantha (POLOS). Aunque ambos mostraron importantes diferencias en cuanto a la composición de monosacáridos, los dos fueron descritos como polímeros altamente complejos (Zempoaltecatl 1999). En la actualidad, la actividad hipoglucemiante de ambos polisacáridos se está estudiando en diferentes modelos experimentales y, al parecer, los resultados son alentadores (Alarcón et al. 2003b). Psacalium decompositum (Gray.) Rob. et Brett. (Asteraceae) (Syn. Cacalia decomposita A. Gray). Es una de las plantas antidiabéticas mexicanas más importantes que forma parte del “complejo Matarique” (Bye 1986; Aguilar et al. 1994). La planta ha mostrado actividad en conejos con hiperglucemia temporal, en ratones sanos y en ratones con diabetes experimental (Alarcón et al. 1997). Estudios ftoquímicos muestran que los principales constituyentes de la raíz son de naturaleza 36 sesquiterpénica, tales como cacalol, cacalona, maturina, maturinona y maturona (Correa y Romo 1966). Aunque el efecto hipoglucémico de algunos de estos compuestos ya fue evaluado, los resultados han sido contradictorios. Estos compuestos no mostraron efecto hipoglucémico en ratones sanos (Alarcón et al. 2000a), pero sí en ratones diabéticos obesos genéticamente alterados, designados C57BL/61-ob/ob (Inman et al. 1999). Además, dos polisacáridos obtenidos de la raíz también han mostrado actividad en ratones sanos (Alarcón et al. 2000a, 2000b). Aún son necesarios estudios químicos y farmacológicos para determinar la estructura de estos polisacáridos y evaluar su actividad hipoglucemiante en animales diabéticos. Por otro lado, también se ha reportado la existencia de alcaloides pirrolizidínicos en la raíz de P. decompositum, los cuales son hepatotóxicos, mutagénicos y carcinogénicos (Sullivan 1981; Plaa 1991). Así, es necesario realizar también estudios de toxicidad, principalmente con los extractos impuros. Conclusión Tomando en cuenta que más de las dos terceras partes de la plantas usadas empíricamente en México aún no se han estudiado, se considera importante continuar con la investigación de sus propiedades antidiabéticas y toxicológicas no sólo a nivel agudo, sino también a nivel crónico. Esto permitirá fundamentar su estudio y su uso clínico, con la fnalidad, no sólo de lograr un mejor control de los pacientes con DM tipo 2 que tratan de controlar su padecimiento usando plantas medicinales, sino también para tratar de prevenir el desarrollo de la enfermedad en sujetos con alta predisposición para desarrollarla (con obesidad, resistencia a la insulina, alteración en la glucosa de ayuno, intolerancia a la glucosa, etcétera) (Alarcón et al. 2003a). Además, conjuntamente con investigaciones dirigidas al aislamiento, purifcación y caracterización química de las sustancias responsables de su actividad hipoglucemiante, es también primordial iniciar programas biotecnológicos dirigidos al cultivo, conservación y mejoramiento de estas especies vegetales. Agradecimientos This research was partially supported by the International Foundation for Science, Stockholm, Sweden, and the Organization for the Prohibition of Chemical Weapons, The Hague, The Netherlands, through a grant to Francisco Javier Alarcón-Aguilar PhD. Research Grant Agreement No. F/3338-1. Referencias 1. Abdel J.A., I.A.Abdel-Hassan y MHH Al-Hakiem. 1997. Hypoglycemic and hyperglycaemic effects of Trigonella foenum-graceoum leaf in normal and alloxan induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 58: 149-155. 2. Acosta J.L., B.E. Jimenez, M.A. Juarez y J.C. Diaz. 2001. Hypoglycemic action of Cucurbita fcifolia on type 2 diabetic patients with moderately high blood glucose levels. Journal of Ethnopharmacology 77: 99-101. 3. ADA.1997. American Diabetes Asociation. Clinical practice recommendations. Screening for diabetes. Diabetes Care 20: 8-23. 4. Aguilar C.A., J.R. Camacho, S. Chino, P. Jácquez y M.E. López. 1994. Herbario Medicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social. Información etnobotánica. Instituto Mexicano del Seguro. Mexico D.F. 5. Aguilar C.A., J.R. Camacho, S. Chino, P. Jácquez y M.E. López. 1998. Plantas medicinales del Herbario IMSS: su distribucion por enfermedades. Instituto Mexicano del Seguro Social. Mexico D.F. 6. Aguilar A. y S. Xolalpa. 2002. La herbolaria mexicana en el tratamiento de la diabetes. Ciencia 53: 24-35. 7. Alarcón FJ. 1997. Investigación Experimental de la acción hipoglucemiante de plantas usadas en el control de la diabetes mellitus. Tesis de Doctorado. Universidad Autónoma Metropolitana- Iztapalapa. México D.F. 8. Alarcón F.J., R. Román, J.L. Flores, M. Jimenez, R. Reyes y B. Gonzalez. 1997. Effects of three Mexican medicinal plants (Asteraceae) on blood glucose levels in healthy mice and rabbits. Journal of Ethnopharmacology 55: 171-77. 9. Alarcón F.J., R. Román, S. Perez, A. Aguilar, C. Contreras y Flores J.L. 1998. Study of the anti-hyperglycemic effects of plants used as antidiabetics. Journal of Ethnopharmacology 61: 101-10. 11. Alarcón F.J., M. Jimenez, R. Reyes, B. Gonzalez, C. Contreras y R. Román. 2000a. Hypoglycemic activity of root water decoction, sesquiterpenoids, and one polysaccharide fraction from Psacalium decompositum in mice. Journal of Ethnopharmacology 69: 207-15. 12. Alarcón F.J., M. Jimenez, R. Reyes y R.Román. 2000b. Hypoglycemic effect of extracts and fractions from Psacalium decompositum in healthy and alloxan-diabetic mice. Journal of 37 Ethnopharmacology 69: 207-15. 13. Alarcón F.J., E. Hernandez, E. Campos, S. Xolalpa, J. Rivas, L. Vazquez y R. Román. 2002a. Evaluation of the Hypoglycemic effect of Cucurbita fcifolia Bouché (Cucurbitaceae) in different experimental models. Journal of Ethnopharmacology 82: 185-191. 14. Alarcón F.J., E. Campos, S. Xolalpa, E. Hernandez y R. Román. 2002b. Study of the hypoglycaemic activity of Ibervillea sonorae roots in healthy and diabetic mice and rats. Pharmaceutical Biology 40: 570-575. 15. Alarcón F.J., Banderas D.T., Gutiérrez L.A., Vázquez C.L., Flores S.J.L. y R. Román. 2003a. Study of the antihyperglycemic effect of antidiabetic plants in rabbits with impaired glucose tolerance. Proceddings of Western Pharmacology Society 46: en prensa. 16. Alarcón F.J., A. Valdez, S. Xolalpa, T. Banderas, M. Jimenez, E. Hernandez y R. Román. 2003b. Hypoglycemic activity of two polisaccharydes isolated from Opuntia fcus-indica and O. streptacantha. Proceddings of Western Pharmacology Society 46: en prensa. 17. Ali-Ajabnoor M. 1990. Effect of aloes on blood glucose levels in normal and alloxan diabetic mice. Journal of Ethnopharmacology 28: 215- 220. 18. Ali L., A.K. Azad, M.I. Rouf, M. Mosihuzzaman, N. Nahar, M. Nur-e-Alam y B. Rokeya. 1993. Studies on hypoglycemic effects of fruit pulp, seed, and whole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta Medica 59: 408-412. 19. Andrade A., H. Wiedenfeld, M.C. Revilla y S. Islas. 2000. Hypoglycemic effect of Equisetum myriochaetum aerial parts on streptozocin diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 72: 129-33. 20. Andrade A. y H. Wiedenfeld. 2001. Hypoglycemic effect of Cecropia obtusifolia on streptozocin diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology 78: 145-49. 21. Barceló A. y S. Rajpathak. 2001. Incidence and prevalence of diabetes mellitus in the Americas. Pan American Journal of Public Health 10: 300-8. 22. Bailey J. y C. Day. 1989. Traditional plant medicines as treatments for diabetes. Diabetes Care 12: 553-4. 23. Bye R.A. Jr. (1986) Medicinal plants of the Sierra Madre: comparative study of Tarahumara and Mexican market plants. Economic Botany 40 103-124. 24. Committee Report. 2002. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classifcation of Diabetes mellitus 2002. Diabetes Care 25: S5- S20. 25. Contreras C., S. Perez, F. Alarcón y R. Román. 2002. Anti-hyperglycemic of Psacalium peltatum. Proceddings of Western Pharmacology Society 45: 134-136. 26. Correa J. yd J. Romo. 1966. The constituents of Cacalia decomposita A. Gray. Structure of maturin, maturinin, maturon, and maturinone. Tetrahedron 22, 685-691. 27. Esteyneffer J. 1978. Florilogio Medicinal. Academia Nacional de Medicina. Mexico. 28. Farnsworth N, 0.Akerele, A. Bingel, D. Soejarto y Z. Guo. 1985. Medicinal plants in therapy. Bulletin of World Healt Organization 63: 965-980. 29. Frati-Munari A, B. Gordillo, P. Altamirano, R. Ariza, R. Cortes, A. Chavez, Islas S. 1991. Infuence of nopal intake upon fasting Glucemia in type II and healthy subjects. Archivos de Investigación Médica 22: 51-56. 30. Gómez F.J. y J.A. Rull. 1997. Sulfonilureas. En Tratado de Diabetología de Gómez-Pérez FJ y Rull-Rodrigo JA. Instituto Nacional de la Nutrición. México D.F. 31. Hammouda Y. y S.M. Amer. 1960. Antidiabetic effect of Tecomine and Tecostanine. Journal of Pharmaceutical Science 55: 1452-4 32. Hammouda Y., R.A. Kader y A.M. Samir. 1964. Hipoglycemic propierties of Tecomine and Tecostanine. Journal of Pharmacy and Pharmacology 16: 833-4. 33. Hernández F. 1959. Historia Natural de Nueva España. En: Obras Completas. UNAM (Eds.). Tomo II. México D.F. 34. Hernandez E., A. Aguilar, L. Aguilar, R. Román, MA. Chavez, L. García, J.L Flores y F.J. Alarcón. 2002a. Studies on hypoglycemic action of Mexican medicinal plants. Proceddings of Western Pharmacology Society 45: 118-124. 35. Hernandez E., Campos E, Alarcón F.J., Vazquez L, Flores J.L y R. Román. 2002b. Acute toxicologic effects of Cucurbita fcifolia. Proceddings of Western Pharmacology Society 45:42-43. 36. Ibañez R. y R. Román. 1979. Efecto hipoglucemiante del nopal. Archivos de Investigación Médica 10: 223-230. 37. Inman W.D., J. Luo, D. Jolad, R. King y R. Cooper. 1999. Antihyperglycemic sesquiterpenes from Psacalium decompositum. Journal of Natural Products 62: 1088-1092. 38 38. Lopez R. y A. Hinojosa.1988. Catálogo de plantas medicinales sonorenses. Universidad de Sonora, Hermosillo Son, México. 39. Lozoya M. 1980. Tronadora (Tecoma stans (L.) H.B.K.). Medicina Tradicional (México) 3 (Fascículo): 1-4. 40. Mancillas L.G., F.J. Gómez y J.A. Rull. 2002. Diagnóstico y Clasifcación de la diabetes mellitus, conceptos actuales. Revista de Endocrinología y Nutrición 10: 63-76. 41. Marles R.J. y R. Farnsworth. 1994. Plants as sources of antidiabetic agents. En H. Wagner y N.R. Farnsworth (eds.). Economic and Medicinal Plants Research 6, London Academic Press. 42. Marles R.J. y R. Farnsworth. 1995. Antidiabetic plants and their active constituents. Phytomedicine 2: 137-189. 43. Martínez M. Las plantas medicinales de México. Ed. Botas. México, D.F. 1969. 44. Meckes M., M.L. Garduño, S. Marquina y L. Alvarez. 2001. Iridoides adicionales de la planta medicinal Astianthus viminalis y su actividad hipoglucemiante y antihiperglucemiante. Revista de la Sociedad Química de México 45: 195-9. 45. Molham Al-Habori y Amala Raman. 1998. Antidiabetic and hypocholesterolemic effects of fenugreek. Phytotherapy Research 12: 233-242. 46. Nathan D.M. 1993. Long-term complications of diabetes mellitus. New England Medicine 328: 1676-1685. 47. Pérez-Gutiérrez R.M. 1997. Actividad hipoglucemiante de Salpianthus arenarius, Acrocomia mexicana, Agarista mexicana y Verbesina persicifolia. Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas (UAMI- UAMX, México). 48. Perez R.M. y R. Vargas. 2002. Triterpenes from Agarista mexicana as potential antidiabetic Agents. Phytotherapy Research 16: 55-8. 49. Perez R.M., A. Ocegueda, L. Muñoz, J. Avila y A. Morrow. 1984. Study of the hypoglycemic effect of some Mexican plants. Journal of Ethnopharmacology 12: 253-262. 50. Perez R.M., C. Perez, M.A. Zavala, S. Perez, H. Hernandez y F. Lagunes. 2000a. Hypoglycemic effects of lactucin-8-O-methylacrylate of Parmentiera edulis fruit. Journal of Ethnoparmacology 71: 391-4. 51. Perez R.M., H. Cervantes, M.A. Zavala, J. Sanchez, S. Perez y C. Perez. 2000b. Isolation and hypoglycemic activity of 5, 7,3´-trihydroxy- 3,6,4´-trimethoxyfavone from Brickellia veronicaefolia. Phytomedicine 7: 25-9. 52. Plaa G. 1991. Toxic responses of the liver. En M. Amdur, J. Doull y C. Kaassen (eds.) Casarett and Doull´s toxicology: The Basic Science of Poisons. New York: Pergamon Press, New York. 53. Ramos R., J.L. Flores, L. Tellez, J. Rivas y Alarcón, F.J. 2000. Estudio experimental de la acción antihyperglucemiante del nopal (Opuntia streptacantha Lemaire). Animales de Experimentación, La Revista Hispanoamericana (Mex.) 5: 17-19. 54. Román R., J.L. Flores, G. Partida, A. Lara y F.J. Alarcón. 1991. Experimental study of the hypoglycemic effect of some antidiabetic plants. Archivos de Investigacion Médica 22: 87-93. 55. Román R., F.J. Alarcón, A. Lara y J.L. Flores. 1992a. Hypoglycemic effect of plants used in Mexico as antidiabetics. Archives of Medical Research 23: 59-64. 56. Román R., A. Lara, F.J. Alarcón y J.L. Flores. 1992b. Hypoglycemic activity of some antidiabetic plants. Archives of medical Research 23, 105-109. 57. Román R., J.L. Flores y F.J. Alarcón. 1995. Anti-hyperglycemic effect of some edible Plants. Journal of Ethnopharmacology 48: 25-32. 58. Román R., C.Contreras, G. Nophal, J.L. Flores y F.J. Alarcón. 2001. Blood glucose level decrease caused by extracts and fractions from Lepechinia caulescens in healthy and alloxan-diabetic mice. Pharmaceutical Biology, 39: 317-321. 59. Saltiel A. y R. Kahn. 2001. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature 414: 799-806. 60. Sullivan G. 1981. Detection of pyrrolizidine alkaloids in matarique (Cacalia decomposita). Veterinary and Human Toxicology 23: 6-7. 61. Tennekoon K.H., S. Jeevathayaparan, P. Angunawala, E.H. Karunanayake y K.S.A. Jayasinghe. 1994. Effect of Momordica charantia on key hepatic enzymes. Journal of Ethnopharmacology 44: 93-97. 62. White J.R. 1996. The pharmacologic management of patients with type II diabetes mellitus in the era of new oral agents and insulin analogs. Diabetes Spectrum 9: 227-234. 63. Wildasin E.M., D.J. Skaar, W.R Kirchain y M. Hulse. 1997. Metformin, a promisin oral antihyperglycemic for the treatment of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Pharmacotherapy 17: 62-73. 64. Xolalpa S. 1990. Catálogo de plantas comestibles en la República Mexicana. II. Herbáceas y epíftas. Tesina. Universidad 39 el nopal (Opuntia fcus indica y O. streptacantha) y su utilidad como foculante en el tratamiento de aguas residuales. Tesis Profesional, Universidad Autónoma de Tlaxcala, México D.F. 67. Zimmet P., M.M. Alberti y J. Shaw. 2001. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature 414: 782-787. Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Mexico D.F. 65. Xolalpa S. 1994. Flora Medicinal Mayo de la región de El Fuerte y Choix, Sinaloa. En: Instituto Nacional Indigenista, ed., Biblioteca de la Medicina Tradicional Mexicana. Flora Medicinal Indígena de México. Tomo I, México D.F. 66. Zempoaltecatl A. 1999. Polisacáridos aislados en 40 41 Chemical composition and cytotoxic activity of Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae) Composición química y actividad citotóxica de Lepechinia speciosa(St. Hill) Epling (Lamiaceae) Patricia Fontes Esteves 1 , Ricardo Machado Kuster 2 , Nancy dos Santos Barbi 3 , Fabio de Sousa Menezes 4 1 Laboratório de Estudo Químico de Espécies de Lamiiforeae, Centro de Ciências e da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil. 2 Laboratório de Fitoquímica de Plantas Medicinais, Centro de Ciências e da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil. 3 Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências e da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil. Autor para correspondencia: Fabio de Sousa Menezes School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin, University of Dublin, Dublin 2, Ireland. Tel.: +353851645266 Fax: +35318962810. E-mail:
[email protected] Abstract. In this study we report the chemical composition of the Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae) fractions, as well as their effects on cytotoxic evaluation and anti-proliferative activity. The results have shown that the dichloromethane (FD) and ethyl acetate (FAE)fractions were the best in both assays. From those fractions it was possible to identify oleanolic, ursolic and palmitic acid from FD and rosmarinic acid and verbascoside from FAE. The next step of this research will be to test the isolated compounds from these fractions. Keywords: Lepechinia speciosa; Lamiaceae; Cell viability; Triterpene Acids; Rosmarinic acid; Verbascoside. Resumen En este estudio se informa de la composición química de fracciones de Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae), así como sus efectos en la evaluación citotóxica y actividad anti-proliferativa. Los resultados mostraron que las fracciones diclorometano (FD) y etil acetato (FAE) fueron las mejores en ambos ensayos. De estas fracciones fue posible identifcar en FD: los ácidos oleanólico, ursólico y palmítico y de FAE; ácido rosmarínico y verbascósido. El siguiente paso de esta investigación será ensayar los compuestos aislados de estas fraccciones. Palabras clave: Lepechinia speciosa; Lamiaceae; viabilidad celular; ácidos triterpenos; ácido rosmarínico; verbascósidos. Introduction The Lamiaceae family is comprised approximately of 224 genera and 5,600 species distributed across the world. One of these genera is Lepechinia, which comprises 40 species that are mainly distributed in South America and México [1; 2]. Plants of the genus Lepechinia are used in traditional medicine for the treatment of uterine infections, uterine tumours, stomach ailments, diabetes mellitus control and diarrhoea [3, 4; 1; 5-7]; in addition, previous investigations showed that species of this genus are used for its hypoglycaemic, vasorelaxant, insulinomimetic, antispasmodic, antimicrobial, cytotoxic and antioxidant activities [8; 6; 9; 10; 3; 11; 12; 5]. Some species belonging to the family Lamiaceae also exhibit cytotoxic activities, such as Lamium album [13], Salvia miltiorrhiza [14], Marrubium cylleneum [15], Marrubium velutinum [15], Glossocarya calcicola [16] and Lepechinia bullata [12], and diterpenes are the main responsible for this activity. Phytochemical studies indicate that plants of this 42 genus are sources of tricyclic diterpenes, favonoids and pentacyclic triterpenes [1]. Oleanolic and ursolic acids are common constituents of plants, principally in the Lamiaceae family [17; 18; 19; 20; 21], and may occur in the free acid form or as aglycones of saponins. These triterpenes are mentioned simultaneously because they have similar structural features and pharmacological activities [22; 23]. Previous studies have pointed out their pharmacological effects, such as anti-infammatory [17; 18; 20; 24], anti-tumour [25; 26], antimicrobial [27], hepatoprotective [18], gastro- protective [18; 28], hypoglycaemic [29], anti-HIV [30] and antifungal [31] effects, as well as many others, which may explain the interest in isolating them. Despite these triterpenes possess pharmacological importance and wide distribution in the Plant Kingdom; the literature contains little information about distribution of these tritepenes. Rosmarinic acid and verbascoside are common constituents of the Lamiaceae family. Several biological activities have been reported for rosmarinic acidand verbascoside. Rosmarinic acid has adstringent, anti- infammatory, antibacterial, antioxidant and antiviral activities. The extracts of Melissa offcinalis containing rosmarinic acid are used in the therapy of herpes simplex infection. Phenolic substances like rosmarinic acid can provide protection against cancer [32; 33]. Due to absence of phytochemical and biological studies on Lepechinia speciosa, a medicinal plant widespread in Brazil, we investigated the cell viability on rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), the anti- proliferative activity on human breast adenocarcinoma cells (MCF-7) and analysed the chemical composition of the bioactive fractions, contributing to the limited scientifc knowledge relating to Lepechinia speciosa. The authors believe this information may stimulate further scientifc studies into this natural resource. Experimental Plant material Lepechinia speciosa (St. Hill) Epling (Lamiaceae) was collected in Parque Nacional de Itatiaia, Rio de Janeiro, Brazil, in February 2004. Voucher specimens were deposited and registered in the Herbarium of the Departamento de Botânica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brazil) with nº RFA-28365. Extract preparation The dried and powdered aerial parts (574g) were extracted with ethanol at room temperature for at least 24h (20 x 400ml). Thereafter, the crude ethanol extract (ET) was fltered, dried under reduced pressure (68.21g, extraction yield 11.88% (w/w) of dry weight). This crude extract was redissolved in water (300ml) and ethanol (200ml) and submitted to a liquid-liquid extraction with n-hexane (10 x 100ml); from this an n-hexane fraction (FH) was obtained. This fraction was dried under reduced pressure (12.34g, extraction yield 18.09% (w/w) of ET), and a residue extract (RE1) (31.34g, extraction yield 45.94% (w/w) of ET) was obtained. The residual crude extract (RE 1 ) was partitioned with dichloromethane (10 x 100ml), obtaining a dichloromethane fraction (FD), which was dried under reduced pressure (6.49g, extraction yield 20.71% (w/w) of RE 1 ), yielding another residual extract (RE 2 ) (16.48g, extraction yield 52.58% (w/w) of RE 1 ). The residual crude extract (RE 2 ) was partitioned with ethyl acetate (10 x 100ml), obtaining an ethyl acetate fraction (FAE). This fraction was dried under reduced pressure (5.6g, extraction yield 33.4% (w/w) of RE 2 ), and a residual extract (RE 3 ) (9.72g, extraction yield 58.9% (w/w) of RE 2 ) was obtained. The residual crude extract (RE 3 ) was partitioned with n-butanol (10 x 100ml), obtaining a butanolic fraction (FB), which was dried under reduced pressure (5.48g, extraction yield 56.38% (w/w) of RE 3 ), and an aqueous fraction (FAQ), which was freeze-dried (3.25g, extraction yield 33.44% (w/w) of RE 3 ). Acid-base extraction An aliquot (50mg) of the dichloromethane fraction (FD) was dissolved in CHCl 3 (50ml), treated (x 5) with 5% Na 2 CO 3 (20ml) and fltered after each treatment. The aqueous fraction was treated with concentrated HCl, and the pH was measured. Thereafter, the fraction was extracted (x 10) with CHCl 3 (10ml). The chloroform fraction (91mg) was treated with ethereal CH 2 N 2 . Fractionation and isolation The ethyl acetate fraction (FAE) (1.4g) was fractionated by CC over silica gel, eluted with a solvent gradient from dichloromethane to methanol. The fractions obtained were analyzed by thin-layer chromatography (TLC) using a mixture of EtOAc, acetic acid and water (10:2:3) as developing solvent and grouped according to their chromatographic profle. Fractions 6-12 (eluted with dichloromethane-methanol 5%) were purifed by CC over silica gel, eluted with dichloromethane to methanol. The fractions obtained were analyzed by thin-layer chromatography (TLC) using a mixture of EtOAc, acetic acid and water (10:2:3) as developing solvent and grouped according to their chromatographic profle. Fractions 30 and 31, eluted with EtOAc:MeOH (6:1), were combined, dried and yielded rosmarinic acid (69.5mg). Fraction 28, eluted with EtOAc:MeOH (6:1) 43 contained verbascoside (4.3mg). Purifcation of these fractions led to the pure compounds (Fig.1). GC-MS The GC-MS analysis was carried out in a Hewlett- Packard HP 5890 SII gas chromatograph coupled to a mass spectrometer model Hewlett-Packard HP 5973, with a capillary column DB-1 (30m x 0.20mm). Helium was used as the carrier gas at 2ml min-1, and the temperature was programmed from 50 to 270ºC at 4ºC/ min. The electron impact ionization was set to 70eV. The volume injected was 1.0µl. The injector, detector and column temperatures were 240°C. NMR-Analyses The dichloromethane fraction (FD) (50mg) has been treated with active charcoal and analyzed by 1 H and 13 C-NMR (also APT technique). Mainly two triterpene acids were found in FD extract (Fig.2). The structural elucidation of rosmarinic acid and verbascoside was carried out by comparison of experimental values from 1 H-NMR with values previously reported [34; 35]. Ursolic and oleanolic acids: 13 C-RMN (50MHz, DMSO d 6 / TMS) data: see Table 1. Rosmarinic acid: 1 H-RMN (200 MHz, CDCL 3 /TMS) data: see Table 2. Verbascosídeo: 1 H-RMN (200MHz, CDCL 3 /TMS) data: see Table 3. HO COOH (3) Oleanolic acid HO COOH (4) Ursolic acid O OH (5) Palmitic acid Fig. 1. Chemical structure of the main compounds identifed within the dichloromethane fraction from Lepechinia specio- sa: (1) oleanolic acid; (2) ursolic acid; (3) palmitic acid. Fig. 2. Chemical structure of the compounds isolated of the ethyl acetate fraction from Lepechinia speciosa: (4) rosmari- nic acid; (5) verbascoside. HO HO HO HO HO OH OH OH OH O O O O O O HO HO O O O OH OH HO 2 1 7 8 8' 7' 1' 2' 3' 3'' 2'' 1'' 6'' 1''' 2''' 3''' 5''' 6''' 4''' 6' 4' 5' 1' 1 2 3 4 5 6 3' 2' 5'' 4'' 6' 9' 5' 4' 9 4 3 5 6 (1) Rosmarinic acid (2) Verbascoside α α'' β β'' Table 1. 13C-NMR spectral data for compound 1, 2 (50MHz, DMSO-D6) and data from literature [40; 41]. C 1 a 2 a 1 2 3 12 13 28 78.7 122.1 143.4 181.0 78.8 125.5 138.0 177.7 78.6 122.0 143.5 178.4 78.6 125.1 138.2 177.9 a Data taken from literature (50MHz, CDCl 3 ) Table 2. 1 HNMR spectral data for compound 4 (200MHz, CD3OD J values (Hz) are given in parentheses), and data from literature [35]. H 4 a 4 2 7.03 (d) 7.03 (d, J 1.7Hz) 5 6.76 (d) 6.77 (d, J 8Hz) 6 6.92 (dd) 6.92 (dd, J 1.7 and 8Hz) 7 6.25 (d) 6.26 (d, J 16Hz) 8 7.50 (d) 7.52 (d, J 16Hz) 2’ 6.77 (d) 6.67 (sl) 5’ 6.67 (d) 6.66 (d, J 8.1Hz) 6’ 6.62 (d) 6.51 (dd, J 1.7 and 8.1Hz) 7’α 3.10 (dd) 3.02 (m) 7’β 2.93 (dd) 3.02 (m) 8’ 5.09 (dd) 4.3 (m) a Data taken from literature (50MHz, CD3OD) 44 Cytotoxicity Cell culture Rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3) were cultured in a Eagle’s minimum essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100U/ml penicillin- streptomycin at 37ºC in 5% CO 2 /humidifed air. Human breast adenocarcinoma cells (MCF-7) were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and maintained at 37°C in a 5% CO 2 /humidifed air. LDH assay The cytotoxic effect of L. speciosa fractions was determined by lactate dehydrogenase released method (LDH). The extracts and fractions of L. speciosa were tested on rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at 10mg/ml and diluted in Dulbecco’s Modifed Eagle’s Medium (DMEM) to concentration of 100µg/ml. Two-fold serial dilutions of the extract or fractions (100µl) were added to triplicate wells containing 100µl of cells per well (2 x 10 6 cell/ml). The cells were incubated at 37°C with 5% CO2 and 90% humidity for 24h. For the positive control, which permitted the maximum LDH release, 100µl/well Triton X-100 solution (2% in assay medium) were added to triplicate wells containing 100µl of cells per well. For the cytotoxic standard, 50µl/well terfenadine (100mM) were added to triplicate wells containing 100µl of cells per well. For the background control, 200µl assay medium were added to triplicate wells, and for low control 100µl/well assay medium were added to triplicate wells containing 100µl of cells per well. The plate was centrifuged at 250g for 10min, and 100µl/well of supernatant were removed and transferred to a 96-well fat bottom plate. To determine the LDH activity in these supernatants, 100µl of assay medium from ELISA kit (reaction mixture) were added to each well and incubated for up to 30min at 20°C. Finally, the absorbance of the samples was measured at 490nm using an ELISA reader. The test was performed in triplicate on different days. Percent cytotoxicity values were calculated using Eq. (1). Data are represented as mean values + standard deviation. Sulphorhodamine B (SRB) assay The antiproliferative activity was determined using sulphorhodamine B (SRB) assay. This is a sensitive, reproducible and simple assay. The dichloromethane Cytotoxicity (%) = (experimental value – low control) (positive control – low control) x 100 (1) Table 3. 1 HNMR spectral data for compound 5 (200MHz, CD3OD J values (Hz) are given in parentheses), and data from literature [34]. H 5 a 5 2 6.72 (sl) 6.70 (sl) 5 6.55 (d) 6.6 (sl) (3,4-dihydroxyphenyl)ethyl 6 6.71 (d) 6.65 (d, J 5Hz) β 2.77 (m) 2.97 (d, J 8.8Hz,CH 2 -β) 1’ 4.39 (d) 4.4 (d, J 7.8Hz, H anomeric-glycose) 2’ 3’ 3.85 (t) 3.12-4.26 (CH 2 -α and H from rhamnose and glycose) Glycose 4’ 4.95 (t) 4.76 (m) 5’ 6’ 3.12-4.26 2’’ 7.09 (s) 7.03 (d, J 1.2Hz) 5’’ 6.80 (d) 6.80 (d, J 1.2Hz) Caffeoyl 6’’ 6.94 (d) 6.92 (dd, J 1.2 and 7.6Hz) α’’ 6.29 (d) 6.26 (d, J 16Hz) β’’ 7.6 (d) 7.51 (d, J 16Hz) Rhamnose 1’’’ 5.24 (sl) 5.23 (d, J 2.2Hz, H anomeric-rhamnose) 6’’’ 1.12 (d) 1.2 (d, J 6.8Hz, Me-Rha) a Data taken from literature (50MHz, CD3OD) 45 and ethyl acetate fractions showed signifcant cytotoxic effect against rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), suggesting us to test both fractions against human breast adenocarcinoma cells (MCF-7). The samples were dissolved in DMSO and further diluted with cell culture medium in different concentrations (1, 5, 10, 25 and 50µg/ml). For antiproliferative activity, 100µl of MCF-7 cells (6.0 x 104) were inoculated onto 96-well plates and incubated at 37°C in 5% CO 2 /humidifed air. After 24h, 100µl of L. speciosa fractions were added and incubated for 48h. Posteriorly, the cells were fxed with 50µl of 50% trichloroacetic acid (TCA) for 1h at 4°C. The plates were washed in distilled water and dried at room temperature. The coloration was acquired by addition of 0.4% sulphorhodamine B (50µl) dissolved in 1% acetic acid for 30min. The plates were incubated at 4ºC, washed with 1% acetic acid, four times, and dried at room temperature. The bound SRB was solubilised by addition of unbuffered Tris Base (10mM, pH 10.5) (100µl) and shaken for 5min. The absorbances were read at a wavelength of 515nm (Labsystems Multiscan EX plate reader). The extracts producing a SRB absorbance lower than 25% that of the time zero control value in the cell line were considered to be cytotoxic. The dose response curves and IC50 values (concentration that induce 50% inhibition of cell growth) were calculated. Results and Discussion Extraction and isolation of the compounds. The dichloromethane fraction was methylated with ethereal diazomethane to obtain the methyl ester derivatives and for analysis by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The chromatographic analysis of the dichloromethane fraction is presented in Table 4, while the mass spectrometry result is presented in Table 5. As it can be seen from Table 4, the fraction contained triterpene acids (oleanolic and ursolic acids) and fatty acid (palmitic acid). In this mixture it was possible to identify two major components: ursolic acid (37.08%, RT=49.3min) followed by oleanolic acid (16.53%, RT=46.2min) and one minor component: palmitic acid (1.18%, RT=19.61min). The mass spectrum obtained for these compounds showed a molecular ion at m/z 270, compatible with the molecular formula C 17 H 34 O 2 and in accordance with the structure of palmitic acid methyl ester; the molecular ion at m/z 470 corresponding to the molecular formula C 31 H 50 O 3 and in accordance with the structure of oleanolic acid methyl ester; the molecular ion at m/z 470, compatible with the molecular formula C31H50O3 and in accordance with the structure of ursolic acid methyl ester (Table 5). Characterization of the constituents of this fraction was simplifed by the assignment of the carbon atoms in the 13 C-NMR. As the chemical shift of a sp2 carbon atom is very characteristic for each triterpenoid skeleton, 13 C-NMR spectroscopy is frequently employed for the structural analysis of triterpene mixtures [36]. To distinguish carbon types (multiplicity), the APT (attached proton test) was used. The last step of this mixture resolution before the confrmation by GC/MS was the comparison of the attributed signals of 13 C- NMR spectra obtained for the mixture with previously published data [37]. All the signals obtained in the 13 C-NMR stated for the presence mainly of two triterpenoid acids: oleanolic (compound 1) and ursolic acids (compound 2)(Fig. 1). This has been confrmed by GC/MS where it was also possible to fnd out the identity of a minor component in the extract: palmitic acid (compound 3)(Fig. 1). Analysis of the 13 C-NMR (50MHz, DMSO-D 6 ) spectrum of oleanolic and ursolic acids and comparison with literature data showed characteristic signals for triterpenoids skeleton at δ (ppm): 177.9 (C-28, C=O, ursolic acid); 178.4 (C-28, C=O, oleanolic acid); 138.2 (C-13, ursolic acid); 143.5 (C-13, oleanolic acid); 125.1 (C-12, ursolic acid); 122.0 (C-12, oleanolic acid) and 78.6 (C3, CHO ursolic and oleanolic acids) (Table 1). Methyl ester of acid Retention time (minutes) % total of area Oleanolic 46:243 16.53 Ursolic 49:370 37.08 Palmitic 19:608 1.18 Table 4. Data of the chromatographic analysis of the dichloromethane fraction of L. speciosa. Molecular Formula Compound name 470 C 31 H 50 O 3 Methyl ester of oleanolic acid 470 C 31 H 50 O 3 Methyl ester of ursolic acid 270 C 17 H 34 O 2 Methyl ester of palmitic acid Table 5: Results of mass spectrometry; shown here are the molecular ion, molecular formula and its correspond- ing methyl ester. 46 Oleanolic and ursolic acids are triterpenes that may occur as aglycones of saponins and as free acids. Several studies have reported their occurrence in various medicinal plant families, specially in the Lamiaceae family, as well as their important pharmacological effects [22]. Previous investigations showed signifcant anti- infammatory effect of ursolic acid isolated from organic extracts of species belonging to the Lamiaceae family [17; 20]. The mechanisms of the anti-infammatory effect of ursolic acid have been attributed to the inhibition of histamine release from mast cells and to the inhibition of complementary activity [38; 39]. The ethyl acetate fraction was fractionated by silica gel column chromatography, yielding an ester of caffeic acid, rosmarinic acid (compound 4), and a phenylpropanoid glycoside, verbascoside (compound 5)(Fig. 2). Analysis of the 1 H-NMR (200MHz, CDCl 3 ) spectrum of rosmarinic acid showed signals at δ (ppm): 3.02 (m) relative to 7’αH, 4.3 (m) relative to 8’H and two double signals: 6.26 (d) and 7.52 (d) respecting to hydrogen of double bond (7H and 8H), with coupling constant of J 16Hz, characteristic of trans bond (Table 2). Rosmarinic acid commonly occurs in species of the Boraginaceae and is restricted to the subfamily Nepetoideae of the Lamiaceae family. This compound has several biological activities, such as antiviral, antioxidant, anti-infammatory, antibacterial and antimutagen [33]. Analysis of the 1 H-NMR (200MHz, CDCl 3 ) spectrum of verbascoside has shown a caffeic acid and a (3,4- dihydroxyphenyl)ethyl moieties. The presence of glucose was verifed through the signal of anomeric hydrogen at δ (ppm): 4.44 (1’H, d, J 7.8Hz), bonded to phenylethyl part of molecule under β form. It was determined by coupling constant that indicate a proton axial, because the coupling constant for α form is J 3.5Hz [34]. It was possible to observe the presence of rhamnose due the signal of anomeric hydrogen at δ (ppm): 5.23 (1’’’H, d, J 2.2Hz) and δ 1.2 (6’’’H, d, J 6.8Hz) relative to methylic hydrogen of C-6. The signal at δ (ppm): 4.76 (4’H, m) is characteristic of the substitution with caffeic acid in the C-4 of glycose. The derivative part of caffeic acid was evidenced by signals at δ (ppm): 6.26 (α’’H, d, J 16Hz) and 7.51 (β’’H, d, J 16Hz), both with coupling constant of 16Hz, typical of trans hydrogen bonded to carbon of double bond. The presence of caffeoyl at δ (ppm): 6.80 (5’’ H, d, J 1.2Hz,), 6.92 (6’’H, dd, J 1.2 and 7.6Hz,) and 7.03 (2’’H, d, J 1,2Hz,) and phenylethyl at δ (ppm): 6.60 (5H, sl), 6.65 (6H, d, J 5Hz) and 6.70 (2H, sl) were confrmed by the presence of two signal groups relative to hydrogens of aromatic systems with meta, orto-meta and orto coupling types (Table 3). Cytotoxicity LDH assay The effect of the L. speciosa fractions and extract was studied in the rat basophilic leukaemia cell culture (RBL-2H3) and the effect of them on the cell viability was examined by measuring the cell membrane integrity through the lactate dehydrogenase released method (LDH). This is a colorimetric method for the quantifcation of cell death and lysis, which is based on the measurement of lactate dehydrogenase (LDH) activity released from the damaged cells into the supernatant. All fractions and extract were tested at concentration of 100µg/ml. The results were measured as percentages and compared against a positive control, Triton X- 100 2% solution, and a standard cytotoxic compound, terfenadine. All the fractions and extract increased the release of LDH from the cells into the surrounding culture medium signifcantly, being the release higher than the one promoted by terfenadine. However, the strongest effects were observed for FAE and FD with 94.5% and 91.2% of LDH release, respectively, while the terfenadine showed 66.43% (Fig. 3). Previous results guided us to test both dichloromethane and ethyl acetate fractions against human breast adenocarcinoma cells (MCF-7). Sulphorhodamine B (SRB) assay When the human breast adenocarcinoma cells (MCF- 7) were treated for 48h with the Lepechinia speciosa fractions and extract, the antiproliferative activity was estimated using sulphorhodamine B (SRB) assay, which measures the proliferation of cells. The SRB assay is the second major technique for testing cytotoxicity Fig.3. The released of LDH from rat basophilic leukemia cells (RBL-2H3)(2 x 10 6 cell/ml) after 24h of treatment with L. spe- ciosa fractions and extract (100µg/ml). For the positive con- trol was utilized Triton X-100 solution (2% in assay medium) and as cytotoxic standard, terfenadine (100mM). 0 20 40 60 80 100 ET FH FD FAE FB FAQ terdenadine triton x 2% L D H R e l e a s e ( % ) 47 and it is based on the uptake of the negatively charged pink aminoxanthine dye by basic amino acids in the cell. When the cells are lysed, the released dye gives a more intense colour and greater absorbance. As shown in Fig. 4, both fractions showed growth inhibition in a dose-dependant way, but the dichloromethane fraction, with higher concentration of triterpene acids, showed 95% of growth inhibition at concentration of 50µg/ml (IC 50 =1.99±0.06µg/ml), although the ethyl acetate fraction has shown a very good result as well, 85% of growth inhibition in the maximum tested concentration (IC 50 = 5.14 ± 0.23µg/ml). Similar to the results obtained for the FD of L. speciosa, diterpenes isolated from the dichloromethane fraction of two species of Lamiaceae (Marrubium cylleneum and Marrubium velutinum) exhibited cytotoxic effect against human tumour cell lines of breast, cervix, melanoma and leukemia [15]. The diterpenes obtained from the methanol fraction of Lepechinia bullata and Glossocarya calcicola also showed cell inhibition on nasopharyngeal carcinoma, leukaemia cells, ovarian carcinoma, hepatocyte carcinoma, prostate adenocarcinoma and gland adenocarcinoma [12; 16]. These studies indicate that mainly the ethyl acetate and dichloromethane fractions or substances isolated from these fractions of plants belonging to the Lamiaceae family are responsible for the signifcant cell inhibition in several cancerous cell lines. The current study provides preliminary data on cytotoxic activity of Lepechinia speciosa fractions. The results showed that the dichloromethane and ethyl acetate fractions possess strong cytotoxic effect on rat basophilic leukaemia cells (RBL-2H3), therefore, our study of antiproliferative activity with human breast adenocarcinoma cells (MCF-7) confrms the signifcant cytotoxic activity of the dichloromethane and ethyl acetate fractions. The dichloromethane fraction predominantly contained a mixture of two triterpene acids (ursolic and oleanolic acids) besides one fatty acid (palmitic acid) and the ethyl acetate fraction led to isolation of an ester of caffeic acid, rosmarinic acid, and a phenylpropanoid glycoside, verbascoside. The next focus will be to test the isolated compounds from these fractions. This information can be helpful when estimating the benefcial properties of Lepechinia speciosa fractions or other plant fractions as valuable medicinal raw plant materials to be used for drug development. Acknowledgements The authors wish to acknowledge CNPq for fnancial support and Profª Regina Braga de Moura, Faculdade de Farmácia da Universidade Estácio de Sá, for identifcation of the plant material. References 1. Delgado G, Hernandez J, Chavez MI, Alvarez L, Gonzaga V, Martinez E. Phytochemistry 1994; 37: 1119. 2. Dominguez-Vazquez G, Berlin B, Ramirez AEC, Estrada-Lugo EJI. Serie Botánica 2002; 73:39. 3. Dimayuga RE, Garcia SK, Nielsen PH, Carsten C. Journal of Ethnopharmacology 1991; 31:43. 4. Graham JG, Quinn ML, Fabricant DS, Farnsworth NR. Journal of Ethnopharmacology 2000; 73:347. 5. Parejo I, Caprai E, Bastida J, Viladomat F, Jauregui O, Codina C. Journal of Ethnopharmacology 2004; 94:175. 6. Roman-Ramos R, Flores-Saenz JL, Partida- Hernández G, Lara-Lemus A, Alarcon-Aguilar F. Archivos de Investigation Medica, 1991; 22:87. 7. Azevedo JGA, Lopez JLM, Cortes AM. Fitoterapia 2005; 76: 104. 8. Alarcon-Aguilara FJ, Roman-Ramos R, Perez- Gutierez S, Aguilar-Contreras A, Contrera- Weber CC, Flores-Saenz S. Journal of Ethnopharmacology 1998; 61: 101. 9. Aguirre-Crespo F, Vergara-Galicia J, Villalobos- Molina R, López-Guerrero JL, Navarrete- Vázquez G, Estrada-Soto S. Life Science 2006; 79: 1062. 10. Rodriguez-Lopez V, Salazar L, Estrada S. Fitoterapia 2003; 74:725. Fig.4. The growth inhibition on human breast adenocarcino- ma cells (MCF-7)(6.0 x 104) after 48h of treatment with L. speciosa dichloromethane and ethyl acetate fractions. 0 25 1.0 5.0 10.0 25.0 50.0 50 75 100 Dichloromethane Ethyl Acetate H t n o r G o f ( % ) Concentration of the extracts (ug/ml) 48 11. Rojas R, Bustamante B, Bauer J. Journal of Ethnopharmacology 2003; 88: 199. 12. Jonathan LT, Che CT, Pezzuto JM. Journal of Ethnopharmacology 1989; 31:43. 13. Paduch R, Wójciak-Kosior M, Matysik G. Journal of Ethnopharmacology 2007; 110:69. 14. Mosaddik MA. Phytomedicine 2003; 10:682. 15. Karioti A, Skopeliti M, Tsiltsilonis O, Heilmann J, Skaltsa H. Phytochemistry 2007; 68:1587. 16. Rasikari HL, Leach DN, Waterman PG, Spooner- Hart RN, Basta AH, Banbury LK, Winter KM, Forster PI. Phytochemistry 2005; 66: 2844. 17. Baricevic D, Sosa S, Della Loggin RD, Tubaro A, Simonovska B, Krasna A, Zupancic A. Journal of Ethnopharmacology 2001; 75: 125. 18. Chen JH, Xia ZH, Tan RX. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2003; 32: 1175. 19. Falcão DQ, Fernandes SBO, Menezes FS. Revista Brasileira de Farmacognosia 2003; 13:81. 20. Miceli N, Taviano MF, Giuffrida D, Trovato A, Tzakou O, Galati EM. Journal of Ethnopharmacology 2005; 97:261. 21. Tan N, Kaloga M, Radtke A, Kiderlen AF, Öksüz S, Ulubelen A, Kolodziej H. Phytochemistry 2002; 61: 881. 22. Janicsák G, Veres K, Kakasy AZ, Máthé I. Biochemical Systematic and Ecology 2006; 34:392. 23. Sun H, Fang W, Wang W, Hu C. Botanical Studies 2006; 47:339. 24. Safayhi H, Sailer ER. Planta Medica 1997; 63: 487. 25. Huang MT, Ho CT, Wuang ZY, Ferraro T, Luo YR, Stauber K, Ma W, Georgiadis C, Laskin JD, Conney AH. Cancer Research 1994; 54: 701. 26. Ovesna Z, Vachalkova A, Horvathova K, Tothova D. Neoplasma 2004; 51:327. 27. Mallavadhani UV, Mahapatra A, Jamil K, Reddy PS. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2004; 27:1576. 28. Rodriguez JA, Astudillo L, Schmeda-Hirschmann G. Pharmacological Research 2003; 48:291. 29. Perez RM, Perez C, Perez S, Zavala MA. Phytomedicine 1998; 5:475. 30. Kashiwada Y, Wang HK, Nagao T, Kitanaka S, Yasuda I, Fujioka T, Yamagishi T, Cosentino LM, Kozuka M, Okabe H, Ikeshiro Y, Hu CQ, Yeh E, Lee KH. Journal of Natural Product 1998; 61:1090. 31. Rocha AD, deOliveira AB, de Souza Filho D, Lombardim JA, Braga FC. Phytoterapy Research 2004; 18: 463. 32. Janicsák G, Máthé I, Miklósi VV, Blunden G. Biochemical Systematics and Ecology 1999; 27:733. 33. Peterson M, Simmonds MSJ. Phytochemistry 2003; 62: 121. 34. Andary C, Wylde R, Laffte C, Privat G, Winternitz F. Phytochemistry 1982; 21: 1123. 35. Khunt M, Rimpler H, Heirinch M. Phytochemistry 1994; 36:485. 36. Menezes FS, Borsatto AS, Pereira NA, Matos FJA, Kaplan MAC. Annals of the Brazilian Academy of Science 1998; 70:761. 37. Mahato SB, Nandy AK, Roy G. Phytochemistry 1992; 31:2199. 38. Balanehru S, Nagarajan B. Medical Science Research 1994; 24: 981. 39. Tsuruga T, Chun YT, Ebizuka Y, Sankawa U. Chemical and Pharmacological Bulletin 1991; 39:3276. 40. Maillard M, Adewunmi CO, Hoslettmann K. Phytochemistry 1992; 31:1321. 41. Seo BS, Tomita Y, Tori K. Journal of the Chemical Society, Chemical Communication 1975; 23: 954. 49 ACTIVIDAD HEMATOPOYÉTICA DE Amphipterygium adstringens (Cuachalalate) IN VITRO E IN VIVO HEMATOPOIETIC ACTIVITY OF Amphipterygium adstringens (Cuachalalate) IN VITRO AND IN VIVO * 1 Rodolfo Velasco-Lezama, 2 Catalina Pliego-Villanueva, 1 Rafaela Tapia-Aguilar, 1Elisa Vega-Ávila y 1 Rubén Román-Ramos. 1 Departamento de Ciencias de la Salud. División de Ciencias Biológicas y de la Salud Iztapalapa. Universidad Autónoma Metropolitana. 2 Licenciatura en Biología Experimental. División de Ciencias Biológicas y de la Salud-Iztapalapa. Universidad Autónoma Metropolitana. Autor para correspondencia: Rodolfo Velasco Lezama Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, DF, México 09340 Tel. +55-58046482, Fax. +55-58044727 Correo electrónico:
[email protected] Resumen Amphipterygium adstringens (Anacardiaceae) se emplea contra el cáncer, úlcera gástrica y la anemia. Dosis de 40, 20, 10 y 5 mg/mL de los extractos hexánico, clorofórmico, metanólico y acuoso de la corteza de este árbol se adicionaron a cultivos médula ósea y de bazo de ratones sanos. Se administró también una dosis del extracto acuoso por vía oral (20, 10, y 5 g/kg) durante tres días consecutivos a grupos de 10 ratones, 48 horas después se les realizó una citometría hemática. Los resultados mostraron que en cultivo de médula ósea, sólo el extracto acuoso incrementó la concentración celular. En cultivo de bazo las dosis de 40 y 20 mg/ml de los extractos acuoso y metanólico incrementaron de 3 a 6 veces la concentración celular. En los ensayos in vivo se observaron incrementos en la concentración de leucocitos y plaquetas con las dosis de 0.2 y 0.1 g/mL. El extracto acuoso mostró la presencia de saponinas, taninos y favonoides. Palabras clave: Amphipterygium adstringens, Cuachalalate, hematopoyesis. Summary Amphipterygium adstringens (Anacardiaceae) is used against cancer, gastric ulcer and anaemia. Hexane, chloroform, methanol and aqueous watery extracts of the bark of this tree (40, 20, 10 and 5 mg/mL) were added to cultures of bone marrow and spleen cells from healthy mice. Also, during three consecutive days the aqueous extract was orally administered (20, 10, and 5 g/kg) to groups of 10 mice/each. After 48 hours a cytometric determination was performed. Results showed that in bone marrow cells culture only aqueous extract increased the cell concentration. Doses of 40 and 20 mg/mL of aqueous and metanolic extracts increased 3 to 6 fold the cell concentration in spleen cells cultures. In vivo assays, doses of 0.2 and 0.1 g/kg signifcantly increased the concentration of leukocytes and platelets. The aqueous extract shown to have saponins, tannins and favonoids. Key Words: Amphiperygium adstringens, Cuachalalate, hematopoiesis. 50 Introducción Las células sanguíneas se originan a partir de una célula precursora común de la médula ósea llamada célula tallo (stem cell, denominación en inglés), con capacidad de autorreplicación y de diferenciación hacia las líneas linfoide y mieloide de la sangre. Este proceso es dinámico y complejo para mantener constante la concentración de dichas células a lo largo de la vida del individuo, debido a la vida media relativamente corta de las células sanguíneas estas requieren de renovación continua, (Orkin, 2000). La hematopoyesis puede ser modifcada por agentes físicos, químicos o infecciosos, provocando alteraciones graves de la proliferación de la médula ósea como la anemia aplástica (AA), que se manifesta como pancitopenia (baja generalizada de células sanguíneas). La AA provoca en los enfermos infecciones, cáncer o sangrados graves que frecuentemente causan la muerte a la mayoría de los adultos que la padecen (Brodsky, 2005). El tratamiento más exitoso en la medicina moderna para esta patología es el transplante de médula ósea (Brunstein, 2006). Sin embargo, debido a su costo elevado es inaccesible para la gran mayoría de los pacientes de países en desarrollo, quienes utilizan como alternativa terapéutica plantas con propiedades medicinales, que supone un tratamiento de bajo costo económico, respaldado por el conocimiento y la tradición popular. Para el presente trabajo se seleccionó a Amphipterygium adstringens por ser una planta frecuentemente citada para el tratamiento de ésta y de otros tipos de anemia refractarios a los tratamientos establecidos en la medicina moderna (Aguilar, 1998, NAPRALERT, 2006). Amphipterygium adstringens es un árbol endémico de México que alcanza hasta los 10 metros de altura, habita en clima cálido, semicálido y templado. En nuestro país se le encuentra en los estados de Puebla, Oaxaca, Jalisco, Morelos y Michoacán (Martínez, 1967). Este árbol de la familia Anacardiacea se conoce popularmente como cuachalalate, cuachalá, volador, entre otros. La corteza del árbol es utilizada desde la época colonial para deshacer tumores (Baytelman, 1993). En nuestros días la corteza se emplea para endurecer las encías y el polvo se aplica de manera local para curar heridas, hemorroides y llagas. La decocción de la corteza es tomada como agua de uso contra la úlcera gástrica, cáncer gastrointestinal, tifoidea y contra diversos tipos de anemia (Argueta, 1994). Experimentalmente se ha demostrado que el extracto metanólico de la corteza tiene actividad antitumoral en ratones con adenocarcinoma mamario (González, 1962), es protector gástrico y antiulcerogénico (Navarrete, 2005). Se ha reportado que la corteza tiene triterpenos (Domínguez, 1985), aldehídos y ácidos anacárdicos (Mata, 1993; Aguilar, 2003). Pese al uso frecuente de esta planta contra la anemia, no existen estudios científcos in vitro o in vivo que apoyen las propiedades hematopoyéticas de Amphiterygium adstringens El propósito del presente estudio es determinar si los extractos de la corteza de Amphiterygium adstringens estimulan la proliferación de las células hematopoyéticas de ratón in vitro e in vivo. Materiales y métodos Material Vegetal La planta fue colectada en Yautepec, Morelos, México en febrero de 2006. El material fue identifcado por el Dr. Jorge Santana del Herbario ”Ramón Riba” de la Universidad Autónoma Metropolitana. Animales de Experimentación Se utilizaron ratones macho CD1 de 8 a 12 semanas de edad proporcionados por el bioterio de la Universidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa, mantenidos a temperatura promedio de 24ºC con periodos alternados de luz y oscuridad de 12 h, con ingesta libre de agua y alimento, de acuerdo con los Estatutos del CICUAL (Comité Institucional para el Uso y Cuidado de los Animales de Laboratorio) de la Norma Ofcial Mexicana, para la producción y mantenimiento de animales de laboratorio NOM-062-200-1999. Preparación de los extractos La corteza de la planta se dejó secar a temperatura ambiente protegida de la luz solar directa y del polvo, se molió manualmente (Victoria, Colombia). Se colocaron 500 g del polvo de la planta en 3 litros de hexano, cloroformo, metanol (JT Baker, USA) o agua. En cada disolvente se calentó a refujo durante tres horas, después se fltró con papel Whatman del No. 42. Los disolventes orgánicos se eliminaron en un evaporador rotatorio a presión reducida (Büchi, Switzerland). En el caso del extracto acuoso, el agua se eliminó por lioflización (Labconco, USA). Preparación de las diluciones de los extractos de prueba Los extractos acuoso y metanólico se disolvieron en medio mínimo esencial (MEM) complementado con 10% de suero de caballo inactivado. Los extractos clorofórmico y hexánico se disolvieron con suero de caballo y se prepararon disoluciones de 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 g/mL, las cuales se esterilizaron por fltración en 51 membranas Millipore de 0.45 y 0.22 μm, se verifcó la esterilidad en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI). Ensayos in vitro Cultivo de médula ósea de ratón Se sacrifcó un ratón macho CD 1 de 8-12 semanas de edad por dislocación cervical, el fémur se separó en condiciones de esterilidad y se inyectó a través del canal medular 1 ml de medio de Leibovitz –L-15- (Gibco-BRL, USA), complementado con 10% de suero de caballo (In Vitro, Mex.). La suspensión celular se homogeneizó mediante pipeteo y se llenaron pipetas de Thomas hasta la marca de 0.5 y se llevó hasta la marca de 11 con solución de Turk (dilución 1:20), se contaron las células nucleadas en un hemocitómetro (Boeco, Germany) mediante microscopia de luz en campo claro. Además, se determinó la viabilidad celular con azul de tripano al 0.4% (Vives, 1997). La suspensión celular se ajustó a 4.0 X 105 células viables/mL con solución salina fsiológica (SSF) y 0.1 ml de esta suspensión se adicionó a una mezcla de 0.6 ml de medio de Leibovitz, 0.2 ml de suero de caballo y 0.1 ml del extracto de prueba (concentración fnal de los extractos en los cultivos (40, 20, 10 y 5 mg/mL). Posteriormente, 0.5 ml de la mezcla anterior se depositaron en placas multipozos (Nunc) de 132 X 88 mm e incubaron durante tres días a 37oC en una incubadora con humedad relativa de 90% y 5% de CO2, las células se cosecharon y contaron en un hemocitómetro por microscopia de luz en campo claro (Jackson, 1990). Cultivo de bazo de ratón Un ratón macho CD 1 de 8-12 semanas de edad se sacrifcó por dislocación cervical, se extrajo el bazo en condiciones de esterilidad, se disgregó mecánicamente sobre una malla metálica y se lavó con medio mínimo esencial (Alfa-MEM) frío y con pH 6.8 y 290 mOsm, las células se recibieron en un tubo de plástico de 15 x 100 mm y se centrifugaron dos veces a 2500 rpm durante 15 minutos. El botón celular se resuspendió en 10 ml de medio Alfa-MOPS y se centrifugó nuevamente a 2500 rpm durante 15 minutos. Finalmente, el botón celular se resuspendió en 5 ml de medio alfa-MEM, se determinó la viabilidad con azul de tripano al 0.4%, se ajustó la concentración celular con medio alfa-MEM a 4.0 X 10 5 células viables/mL y 0.1 ml de esta suspensión se adicionó a un sistema de cultivo con 0.6 ml de medio alfa-MEM, 0.2 ml de suero de caballo y 0.1 ml del extracto de prueba (concentración fnal de los extractos 40 y 20 mg/mL). Se colocaron 0.5 ml de la mezcla anterior en placas multipozos Nunc de 132 X 88 mm y se incubaron 48 horas a 37oC con humedad relativa de 90% y 5% de CO 2 (Nakeff, 1981). Las células se recuperaron con pipeta Pasteur y se contaron en un hemocitómetro por microscopia de luz en campo claro (Vives, 1997). En todos los casos se incluyeron cultivos testigos libres de extracto, cada ensayo se realizó al menos cinco veces. La cuenta celular de los cultivos testigos se consideró como el 100% de proliferación y contra ellos se compararon los cultivos de prueba. Los resultados se expresan como la media de la cuenta celular ± error estándar. La comparación entre los grupos fue realizada usando el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba LSD de Fischer. Un valor de p <0.05 fue considerado estadísticamente signifcativo. Evaluación de la actividad hematopoyética de las plantas in vivo Se emplearon ratones macho CD 1 de 8-12 semanas mantenidos con ingesta libre de agua y alimento hasta 8 horas antes de la administración oro-esofágica de una dosis diaria durante tres días consecutivos de 40, 20 y 10 g//kg del extracto acuoso disuelto en solución salina fsiológica (SSF). Cada dosis se administró a grupos de 10 ratones. Se utilizó un grupo testigo de 10 ratones que recibió sólo SSF. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis todos los ratones se anestesiaron con éter y se sangraron por punción cardiaca. La sangre se colectó en tubos con EDTA al 0.1% y se les realizó una citometría hemática. Análisis ftoquímico preliminar Después de los bioensayos se realizó un estudio ftoquímico preliminar del extracto acuoso para conocer las familias de compuestos químicos que se encuentran en el extracto mediante la formación de complejos coloridos o formación de precipitado (Alarcón-Aguilar, 2006). Saponinas Se colocó una porción del extracto en un tubo de ensaye y se disolvió en agua destilada. La solución obtenida se agitó vigorosamente y se formó espuma de más de 1.0 cm, la que permaneció por más de 10 minutos (Alarcón-Aguilar et al, 2006). Posteriormente se realizó la prueba de Rosenthaler (Domínguez, 1985) para lo cual se colocó en dos tubos de ensaye 0.5 ml de la disolución y se le adicionó a uno de ellos 0.1 ml de una solución de vainillina al 0.1% y 2 gotas de H 2 SO 4 . La formación de un color violeta indica la presencia de saponinas terpénicas. 52 Taninos Se disolvió una porción del extracto en 10 ml de cloruro de sodio al 0.85 % y después se fltró. Se colocaron alícuotas de 4 ml en dos tubos de ensaye. Al tubo 1 se le adicionó 0.2 ml de una solución de gelatina al 1.0% en cloruro de sodio 0.85% (Martínez-Vázquez et al, 1999). Al tubo se le adicionó 0.2 ml de una solución de cloruro férrico al 1.0% en ácido clorhídrico concentrado. La formación de precipitado en el tubo 1 indica la presencia de taninos. La formación de un complejo soluble de color verde (tubo 2) indica la presencia de taninos condensados. Flavonoides Se disolvió una porción de extracto en etanol y posteriormente se fltró. Se colocó en un tubo de ensaye una alícuota de 4.0 ml de esta solución, 0.2 ml de ácido clorhídrico concentrado y unas virutas de magnesio (Martínez-Vázquez et al, 1999). La formación de un complejo soluble de color anaranjada, roja, roja azulosa o violeta indica la presencia de favonas, favononas, favonoles, favononoles o xantonas (prueba de Shinoda). En un segundo tubo se colocó una porción del extracto y se solubilizó con ácido sulfúrico concentrado. La formación de un complejo soluble de color amarillo indica la presencia de favonas y favonoles (Domínguez, 1985). Resultados De cada 500 g del material pulverizado se obtuvieron 48, 22, 12 y 1 g de los extractos acuoso, metanólico, clorofórmico y hexánico, respectivamente, lo que representa un rendimiento de 9.6, 4.4, 2.4 y 0.2%. En el análisis ftoquímico del extracto acuoso de detectó la presencia de saponinas triterpenoides, taninos condensados y favonas/favonoles (favonoides). Actividad hematopoyética de Amphipterygium adstringens in vitro En los cultivos de médula ósea sólo el extracto acuoso estimuló la proliferación celular causando incrementos de 2.3, 1.7, 3.1 y 2.9 veces en la cuenta de células a las dosis de 40, 20, 10 y 0.05 mg/mL, respectivamente (Figuras 1 y 2). En todos los casos los incrementos en el número de células fueron estadísticamente signifcativos (p<0.025). Respecto al cultivo de células de bazo, los extractos acuoso y metanólico estimularon la proliferación celular a las dosis de 40 y 20 mg/mL (Figura 3). Con la dosis de 40 mg/mL el extracto acuoso incrementó 5.8 veces la cuenta celular. Sin embargo, el extracto metanólico mostró menor efecto estimulante (2.26 incrementos), mientras que con la dosis de 20 mg/mL. La actividad hematopoyética de ambos extractos fue similar. Figura 1. Actividad hematopoyética de los extractos acuoso y metanólico de A. adstringens en cultivo de médula. Media ± Error estándar, (n=10). 0 5 Testigo 20 20 40 10 10 40 30 60 50 80 70 Extracto Acuoso Extracto Metanílico Solución Salina Fisiológica 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5 Testigo 20 40 10 Extracto Clorofórmico Extracto Hexánico Solución Salina 0 5 Testigo 20 25 0.4 g/mL 0.2 g/mL 10 15 40 45 30 35 Extracto Acuoso Extracto Metanílico Solución Salina Fisiológica Figura 2. Actividad hematopoyética de los extractos cloro- fórmico y hexánico de A. adstringens en cultivo de médula ósea. Figura 3. Actividad hematopoyética de los extractos acuoso y metanólico de A. adstringens en cultivo de células de bazo de ratón. Células X 10 4 /mL * * * * * * * Células X 10 4 /mL Células X 10 4 /mL * * * * mg/mL de extracto 53 Actividad hematopoyética de Amphipterygium adstringens in vivo Los ratones inoculados con el extracto acuoso de A. adstringens no presentaron variación en la concentración de eritrocitos o en los parámetros eritroides valorados (Cuadro 1). Sin embargo, con las dosis de 40 y 20 g/kg de peso corporal se incrementó de manera signifcativa la cuenta de leucocitos y de plaquetas con respecto al grupo testigo o al grupo tratado con las dosis de 10 g/kg (Cuadro 1). Los resultados son expresados como la media + error estándar. La comparación entre los grupos se realizó con el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba LSD de Fisher R:RAO. Valores p<0.05 fueron considerados estadísticamente signifcativos. Discusión En los resultados de los análisis ftoquímicos de la planta se han reportado la presencia de varios isómeros del ácido masticadienóico, los ácidos instipolinácico, cuachalálico y alquianacárdicos. (Olivera, 1999). Además, se han aislado β-sitosterol y una saponina (Soriano, 1987; Aguilar, 2003). Los ácidos instipolinácico y cuachalálico se han relacionado con la actividad antiulcerosa e hipocolesterolemiante de la planta (Domínguez, 1985; Lara, 1996). Considerando que se trabajó con extractos crudos no es posible atribuir a algún compuesto o grupo de compuestos la actividad hematopoyética de la mayoría de los extractos in vitro. Sin embargo, al revisar la composición química reportada y nuestro análisis ftoquímico, las saponinas se encuentran como componentes constantes de la planta (Watson, 1987, Navarrete, 1989). Es conocido que las saponinas esteroidales o triterpénicas son solubles en agua, metanol y otros disolventes polares y como lo muestra el análisis ftoquímico, las segundas están presentes en los extractos acuoso y metanólico evaluados en este estudio. Así, el efecto hematopoyético de nuestros extractos podría atribuirse a compuestos perteneciente a estas familias químicas, las cuales podrían actuar al menos por dos mecanismos. Uno de ellos, por interacción entre las saponinas y la membrana celular que causa cambios transitorios en la estructura de la membrana, cuyos efectos dependen de la concentración y de la estructura de la saponina. Sin embargo, la interacción específca entre las saponinas y la membrana celular aún se desconoce (Walthelm, 2001). Melzing y colaboradores (2001) adicionaron diferentes saponinas comerciales a cultivos de células endoteliales y demostraron la acidifcación celular expresada como hidrólisis de ATP, liberación de los productos de la glucólisis incluyendo ácido láctico y concluyeron que el componente carbohidrato de la saponina desempeña un papel relevante en la interacción saponina-membrana. Este autor considera que las saponinas que interaccionan con colesterol y con otros componentes de la membrana deben tener una estructura específca. En tanto que Mimaki y colaboradores (1996) mencionan que el efecto de las saponinas sobre la proliferación celular se debe a la creación de canales que permiten el tránsito a diferentes compuestos los cuales estimulan o inhiben la proliferación celular y que la capacidad de las saponinas para inhibir el crecimiento de células transformadas (citotoxicidad) o estimular a la proliferación de células no transformadas no depende sólo de la clase de sapogenina (saponina sin carbohidrato), si no más bien del residuo carbohidrato que llevan. Cuadro 1. Actividad hematopoyética del extracto acuoso de Amphipterygium adstringens in vivo Dosis g/kg Eritrocitos X10 12 /L Hematócrito (%) Reticulocitos (%) Leucocitos X10 9 /L Plaquetas X10 12 /L 0.40 11.9 ± 0.8 45 ± 4 0.59 ± 0.12 *19 ± 3 *1.9 ± 0.03 0.20 12.4 ± 0.4 54 ± 6 0.60 ± 0.15 *18 ± 2 *1.7 ± 0.32 0.10 12.2 ± 0.6 48 ± 8 0.47 ± 0.05 10 ± 2 1.6 ± 0.20 Control 13.8 ± 0.4 56 ± 8 0.58 ± 0.13 12 ± 4 1.5 ± 0.21 Media ± error estándar, (n=8). *p<0.05 respecto al grupo testigo. 54 En apoyo al papel de las saponinas para reconocer los receptores membranales y actuar como mitógenos está el hecho de que un extracto de Phytolacca americana que contiene saponinas triterpénicas es usado para estimular la proliferación de linfocitos en la producción de interferón, factores de crecimiento hematopoyético y citocinas (Sparg, 2004). En los cultivos de médula ósea la cuenta de células presentó en promedio un incremento de 2.5 veces con el extracto acuoso, mientras que en los cultivos de bazo fue de 5.0 veces. En los cultivos testigos también se observó diferencia entre la médula ósea y el bazo, la primera incrementó su población 1.7 veces respecto a la concentración inicial, mientras que en el bazo, dicho incremento fue de 4.1 veces. Estos resultados muestran que las condiciones para el desarrollo de ambos tipos de células fueron adecuadas, ya que aún en ausencia de los extractos pudieron multiplicarse, pero lo hicieron con mayor intensidad en presencia de éstos. Por otra parte, los ensayos in vivo con el extracto acuoso sólo incrementaron la concentración absoluta de leucocitos y plaquetas, lo cual podría deberse a que el extracto fue administrado por vía oral y así expuesto al ataque de enzimas de la saliva, del tracto digestivo o plasma sanguíneo causando la pérdida de actividad hematopoyética (Murray, 2001). La capacidad de A. adstringens para estimular la proliferación de linfocitos como lo reportamos aquí, sugiere una actividad inmunológica de la planta, aunque el papel como inmunoestimulante es desconocido. Nuestros resultados in vivo pueden explicar el uso etnomédico de esta planta en el tratamiento de las hipoplasias medulares, particularmente las que provocan leucopenia o trombocitopenia, ya que las dosis de 40 y 20 g/kg estimulan la producción de leucocitos y de plaquetas, Cuadro 1. Aunque la concentración de eritrocitos no se modifca, se observa disminución en el hematócrito, lo que se interpreta como disminución en el volumen celular, dando origen a microcitos, lo que concuerda con la actividad hemolítica de las saponinas (Apers, 2001), misma que no fue total por el tipo de saponinas que se encuentran o las dosis empleadas. En el presente trabajo, los extractos acuoso y metanólico estimularon la proliferación in vitro de las células del bazo de ratones sanos, el 80% de esta población son linfocitos T y B. Este resultado abre un campo de estudio acerca de los posibles efectos inmunoestimulantes aún no descritos para esta planta. El presente estudio respalda el conocimiento y uso popular de esta planta contra la anemia y constituye un recurso terapéutico de bajo costo, que se encuentra en el entorno de los pacientes y cuyo uso podría contrarrestar la leucopenia, trombocitopenia e hipoplasia medular. Además de profundizar en el conocimiento de uno de los recursos vegetales con los que cuenta el país. Referencias 1. Aguilar, C. A., Camacho, J. R., Chino, S., Jacquez, O., López, M. E. (1994). Herbario medicinal del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS). México. Instituto Mexicano del Seguro Social. IMSS. 2. Aguilar, O.C.J., Sosa, V., Aguilar, O. M. (2003). Toxic phenols in various Anacardiaceae species. Economic Bot. 57, 354-364. 3. Alarcón, A. F., Vega, A. E., Almanza, P. J.C., Velasco, L. R., Vázquez, C. L. (2006). Hypoglycemic effect of Plantago major seeds in healthy and alloxan-diabetic mice. Proc West Pharmacol Soc 49, 51-52. 4. Apers, S., Varonikova, S., Sindambiwe, J., B., Witvrrouw, M., De Clercq, E., Vanden, B. D., Van, M., Vlietinck, A. J., Pieters, L. A. C. (2001). Antiviral, haemolytic and mollusicidal activities of triterpenoids saponins from Maesa lanceolata: establishment of structure-activity relationships. Planta Medica. 67, 528-532. 5. Argueta, V. A., Cano, A. l. M., Rodarte, M. E. (1994). Atlas de las plantas de la medicina tradicional mexicana. I. México. Instituto Nacional Indigenista. 6. Baytelman, B. (1993). Acerca de plantas y curanderos. Etnobotánica y antropología médica del estado de Morelos. México. Instituto Nacional de Antropología e Historia. 7. Brodsky, R., Jones, R. J. (2005). Aplastic anaemia. Lancet 353, 1647-1656. 8. Brunstein, C. G., Wagner, J. E. (2006). Umbilical cord blood transplantation and banking. In: Caskey, C. T., Austin, C. P., Hoxie, J., Hematopoiesis. Ann. Rev. Med. 57, 403-419. 9. Domínguez, X. A., Franco, R., García, S., Porras, Ma. E., Vázquez, G., Amezcua, B. (1985). Plantas medicinales mexicanas XLVIII. Estructura del ácido instipolinásico separado de la corteza del cuachalalate (Amphyterygium adstringens Schl.) Rev. Latinoamer. Quím. 14, 99-100. 10. Domínguez, X. A. (1985). Métodos de investigación Fitoquímica. México. Limusa, S. A. de C. V. Tercera reimpresión. 11. González, E. E., Delgado, N. (1962). Phytochemical investigation of Amphipterygium adstringens. J. Pharm. Sci. 51, 786-790. 55 12. Jackson, C. W., Steward, S.A., Chenaille, P.J., Ashmun, R. A., MCDonald, T. P. (1990). An analysis of megakaryocytopoiesis in C3H mouse. An animal model whose megakaryocytes have 32N as modal DNA class. Blood. 76, 690-696. 13. Lara, O. C., Márquez, A. C. (1996). Plantas medicinales de México. Composición, usos y actividad biológica. México. Universidad Nacional Autónoma de México, p.43. 14. Martínez, M. (1967). Las plantas medicinales de México. 6a edición. Ediciones Botas. México. p. 15. Martínez, V. M., González, A. R., Casares, L. L., Moreno, G. M. N., García, A. A. N. (1999). Antimicrobial activity of Byrsonima crassifolia (L.) H. B. K. J. Ethnopharmacol. 66,79-82. 16. Mata, R. (1993). Chemical studies and biological aspects of some Mexican plants used in traditional medicine. In: Downum, K. R., Romeo, J. T., Stafford, H. A. (Eds.) Recent Advances in Phytochemistry Vol. 27. Phytochemical potential of tropical plants. New York. Plenum Press. pp. 41-62. 17. Meltzing, M. F., Bader, G., Loose, R. (2001). Investigation of the mechanism of membrane activity of selected triterpenoid saponins. Planta Medica 67, 48-53. 18. Mimaki, Y., Sashida, Y. (1996). Steroidal saponins from Liliaceae plants and their biological activities. In: Waller, G. R., Yamasaky, K. (Eds.), Saponins used in traditional and modern medicine. Adv. Exp. Med. Biol. 404, 101-110. 19. Murray, R. K., Ganner, D, K., Mayes, P. A., Rodwell, V. W. (2001). Bioquímica de Harper. 15a. edición. México. El Manual Moderno, S. A. de C. V. pp. 759-772. 20. Nakeff, A. (1981). Examination of culture conditions for optimizing the growth of megakaryocyte colonies. In: Evatt, B. L., Levine, R. F., Williams, N. T. (Eds.). Megakaryocyte biology and precursors: In vitro cloning and cellular properties. New York. Elsevier/North- Holland. pp. 111-125. 21. NAPRALERT. (2006). Natural Products Alert. Data Base, University of Illinois in Chicago, USA. 22. Navarrete, A., Mata, R., Delgado, G. (1989). Alkylanacardic acids from Amphipterygium adstringens. Planta Medica 55, 579-584. 23. Navarrete, A., Oliva, M. E., Sánchez, J., Arrieta, L., Cruz, A., Castañeda, H. G. (2005). Gastroprotection and effect of the simultaneous administration of Cuachalalate (Amphiterygium adstringens) on the pharmacokinetics and anti- infammatory activity of diclofenac in rats. J. Pharm. Pharmacol. 57, 1629-1636. 24. Norma Ofcial Mexicana NOM-062-ZOO-1999. Especifcaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio. México. Diario Ofcial de la Federación. 6 de diciembre de 1999. 25. Olivera, O. A.G., Soto, H. M., Martinez, V. M., Terrazas, S, T., Solares, A. F. (1999). Phytochemical study of cuachalalate (Amphipterygium adstringens, Schiede ex Schlecht). J. Ethnopharmacol. 68, 109-113. 26. Orkin, S. H. (2000). Diversifcation of haematopoietic stem cells to specifc lineages. Nat. Rev. Gen. 1, 57-64. 27. Soriano, G. M., Toscano, R. A., Ortíz, B., Navarrete, A., Sánchez, O. S., Barios, H., Yuste, F. (1987). Structure and sterochemistry of the methyl ester of (5α, 13α, 14β, 17α,20S,24Z)-3oxolanosta-7,24-dien-26-oic acid (masticandienoic acid). Acta Crystallograph. 43, 990-992. 28. Sparg, S. G., Light, M. E., van Staden, J. (2004). Biological activities and distribution of plant saponins. J. Ethnopharmacol. 94. 219-243. 29. Vives, C. J. L., Aguilar, B. J. L. (1997). Manual de técnicas de laboratorio en hematología. 2a edición. Barcelona. Masson, S. A. pp. 91-118. 30. Walthelm, U., Dittrich, K., Genbrich, G., Schöpe, Y. (2001). Effects of saponins on the watery solubility of different model compounds. Planta Medica 67, 48-53. 31. Watson, W. H., Domínguez, X. A., Vázquez, G., García, S. (1987). Cuachalalic acid, a new triterpene from Amphypterygium adstringens. Rev. Latinoamer. Quím. 18, 89-90. 56 57 Rastreo de actividad antifúngica en especies medicinales, a través de estudios de microbiología Screening of antifungal activity in medicinal plants through microbiological assays Ofelia Romero-Cerecero 1 , 2 , Rubén Román-Ramos 3 , Enrique Jiménez-Ferrer 2 , Jaime Tortoriello-García 2 . 1 Doctorado en Ciencias Biológicas, División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana, México, DF 2 Centro de Investigación Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social. Argentina 1, Xochitepec, Morelos, México. 3 Departamento de Ciencias Biológicas, División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa, DF, México Autora para correspondencia: Ofelia Romero Cerecero Centro de Investigación Biomédica del Sur, IMSS, Argentina 1, Xochitepec, Morelos, México 62790. Teléfono: +777 3612155; Fax: +777 3612194 Dirección electrónica:
[email protected] Resumen Las plantas medicinales representan una importante fuente potencial para el aislamiento de nuevos agentes antiinfecciosos. En México, diversas plantas son em- pleadas en el tratamiento de enfermedades cutáneas de origen micótico. La investigación de plantas con activi- dad antifúngica recorre un camino desde los estudios et- nobotánicos hasta investigaciones de laboratorio y clíni- cas. En el presente trabajo se revisan diversos estudios que emplearon técnicas bien establecidas de validación de la actividad antifúngica como i) la difusión en agar, ii) dilución y iii) bioautografía. Se analizó la información disponible en revistas indizadas publicadas durante el periodo 1992 al 2008. Los resultados mostraron que se ha encontrado actividad antifúngica en 251 especies vegetales. Las especies estudiadas se clasifcaron en dos grupos, el primero con actividad antifúngica grande y el segundo con actividad moderada. Se identifcaron numerosas plantas con actividad antifúngica, algunas de las cuales no tienen antecedentes de utilización tera- péutica en la comunidad. En la mayor parte de los casos se requieren estudios adicionales para poder utilizar de manera terapéutica estas plantas. Palabras clave: actividad antifúngica, plantas medici- nales, actividad antimicrobiana. Abstract The medicinal plants represent an important potential resource for the isolation of new antiinfective drugs. In México, a variety of medicinal plants are employed for the treatment of cutaneous illnesses elicited by fungi. The investigation of plants with antifungal activity be- gins with ethnobotanical studies and move along re- search in laboratory and clinical settings. The aim of this study was to search scientifc literature validating the antifungical activity of medicinal plants through techniques such as i) agar diffusion, ii) dilution and iii) bioautography. For this purpose, information available in indexed journals published in the period 1992 – 2008 was analyzed. Results showed 251 species has been found to hold antifungal activity. The species studied were classifed in two groups, the frst one with large antifungal activity and the second with moderate activ- ity. Numerous plants with antifungal activity do not have antecedents of therapeutic utilization in the community. In most of the cases additional studies are required before making feasible the clinical utilization of these medicinal plants. Key words: Antifungal activity, medicinal plants, anti- microbial activity 58 Introducción Debido al frecuente desarrollo de resistencia a los me- dicamentos convencionales que producen los agentes patógenos causantes de infecciones humanas, las plantas representan un fuerte potencial en el descu- brimiento de nuevos agentes antiinfecciosos (Ojala et al., 2000). En algunas regiones la importancia de las plantas medicinales es aún mayor debido a que las es- pecies medicinales no sólo son empleadas dentro de la medicina herbolaria, si no que en algunos países las incluyen dentro de su sistema formal de salud (Valsa- raj et al., 1997). Las plantas medicinales son utilizadas para el tratamiento de un variado número de padeci- mientos, sin embargo las infecciones en la piel son de los padecimientos que con mayor frecuencia son trata- dos con plantas. En el estado de Chiapas de México se identifcaron 249 especies que son utilizadas en forma empírica para tratar enfermedades de la piel, así como también se evidenció que la mazamorra, como se co- noce popularmente a la tiña de los pies (padecimiento producido por hongos), se encuentra dentro de los diez padecimientos dermatológicos más frecuentes (Zurita, Zolla., 1986). Para la realización de investigaciones científcas que aborden el estudio de especies vegetales con propiedades antifúngicas se siguen las mismas estrategias que normalmente se utilizan para buscar otras propiedades terapéuticas. La investigación se basa en estudios previos como son: a) el estudio documentado inicial etnobotánico de la fora medicinal; b) la evaluación etnofarmacológica preliminar utilizando la información publicada sobre la ftoquímica y la farmacología. Una vez teniendo los antecedentes básicos, se continúa con los pasos siguientes: 1) rastreo en el laboratorio de las propiedades microbiológicas de las plantas, 2) estudio fítoquímico de las plantas con mayor actividad y, fnalmente, 3) la evaluación farmacológica y toxicológica de la planta (Heinrich et al., 1992). En la mayoría de los casos se toma el antecedente de reportes de investigaciones previas de la especie de interés y se continúa con modelos farmacológicos establecidos y estandarizados con los que es factible evaluar, y en su caso demostrar, la actividad biológica atribuida (Grosvenor et al., 1995). Es importante seguir esta secuencia debido a que en la mayoría de los países que cuentan con una medicina tradicional, existe un amplio trabajo etnobotánico en los que se da cuenta de un número importante de especies vegetales de interés y que no han sido estudiadas en forma sistemática (Marston et al., 1993). Otra razón que justifca el estudio de las plantas medicinales es la variabilidad de los compuestos dentro de los órganos que conforman una planta. Se ha demostrado que la parte útil de la planta identifcada por la etnobotánica puede variar, por lo que es importante considerar la fuente de la información, las condiciones geoclimáticas y la época del año en que se realiza la colecta. Por esta razón, algunos científcos optan por evaluar diferentes partes de una misma planta y utilizan para su extracción disolventes de diferente polaridad (Cáceres et al., 1993). Es importante señalar que no siempre se sigue un criterio basado en la etnomedicina y que en algunas ocasiones, especialmente en aquéllas en las que existen metodologías farmacológicas para realizar un rastreo sistemático como el caso de la microbiología, se hacen tamizajes con pruebas antifúngicas con la fnalidad de identifcar actividad en una variedad de plantas, que incluso pueden pertenecer a diferentes géneros o familias (Vlietinck et al., 1995). Dentro de las especies vegetales se encuentran algunas que son utilizadas con mayor frecuencia para tratar otro tipo de padecimientos de naturaleza infecciosa y, una vez que se identifca su actividad antibacteriana, se intensifca su estudio y se incluye la evaluación de actividad antifúngica (Baba-Moussa et al., 1999). En ocasiones los resultados no son muy alentadores debido a que a pesar de haber realizado una adecuada selección de la planta basada en un criterio etnobotánico, incluso a través de la extracción utilizando diferentes disolventes, los resultados de la evaluación antifúngica no demuestran este tipo de actividad. Algunos autores reportan que este evento se da en una baja proporción de plantas (Desta, 1993; Khafagi, Dewedar., 2000; Armes et al., 2002) y, otros sostienen que la proporción es muy alta (Cos et al., 2002). Existen factores que pueden infuir en el resultado que se obtiene al evaluar la actividad antifúngica de una planta, es importante tener en consideración algunos aspectos como la forma de extracción, considerando el tiempo, el número de veces que se realiza y la temperatura. Son aspectos capaces de modifcar la capacidad inhibitoria del crecimiento microbiano de un extracto vegetal y son capaces de producir discrepancias entre resultados obtenidos por diferentes autores con la misma planta (Masika y Afolayan, 2002; Somchit et al., 2003). El estudio científco de las plantas en ocasiones tiene como objetivo proveer de información útil sobre sus cualidades terapéuticas, especialmente, a poblaciones alejadas o marginadas en las que no existen otras formas de atención a la salud (Taylor et al., 1995; Taylor et al., 1996). Es por esta razón necesario que los países en donde se cuenta con diversidad vegetal, la documentación de plantas medicinales sea tratada como materia de extrema importancia (Srinivasan et al., 59 2001). Algunos autores promueven además, que otros países, en donde se cuenta con recursos económicos sufcientes, se realicen los estudios de las plantas y se compruebe la actividad que se les atribuye (Locher et al., 1995; Al-Fatimi et al., 2007). Esto, con el fn de que una vez demostrada su actividad antifúngica puedan proporcionar información valiosa para el avance en el desarrollo de nuevos agentes antifúngicos o contribuyan con la estandarización de los ftomedicamentos (Jones et al., 2000). Es importante mencionar que para algunos científcos el estudio de las especies con propiedades antifúngicas, no sólo se realiza con la fnalidad de proveer nuevas sustancias con aplicación clínica, si no además, para despertar el interés hacia la investigación de la etnobotánica y la etnofarmacología (McCutcheon et al., 1994). El estudio de las plantas en preparados no industrializados, en algunos casos ha experimentado un interesante avance, se han identifcado trabajos en los que, con la fnalidad de establecer un tiempo de caducidad del material vegetal obtenido de una especie en particular, se han realizado pruebas con plantas que han sido almacenadas por largos periodos (Griggs et al., 2001). A través de la ftoquímica se ha demostrado que las plantas tienen una cantidad importante de metabolitos denominados secundarios. Estos compuestos que no forman parte estructural de la planta, y que la planta los produce como herramientas de subsistencia, forman un reservorio de compuestos orgánicos formados principalmente de moléculas de bajo peso molecular que suelen tener efectos sobre las funciones biológicas y pudieran ser el origen de productos farmacéuticos (Lentz et al., 1998). Estos compuestos están representados por grupos como los favonoides, terpenos, saponinas, compuestos sulfurados, antocianinas y otros glucósidos fenólicos (Quiroga et al., 2001). Además de los productos del metabolismo secundario, se han aislado diversas proteínas, péptidos y lactosas insaturadas con actividad antifúngica, que pudieran ser desarrollados en respuesta a un complicado mecanismo de defensa contra hongos ftopatógenos (Dahot., 1999). En todo el material bibliográfco que se revisó se emplearon técnicas ya establecidas y ampliamente validadas para buscar la actividad antifúngica en una planta como son: A] Difusión en agar: consiste en añadir una cantidad conocida del extracto vegetal en el en un reservorio formado en el medio de cultivo sólido, que entonces se pone en contacto con el microorganismo inoculado pudiendo inhibir su crecimiento y formando un “halo de inhibición” que puede ser cuantifcado. B] Dilución: en este caso, el extracto vegetal se mezcla en el medio de cultivo apropiado y posteriormente, una vez solidifcado se siembra el microorganismo. Con esta técnica es posible determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), que es la concentración más baja que inhibe el desarrollo visible del microorganismo. C] Bioautografía: técnica moderna que combina la cromatografía en placa fna y la microbiología. En este caso se cultiva en un medio apropiado y sobre la placa cromatográfca desarrollada, un microorganismo y se identifca la inhibición de crecimiento que se produce sobre determinado grupo de compuestos separados identifcables en la cromatografía (Marston et al., 1993; Vlietinck et al., 1995; Lentz et al., 1998; Duraipandiyan et al., 2207). En algunos estudios se combinó la bioautografía con cualquiera de las otras dos técnicas. Fuente de información Los datos que se reportan fueron tomados de revistas indizadas con difusión mundial y que revisan especial- mente aspectos de etnomedicina. El periodo de análi- sis comprendió del año 1992 al 2008. Resultados En el análisis realizado se encontró un total de 251 especies vegetales que presentaron actividad antifún- gica. Los estudios se realizaron en su mayoría en Áfri- ca, Asia, Norteamérica (Canadá, Estados Unidos de América y México) y Sudamérica. En esta revisión se reportan únicamente las plantas que de acuerdo al mé- todo de difusión en agar (20 mm de halo de inhibición o más), dilución (CMI 100 μg/ml o menos) o bioautografa, mostraron una importante inhibición en el crecimiento de cepas de dermatoftos que correspondieron a cual- quiera de los tres géneros: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton (Arenas, 1993; Amado, 2001), asi como de levaduras como Candida spp. La descripción de estas especies puede ser consultada en el Anexo 1. Sin embargo, otras especies que presentaron actividad moderada (por el método de difusión en agar 15 mm de halo de inhibición, dilución (CMI > de 100 µg/ml sin llegar a 500 μg/ml, bioautografa), se describen en el Anexo 2. Dentro de este número de plantas activas se identifcaron especies con efcacia antifúngica demostrada en más de una ocasión y fueron: Artemisia ludovisiana, Anemona obtusiloba, Corydalis longipides, Didymocarpus primulifolius, Drymaria diandra, Elephantopus scaber, Elsholtzia blanda, Elsholtzia 60 fava, Hypericum aledoides, Lygodium japonicum, Macaranga pustulata, Maesa macophyla, Micromeria bifora, Pavetta ternifolia, Pogostemon benhgalensis, Sibbadlismicropetala (todas presentaron actividad moderada) y Lantana trifolia con actividad antifúngica leve. De este grupo de plantas, ninguna cuenta con el antecedente etnomédico como antifúngico. Discusión En el mundo se considera que la incidencia de der- matomicosis (micosis superfciales) es alta, particular- mente en países como México, donde constituye entre el 70 y el 80% de las enfermedades producidas por hongos. A pesar de lo anterior, son padecimientos a los que se les otorga poca importancia clínica y terapéu- tica; razón primordial que promueve la evolución del cuadro patológico a estadios graves en los cuales las lesiones llegan a resultar incapacitantes y, consecuen- temente, a disminuir la calidad de vida de las personas que lo padecen (López Martínez et al., 2000; Amado, 2001; Arenas, 2002; Ruiz, et al 2003). Los primeros tratamientos que se utilizaron para las dermatomicosis datan del siglo XIX, pero estuvieron basados en compuestos poco efcaces y no específcos. En el siglo XX, en el año 1944 apareció el primer medicamento antimicótico de síntesis derivado de los imidazoles y en 1958 apareció la griseofulvina. A partir de entonces surgió un número importante de medicamentos, siendo los productos de administración tópica los más empleados. Pero a pesar de esto, los padecimientos dermatológicos producidos por hongos, aún en estos días, siguen teniendo una presencia importante y universal debido a la rapidez con la que los microorganismos desarrollan resistencia a los medicamentos o al aumento de personas con inmunosupresión (Sánchez et al., 1999; Molina et al., 2000; Del Palacio et al., 2002). Estos antecedentes, aunados al renovado interés por las plantas medicinales, son los que motivan a los científcos a realizar el rastreo de numerosas plantas con la fnalidad de identifcar las propiedades antifúngicas en ellas. A través de esta revisión se identifcaron numerosas plantas que han sido incluidas en procedimientos experimentales orientados a explorar dicha actividad, especies, que independientemente de tener el antecedente empírico de ser utilizado en padecimientos de la piel producidos por hongos, fueron sometidas a rastreos utilizando diferentes extractos, partes de la planta y también diferentes cepas de hongos. Es importante destacar que de las especies estudiadas, aproximadamente la mitad tuvieron actividad antifúngica, de las cuales, el 47.8% presentó pobre actividad, 38.2% moderada y el 13.9% muy buena. En este análisis se identifcó una proporción baja de especies que pueden contribuir al desarrollo de productos útiles para el tratamiento de las enfermedades producidas por hongos. Sin embargo, hay que señalar que no todas las plantas estudiadas fueron seleccionadas a partir de su uso médico tradicional. En los procedimientos de rastreo farmacológico se utilizan 3 diferentes criterios para seleccionar las plantas que será incluidas: 1) el aleatorio donde se incluyen todas las plantas que se encuentren disponibles, asi como sus órganos; 2) químico-taxonómico donde se seleccionan las especies que corresponden a géneros o familias en las que se han identifcado compuestos químicos que han mostrado poseer la actividad farmacológica que se pretende; y 3) el etnobotánico en el cual se seleccionan las especies vegetales y los órganos que son utilizados en las prácticas médicas tradicionales. Se ha demostrado que el criterio etnobotánico suele ser el más acertado en la selección de especies vegetales útiles. Si siempre se utilizara este criterio o sea el conocimiento médico tradicional para seleccionar los candidatos vegetales para el rastreo, seguramente la proporción de resultados favorables se incrementaría considerablemente. Conclusión Las especies seleccionadas con actividad antifúngica deberán ser estudiadas por grupos multidisciplinarios que orienten sus recursos, conocimientos y habilidades al desarrollo de nuevos medicamentos útiles basados en extractos vegetales. La investigación de las plantas medicinales no debe tener como única meta el desarro- llo de conocimiento, ésta deberá contribuir al desarrollo de nuevos ftomedicamentos. Estos se deberán estan- darizar farmacológica y terapéuticamente, de manera que puedan ser dosifcables y sus resultados sean re- producibles. Además deberán demostrar seguridad y efcacia. También los nuevos ftomedicamentos debe- rán ser producidos a partir de material vegetal desarro- llado a través de técnicas controladas de cultivo y sin afectar las especies en su hábitat natural. Referencias 1. Al-Fatimi M, Wurster M, Schröder G, Lindequist U. Antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of selected medicinal plants from Yemen. J Ethnopharmacol 2007; 111: 657-666. 61 2. Amado S. Lecciones de dermatología. Méndez editores S.A de C.V. 14ª Ed. México 2001:265- 281. 3. Arenas R. Micología médica ilustrada. México. McGraw-Hill 1993: 3-9 y 57-74. 4. Armes N, Viswanathan MB, Saraswanthy A, Balakrishna K, Bridha P, Lakshmanaperumalsamy P. Phytochemical and antimicrobial studies of Begonia malabarica. J Ethnopharmacol 2002; 79:129-132. 5. Baba-Moussa F, Akpagana K, Bouchet P. Antifungal activities of seven West African Combretaceae used in tradicional medicine. J Ethnopharmacol 1999; 66: 335-338. 6. Batawila K, KokouK, Koumaglo K, Gbéassor M, Foucault B, Bouchet Ph, Akpagana K. Antifungal activities of fve Combretaceae used in Togolese traditional medicine. Fitoterapia 2005; 76: 264- 268. 7. Buwa LV, Staden van J. Antibacterial and antifungal activity of traditional medicinal plants used against venereal diseases in South Africa. J Ethnopharmacol 2006; 103: 139-142. 8. Cáceres A, López B, Juárez X, del Aguila J, García S. Plants used in Guatemala for the treatment of dermatophytic infections 2. Evaluation of antifungal activity of seven American plants. J Ethnopharmacol 1993; 40: 207-213. 9. Canales M, Hernández T, Serrano R, Hernández LB, Duran A, Ríos V, Sigrist S, Hernández HLH, García AM, Angeles- López O, Fernández- Araiza MA, Avila G. Antimicrobial and general toxicity activities of Gymnosperma glutinosum: A comparative study. J Ethnopharmacol 2007; 110: 343-347. 10. Chamundeeswari D, Vasantha J, Gopalakrishnan S, Sukumar E.Antibacterial and antifungal activities of Trewia polycarpa roots. Fitoterapia 2004; 75: 85-88. 11. Chowdhury R, Rashid CM. Antimicrobial activity of Toona ciliata and Amoora rohituka. Fitoterapia 2003; 74: 155-158. 12. Cos P, Hermans N, De Bruyne T, Aspers S, Sindambiwe JB, Berghe DV, Pieters L, Vlietinck AJ. Further evaluation of Rwandan medicinal plant extract for their antimicrobial and antiviral activities. J Ethnopharmacol 2002; 79:155-163. 13. Cruz MCS, Santos PO, Barbosa AM, De Mélo DLFM, Alviano CS, Antoniolli AR, Alviano DS, Trindade RC. Antifungal activity of Brazilian medicinal plants envolved in popular treatment of mycoses. J Ethnopharmacol 2007; 111: 409-412. 14. Dabur R, Singh H, Chhillar AK, ali M, Sharma GL. Antifungal potential of Indian medicinal plants. Fitoterapia 2004; 75: 389-391. 15. Dahot M U. Antibacterial and antifungal activity of small protein of Indigofera oblongifolia leaves. J Ethnopharmacol 1999; 64: 277-282. 16. Del Palacio A, Garau M, Cuétara MS. Tratamiento actual de las dermatoftosis. Rev Iberoam Micol 2002; 19: 68-71. 17. Desta B. Ethiopian tradicional herbal drugs Part II: Antimicrobial activity of 63 medicinal plants. J Ethnopharmacol 1993; 39: 129-139. 18. Duraipandiyan V, Ignacimuthu S.Antibacterial and antifungal activity of Cassia fstula L.: An ethnomedicinal palnt. J Ethnopharmacol 2007; 112: 590-594. 19. Govindarajan R, Vijayakumar M, Singh M, Rao CH V, Shirwaikar A, Rawat AKS, Pushpangada P. Antiulcer and antimicrobial activity of Anogeissus latifolia. J Ethnopharmacol 2006; 106: 57-61. 20. Griggs JK, Manadhar NP, Towers GHN, Taylor RSL. The effects storage on the biological activity of medicinal plants from Nepal. J Ethnopharmacol 2001; 77: 247-252. 21. Grosvenor PW, Supriono A, Gray DO. Medicinal plants from Riau Province; Sumatra, Indonesia. Part 2: antibacterial and antifungal activity. J Ethnopharmacol 1995; 45: 97-111. 22. Heinrich M, Kuhnt M, Wright CW, Rimpler H, Phillipson JD, Schandelmaier, Warhurst DC. Parasitological and microbiological evaluation of Mixe Indian medicinal plants (Mexico). J Ethnopharmacol 1992; 36:81-85. 23. Jayasinghe ULB, Jayasooriya CP, Bandara BMR, Ekanayake SP, Merlini L, Assante G. Antimicrobial activity of some Sri Lankan Rubiaceae and meliaceae. Fitoterapia 2002; 73: 424-427. 24. Jones NP, Arnason JT, Abou-Zaid M, Akpagana K, Sánchez-Vindas P, Smith ML. Antifungal activity of extracts from medicinal plants used by First Nations Peoples of eastern Canada. J Ethnopharmacol 2000; 73: 191-198. 25. Khafagi IK, Dewedar A. The effciency of random versus ethno-directed research in the evaluation of Sinai medicinal plants for bioactive compounds. J Ethnopharmacol 2000; 71: 365- 376. 26. Lentz DL, Clark AM, Hufford CD, Meurer- Grimes B, Passreiter CM, Cordero J, Ibrahimi O, Okunade AL. Antimicrobial properties of Honduras medicinal plants. J Ethnopharmacol 1998; 63: 253-263. 62 27. Liu H, Yang XL, Ding JY, Feng YD, Xu HB. Antibacterial and antifungal activity of Erigeron breviscapus. Fitoterapia 2003; 74: 387-389. 28. Locher CP, Burch MT, Mower HF, Berestecky J, Davis H, Van Poel B, Lasure A, Vanden Berghe DA, Vlietinck AJ. Anti-microbial activity and anti-complement activity of extracts obtained from selected Hawaiian medicinal plants. J Ethnopharmacol 1995; 49: 23-32. 29. Lohombo-Ekomba ML, Okusa PN, Penge O, Kabongo C, Choudhary MI, Kasende OE. Antibacterial, antifungal, antiplasmodial, and cytotoxic activities of Albertisia villosa. J Ethnopharmacol 2004; 93: 331-335. 30. López Martínez R, Sánchez Paredes E, Hernández Hernández F, Manzano Calloso P, Méndez Tovar LJ. Aportación al estudio epidemiológico de las dermatoftosis. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2000; 38: 455-458. 31. Marston A, Maillard M, Hostettmann K. Search for antifungal, molluscicidal and larvicidal compounds from African medicinal plants. J Ethnopharmacol 1993; 38: 215-223. 32. Masika PJ, Afolayan AJ. Antimicrobial activity of some plants used for the treatment of livestock disease in the Eastern Cape, South Africa. J Ethnopharmacol 2002; 83: 129-134. 33. McCutcheon AR, Ellis SM, Hancock REW, Towers GHN. Antifungal screening of medicinal plants of British Columbian native peoples. J Ethnopharmacol 1994; 44: 157-169. 34. Molina D, Monroy E, Arenas R. Micosis superfciales. PAC Dermatología-1 Libro 2. 2000. 35. Morteza-Semnani K, Amin Gh, Shidfar MR, Hadizadeh H, Shafee A. Antifungal activity of the methanolic extract and alkaloids of Glaucium oxylobum. Fitoterapia 2003; 74: 493-496. 36. Muschietti L, Derita M, Sülsen V, Muñoz JD, Ferraro G; Zacchino S, Martino V. In vitro antifungal assay of tradicional Argentine medicinal plants. J Ethnopharmacol 2005; 102: 233-238. 37. Ojala T, Remes S, Haansuu P, Vuorela H, Hiltunen R, Haahtela K, Vuorela P. Antimicrobial activity of some coumarin containing herbal growing in Filand. J Ethnopharmacol 2000; 73: 299-305. 38. Prasad NR, Anandi C, Balasubramanian S, Pugalendi V. Antidermatophytic activity extracts from Psoralea coryfolia (Fabaceae) correlated with the presence of a favonoid compound. J Ethnopharmacol 2004; 91: 21-24. 39. Quiroga EN, Sampietro AR, Vattuone MA. Screening antifungal activities of selected medicinal plants. J Ethnopharmacol 2001; 74:89- 96. 40. Ruiz E, Arenas R, Rodríguez Álvarez M, Monroy E, Fernánez RF. Tinea pedis y onicomicosis en niños de una comunidad Mazahua. Gac Med Mex 2003; 139: 215-220. 41. Sánchez JL, Obón L, Pont V. Tratamiento actual de las micosis superfciales. Rev Iberoam Micol1999; 16: 26-30. 42. Somchit MN, Reezal I, Nur IE, Mutalib AR. In vitro antimicrobial activity of ethanol and water extracts of Cassia alata. J Ethnopharmacol 2003; 84: 1-4. 43. Srinivasan D, Nathan S, Suresh T, Perumalsamy LP. Antimicrobial activity of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J Ethnopharmacol 2001; 74: 217-220. 44. Stein AC, Sortino M, Avancini C, Zacchino S, Poser von G. Ethnoveterinary medicine in the search for antimicrobial agents : antifungal activity of some species of Pterocaulon (Asteraceae). J Ethnopharmacol 2005; 99:211-214. 45. Tatsadjieu LN, Essia Ngang JJ, Ngassoum MB, Etoa FX. Antibacterial and antifungal activity of Xylopia aethiopica, Monodora myristica, Zanthoxylum xanthoxyloïdes and Zanthoxylum leprieurii from Cameroon. Fitoterapia 2003; 74: 469-472. 46. Taylor RS, Manandhar NP, Towers GHN. Screening of selected medicinal plants of Nepal for antimicrobial activities. J Ethnopharmacol 1995; 46: 153-159. 47. Taylor RSL, Edel F, Manandhar, Towers GHN. Antimicrobial activities of southern Nepalese medicinal plants. J Ethnopharmacol 1996; 50: 97- 102. 48. Valsaraj R,Valsaraj R, Pushpagdan P, Smitt UW, Adsersen A, Nyman U. Antimicrobial screening of selected medicinal plants from India. J Ethnopharmacol 1997; 58: 75-83. 49. Vlietinck AJ, Van Hoof L, Lasure A, Berghe VD, Rwangabo PC, Mvukiyunwami J. Screening of hundred Rwandese medicinal and antiviral properties. J Ethnopharmaco1 1995; 46: 31-47. 50. Webster D, Taschereau P, Belland RJ, Sand C, Rennie R. Antifungal activity of medicinal plant extracts; preliminary screening studies. J Ethnopharmacol 2008; 115: 140-146. 51. Zurita M, Zolla C. Enfermedades dermatológicas en la medicina tradicional de México. Boletín de la Ofcina Sanitaria Panamericana 1986; 101: 339-345. 63 Anexo 1. Plantas medicinales utilizadas de manera empírica para el tratamiento problemas de salud y que pre- sentaron buena actividad contra cepas de hongos. Especie Familia Hongo con crecimiento inhibido País donde se realizó estudio/ Parte de la planta / Usos Albertisia villosa Menispermaceae A.. niger África Raíz Malaria (Lohombo-Ekomba et al., 2004) Annona muricata L. Annonaceae P. oxalicum México Corteza Diarrea Anogeissu leiocarpus (DC.) Guill. et Perr. (L.) Combretacea T. mentagrophytes M. gypseum T. rubrum A.. fumigatus M. Nahum Togo Hojas Infección en el estomago (Batawila et al., 2005) Cassia alata L. Fabaceae C. albicans Malasia Hojas y corteza Antifungico,diurético antibacterial,problemas uterinos Cassia fistula L. Leguminaceae T. rubrum M. gypseum P. marneffei India Semilla * Combretum caffum Kuntze Combretaceae A.alternaria M. hiemalis S. commune A. nige P. notatum Sudáfrica Corteza * Citrullus colocynthis (L.) Schrad. Curcubitaceae T. mentagrophytes Egipto Partes aéreas Prurito, mordedura de vibora, dermatitis por pelo de camello Clematis hirsuta Per. et Guill. var. hirsuta Ranunculaceae T. rubrum E. floccosum C.albicans M.canis Ruanda Hojas * Combretum hispidum C. Lawson Combretaceae T. mentagrophytes M. gypseum África Tallos * Combretum nigricans Lepr. Combretaceae E. floccosum M. gypseum T.mentagrophytes T. rubrum África Tallos, raíz * Diospyros usambarensis F. White Ebenaceae C. cucumerinum África Raíces * Epilobium angustifolium L. Onagracea Candida glabrata Candida lusitaniae Saccharomyces cerevisiae Canadá Raíz * Fragaria virginiana Dúchesne Rosacea Candida krusei Candida glabrata Candida lusitaniae T. rubrum T.mentagrophytes A. flavus Canadá Hojas * (Webster et al., 2008) Garcinia livingstonei T. Anderson. Gutiferae C.cucumerinum C. albicans África Raíz * Glaucium oxylobum Boiss. & Buhse Papaveraceae M.canis M. gypseum T. mentagrophytes E. floccosum Iran Partes aéreas Laxante, hipnótico, antidiabético, problemas de la piel (Morteza-Semnani et al., 2003). Indigofera oblongifolia Forsk Fabaceae A.fumigatus A.niger A. flavus P. expansum Pakistan Tallos * Leonurus sibiricus L. Labiatae P. oxalium México Partes aéreas Dolor gastrointestinal P. aduncum L. Piperaceae T. mentagrophytes S. cerevisiae Honduras, Fruto, tallos, hojas. Dolor, astringente, problemas de aparato reproductor femenino P. alopecuroides (Lam) D.C Asteraceae T. rubrum T. mentagrophytes Brasil Partes aéreas Problemas de la piel (Stein et al., 2005) 64 Piper methysticum Forst Piperaceae M. canis E. floccosum Hawai, Tallos, hojas, raíz. Infecciones urinarias, Tranquilizante Potentilla simples Michx. Rosaceae Candidad glabrata Canadá Tallos, hojas * Psychotria hawaiiensis Gray Rubiaceae E. floccosum Hawai Corteza, hojas Golpes, heridas Pteleopsis suberosa Engl. & Diels Combretaceae T.mentagrophytes T. rubrum M. gypseum C. albicans E. floccosum África Brotes y corteza de tallo * Rosamarinus officinalis L. Lamiaceae T.mentagrophytes Egypto, Partes aéreas * Salix capensis Thunb Salicaceae A..alternaria M. hiemalis P. notatum S. commune Sudáfrica Corteza Reumatismo fiebre Scaevola sericeae Forst Goodeniaceae M. canis E. floccosum Hawai Hojas Heridas,cataratas piel escamosa, punzadas Schotia latifolia Jacq. Caesalpinioideae A..alternaria M. hiemalis S. commune Sudáfrica Conteza Cardialgia, diarrea Solanum incanum L. Solanaceae T. rubrum Fonseca predosoi C.neoformans C.albicans C.guilliermondii Alemania Fruta Problemas de la piel, antiseptico de los dientes dolor de cabeza Solanum níger L. Solanaceae T. rubrum M. canis E. floccosum Hawai Corteza Problemas respiratorios Erupciones cutáneas Heridas, golpes Terminalia avicennioides L. Combretaceae T.mentagrophytes T. rubrum M. gypseum C. albicans E. floccosum África Hojas,corteza de raíz * Terminalia bellerica Roxb. Combretaceae A. .níger C. albicans India Cascara de la fruta * Terminalia glaucescens Planch. ex Benth. Combretaceae T. mentagrophytes M. gypseum T. rubrum A. fumigatus M. Nahum Togo Hojas Malaria, problemas de la piel, ecsema, candidiosis y dermatitis ( Batawila et al., 2005) Terminalia triflora (Grises.) Lillo Bonaginaceae .T. mentagrophytes T. rubrum Argentina Partes aéreas Antifungico (Muschietti et al., 2005) Trachyspermum ammi (L.) Sprague Compositae A..níger C.albicans India Fruta * Waltheria americana L. Esterculaceae C.cucum P. oxalium México, Partes aéreas Purgativo, fiebre, escabiasis, Tos * No se reportan más datos de la especie. Anexo 2. Plantas medicinales utilizadas empíricamente para tratar problemas de salud y que presentaron activi- dad moderada contra cepas de hongos. Especie Familia Hongo con crecimiento inhibido País donde se realizó el estudio/parte de la planta Acacia catechu (L. f.) Brandis Fabaceae A. niger C. albicans India Tallos Achyrates aspera L. Amaranthaceae C. albicans Etiopia Flores Infecciones nasales Adansonia digitata L. Bombacaceae T. rubrum M. canis E. floccosum Hawai Flores Alargium salviifolium Wangerin Alangiaceae A. niger C. albicans India Raíz * Alkanna orientalis (L.) Boiss. Boraginaceae T. mentagrophytes M. canis C. albicans Egypto Toda la planta 65 Allium cepa L. Liliaceae C.albicans A.niger A. flavus A.fumigatus India * Anemona obtusiloba (Hook) G. Don. Ranunculceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Raíz Tos, resfriado Anogeissis latifolia Wall. ex. Guill. & Perr. Combretacea T. rubrum A. falus C. albicans India, problemas de Estomago y piel (Govindarajan et al., 2006) Artocarpus elasticus Reinw. ex Blume. Moraceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra Corteza Disenteria Artemisia herba- alba var. Laxiflora Boiss. Asteraceae T. mentagrophytes Egipto Toda la planta Gripa, tos, antidiarreico Artemisia ludoviciana ssp. mexicana Nutt. Compositae C. cucumerinum México Hojas Dolor de estómago, vómito A. rohituka Wight & Arn. Meliaceae Curvularia lunata B. theobtomae Bangladesh Corteza, tallos * (Chowdhury, Rashid., 2003) Asplenium trichomanes (Burn. f. ) Kaulf. Apocynaceae C. albicans Etiopia Raíces Lepra Azima teracantha Lam. Salvadoraceae C.albicans T. mentagrophytes A. fumigatus C. maltosa C. krusei Absidia corymbifena Alemania Fruta Reumatismo, tos Barringtonia asíatica (L.) Kurz Lecythidaceae M. canis Hawai Flores Golpes, quemaduras Byrsonia crassifolia H.B.K. Malpighiaceae E.floccosum T. rubrum Guatemala Tallo Infecciones en boca, leucorrea Calotropis procera (Aiton) R. Br. Asclepiadaceae C. albicans Etiopia Latex Úlceras tropicales Calpunea aurea (Ait) Benth. Leguminosae C. albicans Etiopia Semilla Abcesos Cammiphora resinflua Martelli Burseraceae C. albicans Etiopia Raíz Lesiones de la piel Cammiphora sp. Burseraceae C. albicans Etiopia, Raíz Lesiones en cuero cabelludo Cassia cf. nodosa Buch.-Ham Fabaceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra Raíz Dolor de cabeza Centipeda minima (L.) Br. & Asch. Asteraceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Partes aereas Tos, resfriado Chymaphila umbellata (L.) W. Bart Pyloraceae C.albicans T. mentagrophytes M. gypseum Canadá Toda la planta * Clausena obyssinica Engl. Retaceae C.albicans Etiopia Hojas Lesiones en piel Clematis sinesis Fresen. Ramunculaceae C.albicans Etiopia Hojas Lesiones en piel Cleome droserifolia (Forssk.) Delile Capparidaceae T. mentagrophytes Egipto Toda la planta Picaduras de insectos Clerodendron myricoides (Hochst.) R. Br. Ex Vatke Verbenaceae C.albicans T. mentagrophytes Ruanda Tallos, hojas * Combretum glutinosum Perr. ex DC Combretaceae T. mentagrophytes M. gypseum T. rubrum E. floccosum C.albicans África Hojas * Commelina benghalensis L. Commelinaceae C.albicans Etiopia Hojas Neumonía Corydalis longipes DC. Fumariaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta Tifoidea Cucumis prophetarum L. Cucurbitaceae C.albicans Etiopia Raíz Antrax Cyathula uncinulata (Schrad.) Schinz Amaranthaceae E. floccosum Rwanda Hojas, tallo, raíz * Didymocarpus primulifolius D.Don Gesneriaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta Gripa 66 Dioscorea sp. Dioscoreaceae C.albicans Etiopia Hojas Sinusitis Dissochaetagracilis (Jack) Bl. Melastomataceae Fusarium oxysporum Isla de Sumatra Hojas, tallos Diarrea Dodonae viscosa (L.) Sapindaceae C.albicans Etiopia Hojas Lesiones en piel Drymaria diandra (Sw.) Macfad. Caryophylaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta Tos, gripa dolor de cabeza, fiebre, indigestión Echinops sp. (Benth.) Benth Composiatae C.albicans Etiopia Raíz Fiebre Elephantopus scaber L. Asteracea T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Raíz, Afrodisiaco, gripa tuberculosis, tos, lesiones por sifilis Elsholtzia blanda (Benth.) Benth. Lamiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Tallos Gripa, tos , fiebre, escabiasis Elsholtzia flava (Benth.) Benth. Lamiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Raíz Fiebre Elsholtzia fruticosa (D. Don) Rehder Lamiaceae T. mentagrophytes Nepal Raíz Fiebre Embelia schimperi Vatke Myrsinaceae C.albicans Etiopia Fruta Gonorrea Epilobium angustifolium L. Onagraceae T. mentagrophytes M. gypseum C.albicans Canadá Raíz * Epilobium sp. Onagraceae C.albicans Etiopia Hojas Lesiones en piel Erigenon breviscapus (Vant.) Hand-Mazz Asteraceae C.albicans C. tropicales C. parapsitosis A. penicilloides A. candidus China Toda la planta * Geum macrophyllum Willd. Rosaceae C.albicans A. flavus A. fumigatus Fusarium tricuictum M. cookerri T. mentagrophytes M. gypseum T. viridae British Columbia Raíz * Glaucium arabicum Fres. Papaveraceae C.albicans M.canis T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Piel, ojos Gliricidia sepium Kunth ex Steud. Fabaceae E. floccosum T. rubrum Guatemala Raíz Gastroenteritis, tópica para efermedades exantemáticas, úlceras, tiña Gymnosperma glutinosum (Spreng.) Less. Asteraceae T. mentagrophytes A. niger México Partes aéreas Diarrea (Canales et al., 2007). Gynoglassum caeruleum Hochst. Ex DC. Boraginaceae C.albicans Etiopia Hojas Infección en oídos Hypericum elodeoides Choisy Hyperaceae T. mentagrophytes Nepal Raíz Fiebre Hypericum cordifolium Choisy Hyperaceae T. mentagrophytes Nepal Tallos, Desordenes de la menstuación, picadura animales ponzoñosos, diarrea Harpephyllum caffrum Bernh. Lithraea Miers ex Hook. & Arn. Anacardiaceae C.albicans Sudáfrica Tallos Gonorrea (Buwa, Staden., 2006) Ipomea congesta R. Br. Convolvulaceae E. floccosum M.canis Hawai Tallos Purgante, para las fracturas Lygodium japonicum (Thunb.) Sar. Lygodiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Partes aéreas Herpes 67 Macaranga pustulata King ex Hook. f. Euphorbiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Corteza Heridas infectadas, remover pus Maesa macrophylla Wall. A. DC. Myrsinaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Corteza, Escabiasis, difteria Malpighia glabra L. Malpighiaceae E. floccosum T. rubrum Guatemala Hojas * Micromera biflora (Buch.-Ham. Ex D. Don) Benth. Lamiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta Gripa, tos, sinusitis, epistaxis Monodora myristica (Gaertn.) Dunal Annonaceae A. flavus Camerún Fruto Tos, bronquitis, diarrea esterilidad femenina Morinda tinctoria Roxb. Meliacea A. niger Sri Lankan Hojas, corteza Reumatismo, Diarrea, heridas (Jayasinghe et al., 2002) Frankenia resoluta Forsk. Euphorbiaceae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Diarrea Ocimum forskolei Benth Lamiaceae T. rubrum C.albicans C. guilliermondii Fonseca pedrosoi C. neoformans Alemania Hierba Infecciones en piel, fiebre, cosmético Origanum syriacum var Bevanii Ietsw. Compositae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta * Pavetta ternifolia (Oliv.) Hiern Rubiaceae T. mentagrophytes M.canis Ruanda Hojas * P. crispum (P. Mill.) Apiaceae S. cerevisiae Filandia Toda la planta * Phagnalon rupestre (L.) DC. Compositae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Tos, gripa Phlomis aurea T. mentagrophytes Egypto * Pipturis albidus Gray Urticaceae M.canis Principia utilis Hawai Corteza, tallos, hojas, debilidad, purificar la sangre, en mujeres embarazadas Plumbago indica L. Plumbaginaceae C.albicans A. niger India Hojas * Pogostemon benghalensis (Burm. f.) Kuntze Lamiaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta, raíz Catarro,tos, indigestión Principia utilis Rosaceae T. mentagrophytes Nepal * Psoralea crorylifolia (Roxb. ex DC.) Fabaceae T. ment agrophyt es E. E.floccosum T. rubrum M. gypseum India Semillas Problemas en piel y estómago Psychotria hawaiiensis Fosberg o Gray es otro autor Rubiaceae M.canis T. rubrum Hawai Hoja, fruto Heridas Retama raetam (Forssk.) Webb & Berthel. Leguminosae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Heridas, úlceras abierta Rhus tripartita (Ucria) Grande Anacardiaceae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Tos, gripa Rubus regidus Smith Rosacea C.albicans M.canis T.mentagrophytes Ruanda Hojas raíz Antibacterial,antifungica Rumex hastatus D. Don Polygonaceae T.mentagrophytes Nepal Raíz Dolor de cuello Scindapus officinalis Araceae T.mentagrophytes Nepal Fruto Disenteria, diarrea Senecio gigans Vatke Compositae C.albicans Etiopia Hojas Tifo Sibbadlia micropetala (D. Don) Hand.-Mazz. Rosaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Toda la planta Diarrea, disenteria Solanum xanthocarpum Schrad. & H. Wendl. Solanaceae A.fumigatus A.niger A. flavus India Toda la planta Repelente (Dabur et al., 2004) Solenostemma oleifolium Bullock & E. A. Bruce Asclepiadaceae T. mentagrophytes Egypto Toda la planta Ojos, piel, infección de nariz 68 Spilanthes acmella (L.) Murray Compositae C.albicans Etiopia Hojas Tonsilitis Terminalia alata Heyne ex Roth Combretaceae T. mentagrophytes C.albicans A. fumigatus Nepal Corteza Diarrea, disenteria Tetradenia riparia (Hochst) Codd. Lamiaceae C.albicans Ruanda Hojas, tallo, raíz * Thunbergia alata Boj. Ex. Sims. Acanthaceae M.canis T.mentagrophytes Ruanda Partes aéreas y raíz * Toona ciliata M.J. Roem. Meliaceae Curvularia lunata B. theobtomae Bangladesh Tallos, corteza Antifungico (Chowdhury, Rashid., 2003) Trewia polycarpa Benth. Euphorbiaceae C.albicans A. niger C. neoformans Penicilium sp. India Raíz Reumatismo gota, hinchazón, flatulencia, flema (Chamundeeswari et al., 2004) Tridax procumbers L. Asteraceae T. mentagrophytes C.albicans A. fumigatus Nepal Partes aéreas Heridas, cortadas Valeriana jatamansii Jones Valerianaceae T. mentagrophytes M. gypseum Nepal Raíz Infeccion en ojos Verbascum sinaiticum Benth. Scrophulariaceae T. mentagrophytes Egypto * Vernonia amygdalina Delile Asteraceae C.albicans Etiopia Hojas Lesiones de cuero cabelludo Ziziphus joazeiro Mart. Rhamnaceae T. rubrum C. guilliermondii Brasil Toda la planta Micosis (Cruz et al., 2007) * No se reportan más datos de la especie. 69 Antioxidant activity of isoquercetin and Hyptis fasciculata on yeast cells Actividad antioxidante de isoquercetina e Hyptis fasciculata en levaduras Carmelita Gomes da Silva 1 , Raul Raulino 1 , Debora Malta Cerqueira 2 , Marcos Dias Pereira 1 , Anita Dolly Panek 1 , Joaquim Francisco Mendes da Silva 3 , Elis Cristina de Araujo Eleutherio 1 , Fabio de Sousa Menezes 4 1 Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ, 21949-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 2 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, ICB, UFRJ, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 3 Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, UFRJ, 21949-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. 4 School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin. Panoz Institute. 23, Westland Row, Dublin 2, Ireland. Corresponding author: Fabio de Sousa Meneses School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College Dublin. Panoz Institute. 23, Westland Row, Dublin 2, Ireland. Phone/Fax: 00 353 1 896 3317 E-mail:
[email protected] Abstract Reactive oxygen species (ROS) are thought to un- derline the process of ageing and the pathogenicity of various diseases, such as neurodegenerative dis- orders and cancer. The use of traditional medicine is widespread and plants still present a large source of natural antioxidants that might serve as leads for the development of novel drugs. In this paper, the alcoholic extract from leaves of Hyptis fasciculata, a Brazilian medicinal plant, and isoquercetin, a favonoid identifed in this species, showed to be active as 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical scavengers. The extract of Hyptis fasciculata and isoquercetin were also able to increase tolerance of the eukaryotic microorganism Saccharomyces cerevisiae to both hydrogen perox- ide and menadione, a source of superoxide. Cellular protection was correlated with a decrease in oxidative stress markers, such as levels of ROS, protein carbon- ylation and lipid peroxidation, confrming the antioxidant potential of Hyptis fasciculata and isoquercetin. Keywords: isoquercetin, Hyptis fasciculata, antioxidant activity, Brazilian plants, oxidative stress Resumen Se piensa que las especies reactivas de oxígeno (ROS, siglas en inglés) subyacen tras el proceso de envejeci- miento y en la patogenicidad de varias enfermedades como los trastornos degenerativos y el cáncer. El em- pleo de la medicina tradicional es extenso y las plantas representan una fuente importante de antioxidantes naturales que pueden servir de base para el desarrollo de nuevos medicamentos. En este trabajo, el extrac- to alcohólico de hojas de Hyptis fasciculata mostró ser tan activo como el 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH, siglas en inglés) como neutralizador de radicales libres. El extracto de Hyptis fasciculata e isoquercetina fueron también capaces de aumentar la tolerancia al peróxido de hidrógeno y la menadiona – una fuente de supe- róxido- del microorganismo eucarionte Saccharomyces cerevisiae. La protección celular se correlacionó con una disminución de los marcadores de estrés oxidativo como ROS, carbonilación de proteínas y peroxidación de lípidos, esto confrmó el potencial antioxidante de Hyptis fasciculata e isoquercetina. Palabras clave: isoquercetina, Hyptis fasciculata, acti- vidad antioxidante, plantas brasileñas, estrés oxidativo. 70 Introduction Plants can produce a remarkably diverse range of low- molecular-weight natural products, also known as spe- cial metabolites [1]. This rich diversity results in part from an evolutionary process driven by selection for acquisi- tion of an improved defense against microbial or insect attacks [1]. Special metabolites constitute important ac- tive molecules which differ widely in terms of structure and biological properties [2]. According to The World Health Organization about 65-80% of the population in developing countries depends upon medicinal plants as the unique form of access to basic health treatments [3]. However, a profound scientifc study and standard- ization of these plants, as phytotherapeutics, is neces- sary to guarantee safety in their utilization by the public health system. Brazilian biodiversity has signifcantly contributed to the discovery of new pharmacologically active molecules from medicinal plants [4]. In this paper, an extract from the Brazilian species Hyptis fasciculata and a favonol identifed in this plant, called isoquercetin, were analyzed for their antioxidant activity. In the last two decades, more attention has been paid to the antioxidant activity of plant extracts or isolated substances from plants [4], because reactive oxygen species (ROS) are implicated in aging and in the etiology of several disease processes such as atherosclerosis, neurodegenerative disorders, some cancers, cirrhosis, fbrosis, infammation and diabetes [2]. ROS can be produced from both endogenous and exogenous sources. Potential endogenous sources include mitochondria, cytochrome P450 metabolism, peroxisomes and infammatory cell activation. Mitochondria have long been known to generate signifcant quantities of superoxide radicals and hydrogen peroxide, the most abundant ROS in vivo [5]. ROS production is counteracted by an intricate antioxidant defense system that includes enzymatic scavengers, such as superoxide dismutases and peroxidases, and some antioxidants, like glutathione, ascorbate, favonoids and carotenoids. When ROS production exceeds cellular antioxidant capacity, the consequences are modifcation to cellular proteins, lipids and DNA, which can lead to cell death or to acceleration in ageing and age-related diseases. [6]. H. fasciculata of the Lamiaceae family is used in phytomedicine, in the treatment of different pathologies [4]. Popularly known as “marroio-do-brasil”, this spe- cies is a widely spread perennial plant found in south- ern countries of South America and its dried leaves and stems have been used for treatment of gout, spasms, fever and as expectorant [7,8]. Some chemical con- stituents in the aerial parts of H. fasciculata were re- cently isolated and studied: two labdane diterpenoids, 15α-methoxyfaciculatin and 15β-methoxyfaciculatin [7]; the favonoids cirsilineol, cirsimaritina, aurantiamide acetate, aurantiamide benzoate, methoxynepetaefolin and isoquercetin [8;9]. Quercetin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyfavone) is the major favonol found in the plant kingdom and it may be a powerful bioactive constituent of the human diet due to excellent free radical scavenging activity [10]. Its an- tioxidant properties have been extensively investigat- ed: quercetin protected glial cells from oxidative stress [11], decreased atherosclerosis [10] and showed anti- infammatory [10)], anticancer and anti-aging activities [12,13]. The favonol isoquercetin (quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside), which is typically found in onions, is a quercetin moiety substituted by a glucose molecule on C3 of the favonoidic nucleus [14]. This favonol was isolated in some plant species as Crataegus sp. [15], Argemone platyceras [14] and was characterized for the frst time in the genus Hyptis [9]. We used two complementary approaches to analyze the antioxidant activity of H. fasciculata and isoquercetin: evaluation of the capacity of the extract of H. fasciculata and isoquercetin to scavenge free radicals in vitro, and analysis of their potential in protecting Saccharomyces cerevisiae cells against oxidation. The use of this lower eukaryote as a model system for the study of oxidative stress responses in vivo is particularly attractive: about 30% of the human disease-associated genes signifcantly match yeast genes; in contrast to humans, yeast genes can be easily manipulated; and no less important, the use of animals in toxicology tests is falling into disuse, today, for both ethical and scientifc reasons [4,16]. Material and methods Chemicals and Reagents. H 2 O 2 was purchased from Merck. Menadione, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), catechin, isoquercetin and quercetin were ob- tained from Sigma Chemicals. Media components were obtained from Difco. Plant Material. Commercial Ginkgo biloba (GBE 761) were obtained from Tanakan as a 40 mg (concentration) oral solution. Aerial parts from H. fasciculata were collected and classifed by Dr. S.A.L. Bordignon (Luteran University of Brazil- RS). A voucher sample has been deposited in the Botanical Department – Institute of Biosciences, Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil. Sample Preparation. Aerial parts of H. fasciculata were dried, minced 792g and then, extracted by 71 maceration with absolute ethanol at room temperature. Ethanol was evaporated under reduced pressure and the extract 98.3g was stored at -20ºC. The ethanol extract of H. fasciculata was partitioned in different solvents obtaining fractions with crescent polarities; the n-butanol fraction was used in this work. The dried extracts were dissolved in ethanol to an approximate fnal concentration of 120 mg/mL. DPPH photometric assay. Samples were evaluated in terms of hydrogen donation or radical scavenging ability using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), which is purple at room temperature [4]. Ethanol solutions of the samples, at different concentrations, were mixed with 0.3 mM DPPH ethanol solution. Absorbance was measured at 518 nm after 30 min of reaction at 25°C. The results were expressed as IC 50 , which means the concentration of sample necessary to decrease the absorbance of DPPH in 50%. Phenolic Compound Content. The sample solution (1 mL) was mixed with 1 mL of diluted Folin-Ciocalteu reagent (1 N) in a test tube. After 3 min of reaction, 2 mL of 35% Na 2 CO 3 was added and the mixture was incubated for 30 min at room temperature. Absorbance was measured at 700 nm and catechin was used as standard [17]. Yeast strains, media and growth conditions. Wild type strain BY4741 (MATa, his3, leu2, met15, ura3) and its isogenics mutants sod1Δ and ctt1Δ, harboring the genes SOD1 (cytosolic superoxide dismutase) and CTT1 (cytosolic catalase), respectively, interrupted by the gene KanMX4, were acquired from Euroscarf, Germany. Stocks of these strains were maintained on solid YPD medium (1% yeast extract, 2% glucose, 2% peptone and 2% agar); in the case of the mutant strains, the medium also contained 0.02% geneticine. Cells were grown up to the middle of frst exponential phase (106 cells/mL) in liquid YPD medium, using an orbital shaker at 28°C and 160 rpm, with 5/1 of fask volume/medium ratio. In vivo antioxidant analysis. Cells were directly stressed with 2 mM hydrogen peroxide or to 20 mM menadione for 1h at 28°C/160 rpm, or previously treated with 5 mg/mL of either plant extract (H. fasciculata or G. biloba) or 10 μg/mL of favonols (isoquercetin or quercetin) for 1h at 28°C/160 rpm before being stressed. To choose the doses of plant extract/favonol used in the adaptive treatments, cells were exposed to increased concentrations of H. fasciculata extract or isoquercetin and then spotted adjacently on YPD agar plates incorporating peroxide or menadione. The concentration chosen was the lowest which could improve cell growth compared to cohorts exposed to stress without being treated with plant extract/isoquercetin. Cell viability was analyzed by plating, in triplicate, on solid YPD medium, after proper dilution. Plates were incubated at 28oC for 72 h and the colonies counted. Tolerance was expressed as percentage of survival [18]. Biomarkers of Oxidative Stress. For lipid peroxidation assays, 50 mg of cells were harvested by centrifugation and washed twice with 20 mM Tris/HCl buffer, pH 7.4. The pellets were re-suspended in 500 µL of the same buffer, containing 10 % trichloroacetic acid, and 1.5 g of glass beads were added. The samples were disrupted by 3 cycles of one minute agitation on a vortex mixer followed by one minute on ice. The supernatants obtained after centrifugation were mixed with 0.1 mL of 0.1 M EDTA and 0.6 mL of 1 % w/v thiobarbituric acid in 0.05 M NaOH. The reaction mixture was incubated in a boiling water bath for 15 min and, after cooling, absorbance was measured at 532 nm [19]. The 2’,7’-dichlorofuorescein diacetate probe, sensitive to oxidation, was used to measure the level of intracellular oxidation. Fluorescence was measured using a (Photo Technology International PTI) spectrofuorimeter set at an excitation wavelength of 504 nm and an emission wavelength of 524 nm. A fresh 5 mM stock solution of the probe dissolved in ethanol was added to the culture to a fnal concentration of 10 µM and incubation at 28°C continued for 15 min to allow uptake of the probe. Cells, treated or not with antioxidants, were stressed as described previously and, subsequently, about 50 mg of cells were harvested by centrifugation and washed twice with water. Disruption of samples was performed according to [18]. After centrifugation at 25.000 × g for 5 min, the supernatant solutions were diluted 6-fold with water and fuorescence measured [20]. Extracts for protein carbonyl determinations were obtained by disruption of cells with glass beads in 0.1M Tris–HCl buffer, pH 7.0 [6]. Protein samples were mixed with 10 mM DNPH (dinitrophenylhydrazine) in 2 N HCl, or in 2 N HCl without DNPH, at room temperature for 1 h with agitation every 15 min. Proteins were precipitated with 20% trichloroacetic acid (w/v), centrifuged (13,000 x g for 3 min) and the supernatant was discarded. Samples were washed three times with 1 ml ethanol- ethyl acetate (1:1 v/v). The precipitate was re-dissolved in 1 ml of 6 M guanidine HCl in 20 mM potassium phosphate adjusted to pH 2.3 with trifuoroacetic acid, and left for 30 min. at 37°C to redissolve. Any remaining insoluble material was removed by centrifugation (13,000g for 1 min) and the absorbance measured at 360 nm. The carbonyl content was calculated, using the molar absorption coeffcient of 22,000 M- 1 cm- 1 for aliphatic hydrazones [21]. 72 Catalase and superoxide dismutase activities. Extracts were obtained by disruption of cells with glass beads [18]. The supernatants obtained after centrifugation at 25,000 x g were used for enzymatic determination. Catalase and superoxide dismutase activities were measured according to [22] and [23], respectively. Protein was determined according to Stickland [24]. Statistical Analyses. Results were expressed as mean ± standard deviation of at least three independent experiments. Statistical differences were tested using ANOVA followed by Tukey-Kramer multiple comparisons test. The latter denotes homogeneity between experimental groups at p < 0.05. In the fgures, the asterisk means values statistically not considered as different. Results and discussion In Vivo and in Vitro Antioxidant Activity of H. fas- ciculata and Isoquercetin. Polyphenols are a large and diverse class of compounds, many of which occur naturally in a wide range of food and plants. The fa- vonoids are the largest and best-studied group among polyphenols. A range of plant polyphenols is, either being actively developed or already currently sold as dietary supplements and/or herbal-derived medicines. Although, these compounds play an unknown role in nutrition (non-nutrients), many of them have properties including antioxidant, anti-mutagenic, anti-estrogenic, anti-carcinogenic and anti-infammatory effects that might potentially be benefcial in preventing disease and protecting the stability of the genome [25]. The antioxidant potential of polyphenols has been correlated to the capacity of donating hydrogen radicals. The number and the confguration of H-donating hydroxyl groups are both important structural features infuencing the antioxidant capacity of phenolic compounds [26]. Initially, it was analyzed the reactivity of H. fasciculata extract and isoquercetin with DPPH, a stable free radical. As DPPH picks up one electron in the presence of a free radical scavenger, the absorption decreases and the resulting discoloration is stechiometrically related to the number of electrons gained [4]. Results of DPPH reduction by extracts are shown in Table 1. The favonoid isoquercetin exhibited a low IC 50 value (11.8 µg/mL) being an excellent DPPH scavenger, lower than quercetin IC 50 , used as standard. The extract of H. fasciculata also showed an outstanding DPPH scavenger activity, comparable to G. biloba extract, used as standard due to its well established antioxidant activity [27]. However, as far as total phenolic content is considered, H. fasciculata showed a 3.5-fold lower value than that observed for a G. biloba, indicating that non-phenolic compounds could play an important role in the in vitro antioxidant activity of H. fasciculata extract. Characterizing antioxidants only on the basis of ability to scavenge free radicals is inadequate. It is important to verify if compounds that are excellent antioxidants in vitro work as such in vivo. Thus, we also evaluated the antioxidant activity of H. fasciculata extract and isoquercetin using the yeast S. cerevisiae. Exponentially growing cells are very sensitive to oxidants due to catabolic repression exerted by glucose on antioxidant defense system [18]. However, a previous treatment with an antioxidant would increase cell tolerance to an oxidative stress. We tested different oxidative stresses, generated by hydrogen peroxide or menadione, a source of superoxide radical. Menadione and H 2 O 2 can generate hydroxyl radical, the most reactive and toxic ROS [13, 18]. H 2 O 2 and hydroxyl radical exhibit high redox potential and have been shown to damage biomolecules in vitro and in vivo. Menadione can also cause an oxidative stress by forming a complex with glutathione, the main antioxidant thiol [5, 13]. Samples IC 50 (µg/mL) Phenolic compound concentration (mg/ mL) Relative SOD activity G. biloba 26.6 ± 0 61.1 ± 0 ND Quercetin 65.6 ± 0.6 ND* ND Isoquercetin 11.8 ± 1.1 ND 1.4 ± 0.1 H. fasciculata 35.0 ± 0.3 17.5 ± 0.2 0.8 ± 0.1 *ND = not determined Table 1. DPPH radical scavenging activity was expressed as IC50. The IC50 values were obtained by linear regression and showed a very good coeffcient of determination (r2 ≥0.97). Statistical analysis (ANOVA) of data from the three sepa- rate tests showed that all experiments made with each sample were statistically equivalent (p < 0.05). Phenolic compound content was determined only in plant extracts as described in Methods. Activation of SOD produced by antioxidants was expressed as a ratio between activity of cells treated with antioxidants and activity of non-treated cells. 73 Accordind to Fig. 1A, H. fasciculata extract and isoquercetin increased tolerance to H 2 O 2 stress in both wild-type strain and in the mutant defcient in cytosolic catalase (ctt1 strain). The rise in tolerance in the wild- type strain was similar to the antioxidant standards G. biloba and quercetin. This result indicates that the the active compounds present in H. fasciculata as well as isoquercetin itself could be considered able to inactivate hydrogen peroxide effects even in the absence of its catabolic enzyme. Corroborating this hypothesis, neither H. fasciculata nor isoquercetin treatments were able to increase catalase activity (results not shown). Regarding the superoxide stress induced by menadione, H. fasciculata extract and isoquercetin increased the survival of wild-type in levels higher than the respective standards (Figure 1B). Although isoquercetin was able to recover 100% of survival in wild-type, it showed no protection in the mutant strain defcient in cytosolic superoxide dismutase, indicating that the mechanism of action of isoquercetin could be dependent on this antioxidant enzyme. Hyptis fasciculata also was unable to increase the tolerance of sod1 strain. A compound might exert antioxidant actions in vivo by inhibiting generation of reactive species, or by directly scavenging them. An additional mechanism by which an antioxidant might act in vivo is by raising the levels of endogenous antioxidant defenses, e.g., by up-regulating expression of the genes encoding superoxide dismutase. Interestingly enough the treatment with isoquercetin enhanced SOD activity up to 40% (Table 1), confrming that the antioxidant effect of this favonoid is SOD-dependent. On the other hand, H. fasciculata extract, a source of isoquercetin, was not able to increase SOD activity (Table 1) although it had been capable to induce tolerance to menadione (Figure 1B). The inability of the H. fasciculata of inducing SOD activity could be explained by the low concentration of isoquercetin present in the extract or by the negative synergism among the other compounds present in the extract thus interfering with the benefc action of isoquercetin [28]. Protection against Oxidative Damage. It is possible for an antioxidant to protect in one biological system, but to fail to protect (or even sometimes to promote damage) in others. For example, antioxidant inhibitors of lipid peroxidation may not protect other molecular targets (such as protein) against oxidative damage. The polyunsaturated fatty acyl side chains, because of their susceptibility to oxidative damage in membrane phospholipids, pose a constant threat to cellular integrity and function, mainly due to the loss of membrane properties, for example, selectivity [28, 29]. This process, called lipid peroxidation, leads to malondialdeyde (MDA) as the fnal product, which is mutagenic in bacterial and mammalian cells and carcinogenic in rats [5]. Our results showed that, H. fasciculata and isoquercetin reduced lipid peroxidation levels after the action of both stressful agents (Figure 2A). Lipid oxidation levels induced by menadione were reduced to control levels, when yeast cells were treated with both antioxidants. A variety of plant extracts and isolated compounds is effective in reducing of lipid peroxidation. Euryale ferox seeds, dose-dependently, reduce lipid oxidation levels after oxidative damage induced by H 2 O 2 , in hamsters [29]. Diverse favonoids such as, quercetin, rutin, ginkgettin, amentofavone and tetra-O-methylamentofavone isolated from Araucaria angustigolia also decrease, in a dose-dependent form, lipid peroxidation levels in phosphatidylcholine lipossomes [30]. Interactions of favonoids with membranes may reduce the incorporation into the bi- layer of hydrophobic compounds that can affect, either directly or indirectly, the integrity of the membranes [31]. Induction of SOD activity produced by isoquercetin (Table 1) might also contribute to its protective effect against lipid oxidation. Results shown in this paper strongly point towards the antioxidant capacity of both the extract and favonoid in protecting yeast cells against the toxic effect of ROS produced by hydrogen peroxide and menadione stress. To determine whether these extracts and isoquercetin are in fact responsible for the increase in cellular viability by decreasing ROS levels, we analyzed intracellular oxidation. The assay was carried out using a fuorescent probe, 2’,7’-dichlorofuorescein diacetate (DCF). This probe is absorbed and trapped inside the cells after cleavage of the diacetates by an intracellular esterase, and thereafter, is no longer able to leave the cell. Once inside the cell, it becomes susceptible to attack by ROS, producing a more fuorescent compound [18]. According to Figure 2B, the stress induced by H 2 O 2 increased fuorescence signifcantly in relation to the control (13- fold), while the increase caused by menadione was less signifcant (2.5-fold). In spite of that, H. fasciculata and isoquercetin were able to reduce intracellular oxidation to basal levels during the stress with peroxide. After the stress with menadione, both antioxidants decreased the fuorescence to lower levels than the control (Figure 2B). 74 Oxidative damages to proteins, lipids or DNA may all be seriously deleterious and may occur concomitantly. However, proteins are possibly the most immediate vehicle for inficting oxidative damage on cells because they are often catalysts rather than stoichiometric mediators [24]. Superoxide anions cause the release of iron-sulfur clusters of several enzymes leading to their inactivation. Stadtman and co-workers described that oxidatively modifed proteins (measured as protein carbonylation) accumulate as a function of cell age in human erythrocytes and fbroblasts. Oxidative modifcation of proteins has been associated to aging- related pathologies such as Alzheimer’s disease [32]. Grape seed extract showed an improvement of 30% on memory, in aged rats after 4 days of treatment, and decreased the protein carbonyl levels in 44% in the brain regions after 30 days of treatment [33]. As can be seen in Figure 2C, H. fasciculata and isoquercetin reduced the levels of protein carbonylation below those of the control when yeast cells were stressed with hydrogen peroxide. Whereas when the stress was induced by menadione, only isoquercetin was able to reduce carbonylation down to basal levels. H. fasciculata did not have as signifcant effect as isoquercetin (Figure 2C). In a recent paper, also using yeast cells as a model, quercetin was shown to be decrease 5-6-fold the H 2 O 2 -induced dihydrorhodamine fuorescence. Quercetin also decreased the constitutive levels of oxidized proteins and lipids against oxidative damages induced by H 2 O 2 [13]. In conclusion, our results indicate that the n-butanol fraction of the aerial parts of Hyptis fasciculata and the favonoid isoquercetin identifed in this species showed outstanding antioxidant activity in yeast cells. They seem to be able to increase cellular survival by reducing intracellular lipid and protein oxidation levels, or either as ROS scavengers. Superoxide dismutase activity seems be induced by isoquercetin, however this favonoid was not dependent upon catalase in order to increase survival of cells. The results antioxidant activity in vitro were corroborated by the results we obtained using Saccharomyces cerevisiae suggesting that its use is appropriate for the in vivo investigation of natural antioxidant sources. Acknowledgements This work was supported by grants from FAPERJ, CAPES, CNPq and FAPESP (grant 04-10067/6). Figure 1. Effect of plant extracts and favonoids on cell viability after stress with 2 mM hydrogen peroxide (A) and 20 mM menadione (B). Control (wild type) and ctt1 mutant cells, harvested in frst exponential phase, were directly stressed (black bar) or were previously submit- ted to 5 mg/mL GBE 761® (dotted bar) and HF (white bar); 10 µg/ mL of Q (striped bar) and IQ (gray bar). * Values not considered dif- ferent. Figure 2. Effect of Hyptis fasciculata extract and of isoquercetin on lipid peroxidation (A), on fuorescence from cells treated with 10 μM 2’, 7’-dochlofuorescein (B) and on carbonylation of proteins (C), after a stress with 2 mM hydrogen peroxide and with 20 mM menadione. Control cells (wild type), harvested in frst exponential phase, were directly stressed (black bar) or were previously submitted to 5mg/mL of HF (white bar) and 10 µg/ mL of IQ (gray bar). The results were expressed as a ratio between stressed cells, treated or not with HF or IQ and non-stressed cells. * Values not statistically different. 0 5 20 ctt 1 Wild - type * * A % S u r v i v a l 10 15 0 sod 1 Wild - type B % S u r v i v a l 20 40 60 80 100 120 4 3 2 1 0 14 12 10 8 6 4 2 2 0 0 1 Medadione H 2 O 2 * * * * A B C F o l d i n c r e a s e C a r b o n y l a t i o n F o l d i n c r e a s e F l u o r e s c e n c e F o l d i n c r e a s e L i p i d P e r o x i d a t i o n 75 References 1. Dixon RA. Natural products and plant disease resistance. Nature 2001; 411: 843-847. 2. Argolo ACC, Sant’Ana AEG, Pletsch M, Coelho LCBB. Antioxidant activity of leaf extracts from Bauhinia monandra. Bioresour. Technol 2004; 95: 229-233. 3. Veiga-Júnior VF, Pinto AC, Maciel, MAM. Plantas medicinais:cura segura? Quim. Nova 2005; 28: 519-528. 4. Silva CG, Herdeiro RS, Mathias CJ. et al. Evaluation of antioxidant activity of Brazilian plants. Pharmacol. Res 2005; 52: 229-233. 5. Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact 2006; 160: 1-40. 6. Duffy S, So A, Murphy TH. Activation of endogenous antioxidant defenses in neuronal cells prevents free radical-mediated damage. J. Neurochem 1998; 71: 69-77. 7. Ohsaki A, Kishimoto Y, Isobe T, Fukuyama Y. New labdane diterpenoids from Hyptis fasciculata. Chem. Pharm. Bull 2005; 53: 1577-1579. 8. Isobe T, Doe M, Morimoto Y, Nagata K, Ohsaki A. The anti-Helicobacter pylori favones in a Brazilian plant, Hyptis fasciculata and the activity of methoxyfavones. Biol. Pharm. Bull 2006; 29: 1039-1041. 9. Cerqueira DM, Falcão DQ, Silva A, Menezes FS. Estudo químico e farmacológico da partição em acetato de etila do extrato etanólico de folhas e inforescências de Hyptis fasciculata. In: XII Congresso Ítalo-Latino-Americano de Etnomedicina, 2003, Rio de Janeiro. XII Congresso Ítalo-Latino-Americano de Etnomedicina, 2003, 139. 10. Juzwiak S, Wójcicki Jerzy, Mokrzycki K. et al. Effect of quercetin on experimental hyperlipidemia and atherosclerosis in rabbits. Pharmacol. Rep 2005; 57: 604-609. 11. Gitika B, Ram MS, Sharma SK, Ilavazhagan G, Banerjee PK. Quercetin protects C6 glial cells from oxidative stress induced by terciary- butylhydroperoxide. Free Radic. Res 2005; 40: 95-102. 12. Tieppo J, Vercelino R, Dias AS, Silva Vaz MF, Silveira TR, Marroni CA, Marroni NP, Henriques JAP, Picada JN. Evaluation of the protective effects of quercetin in the hepatopulmonary syndrome. Food Chem. Toxicol 2007; 45: 1140- 1146. 13. Belinha I, Amorim MA, Rodrigues P, De Freitas V, Moradas-Ferreira P, Mateus N, Costa V. Quercetin increases oxidative stress resistance and longevity in Saccharomyces cerevisiae. J. Agric. Food Chem 2007; 55: 2446-2451. 14. Fernandez J, Reyes R, Ponce H, Oropeza M, VanCalsteren M, Jankowski C, Campos MG. Isoquercetrin from Argemone platyceras inhibits carbachol and leukotriene D4-induced contraction in guinea-pig airways. Eur. J. Pharmacol 2005; 522: 108-115. 15. Zhang Z, Chang Q, Zhu M, Huang Y, Ho WKK, Chen Z. Characterization of antioxidants present in hawthorn fruits. J. Nutr. Biochem 2001; 12: 144-152. 16. García-Fernandéz AJ, Bayoumi AE, Pérez- Pertejo A, Motas M, Reguera RM, Ordóñez C, Balaña-Fouce R, Ordóñez D. Alterations of the glutathione-redox balance induced by metals in CHO-K1 cells. Comp. Biochem. Physiol 2002; 132: 365-373. 17. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin- Ciocalteu reagent. Meth. Enzymol 1999; 299: 152-178. 18. Pereira MD, Herdeiro PN, Fernandes PN, Eleutherio ECA, Panek AD. Targets of oxidative stress in yeast sod mutants. Biochim. Biophys. Acta 2003; 1620: 245-251. 19. Steels EL, Learmonth RP, Watson K. Stress tolerance and membrane lipid insaturation in Saccharomyces cerevisiae grown aerobically or anaerobically. Microbiology 1994; 140: 569-576. 20. Davidson JF, Whyte B, Bissinger PH, Schiestl RH. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1996; 93: 5116- 5121. 21. Levine RL. et al. Meth. Enzymol 1990; 186: 464- 478. 22. Aebi H. Catalase in vitro. Meth. Enzymol 1964; 105: 114-118. 23. Floche L, Otting F. Superoxide dismutase assays. Meth. Enzymol 1984; 105: 93-104. 24. Dalle-Donne. et al. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta 2003; 329: 23-38. 25. Ferguson LR. Role of plant polyphenols in genomic stability. Mutat. Res 2001; 475: 89-111. 26. Soobrattee MA, Neergheen VS, Luximon-Ramma A, Aruoma OI, Bahorum T. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions. Mutat. Res 2005; 579: 200-213. 27. Barth SA, Inselmann G, Engemann R, 76 Heidemann HT. Infuences of Ginkgo biloba on cyclosporine A induced lipid peroxidation in human liver microsomes in comparison to vitamin E, glutathione and N-acetylcysteine. Biochem. Pharmacol 1991; 41: 1521-1526. 28. Liu RH. Potential Synergy of Phytochemicals in Cancer Prevention: Mechanism of Action. J. Nutr 2004; 134: 3479S-3485S. 29. Lee SE, Ju EM, Kim JH. Antioxidant activity of extracts from Euryale ferox seed. Exp. Mol. Med 2002; 34: 100-106. 30. Yamaguchi LF, Vassão DG, Kato MJ, Mascio PD. Bifavonoids from Brazilian pine Araucaria angustifolia as potentials protective agents against DNA damage and lipoperoxidation. Phytochemistry 2005; 66: 2238-2247. 31. Verstraeten SV. et al. Antioxidant and membrane effects of procyanidin dimmers and trimers isolated from peanut and cocoa. J. Agric. Food Chem 2005; 53: 5041-5048. 32. Reverter-Branchat G, Cabiscol E, Tamarit J, Ros J. Oxidative damage to specifc proteins in replicative and chronological-aged Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem 2004; 279: 31983-31989. 33. Balu M, Sangeetha P, Murali G, Panneerselvam C. Age-related oxidative protein damages in central nervous system of rats: modulatory role of grape seed extract. Int. J. Dev. Neurosci 2005; 23: 501-7. 77 Resumen Plantago major L. (llantén) es una planta que se emplea en la medicina tradicional mexicana como antitumoral, an- tiinfamatoria, antidiarreica, antibiótica y antiséptica. Las semillas se emplearon para obtener el extracto hexánico, que se probó sobre cultivos de las bacterias Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Shigella fexneri, Proteus mirabilis y Salmonella typhimurium. Se empleó como control positivo una mezcla de penicilina- estreptomicina. El extracto inhibió en un 54 a 66% el crecimiento de todas las bacterias probadas. El extracto presentó compuestos de tipo terpenoide. Palabras clave: Plantago major L. llantén, actividad antibacteriana, terpenos. Summary Plantago major L (llantén) a plant employed in Mexi- can traditional medicine is claimed to have antitumoral, anti-infamatory, antidiarrhoeal, antibiotic and antisep- tic activities. The seeds were employed to prepare the hexanic extract that was assessed over bacterial cul- ture of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Sal- monella typhi, Shigella fexneri, Proteus mirabilis and Salmonella typhimurium. Penicillin- streptomycin solu- tion was used as positive control. The extract inhibited bacterial growth in all assays in 54 to 66%. The hexanic extract showed to have terpenoids-like compounds. Key Words: Plantago major L. llantén, antibacterial ac- tivity, terpenoids. Introducción Las enfermedades infecciosas intestinales y de vías respiratorias son las dos principales causas de muerte en la población infantil mexicana de 1-4 años, mien- tras que en la población total las infecciones intestina- les y las respiratorias son la séptima y quinta causa de muerte, de manera respectiva (SINAIS, 2007). Las bacterias Escherichia coli, Salmonella typhi y Shigella fexneri son las bacterias que más frecuentemente se asocian con infecciones gastrointestinales en el hombre. Por otra parte Staphylococcus aureus origina una amplia variedad de infecciones supurativas e infecta heridas y órganos internos. Se asocia también a la intoxicación alimentaria debida a las toxinas que libera. Este patógeno también infecta a animales (Tortora et al, 2004). Actividad antibacteriana de las semillas de Plantago major L. Antibacterial activity of Plantago major L SEEDS. * 1 Elisa Vega-Ávila, 2 Shindu Irais Gómez-Covarrubias, 1 Rafaela Tapia-Aguilar, 3 Jorge Santana-Carrillo y 1 Rodolfo Velasco-Lezama. 1 Laboratorio de Hematología Experimental. Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. 2 Licenciatura en Biología Experimental. División de Ciencias Biológicas y de la Salud-Iztapalapa. Universidad Autónoma Metropolitana. 3 Herbario “Ramón Riba”. Departamento de Biología. Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa. Autora para correspondencia: Elisa Vega Avila Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana San Rafael Atlixco 186, Iztapalapa, México DF 09340 Tel. +55-58046482, Fax. +55-58044727 Correo electrónico:
[email protected] 78 A pesar de que en la antigüedad no se conocía la existencia de los microorganismos y su papel en la generación de infecciones ya se empleaban las plantas Melissa offcinalis, Allium sativum y Melaleuca alternifolia para el tratamiento de enfermedades infecciosas comunes y en la actualidad se reconocen a estas plantas como agentes antimicrobianos de amplio espectro (Heinrich et al, 2004). La medicina tradicional participa de manera activa en el sistema médico mexicano y se relaciona con el 40% de los servicios de salud; se estima que un 25% (aproximadamente 20 millones de personas) aún dependen de las plantas con propiedades medicinales para el tratamiento de enfermedades (Hernández et al, 2003). En la investigación etnobotánica realizada por Aguilar y Camacho (1984) se agrupan las plantas del Herbario del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSSM) de acuerdo a su acción en los aparatos y sistemas. Esta clasifcación permitió proponer al IMSSM una lista de las especies vegetales más usadas en México para los padecimientos de los aparatos digestivo y respiratorio. De acuerdo a la información registrada en dicho herbario, el 60% de las especies se relacionan con el tratamiento de las afecciones del aparato digestivo, piel y aparato respiratorio (Aguilar et al, 1996). Plantago major L. (llantén) es una de las plantas empleadas para el tratamiento de enfermedades asociadas al aparato digestivo. Plantago major L. es una planta cosmopolita de distribución mundial. Es anual o perenne con una altura 10 a 30 cm con hojas en forma de roseta que envuelven parte del tallo. Sus fores están dispuestas en espigas y son blanco verdosas. Sus semillas son de color café. En la medicina tradicional mexicana se emplea como antiinfamatoria, en infecciones vaginales, diarrea, disentería y carminativa (Argueta et al, 1994). Se aplica para quitar manchas de la piel, es antiséptica y antibiótica (Márquez et al, 1999). Estudios previos en nuestro grupo de trabajo mostraron que el extracto hexánico de las partes áreas de P. major inhibe el crecimiento de E. coli (Velasco et al, 2006), en el presente trabajo evaluamos la actividad antibacteriana in vitro del extracto hexánico de las semillas de esta planta. Material y métodos Preparación del extracto hexánico La planta se adquirió en el Mercado de Sonora del Dis- trito Federal de México durante el mes mayo de 2008. La planta fue identifcada por especialistas del herbario “Ramón Riba” de Universidad Autónoma Metropolitana donde se depositó un ejemplar de la planta con el regis- tro UAMIZ52718. Se separaron las espigas, se dejaron secar a temperatura ambiente, se recuperaron las se- millas manualmente y se molieron en la licuadora (Phi- llips). Al material molido se le adicionó hexano (JT Baker, USA) y se calentó la mezcla a refujo durante 4 horas. Se separó el material sólido por fltración y se concentró el extracto a presión reducida en un rotavapor. Microorganismos empleados Se emplearon las cepas bacterianas; Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella typhi ATCC 6539, Shigella fexneri ATCC 29003, Proteus mirabilis NCTC 2896 y Salmonella typhimurium ATCC 13311. Preparación de los sensidiscos Se prepararon soluciones del extracto en concentracio- nes de 1.5, 0.15 y 0.015 mg/ml de DMSO al 10% (JT Baker, USA) y se aplicaron 50 µl de cada una de estas soluciones para impregnar discos estériles de 6.0 mm de diámetro (Whatman No. 1), de manera tal que la concentración fnal del extracto en los discos fue de 75, 7.5 y 0.75 µg. Se empleó un control negativo impregna- do con 50 µl del DMSO al 10%. Como control positivo se emplearon sensidiscos impregnados con 50 µl de una mezcla de penicilina-estreptomicina (Sigma, USA) en concentración de 100 UI-100 µg/ml de manera tal que el control positivo tuvo 5 UI de penicilina-5 µg de estreptomicina. Evaluación de la actividad antibacteriana La actividad antibacteriana se evaluó por el método de difusión en disco (Vanden Berghe and Vlietinck, 1991). Los microorganismos se sembraron en agar cerebro y corazón (BHI) (Bioxon) y se incubaron 24 horas a 37 ºC. Se seleccionó una colonia de cada uno de los mi- croorganismos empleados y se subcultivo en caldo BHI 24 horas a 37ºC. Los cultivos se ajustaron con solución salina estéril (para obtener una turbidez estándar del tubo No. 1 del nefelómetro de Mac Farland (108 unida- des formadoras de colonias). Se depositaron 0.30 ml de la suspensión bacteriana y se sembraron por disper- sión con una varilla acodada en placas de Agar Müe- ller-Hinton (Bioxon). Las placas sembradas se dejaron en reposo a temperatura ambiente al menos 30 minu- tos para que se absorbieran las bacterias sembradas, posteriormente se colocaron sobre los cultivos los dis- cos impregnados previamente y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. La actividad antibacteriana en cada disco se valoró midiendo el halo de inhibición del creci- miento alrededor del disco. La actividad de la solución 79 de antibióticos (control positivo) se consideró como el 100% de inhibición y contra ella se comparó la activi- dad del extracto de prueba. Esta prueba se realizó por triplicado en tres ocasiones distintas. Análisis ftoquímico preliminar El extracto obtenido fue de color amarillo con consis- tencia grasosa y en base a la consistencia el análisis ftoquímico se orientó a la búsqueda de compuestos terpenoides usando la reacción de Lieberman-Buchar- dt (Alarcón-Aguilar et al, 2006). Se disolvió una porción del extracto en cloroformo (JT Baker, USA) a la que se le añadieron anhídrido acético (JT Baker, USA) y unas gotas de ácido sulfúrico concentrado (JT Baker, USA), dando la formación de un anillo de color rojo en la interfase por lo que se consideró positiva la prueba. Posteriormente se aplicó una porción del extracto di- suelto en cloroformo sobre una placa de sílica gel 60 F254 (Merck) y se resolvió con una mezcla de hexano: diclorometano (9:1), fnalmente se reveló con luz ultra- violeta de onda corta y con yodo. Resultados En la concentración de 75 µg/disco, el extracto hexá- nico de las semillas inhibió el crecimiento de las bac- terias (55.0 – 66.7%). Con las concentraciones de 7.5 y 0.75 µg/disco se inhibió un 6.3% el crecimiento de P. mirabilis. En el caso de Salmonella typhimurium se in- hibió el crecimiento en 4.2% a la concentración de 7.5 µg/disco (Cuadro 1). En el análisis ftoquímico se detectó la presencia de compuestos terpenoides. El análisis cromatográfco mostró 6 manchas que corresponden a 6 compuestos diferentes. Discusión En este trabajo encontramos que el extracto hexánico de las semillas, dosis de 75 µg/disco inhibe más de un 50% el crecimiento de todas las bacterias probadas. El grupo de compuestos presentes en el extracto son del tipo de los terpenoides/esteroles y la placa de croma- tografía mostró seis manchas por lo en este extracto existen al menos seis compuestos diferentes. Dentro del grupo de compuestos que conforman a los terpenos encontramos a los monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenoides, triterpenos y carotenoides (Harbone, 1998). Entre los monoterpenos con actividad contra Staphylococcus se encuentran γ-terpineno, α-tepineol, terpinen-4-ol y linalol los cuales presentan concentraciones mínimas inhibitorias (MIC, siglas en inglés) en el rango de 0.125 -0.25%. Estos monoterpenos se aislaron de Melaleuca alternifolia y el compuesto terpinen-4-ol fue el compuesto más activo contra bacterias gram-negativas (Gibbons, 2004). Se aisló de Artemisia asiatica el 1,8- cineol, monoterpeno activo contra Staphylococcus (MIC = 2 µl/ml), E. coli (MIC=3 µl/ml) y P. aeruginosa (MIC=3 µl/ml) (Kalemba et al 2000). Las sesquiterpenlactonas 6-O-metilacrililplenolina, 6-O-isobutiroilplenolina y 6-O-angeloilplenolina se aislaron de Centipeda minima, planta empleada en la medicina tradicional de Nepal para tratar infecciones y las tres mostraron actividad contra Bacillus subtilis, Staphylocococcus aureus (Taylor & Towers, 1998). Los dieterpenos constituyen el grupo más grande de compuestos de origen natural que presentan actividad contra los Staphylococcus (Gibbons, 2004) y entre estos se encuentra el isopimarano que también actúa sobre B. subtilis (MIC=4 µg/ml) y se sugiere que daña la membrana, aunque se desconoce el mecanismo de acción especifco (Woldemichael, 2003). El ácido Extracto/ Control Cepas bacterianas empleadas µg/disco S. thyphimurium E.coli S.typhi S. fexneri P.mirabilis S. aureus 75 56.43 66.66 55 59.99 62.50 65.0 7.5 --4.16 -- -- -- 6.25 -- 0.75 --- -- -- -- 6.25 -- DMSO 10% 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Penicilina- estreptomicina 5 UI/5 µg 100 100 100 100 100 100 Cuadro 1. Actividad antibacteriana del extracto hexánico de P.major y penicilina-estreptomicina. Porcentaje de inhibición (n=9). 80 beyerenóico es un diterpeno aislado de Viguiera hypargyrea, posee actividad contra Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis (MIC=12 µg/ml), (Zamilpa et al, 2002). Entre los triterpenos existen 2 nor-friedelanos aislados de Crossopetalum gauneri con una potencia excelente contra S. epidermis (MIC=0.54 -1.11 µM) ya que son más potentes que el cloranfenicol (MIC= 12.4 µM) (Ankli et al, 2000). Dado que P. major ha sido usado para diferentes propósitos en la medicina tradicional mundial, se han estudiado y demostrado diversas actividades biológicas de la planta. La mayoría de las pruebas se han realizado con extractos crudos sin examinar la naturaleza de los compuestos activos (Samuelsen, 2000). Entre las actividades evaluadas se encuentra la antibacteriana de los extractos, metanólico, etanólico al 50% y etanólico al 70%, determinada por el método de difusión en disco. El extracto metanólico fue el más activo contra S. typhimurium y presentó la actividad débil contra S. aureus resistente a la meticilina y Mycobacterium phlei (McCutcheon et al, 1992). El extracto etanólico al 50% fue activo contra S. aureus, B. subtilis, S. dysenteriae y E. coli (Cáceres et al, 1987). El extracto obtenido con etanol al 70% fue más efcaz contra S. fexneri (Moskalenko 1986) y presentó actividad débil contra S. aureus (Cáceres et al, 1990), S. sonnei, (Moskalenko 1986) y E. coli (Cáceres et al, 1990). Debido a que los extractos se obtuvieron empleando disolventes polares, se esperaría que los metabolitos activos no son de tipo terpenoide, siendo este trabajo el primero que reporta actividad antibacteriana de las semillas en solventes no polares Con la planta completa de P. major se prepararon extractos con etanol, metanol y agua y se probaron sobre S. aureus, B. subtilis, E. coli, C. albicans y C. tropicalis y fueron los extractos obtenidos con metanol los que tuvieron actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positiva y Gram negativa tales como el S. aureus (MIC = 100 mg/ml), E. coli (120 mg/ml). El extracto etanólico también mostró actividad contra S. aureus (MIC=200 mg/ml) y E. coli (140 mg/ml). Se observó, mediante microscopia electrónica de barrido, que después de exponer a E. coli y S. aureus en presencia de 200 mg/ ml del extracto metanólico y etanólico la pared celular de S. aureus se deformó produciendo ondulaciones en las células las que también se pegaron. (Sharifa et al, 2008). De las partes aéreas de P. major se ha aislado la aucubina que es un iridoide glucosilado y es el aglicón de la aucubina, la aucubigemina, compuesto que presenta actividad antimicrobiana y antifúngica (Samuelsen, 2000). La aucubigemina es un principio activo importante y es durante su catabolismo por hidrólisis, se forma un dialdehído que actúa como bactericida ya que desnaturaliza las proteínas de ciertos microorganismos (Blanco et al, 2008). La actividad bactericida del extracto hexánico no se atribuye a la aucubina ya que esta sustancia se extrae en los extractos obtenidos con metanol. Conclusión En el presente trabajo mostramos que el extracto hexá- nico de las semillas de Plantago major L. inhibió en una concentraron baja el crecimiento de las seis bacterias probadas, algunas de ellas consideradas como los agentes causales de infecciones gastrointestinales. Por lo que consideramos que el presente estudio respalda el conocimiento y uso popular de esta planta contra las infecciones bacterianas del aparato digestivo, y propor- ciona nuevo conocimiento de las propiedades químicas de esta planta. Agradecimientos Esta investigación se realizó con el apoyo parcial de PROMEP, en apoyo a los cuerpos académico, a través del convenio 907011-14610757. Agradecimientos Agradecemos del personal del Herbario de la Universi- dad Autónoma Metropolitana – Iztapalapa en la identif- cación de las muestras vegetales de Plantago major L. Referencias 1. Aguilar CA, Camacho JRVS (1984). La herbolaria como recurso básico. Estadísticas Nacionales En: Medicina Tradicional y Herbolaria. Materiales para su estudio. Publicación del IMSS. pp 88-92. 2. Aguilar CA, Camacho JRVS, Chino S, Jácquez, P, López ME (1996). Plantas medicinales del herbario del IMSS. Cuadro básicos por aparatos y sistemas del cuerpo humano. Instituto Mexicano del Seguro Social. pp. 32. 3. Alarcón AF, Vega AE, Almanza PJ, Velasco LR, Vázquez CL, Román RR (2006). Hypoglucemic effect of Plantago major seeds in healthy and alloxan-diabetic mice. Proc West Pharmacol Soc 49: 51-54. 81 4. Ankli A, Heilmann J, Heinrich M, Sticher O (2000). Cytotoxic cardenolides and antibacterial terpenoids from Crossopetalum gaumeri. Phytochemistry 54: 531-537. 5. Argueta VA, Cano ALM Rodarte ME (1994). Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana, Vol. II. Instituto Nacional Indigenista. México. pp 128. 6. Blanco B, Saborío A, Garro G. (2008). Descripción anatómica, propiedades medicinales y uso potencial de Plantago major (llantén mayor). Tecnología en Marcha. 21-22: 17-24. 7. Cáceres A., Giron LM, Alvarado SR, Torres MF. (1987). Screening of antimicrobial activity of plants popularly used in Guatemala for the treatment of dermatomucosal diseases. J Ethnopharmacol 20: 223-237. 8. Cáceres A, Cano O, Samayoa B, Aguilar L (1990). Plants used in Guatemala for the treatment of gastrointestinal disorders. A screening of 84 plants against enterobacteria. J Ethnopharmacol 30: 55-73. 9. Gibbons S (2004). Anti-staphylococcal plant natural products. Nat Prod Rep 21:263-277. 10. Harbone JB (1984). Phytochemical methods. A guide to modern techniques of plants analysis. 2nd ed. Chapman and Hall. London. pp 100-141. 11. Heinrich M, Barnes J, Gibbons S, Williamson EM (2004). Fundamentals of pharmacognosy and phytotherapy. Churchill Livingstone, Edinbrugh. pp 245-252. 12. Hernández T, Canales M, Avila JG, Durán A, Caballero J, Romo de Vivar A, Lira R. (2003). Ethnobotany and antibacterial activity of some plants used in tradicional medicine of Zapotitlán de las Salinas, Puebla (México). J Ethnopharmacol 88:181-188. 13. Kalemba D, kusewicz, Swiader K (2002). Antimicrobial activity of the essential oil of Artemisia assiatica Nakai. Phytother Res 16: 288-291. 14. McCutcheon AR, Ellis SM, Hancock REW, Towers GHN (1992). Antibiotic screening of medicinal plants of the British Colombian native plants. J Ethnopharmacol 37: 213-223. 15. Márquez C, Lara OF, Esquivel RB, Mata ER (1999). Plantas medicinales de México II. Composición, usos y actividad biológica. Universidad Nacional Autónoma de México. pp 107-109. 16. Moskalenko SA (1986). Preliminary screening of far-eastern ethnomedicinal plants for antibacterial activity. J Ethnopharmacol 15: 231-259. 17. Samuelsen AB (2000). The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. A review. J Ethnopharmacol 71:1-21. 18. Sharifa AA, Neoh YL, Iswadi MI, Khairul O, Abdul HM, Jamaludin M, Mohamed Azman AB, Hing HL (2008). Effects of methanol, ethanol and aqueous extract of Plantago major on Gram positive bacteria, gram negative bacteria and yeast. Ann Microscopy 8:42-44. 19. Taylor RSL, Towers GHN (1998). Antibacterial constituents of the Nepalese medicinal herbs, Centipeda minima. Phytochemistry 47: 631-634. 20. Tortora J, Gerard J, Funke R, Berdell R, Case L. Christine 8th Ed. Microbioloy, an introduction. Pearson, Benjamin Cummings. 2004. 21. Vanden Berghe DA, Vlietinck AJ (1991). Screening methods for antibacterial and antiviral agents from higher plants. In: Dey PM, Harborne JB, Hostettman K. (Eds). Methods in Plant Biochemistry. Assay for Bioactivity. Vol 6. Academic Press, London, pp 47-69. 22. Velasco-Lezama R, Tapia-Aguilar R, Román- Ramos R, Vega-Avila E, Pérez-Gutiérrez MS (2006). Effect of Plantago major on cell proliferation in Vitro. J Ethnopharmacol. 103: 36- 42. 23. Woldemichael G., Wachter MP, Singh MP, Maiese WM, Timmermann BN (2003). Antibacterial diterpenes from Calceolaria pinifolia. J Nat Prod 66: 242-246. www.sinais.salud.gob. mx. 24. Zamilpa A, Tortoriello J, Navarro V, Delgado G, Alvarez L (2002). Antispasmodic and antimicrobial diterpenic acids from Viguiera hypargyrea roots. Planta Med 68:281-283. 82 83 RESUMEN Objetivo: Establecer si el tipo de placebo utilizado puede, o no, infuir los resultados de ensayos clínicos de acu- puntura. Diseño: Meta-análisis de los resultados según el diseño del placebo. Noventa publicaciones pudieron ser clasif- cadas en uno de dos grupos: i) 45 ensayos clínicos con seudo-acupuntura consistente en pinchar fuera del meri- diano, pero cerca del acupunto clásico, clasifcados como modelo energético de placebo (EPM). ii) 45 estudios cuyo placebo consistió en punzar en zonas distantes de los puntos activos; clasifcados como modelo metamérico o neurofsiológico de placebo (MPM). En ambos grupos de publicaciones, se evaluó la proporción de resultados signifcativos y la distribución de resultados de no-signi- fcativos con alivio mayor de 35% en ambos grupos de pacientes, mediante la prueba de Chi-cuadrado. Resultados: La proporción de resultados signifcativos fue apreciablemente más alta en el grupo MPM (73.33%), (p <0,03). El grupo EPM, arrojó 80% de resultados no-signi- fcativos con alivio mayor de 35%. (p <0,05). Conclusión: La falsa acupuntura (EPM) emergió tan acti- va como acupuntura “verdadera” por tato es un pseudos- placebo. Lo que sugieren que el procedimiento placebo empleado sí determina el resultado, -éxito o fracaso- de un ensayo clínico de acupuntura, para obtener diferen- cias entre grupos comparables, aun cuando éstas real- mente existan. Palabras claves: Meta-análisis Acupuntura, acupuntura sham, modelo de placebo neurofsiológico o segmenta- rio. Does the Choice of Placebo Determine the Results of Clinical Studies on Acupuncture? Abstract Objective: To establish whether the choice of the place- bo treatment used may infuence the outcomes of clinical trials on acupuncture or not. Design: A meta-analysis of outcomes according to the choice of the placebo of ninety publications classifed into one of two groups: i) 45 clinical trials with sham-acupunc- ture, (needling outside the meridian, but near to classical acupoints) classifed as energetic placebo model (EPM). ii) 45 studies whose placebo treatment was needling within a zone far enough from the active points, classifed as metameric placebo model (MPM). In both groups of ¿Determina el diseño del placebo los resultados de los ensayos clínicos de acupuntura? Meta-análisis de 100 ensayos clínicos Does determine results of the clinical outcomes of acupuncture the design of the placebo? Meta-analysis of 100 clinical assays. Max Sánchez-Araujo Clínica Médica de la Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”. Unidad de Investigación de Terapias Complementarias. Coro, Venezuela. Instituto de Investigación de Salud y Terapéutica, INSYT Caracas, Venezuela. Autor para correspondencia: Max Sánchez-Araujo Instituto de Investigación de Salud y Terapéutica, INSYT Av. Río de Janeiro, Edif. San Jacinto, Ofc. 3, Las Mercedes, Caracas 1060, Venezuela. Dirección electrónica:
[email protected] 84 publications, the proportions of signifcant results and the distribution of nonsignifcant results with improvements in both groups of patients greater than 35% were assessed by the chi-square test. Results: The proportion of meaningful results was signi- fcantly higher in the MPM group (73.33%), (p < 0.03). In the EPM group 80% showed nonsignifcant results with improvements greater than 35% in both groups of pa- tients. (p <0.05). Conclusion: Sham acupuncture (EPM) appears almost as active as ‘real’ acupuncture. Thus, these results su- ggest that placebo procedures can determine the outco- me, i. e. success or failure of a clinical trial of acupuncture to obtain differences among compared groups, in case they actually exist. Key words: Meta-analysis, Acupuncture, sham acupunc- ture, neurophysiologic o metameric placebo model. Introducción En el último cuarto de siglo se ha incrementado noto- riamente la investigación básica y clínica de la acupun- tura. En general, puede asumirse, que los mecanismos básicos de la acupuntura se han establecido sufcien- temente; no obstante, su validación clínica es todavía incipiente. Muchos trabajos conducen a conclusiones contradictorias por meras fallas metodológicas de diver- sa naturaleza e importancia que diezman la calidad de las publicaciones (1, 2). Dos meta-análisis de acupun- tura para el dolor crónico arrojaron resultados contra- dictorios (1-4). Algunos autores llegan incluso a dudar que sea posible evaluar los efectos de la acupuntura mediante los procedimientos utilizados en los estudios clínicos comparativos controlados, de acuerdo con las reglas de Occidente (5, 6). Independientemente de la calidad del diseño, se han podido identifcar tres gran- des grupos de difcultades inherentes a la acupuntura, a saber: a) no existe una regla clara y práctica para la escogencia del tratamiento de acupuntura que se apli- cará al grupo experimental, el cual debe respetar los principios de la terapéutica con acupuntura y, al mismo tiempo, debe ser equiparable de un sujeto a otro dentro de dicho grupo (7, 8). b) Difcultades relativas a la for- ma de enmascaramiento para mantener la posibilidad de contrastar a los grupos en el curso del estudio y, en fn, c) la falta de defnición de un procedimiento placebo adecuado para la acupuntura. Este último aspecto pa- rece de gran relevancia, pues las discrepancias en la defnición del placebo ideal para la acupuntura consti- tuye, probablemente, la fuente más importante de hete- rogeneidad y contrastes en los resultados de los ensa- yos clínicos de acupuntura, pues conduce a resultados contradictorios (9). Existen dos grandes tendencias en el diseño (10, 11), a saber: uno que sigue el modelo energético tradicional, que consiste en colocar la aguja placebo cerca del punto activo (acupuntura real), pero fuera del meridiano; el otro, concebido bajo un modelo que podríamos califcar de neurofsiológico, porque, de alguna manera, toma en cuenta la estructura neuroló- gica subyacente y el comportamiento funcional de las metámeras o, simplemente, toma precauciones para no activar el DNIC (12). El impacto de la imaginación, las creencias y las emociones en el proceso de curación ha sido reconocido desde hace mucho tiempo (13, 14) Este fenómeno sorprendente, capaz de modifcar el curso de una enfermedad, es lo que se denomina efecto placebo. Desde los años cincuenta, mediante el empleo de diferentes formas farmacéuticas, inyecciones, tabletas, cápsulas, grageas, ungüentos, etcétera, se ha establecido que el efecto placebo proporciona entre el 30 y 35% de la respuesta terapéutica. (15) El efecto de un tratamiento cualquiera viene dado por la suma del efecto terapéutico, más el efecto placebo del producto o procedimiento en cuestión, más el efecto de la interacción paciente-terapeuta. Así, la acción del placebo es una mezcla de auto y heterosugestión con componentes psicológicos y socioculturales cuyos efectos son impredecibles. (16) La imposibilidad de predecir el efecto placebo hace necesario el diseño de ensayos placebo controlados para la mayorías de los estudios clínicos (17). Dadas las evidencias que señalan la selección del procedimiento placebo en los ensayos clínicos de acupuntura como una eventual fuente de distorsión de los resultados que origina controversia y frustración, el objetivo del presente trabajo es responder la pregunta: ¿Es determinante la forma en que se diseña y ejecuta el placebo en el resultado de los ensayos clínicos de acupuntura? Material y métodos Se revisaron los ensayos clínicos aleatorizados y con- trolados con placebo de acupuntura en el tratamiento de diversas afecciones dolorosas y no dolorosas toma- dos a través de una búsqueda on line en el MEDLINE desde 1975 hasta 1989, combinada con búsquedas en MEDLINE CD ROM y en la ACUBASE de la Universi- dad de Montpellier desde 1989 hasta 1995 (Palabras claves: acupuncture, clinical trial, sham acupuncture, therapy, treatment). Además se escudriñó en las re- ferencias bibliográfcas de los artículos mas importan- tes. 85 A. Haciendo abstracción de los otros aspectos metodológicos, se enfocó la atención, exclusivamente, en lo relativo al diseño del placebo. De acuerdo al modelo de placebo utilizado, las publicaciones fueron clasifcadas en dos grupos: a) grupo de publicaciones con modelo energético del placebo (MEP) y b) grupo de publicaciones con modelo metamérico del placebo (MMP). En el estudio no se aceptó como placebo los procedimientos que obviaban la inserción de agujas. Fueron descartados para evitar los sesgos relacionados con el objeto de este trabajo: establecer si existe o no diferencia en los resultados de ensayos en los que la estimulación nociceptiva de la piel se ejecuta fuera y dentro del dermatomo donde se ubica el punto real. B. Se denominó modelo energético de placebo (MEP) al procedimiento que empleaba como falso tra- tamiento la aplicación de las agujas fuera del meridiano, en un sitio cercano al punto de acupuntura real (sham acupuncture), puesto que se basa en el criterio de que las agujas aplicadas fuera del meridiano, no tendrán efecto, pues, al no interferir con el fujo de energía en los canales, no pueden restablecer el equilibrio ener- gético. C. El modelo metamérico o neurofsiológico de placebo (MMP) es el procedimiento de colocar las agujas del grupo control en un dermatomo diferente y sufcientemente alejado de los puntos activos usados en el grupo experimental, porque toma en cuenta la arquitectura metamérica del cuerpo y comportamiento funcional de las metámeras. En ambos grupos de publicaciones se estudió a) la distribución de resultados signifcantes de acuerdo al tipo de placebo empleado y b) la distribución de resultados no signifcantes acompañados de una tendencia a la mejoría de los síntomas, en el grupo tratado y en el grupo control. Para tal fn, en los trabajos con este tipo de resultados, se precisó, cuando fue posible, si en los grupos comparados la proporción de sujetos con mejoría de algunos de los criterios de juicio era signifcativamente mayor del 35%; es decir, superior a la esperable por el simple efecto placebo. Con este objeto, se escudriñó en los resultados para establecer si existía explícitamente esta información. En su defecto, cuando era posible, se procedía a explorar los datos para ver si esta información estaba consignada de manera indirecta. Análisis estadístico A. Se comparó el porcentaje de resultados con diferen- cias no signifcativas obtenidos en los dos grupos de ensayos clínicos (MEP y MNP, de manera respectiva). Se empleó la siguiente hipótesis nula: ambos modelos de placebo son equiparables, por tanto debe haber una proporción equivalente de buenos resultados en am- bos grupos de publicaciones. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Chi Cuadrada. B. En ambos grupos de publicaciones, se comparó además, la distribución de resultados no signifcativos asociados con una mejoría de los síntomas superior al 35% tanto en el grupo tratado como el de control. En este caso se empleó la siguiente hipótesis nula: si ambos modelos de placebo son equivalentes, la proporción de trabajos con este género de resultados será similar entre los dos grupos de publicaciones. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Chi Cuadrada. Resultados Cumplieron los requisitos de inclusión 127 estudios clínicos comparativos. Se observaron cuatro grandes tendencias en el diseño de los ensayos clínicos: a) estudios clínicos con modelo energético del placebo (MEP): 35,43 % (45/127); b) estudios clínicos con mo- delo metamérico de placebo ( MMP): 35,43 % (45/127); c) acupuntura comparada con un tratamiento de refe- rencia: 21,26 % (27/127) y d) acupuntura comparada con un grupo sin tratamiento: 7,87 % (10/127) Los gru- pos c y d fueron descartados para este estudio. (En total: 37 publicaciones c. Acupuntura vs. tratamiento de referencia o Mock TENS o TENS apagado: 27 trabajos y d) acupuntura versus no-tratamiento: 10 trabajos, ver Figura 1. En el grupo MEP sólo se observaron diferencias signifcativas en el 33.33 % (15 / 45); mientras que en el grupo MMP se obtuvo diferencias signifcativas en el 73.33 % de los trabajos (33 / 45), la prueba del X 2 señala una diferencia signifcativa (p <0.03) en ambos grupos de publicaciones; es decir, el modelo energéti- co de placebo (MEP) fracasa más frecuentemente en discernir diferencias que el modelo metamérico (MMP) (Figura 2). Por otra parte, en los trabajos con modelo energético (MEP) fue mas frecuente la situación de re- sultados no signifcantes con alivio signifcativo de los pacientes de ambos grupos. (En el grupo MEP: 80 % (24/30) y en grupo MNF: 20 % (6/30) con una diferen- cia signifcativa: p < 0.05; lo que subraya que la colo- cación de agujas fuera del meridiano pero dentro de la misma metámera tiene un efecto similar al del punto clásico (Figura 3). 86 Discusión Los resultados encontrados son consistentes con la hipótesis de que la forma cómo se diseña y ejecuta el placebo sí determina los resultados de la investigación clínica en acupuntura. Es decir, el diseño del placebo puede defnir el éxito o el fracaso de un ensayo clíni- co para obtener diferencias signifcantes entre el grupo tratado y el grupo control. Esto sugiere que el efecto producido por el punto fuera del meridiano pero en el mismo dermatomo es muy similar al obtenido por es- timulación del punto real, debido a la arquitectura me- tamérica del cuerpo. Por lo tanto, la aplicación de las agujas fuera del meridiano parece constituir un falso placebo; en cambio la colocación de las agujas placebo fuera de la metámera afectada no actúa sobre los sín- tomas del paciente y constituye un verdadero placebo. Desde hace mucho tiempo se habían identifcado difcultades para la ejecución del placebo para la acupuntura (1-4). Por supuesto, desde el paradigma energeticista, era lógico pensar que bastaba colocar las agujas fuera del punto del meridiano (sham acupuncture), porque se suponía que este procedimiento, incapaz de interferir con el fujo energético, no tendría efecto alguno. Por esta razón la sham acupuncture se convirtió en el placebo ideal para los cultores de la investigación clínica de la acupuntura y en una importante fuente de confusión y controversias. Así, Gaw et al. (18) en un riguroso estudio clínico pionero, compararon acupuntura real y placebo- acupuntura (sham Acupuncture) en pacientes con dolor osteoartrítico en varias regiones del cuerpo. El placebo consistió en la aplicación de agujas en puntos cercanos a los acupuntos reales, pero fuera del meridiano. Los resultados mostraron una signifcativa mejoría del dolor y de la movilidad articular en ambos grupos, pero sin diferencias signifcativas entre la acupuntura real y el placebo. Desde entonces y de manera consistente, los ensayos que comparan acupuntura con sham acupunture han venido arrojando resultados similares. En cambio, cuando se han empleado condiciones placebo sin punción, con mayor frecuencia se han reportado resultados signifcativamente superiores con acupuntura (19). De igual forma, otros autores, desconociendo la estructura metamérica, han usado inyección de agua destilada o lidocaína como placebo, ignorando, además, que basta la perturbación producida por una aguja para desencadenar la respuesta de la metámera (20). Actualmente, está bien establecido que inyectar agua destilada o anestésico tiene un efecto al menos tan potente que la aplicación de agujas secas (21, 22). En cambio, Duplan et al. (23) sí obtuvieron diferencias signifcantes usando sham-acupunture como placebo en la ciática aguda; pues al colocar las agujas fuera del meridiano, en la región lumbar (L4-L5) las aplicaron en Figura 1. Grandes tendencias en el diseño de los ensayos clínicos Metameric Placebo 35% Metameric Placebo C D Energetic Placebo Energetic Placebo 36% D 8% C 21% Metameric Placebo Energetic Placebo Non Significant P<0,05 67% 33% 27% 73% 0 5 10 15 20 25 30 35 30 33 15 12 Metameric Placebo Energetic Placebo RELIEF Rate >35% RELIEF Rate <35% NO INFORMATION 0 5 10 15 20 25 15 Figura 2. Distribución de los resultados de acuerdo al diseño del placebo Figura 3. Resultados no significativos con notable alivio en ambos grupos de pacientes. 87 una metámera diferente (D12-L1), lo cual explica el éxito de la acupuntura sham en esta caso. Así mismo Luu et al. (24), usando como placebo puntos colocados en las extremidades inferiores obtuvieron diferencias altamente signifcativas en el volumen espiratorio máximo en un segundo entre los grupos. Todo parece indicar que si no se toma en cuenta la neurobiología y la estructura metamérica del cuerpo, se corre el riesgo de continuar desarrollando estudios que utilizan la llamada sham acupunture como placebo y de esta forma, sin proponérnoslo, sabotear los resultados de los ensayos clínicos de acupuntura, como en el reciente trabajo de Takeda y Wessel, (25), en el que se comparó acupuntura y sham acupuncture para el tratamiento del dolor osteoartrítico de las rodillas y, al igual que Gaw, 19 años antes, concluyeron erróneamente, que la acupuntura es equivalente al placebo. Esta difcultad para obtener diferencias signifcantes entre acupuntura real y acupuntura placebo, había sido interpretada de varias maneras: a) ambos tratamientos ejercen su efecto a través de factores placebo; b) la acupuntura placebo es un tratamiento específco igualmente efcaz; la localización de los puntos es irrelevante (26); c) existen pequeñas diferencias entre la acupuntura verdadera y la falsa, pero no ha sido detectada por los investigadores por que se necesitarían inusualmente grandes números de sujetos en ambos grupos y el empleo de instrumentos estadísticos particularmente sensibles para poderlas discernir (27, 28). Sin embargo, los resultados del presente meta- análisis sugieren que el efecto producido por el punto fuera del meridiano es muy similar al del punto de acupuntura real, si está dentro de la metámera afectada, lo cual ya había sido observado por Chien-Ping (29). Por lo tanto, para evitar el Error Tipo II, (que consiste en descartar erróneamente un tratamiento como falso, cuando realmente es activo, por falta de robustez de la prueba estadística empleada), en lugar de un número muy alto de sujetos y el empleo de instrumentos estadísticos especiales para discernir el grado de signifcación, cuando la hubiere, puede resultar mucho más práctico y sencillo tomar en consideración la estructura metamérica del cuerpo y colocar las agujas placebo en zonas separadas, al menos, por tres o cuatro segmentos del dermatomo donde se aplican las agujas del tratamiento real. En otro lugar hemos sugerido que las zonas placebo ideales del cuerpo estarían ubicadas en sitios donde músculos voluminosos separan la piel de los paquetes vasculares y nerviosos importantes; por ejemplo en la regiones deltoidea y glútea (30). Estas zonas placebo fueron validadas recientemente por Lux y Col., quienes compararon electroacupuntura del dermatomo gástrico con la electroestimulación de la región deltoidea y no encontraron infuencia alguna de la manipulación placebo en la función gástrica (31). Esta situación no ha cambiado por que parece que los investigadores Occidentales han sido proclives a cambiar su propia metodología que a poner en tela de juicio el legado de los antiguos médicos chinos. Todo parece indicar que no podemos seguir aceptando como algo defnitivamente acabado e inmutable, el legado del pasado, de la tradición, so pena de ser castigados. Referencias 1. Lewith GT and Machin D. On the evaluation of the clinical effects of acupuncture. Pain 16:11- 127, 1983. 2. Richardson PH and Vincent CA, Acupuncture for the treatment of pain: a review of evaluative research. Pain 24:15-40, 1986. 3. Patel M, Gutswiller F, Paccaud F, Marazzi A. A meta-analysis of acupuncture for chronic pain. Int J Epidemiol 1989; 18: 900-906. 4. Ter Riet G, Kleijnen J, Knipschild P. Acupuncture and chronic pain: a criteria-based meta-analysis. Clin Epidemiol 1990; 433: 1191 -1199. 5. Lewith GT. Can we assess the effects of acupuncture? Br Med J 1984; 288: 1475-1476. 6. Harden RN. The pitfalls of acupuncture research: Can East satisfy West? Arthritis Care Res 1994; 7: 115-117. 4. Ter Riet G, Kleijnen J, Knipschild P. Acupuncture and chronic pain: a criteria-based meta-analysis. Clin Epidemiol 1990; 433: 1191 -1199. 5. Lewith GT. Can we assess the effects of acupuncture? Br Med J 1984; 288: 1475-1476. 6. Harden RN. The pitfalls of acupuncture research: Can East satisfy West? Arthritis Care Res 1994; 7: 115-117. 7. Kraemer FS, Cardoso M de FI, Yamamura Y. Acupuncture in angina pectoris. Correspondence. J Int Med 229: 381-386, 1991. 8. Schmidt, JG, How to measure effcacy of acupuncture therapy. WFAS International Symosium on the Trend of Research in Acupuncture. Rome 22-24 October, 1992 Abstracts an td Papers. pp 89-90. 9. Sánchez-Araujo M. Luckert A. The placebo design in acupuncture research. Acup Electro- ther Res 1990; 15: 268. Abstract. 10. Lewith GT, and Machin D. On the evaluation of the clinical effects of acupuncture. Pain, 16:111- 127, 1983 88 11. Richardson PH. and Vincent CA. Acupuncture for the treatment of pain: a review of evaluative research. Pain; 24: 15-40, 1986. 12. Bing Z, Villanueva L, Le Bars D. Acupuncture and diffuse noxious inhibitory controls: Naloxone- reversible depression of activities of trigeminal convergent neurones. Neuroscience 1990; 37: 809-818. 13. White, L., Tursky B., Schwartz, G.E.: Placebo in perspective in: White, L., Tursky B., Schwartz, G.E. (Edit): Placebo, Theory, Research, and Mechanisms. The Gilford Press, New York, 1985 14. Cousins, N. Anatomy of an ilness. Bantam Books, New York, 1981. 15. Schwartz D, Flammant R, Lellouch J. L’Essai thérapeutique chez l’homme, Flammarion Medecine Sciences. Paris, 1981. 16 Caulin Ch. Chastang Cl. Dahan R. Méthodologie de l’évaluation de la thérapeutique. Masson, Paris, 1993. 17. De Deyn PP and D’ Hooge R. Placebos in clinical practice and research. J Med Ethic. 1996: 22: 140-146. 18. Gaw et al. Effcacy of acupunctura on osteoarthritic pain. New Engl J Med 21: 375-378, 1975. 19. Richardson PH. and Vincent CA. Acupuncture for the treatment of pain: a review of evaluative research. Pain; 24: 15-40, 1986. 20. Mendelson et Al., Acupuncture treatment of chronic back pain, a double-blind placebo- controlled trial, Am J Med, 74: 49-55, 1983. 21. Hong C-Z. Lidocaine injection versus dry needling to myofascial trigger point. Am J Phys Med Rehabil 70:256-263, 1994. 22. Baldry, P. Superfcial dry needling at myofascial trigger point sites. J Musculoske pain 3:117-126, 1995. 23. Duplan B, Cabanel G, Piton JL, Grauer JL. Phelip X. Acupuncture et lombosciatique à la phase aigüe. Etude en double aveugle de trente cas. Sem Hôp Paris 1983; 59: 3109-3114. 24. Luu M, Maillard D, Pradalier A, Boureau F.: Contrôle spirométrique dans la maladie asthmatique des effects de la puncture de points douloureux thoraciques. Respiration 48: 340-345, 1985. 25. Takeda W, Wessel J. Acupuncture for the treatment of pain of osteoarthritic knees. Arthritis Care Res 1994; 7: 118-122. 26. Richardson PH. and Vincent CA. Acupuncture for the treatment of pain: a review of evaluative research. Pain; 24: 15-40, 1986. 27. Lewith and Machin, 1984; Stux G. and Pomeranz B. Basics of Acupuncture, Springer Verlag, Berlin Heildelberg, 1988. 29. Chien-Ping, W. Chao CC, Wei JY. Inhibitory effect produced by stimulation of afferents nerves on responses of cat dorsolateral fasciculus fbres to noxious stimulus. Sci Sinica 17: 687-697, 1974. 30. Luckert-Barela AJ, Sánchez-Araujo M. An ideal placebo for acupuncture? WFAS International Symosium on the Trend of Research in Acupuncture. Rome 22-24 October, 1992 Abstracts and Papers. pp 143. 31. Lux G, Hagel J, Bäcker P, Bäcker G, y col. Acupuncture inhibitis vagal gastric acid secretion stimulated by sham feeding in healthy subjects. Gut 1994; 45:1026-1029. Electro-ther Res 1990; 15: 268. Nota Versiones previas y en idioma inglés de este trabajo han sido presentadas y publicadas de la siguiente manera: a) 3er. Simposium Científco de Einsiedeln, Suiza, en oc- tubre de 1997 y seleccionado para su publicación. b) Methods and Design of a Pragmatic Clinical Resear- ch, Oriented towards Patient Beneft 3rd Scientifc Symposium of Einsiedeln October 16-19, 1997 Einsiedeln, Switzerland Editor Johannes G. Schmidt, Einsiedeln c) Studien zu «Placebo’ · Studies on ‘Placebo’ M. Sánchez Araujo Does the Choice of Placebo Deter- mine the Results of Clinical Studies on Acupuncture? Forschende Komplementärmedizin Vol. 5, Suppl. 1, 8- 11, 1998 d) Forschende Komplementärmedizin und Klassische Naturheilkunde/Research in Complementary and Clas- sical Natural Medicine 1998;5 (Suppl. 1):8-11 (DOI: 10.1159/000057100). 89 Resumen Cualquier tratamiento médico se encuentra enmarcado en un contexto cultural y cosmovisión particulares que contribuyen de manera importante en el resultado del tratamiento. El efecto placebo es la mejoría de la per- sona enferma que se observa tras un tratamiento simu- lado que no tiene elementos de un tratamiento “activo”. El objetivo de este trabajo es examinar los mecanismos del efecto placebo que son comunes con los cambios orgánicos que se observan tras la administración de acupuntura. Estudios recientes basados en neuroimagenología funcional han mostrado que la expectativa de dolor genera cambios en la actividad de la corteza prefrontal dorsolateral y orbitofrontal. Estos cambios se detectan de manera anticipada antes de la experiencia dolorosa, lo que sugiere que dichas estructuras pueden forma parte de un sistema comprometido en el control cognitivo del dolor. Una vez que el sujeto experimenta el estimulo nociceptivo, diversos estudios han mostrado que el placebo produce una reducción de actividad en regiones corticales que de manera clásica se relacionan con el procesamiento nociceptivo, ínsula anterior y área rostral del cíngulo, principalmente. En estas regiones la atenuación del procesamiento del dolor parece ser mediada por la liberación de opioides. En la analgesia por placebo se coordinan al menos dos sistemas cerebrales anatómicamente diferenciados. El mecanismo inductor parece estar localizado prefrontalmente y activarse inicialmente. Este sistema puede ejercer infuencia sobre otras regiones corticales (cíngulo e ínsula) atenuando en estos niveles superiores el procesamiento de información nociceptiva. De manera semejante la acupuntura empleada con fnes analgésicos se ha demostrado ejerce su acción a través de estos mismos mecanismos. Palabras clave: efecto placebo, acupuntura, mecanis- mos de la acupuntura, dolor Abstract Any medical therapy is framed in a cultural and cosmo- vision context this view could contribute in an important way in the result of the healing process. The placebo effect is the improvement of the sick person observed after a simulated treatment that does not any “active” component. The objective of this work is to examine the common mechanisms of the placebo effect and the organic changes observed after the acupuncture treatment. Recent studies based on functional neuro- imagenology have shown that the expectation of pain generates changes in the activity of the prefrontal dor- solateral and orbitofrontal cortex. These changes are detected before the painful experience, this fact sug- gested that these structures could form part of a system involved in the cognitive control of the pain. Once the subject experiences nociceptive stimulus, diverse stud- Efecto placebo y acupuntura: ¿mecanismos comunes en analgesia? Placebo effect and acupunture: shared mechanisms in analgesia? Miguel J. Reyes-Campos, Livia G. Díaz-Toral, José Luis Flores-Sáenz, José Federico Rivas-Vilchis Departamento de Ciencias de la Salud, Especialización en Acupuntura y Fitoterapia, Universidad Autónoma Metropolitana – Iztapalapa, México. Autor para correspondencia: Dr. José Federico Rivas-Vilchis Especialización en Acupuntura y Fitoterapia, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa e-mail:
[email protected] 90 ies have shown that the placebo produced a decrease of brain cortical regions activity usually related with the nociceptive processing mainly in the insula and ros- tral cingulated. In these regions the amiloration of the pain processing seems to be elicited by the liberation of opioides. In the analgesia by placebo at least two different cerebral systems are coordinated. The trig- ger mechanism seems to be located in the prefrontal cortex and to be activated initially. This system can ex- ercise infuence on other cortical regions (cingulo and insula) reducing in that upper levels the processing of nociceptive information. In similar way the acupuncture treatment of pain has been shown to act through these same mechanisms. Key words: placebo effect, acupuncture, acupuncture mechanisms, pain Introducción La investigación en el efecto placebo está en auge, en parte debido a el interés en tratamientos complementa- rios como la acupuntura (Vallance AK, 2006). Desde la antigüedad el hombre ha creído que recurrir a ciertas prácticas médicas puede ejercer una infuencia positiva sobre su salud. Estas creencias y expectativas se re- lacionan con su educación, cultura y cosmovisión. Un ejemplo actual de lo anterior es el efecto placebo. Para comprender adecuadamente este fenómeno hay que tener en cuenta que cualquier tratamiento -dentro de un sistema médico formal o informal- está rodeado por un contexto psicosocial y cultural que puede infuir en el resultado terapéutico. Desde el punto de vista del método científco, para analizar el efecto específco del contexto que rodea al tratamiento se hace necesario eliminar la acción producida por el tratamiento (p. ej., la administración de un medicamento determinado) y reproducir en todos los aspectos el contexto psicoso- cial concreto. Lo anterior se lleva a cabo aplicando un tratamiento simulado (es decir, un placebo). Así, el pa- ciente cree que el tratamiento que está recibiendo es “activo» y espera una mejora clínica. El efecto placebo es la mejora que se observa tras el tratamiento simula- do. Por ejemplo, en el caso del dolor, el propio contexto asociado al tratamiento puede aun sin la aplicación de medicamento analgésico alguno, reducir o eliminar el procesamiento nociceptivo, alcanzándose una analge- sia signifcativa (Colloca y Benedetti, 2005). Diversos estudios han mostrado que el efecto placebo es decir el contexto del tratamiento más las creencias y expectativas de los pacientes pueden producir un efecto semejante a ciertos niveles de dosifcación de algunos medicamentos activos como la morfna. Y se ha mostrado en estos mismos estudios que para superar al efecto placebo es necesario agregar dosis adicionales en este caso de morfna (Levine y Gordon, 1984; Levine et al., 1981). Por lo tanto, podemos afrmar que el efecto placebo es un fenómeno psicobiológico y cultural. Éste puede ser empleado como un modelo para investigar como los procesos cognitivos de la actividad mental relacionados a expectativas y creencias de curación y procesos de condicionamiento interactúan con los diferentes sistemas cerebrales para promover respuestas fsiológicas y conductuales de adaptación y respuesta a procesos nosógenos. Por otro lado, este fenómeno debería ampliar nuestra concepción acerca de los límites de las capacidades endógenas de adaptación de nuestro propio organismo. Ahora es un tema importante de estudio el estudio de aspectos subjetivos de la persona cuyas expectativas, creencias, valores y condicionamientos son aspectos que son posibles de investigar, y que existen mecanismos neurales relacionados con estos procesos subjetivos que a su vez pueden modular positivamente ciertos aspectos homeostáticos (Wager, 2005). La investigación actual del efecto placebo ha mostrado que los constructos “subjetivos” como las expectativas y los valores tienen bases fsiológicas identifcables que pueden actuar como moduladores de procesos homeostáticos (Benedetti et al., 2005). La evidencia creciente publicada acerca del efecto placebo como un fenómeno subjetivo legítimo acompañado de cambios fsiológicos medibles contradice de manera importante la visión de que las respuestas placebo refejan sólo una respuesta distorsionada o errores de metodología de algunas publicaciones (Wager et al., 2004; Petrovic et al., 2002). La evidencia más defnitiva de la existencia legítima del efecto placebo proviene de trabajos experimentales que destacaron el bloqueo químico del sistema opioide endógeno por medio de naloxona que puede revertir el efecto placebo demostrado claramente de manera previa (Benedetti y Amanzio, 1997; Benedetti, 1996; Amanzio y Benedetti, 1999). De igual manera, se ha demostrado experimentalmente que la naloxona es capaz de bloquear la analgesia mediada por la acupuntura (Mayer et al., 1977; Cheng y Pomeranz, 1980; Sjolund y Eriksson, 1979; Han et al., 1986). En este artículo revisamos algunos de los mecanismos biológicos relacionados con el efecto placebo y la aplicación de la acupuntura en el control del dolor y discutimos los mecanismos fsiológicos comunes que comparten ambos fenómenos. 91 Estudio actual del efecto placebo El término placebo proviene de una palabra latina que signifca de manera literal complacer. Se empleo en a partir del siglo XVIII para signifcar medidas médicas para complacer al paciente más que lograr un bene- fcio terapéutico real (Cavannaa et al., 2007). El con- cepto moderno de efecto placebo, signifca un cambio real en el estado de la enfermedad inducido por el va- lor simbólico de la medicina más que el resultado de un efecto terapéutico específco. El efecto placebo se comprende de manera actual en la comunidad médica como una respuesta terapéutica inducida por proce- dimientos verbales o de comportamiento que operan por medio de las creencias de los pacientes en el po- der terapéutico del placebo (Szawarski, 2004) El diseño típico utilizado habitualmente para examinar el efecto analgésico de cualquier procedimiento farmacológico o no farmacológico es el doble ciego. En este caso a un grupo de pacientes se les aplica el tratamiento “activo”, mientras que a un segundo grupo se les proporciona tratamiento placebo que es igual al del primer grupo en todo, salvo en la sustancia aplicada. Puesto que es un diseño doble ciego, ni el investigador o los pacientes conocen que tratamiento recibe cada grupo. A los pacientes se les dice que van a recibir el tratamiento activo o el placebo, con una probabilidad del 50%. Para concluir que el tratamiento activo es efcaz, sus efectos deben ser superiores a los obtenidos en el grupo placebo. Sin embargo, para fnes del estudio del efecto placebo, con este procedimiento no es posible aislar de manera confable el efecto placebo. La única manera de apreciar dicho efecto es introduciendo un segundo grupo control que recibe el tratamiento activo de manera no evidente, sin que lo sepa el propio sujeto. De esta manera se elimina específcamente el contexto psicosocial y las expectativas cognitivas de alivio del paciente, dejando al fármaco administrado como único responsable de la mejora observada (Kiersch y Weixel, 1988). Procesos subyacentes a la analgesia por placebo La analgesia placebo puede ser debida a la expectativa del benefcio clínico y el condicionamiento pavloviano con o sin intervención de mecanismos opioides. Una idea emergente es que los efectos placebo basados en expectativas son mediados por opioides, pero los efectos placebo condicionados son dependientes de otros mecanismos (Wager et al., 2007. Se sabe que los opioides endógenos tienen un papel fundamental en la analgesia inducida por expectativa, pero sin embargo el conocimiento respecto a estos fenómenos es esca- so (Benedetti et al., 2003; Pollo et al., 2001; Stewart- Williams y Podd, 2004). Un aspecto importante es el referente a los diferentes mecanismos que median este fenómeno y cuales son opioides o no opioides. Al pa- recer los sistemas neuroquímicos subyacentes serán opioides o no opioides cuando el efecto placebo esté relacionado con expectativa (Wager y Nitchke, 2005; Benedetti et al., 2003) o condicionamiento clásico (Vo- udoris et al., 1989; Stewart-Williams y Podd, 2004), de manera respectiva. El placebo activado por opioides endógenos y generado por expectativas cognitivas de alivio del dolor presenta una especifcidad somatotópica. En un estudio en el cual se inyectó capsaicina por vía subcutánea, que produce una sensación dolorosa de quemazón, simultáneamente en cuatro puntos del organismo (Benedetti et al., 1999). El placebo se indujo mediante la aplicación de crema sobre sólo una de estas partes del cuerpo, y se les hizo creer a los sujetos que era un potente analgésico local. El efecto placebo se manifestó sólo en la zona tratada y no sobre el resto de las regiones tratadas con capsaicina. El efecto placebo fue abolido de manera completa mediante la aplicación intravenosa de naloxona. De este estudio se concluye que i) la expectativa de alivio dirigida sobre una zona corporal concreta induce placebo opioide sólo sobre dicha zona; y ii) la acción de los opioides es específca y sólo ejerce su acción en la región corporal a la que se dirigen las expectativas de analgesia. Neuroanatomía funcional de la analgesia inducida por placebo El estudio de los mecanismos y estructuras que subya- cen al efecto placebo y explican su efecto sobre el do- lor está en auge. En este último contribuye el desarrollo de las técnicas modernas de imagenología funcional. Se han distinguido dos grupos de sistemas funciones cerebrales respecto al efecto placebo y dolor: los rela- cionados con la inhibición del procesamiento nocicepti- vo en regiones cerebrales específcas y aquellos impli- cados con el desarrollo de las expectativas de analgesia que pudieran activarse con anticipación al dolor. Se ha demostrado que durante la presentación del estimulo nociceptivo el placebo atenuó de manera signifcativa la actividad de una serie de estructuras clásicamente implicadas en el procesamiento del dolor (Wager et al., 2004) Entre estas se encontraban la zona más rostral de la corteza cingulada anterior, la ínsula anterior y el tálamo, fundamentalmente. Es interesante señalar que 92 estas mismas regiones se encuentran comprometidas en la analgesia por placebo asociada al tratamiento con acupuntura (Kong et al., 2006) Por tanto, dado que la actividad en el cíngulo anterior y en particular en la ínsula anterior se relaciona con la experiencia subjetiva de dolor (Craig et al., 2000) parece plausible suponer que la reducción en la percepción del dolor producida por el placebo puede ser explicada, al menos en cierto grado, por su efecto sobre estas regiones corticales. En relación con las zonas activadas durante la fase de anticipación del dolor se ha observado (Wager et al., 2004) que las expectativas de alivio del dolor produjeron un aumento de actividad bilateral en amplias regiones de la corteza prefrontal, principalmente en la corteza prefrontal dorsolateral (áreas 9 y 46 de Brodmann; PDL) y en la corteza orbitofrontal (área 11 de Brodmann; POB). Este incremento se correlacionaba positivamente con la respuesta placebo medida conductualmente (reducción del dolor comunicada por los sujetos) y neuralmente (reducción de la actividad cerebral registrada en la corteza cingulada ínsula anteriores). Por tanto, las expectativas de reducción del dolor generadas por el placebo parecen depender especialmente de la actividad prefrontal. Es importante destacar que durante la fase de anticipación el grupo placebo también mostró un incremento de actividad neural en las proximidades de la sustancia gris periacueductal (SGP), región que contiene una elevada concentración de receptores opioides y es el origen de eferencias hacia la medula espinal (Craig et al., 2000). El aumento en la actividad de la SGP se correlacionó positivamente con el efecto placebo conductual (reduc- ción de dolor) y el neural (reducción de actividad cere- bral en cíngulo anterior e ínsula anterior). Asimismo, el incremento de actividad detectada en la SGP se co- rrelacionó positivamente con el observado en la PDL y POB, Curiosamente, durante esta fase de anticipación la región rostral de la circunvolución del cíngulo ante- rior (área 24 de Brodmann) resultó también fuertemen- te activada. Esta zona coincide con la región que ex- perimenta una reducción de activación durante la fase de dolor, lo que sugiere que el cíngulo rostral no sólo interviene en el procesamiento del dolor propiamente dicho, si no que es parte también de la red neural com- prometida en el control cognitivo del dolor. Otro punto importante es la comprensión del signifcado funcional de la activación de la SGP durante la fase de expectativa/anticipación de placebo, es bien conocido el control que ejerce esta región mesencefálica sobre circuitos espinales asociados a la transmisión del dolor (Fields, 2004). Por otra parte, la SGP recibe aferencias desde la ínsula, la región rostral del cíngulo (área 24 de Brodmann), el núcleo accumbens, la amígdala y la corteza frontal. De esta manera, todos estos datos sugieren globalmente que la activación de las regiones prefrontales, entre otras, pueden poner en funcionamiento, justo antes de la aparición de la estimulación nociceptiva, un sistema analgésico cerebroespinal que reduciría el dolor a nivel espinal. En síntesis, la analgesia alcanzada por el placebo parece depender de la acción conjunta de dos mecanismos puestos en marcha, presumiblemente, por la corteza prefrontal: primero, la activación del mencionado circuito cerebroespinal con origen en la SGP; en segundo lugar, se produciría una atenuación del procesamiento nociceptivo dentro del propio encéfalo (corteza cingulada anterior e ínsula anterior) en regiones asociadas fundamentalmente al procesamiento del componente afectivo del dolor. Liberación de opioides endógenos en la analgesia por placebo La primera prueba que sugirió la participación de los receptores µ-opioides en la analgesia por placebo fue aportada por Levine et al. (1978) obteniéndose resul- tados similares en años siguientes con procedimien- tos muy parecidos (Gracely et al., 1983; Levine et al., 1978). En general en estos estudios la aplicación de placebo con expectativas de analgesia reducía signi- fcativamente el dolor clínico o experimental inducido en los sujetos; sin embargo, la inyección de naloxona, abiertamente a la vista de los sujetos o subrepticia, bloqueaba el efecto placebo, lo que sugirió claramente una mediación opioide endógena en dicho fenómeno. El siguiente paso importante para la comprensión de la base neuroquímica del efecto placebo se dio mediante el empleo de la tomografía por emisión de positrones (PET) (Petrovic et al., 2002), que permitió descubrir que la administración de remifentanilo (un agonista de los receptores µ-opioides) y la aplicación de placebo con expectativas de analgesia activaban la misma región cerebral, concretamente la zona más rostral de la cor- teza cingulada anterior. En esta zona estudios recien- tes realizados en seres humanos han demostrado una alta concentración de receptores µ-opioides (Casey et al., 2000; Schlaepfer et al., 1998). Por tanto, el hecho de que una de las regiones cerebrales más activas por el placebo coincida con una zona de alta concentración de receptores µ-opioides apoya la idea de un probable vínculo funcional o mecanismo neural común entre la analgesia inducida por placebo y el sistema opioide en- dógeno. 93 En otro estudio se demostró de manera directa e in vivo la liberación de opioides endógenos por la utilización del efecto placebo en el cerebro de seres humanos (Zubieta et al., 2005). En este estudio se empleó PET y carfentanilo (C11), un agonista selectivo de los receptores µ-opioides. Bajo estas condiciones la activación in vivo de este sistema de neurotransmisión es inferida a través de la reducción del agonista radiactivo que se une a los receptores µ- opioides. Se parte del supuesto de que en el grupo que no recibe el tratamiento placebo no está funcionando específcamente este sistema de neurotransmisión, y por lo tanto la ocupación de los receptores µ-opioides por el carfentanilo (C11) debería ser del 100%. De diferente manera, en el grupo tratado con placebo se supone que dicho sistema está activado y gran parte de los receptores opioides están ocupados por la liberación de opioides endógenos y por lo tanto se reducirá la cantidad de carfentanilo (C11) ligado a dichos receptores, y la magnitud de dicha reducción constituye un índice del grado en el que se ha activado el sistema opioide endógeno durante el efecto placebo. Utilizando este modelo experimental se encontró que el sistema opioide se activaba signifcativamente más durante la aplicación de placebo. Concretamente, las regiones en las que se operó una liberación signifcativa de opioides fueron: la corteza prefrontal dorsolateral (área 8 y 9 de Brodmann), la corteza cingulada rostral (área 24 y 25 de Brodmann), la corteza insular anterior y el núcleo accumbens. Otra área de menor actividad que las anteriores, pero cercana a lo signifcativo, fue la corteza insular posterior. Además resultados de otros estudios mostraron que algunas de las zonas cerebrales en las que el placebo incrementa la neurotransmisión opioide coinciden, como la corteza cingulada anterior e ínsula anterior, principalmente (Craig et al., 2000; Singer et al., 2004; Talbot et al., 1991; Davis et al., 1995; Gelnar et al., 1999) Acupuntura y analgesia: mecanismos comunes Una mayoría de los casos que son tratados en los ser- vicios de atención de primer nivel y por lo tanto en los de acupuntura son padecimientos autolimitados (como las lumbalgias); otros de ellos tienen periodos de remi- sión espontáneos (como la migraña o el asma) y casi todos ellos se caracterizan por n cuadro clínico consti- tuido principalmente por síntomas. Por lo tanto, la eva- luación de la efcacia de la acupuntura requiere casi siempre la realización de estudios clínicos controlados (ECA). Este artículo se basa de manera predominante en un análisis de revisiones sistemáticas realizadas por Complementary and Alternative Medicine Field of the Cochrane Collaboration. También se incluyen ECA que han sido publicados de manera reciente. La acupuntura ha sido investigada de manera extensa clínica y experimentalmente (Kaptchuk, 2002; Cho et al., 1998; Pariente et al., 2005; Kong et al., 2006; Ma, 2004); pero sus mecanismos de acción no son del todo conocidos (Ma, 2004; Lewit et al., 2005; Ernst, 2006; Lewith et al., 2006) La cultura afecta en forma determinante la práctica de la medicina como las creencias de los pacientes (Moerman y Jonas, 2002). El empleo de la acupuntura se da en un marco de creencias y rituales que la signifcan como un remedio antiguo y natural, de esta manera la acupuntura es en especial buena para inducir en los pacientes creencias y expectativas. Las bases teóricas que subyacen al tratamiento con acupuntura no se relacionan con la medicina moderna (Kaptchuk, 2002). Esta divergencia flosófca y empírica de la medicina moderna para explicar los patrones y ritmos de vida permite a los pacientes tener creencias y elevadas expectativas de este tratamiento. Otro factor importante que contribuye a aumentar las expectativas en la efcacia de la acupuntura es que la mayoría de los pacientes, por ejemplo con dolor crónico, recurren a la acupuntura sólo después de haber tenido experiencias fallidas con tratamientos convencionales. Además, la naturaleza invasora de la acupuntura y la manera sofsticada en que se aplica puede contribuir en gran medida en la creencias y expectativas de los pacientes respecto a la efcacia de la acupuntura (Liu, 2007). La experiencia clínica ha mostrado que las creencias y las expectativas juegan un papel fundamental en la efcacia de la acupuntura y la magnitud de sus efectos está determinada por como y en que grado el paciente está involucrado en su contexto psicosocial: la acupuntura parece ser más efcaz en los pacientes con expectativas y creencias mayores. Esta afrmación probó ser verdadera en un estudio reciente de acupuntura y dolor que informó que las expectativas y creencias de los pacientes (determinadas por la asignación evidente al grupo de acupuntura real o placebo) tuvieron un mayor impacto en las metas del tratamiento que el tratamiento en si mismo (Bausell et al., 2005). Dado el importante papel de expectativas y creencias en la efcacia de la acupuntura, un estudio previo sugirió que el proceso de consentimiento informado de hacerse explícito en cuando informe publicado de estudios que evalúan la efcacia de la acupuntura, debido a que la 94 forma en que los pacientes son informados determina en gran medida los niveles de creencias y expectativas, y de allí el resultado del tratamiento (Liu y Liu, 2006). La atención dirigida, miedo-ansiedad son factores fundamentales en el tratamiento con acupuntura. Durante la aplicación de la acupuntura, la ansiedad y miedo del paciente no siempre son evidentes, pero se manifestan principalmente como una atención altamente focalizada, debido a que las percepciones negativas respecto al tratamiento son superadas por las expectativa de benefcios. Se ha sugerido en un estudio previo que los mayores niveles de miedo y ansiedad contribuyen a una focalización somática aumentada (Geers et al., 2006). Conclusiones La analgesia relacionada con procesos placebo, en la que las creencias y expectativas acerca de recibir un tratamiento ha mostrado ser efcaz para la reducción del dolor. El efecto placebo puede ser cuantifcado en términos conductuales y neurales. De esta manera, in- vestigaciones recientes han mostrado que el placebo produce un aumento en la actividad cerebral de la cor- teza prefrontal dorsolateral y de regiones cercanas a la SGP. Estos cambios se producen justo antes de la apli- cación del estímulo nociceptivo. El hecho de que es- tas zonas se activen con anticipación a la experiencia de dolor sugiere que pueden controlar otras regiones cerebrales esenciales implicadas directamente en el procesamiento nociceptivo. De acuerdo con esta idea, estudios recientes indican que la analgesia por place- bo reduce la actividad nerviosa de la corteza anterior del cíngulo y de la ínsula anterior, principalmente. Dado que estas regiones están asociadas al procesamiento de aspectos afectivo-emocionales del dolor, lo anterior hace pensar que al menos parte de la analgesia por placebo se ejerce centralmente, reduciendo el proce- samiento de información nociceptiva a nivel superior. Por último, datos muy recientes indican que el placebo produce analgesia en estos niveles superiores debido a la liberación de opioides endógenos y a la activación de receptores µ-opioides. Las expectativas y creencias positivas de los pacientes siempre se espera que estén presentes cuando se lleva a cabo un tratamiento, como es el caso de la acupuntura. No obstante, en ocasiones son tratados pacientes que tienen dudas acerca de la efcacia de la acupuntura; en estos pacientes la acupuntura puede no sólo ser inefcaz si no inclusive causar efectos inesperados e inexplicables que pueden ser referidos como efectos adversos. En algunos pacientes, estos efectos pueden durar durante cierto tiempo y no desaparecen hasta que el paciente se convence que la acupuntura no daña. Parece ser que las creencias y expectativas de los pacientes determinan en gran medida la orientación de los efectos de la acupuntura – sentimiento positivos inducen efecto terapéuticos y por el contrario, efectos negativos inducen efectos deletéreos. La atención insufciente del papel del contexto social en la efcacia de la acupuntura puede explicar en parte los dilemas que han surgido en la investigación de la acupuntura. Una revisión global entre la asociación de la acupuntura y el efecto placebo puede contribuir a clarifcar el modo de acción de ésta. Referencias 1. Amanzio M, Benedetti F. Neuropharmacological dissection of placebo analgesia: expectation- activated opioid systems versus conditioning- activated specifc subsystems. J Neurosci 1999;19:484–94. 2. Bausell RB, Lao L, Bergman S, Lee WL, Berman BM. Is acupuncture analgesia an expectancy effect?: preliminary evidence based on participants’ perceived assignments in two placebocontrolled trials. Eval Health Prof 2005;28:9–26. 3. Benedetti F. The opposite effects of the opiate antagonist naloxone and the cholecystokinin antagonist proglumide on placebo analgesia. Pain 1996;64:535–43. 4. Benedetti F, Amanzio M. The neurobiology of placebo: from endogenous opioids to cholecystokinin. Prog Neurobiol 1997;52:109–25. 5. Benedetti F, Arduino C, Amanzio M. Somatotopic activation of opioid systems by target- directed expectations of analgesia. J Neurosci 1999;19:3639-48. 6. Benedetti F, Mayberg HS, Wager TD, Stohler CS, Zubieta JK. Neurobiological mechanisms of the placebo effect. J Neurosci 2005;25:10390–402. 7. Benedetti F, Pollo A, Lopiano L, Lanotte M, Vighetti S, Rainero I. Conscious expectation and unconscious conditioning in analgesic, motor and hormonal placebo/nocebo responses. J Neurosci 2003;23:4315-23. 8. Cheng RSS, Pomeranz BH. Electroacupuncture analgesia is mediated by stereospecifc opiate receptors and is reversed by antagonists of type 1 receptors. Life Sci 1980;26:631–8. 9. Cho ZH, Chung SC, Jones JP, Park JB, Park JH, Lee HJ, Wong EK, Min BI. New fndings of the 95 correlation between acupoints and corresponding brain cortices using functional MRI. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:2670–3. 10. Casey K, Svensson P, Morrow T, Raz J, Jone C, Minoshima S. Selective opiate modulation of nociceptive processing in the human brain. J Neurophysiol 2000;84:525-33. 11. Cavannaa AE, Strigaroa G, Monacoa F. Brain mechanisms underlying the placebo effect in neurological disorders. Functional Neurology 2007; 22(2):89-94. 12. Colloca L, Benedetti M. Placebos and painkillers: is mind as real as matter? Nature Rev Neurosci 2005;6:545-52. 13. Craig AD, Chen K, Bandy D, Reiman EM. Thermosensory activation of insular cortex. Nat Neurosci 2000;3:184-90. 14. Davis K, Wood M, Crawley A, Mikulis D. fMRI of human somato-sensory and cingulate cortex during painful electrical nerve stimulation. NeuroReport 1995;7:321-5. 15. Ernst E. Acupuncture – a critical analysis. J Intern Med 2006;259:125–37. 16. Fields HL. State-dependent opioid control of pain. Nat Rev Neurosci 2004;5:565-75. 17. Geers AL, Helfer SG, Weiland PE, Kosbab K. Expectations and placebo response: a laboratory investigation into the role of somatic focus. J Behav Med 2006;29:171–8. 18. Gelnar P, Krauss B, Sheehe P, Szeverenty N, Apkarian A. A comparative fMRI study of cortical representations for thermal painful, vibrotactile, and motor performance tasks. Neuroimage 1999;10:460-82. 19. Gracely RH, Dubner R, Wolskee PJ, Deeter WR. Placebo and naloxone can alter post- surgical pain by separate mechanisms. Nature 1983;306:264-5. 20. Han JS, Ding XZ, Fan SG. Cholecystokinin octapeptide (CCK-8): Antagonism to electroacupuncture analgesia and a possible role inelectroacupuncture tolerance. Pain 1986;27:101–15. 21. Kaptchuk TJ. Acupuncture: theory, effcacy, and practice. Ann Intern Med 2002;136:374–83. 22. Kirsch 1, Weixel U. Double-blind versus deceptive administration of a placebo. Behav Neurosci 1988;102:319-23. 23. Kong J, Gollub RC, Rosman 15, Webb JM, Vangel MG, Kirsch I, et al. Brain activity associated with expectancy enhanced placebo analgesia as measured by functional magnetic resonance imaging. J Neurosci 2006;26:381-8. 24. Levine JD, Gordon NC. Infuence of the method of drug administration on analgesic response. Nature 1984;312:755-6. 25. Levine JD, Gordon NC, Fields HL. The mechanisms of placebo analgesia. Lancet 1978;2:654-7. 26. Levine JD, Gordon NC, Smith R, Fields HL Analgesic responses to morphine and placebo in individuals with postoperative pain. Pain 1981;10:379-89. 27. Lewith GT, White PJ, Kaptchuk TJ. Developing a research strategy for acupuncture. Clin J Pain 2006;22:632–8. 28. Lewith GT, White PJ, Pariente J. Investigating acupuncture using brain imaging techniques: the current state of play. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:315–9. 29. Liu T. Role of acupuncturists in acupuncture treatment. Evid Based Complement Alternat Med 2007;4:3–6. 30. Liu T, Liu C. Acupuncture for treating osteoarthritis of the knee and hip. Arthritis Rheum 2006;54:3375–7. 31. Ma SX. Neurobiology of acupuncture: toward CAM. Evid Based Complement Alternat Med 2004;1:41–7. 32. Mayer E J, Price DD, Rafi A. Antagonism of acupuncture analgesia in man by the narcotic antagonist naloxone. Brain Res 1977;121:368– 72. 33. Moerman DE, Jonas WB. Deconstructing the placebo effect and fnding the meaning response. Ann Intern Med 2002;136:471–6. 34. Pariente J, White P, Frackowiak RSJ, Lewith G. Expectancy and belief modulate the neuronal substrates of pain treated by acupuncture. Neuroimage 2005;25:1161–7. 35. Petrovic P, Kalso E, Petersson KM, Ingvar M. Placebo and opioid analgesia—imaging a shared neuronal network. Science 2002;295:1737–40. 36. Pollo A, Amanzio M, Arslanian A, Casadio C, Maggi G, Benedetti F. Response expectancies in placebo analgesia and their clinical relevance. Pain 2001;93:77–84. 37. Schlaepfer T, Strain E, Greenberg B, Preston K, Lancaster E, Bigelow G, et al. Site of opioid action in the human brain: mu and kappa agonists subjective and cerebral blood fow effects. Am J Psychiatry 1998;155:470-3. 38. Singer T, Seymour B, O’Doherty J, Kaube H, Dolan RJ, Frith CD. Empathy for pain involves the affective but not sensory components of pain. Science 2004;303:1157-62. 96 39. Sjolund BH, Eriksson MB. The infuence of naloxone on analgesia produced by peripheral conditioning stimulation. Brain Res 1979;173:295–302. 40. Stewart-Williams S, Podd I. The placebo effect: dissolving the expectancy versus conditioning debate. Psychol Bull 2004;130:324-40. 41. Stewart-Williams S, Podd J. The placebo effect: dissolving the expectancy versus conditioning debate. Psychol Bull 2004;130:324–40. 42. Szawarski Z. The concept of placebo. Sci Eng Ethics 2004;10:57-64 43. Talbot J, Marrett S, Evans A, Meyer E, Bushnell M, Duncan G. Multiple representations of pain in human cerebral cortex. Science 1991 ;251 :1355- 8. 44. Vallance AK. Something out of nothing: the placebo effect. Advan Psychiatr Treat 2006;12:287–96. 45. Vickers A, Wilson P, Kleijnen J. Acupuncture. Qual Saf Health Care 2002;11:92–7. 46. Voudouris NJ, Connie LP, Coleman G. Conditioned response models of placebo phenomena: further support. Pain 1989;38:109- 16. 47. Wager TD. The neural bases of placebo effects in pain. Curr Direct Psychol Sci 2005;14:175-9. 48. Wager TD, Nitschke JB. Placebo effects in the brain: linking mental and physiological processes. Brain Behav Immun 2005; 19:281-2. 49. Wager TD, Scott DJ, Zubieta JK. Placebo effects on human m-opioid activity during pain. PNAS 2007;104:11056–61. 50. Wager TD, Rilling JK, Smith EE, Sokolik A, Casey KL, Davidson RJ, Kosslyn SM, Rose RM, Cohen JD. Placebo-induced changes in FMRI in the anticipation and experience of pain. Science 2004;303:1162–7. 51. Zubieta JK, Bueller JA, Jackson LR, Scott DJ, Xu Y, Koeppe RA, et al. Placebo effects mediated by endogenous opioid activity on mu-opioid receptors. J Neurosci 2005;25:7754-62. 97 DECLARACION DE HELSINKI DE LA ASOCIACION MEDICA MUNDIAL Principios éticos para las investigaciones médicas en seres humanos Adoptada por la 18ª Asamblea Médica Mundial, Helsinki, Finlandia, junio 1964 y enmendada por la 29ª Asamblea Médica Mundial, Tokio, Japón, octubre 1975 35ª Asamblea Médica Mundial, Venecia, Italia, octubre 1983 41ª Asamblea Médica Mundial, Hong Kong, septiembre 1989 48ª Asamblea GeneralSomerset West, Sudáfrica, octubre 1996 52ª Asamblea General, Edimburgo, Escocia, octubre 2000 Nota de Clarifcación del Párrafo 29, agregada por la Asamblea General de la AMM, Washington 2002 Nota de Clarifcación del Párrafo 30, agregada por la Asamblea General de la AMM, Tokio 2004 59ª Asamblea General, Seúl, Corea, octubre 2008 A. INTRODUCCION 1. La Asociación Médica Mundial (AMM) ha promulgado la Declaración de Helsinki como una pro- puesta de principios éticos para investigación médica en seres humanos, incluida la investigación del material humano y de información identifcables. La Declaración debe ser considerada como un todo y un párrafo no debe ser aplicado sin considerar todos los otros párrafos pertinentes. 2. Aunque la Declaración está destinada principalmente a los médicos, la AMM insta a otros participan- tes en la investigación médica en seres humanos a adoptar estos principios. 3. El deber del médico es promover y velar por la salud de los pacientes, incluidos los que participan en investigación médica. Los conocimientos y la conciencia del médico han de subordinarse al cumpli- miento de ese deber. 4. La Declaración de Ginebra de la Asociación Médica Mundial vincula al médico con la fórmula “velar solícitamente y ante todo por la salud de mi paciente”, y el Código Internacional de Etica Médica afrma que: “El médico debe considerar lo mejor para el paciente cuando preste atención médica”. 5. El progreso de la medicina se basa en la investigación que, en ultimo término, debe incluir estudios en seres humanos. Las poblaciones que están subrepresentadas en la investigación médica deben tener un acceso apropiado a la participación en la investigación. 6. En investigación médica en seres humanos, el bienestar de la persona que participa en la investigación debe tener siempre primacía sobre todos los otros intereses. 98 7. El propósito principal de la investigación médica en seres humanos es comprender las causas, evolu- ción y efectos de las enfermedades y mejorar las intervenciones preventivas, diagnósticas y terapéu- ticas (métodos, procedimientos y tratamientos). Incluso, las mejores intervenciones actuales deben ser evaluadas continuamente a través de la investigación para que sean seguras, efcaces, efectivas, accesibles y de calidad. 8. En la práctica de la medicina y de la investigación médica, la mayoría de las intervenciones implican algunos riesgos y costos. 9. La investigación médica está sujeta a normas éticas que sirven para promover el respeto a todos los seres humanos y para proteger su salud y sus derechos individuales. Algunas poblaciones sometidas a la investigación son particularmente vulnerables y necesitan protección especial. Estas incluyen a los que no pueden otorgar o rechazar el consentimiento por sí mismos y a los que pueden ser vulnerables a coerción o infuencia indebida. 10. Los médicos deben considerar las normas y estándares éticos, legales y jurídicos para la investigación en seres humanos en sus propios países, al igual que las normas y estándares internacionales vigentes. No se debe permitir que un requisito ético, legal o jurídico nacional o internacional disminuya o eli- mine cualquiera medida de protección para las personas que participan en la investigación establecida en esta Declaración. B. PRINCIPIOS PARA TODA INVESTIGACION MEDICA 11. En la investigación médica, es deber del médico proteger la vida, la salud, la dignidad, la integridad, el derecho a la autodeterminación, la intimidad y la confdencialidad de la información personal de las personas que participan en investigación. 12. La investigación médica en seres humanos debe conformarse con los principios científcos general- mente aceptados y debe apoyarse en un profundo conocimiento de la bibliografía científca, en otras fuentes de información pertinentes, así como en experimentos de laboratorio correctamente realizados y en animales, cuando sea oportuno. Se debe cuidar también del bienestar de los animales utilizados en los experimentos. 13. Al realizar una investigación médica, hay que prestar atención adecuada a los factores que puedan dañar el medio ambiente. 14. El proyecto y el método de todo estudio en seres humanos debe describirse claramente en un protocolo de investigación. Este debe hacer referencia siempre a las consideraciones éticas que fueran del caso y debe indicar cómo se han considerado los principios enunciados en esta Declaración. El protoco- lo debe incluir información sobre fnanciamiento, patrocinadores, afliaciones institucionales, otros posibles confictos de interés e incentivos para las personas del estudio y estipulaciones para tratar o compensar a las personas que han sufrido daños como consecuencia de su participación en la inves- tigación. El protocolo debe describir los arreglos para el acceso después del ensayo a intervenciones identifcadas como benefciosas en el estudio o el acceso a otra atención o benefcios apropiadas. 15. El protocolo de la investigación debe enviarse, para consideración, comentario, consejo y aprobación, a un comité de ética de investigación antes de comenzar el estudio. Este comité debe ser independiente del investigador, del patrocinador o de cualquier otro tipo de infuencia indebida. El comité debe con- 99 siderar las leyes y reglamentos vigentes en el país donde se realiza la investigación, como también las normas internacionales vigentes, pero no se debe permitir que éstas disminuyan o eliminen ninguna de las protecciones para las personas que participan en la investigación establecidas en esta Declaración. El comité tiene el derecho de controlar los ensayos en curso. El investigador tiene la obligación de proporcionar información del control al comité, en especial sobre todo incidente adverso grave. No se debe hacer ningún cambio en el protocolo sin la consideración y aprobación del comité. 16. La investigación médica en seres humanos debe ser llevada a cabo sólo por personas con la formación y califcaciones científcas apropiadas. La investigación en pacientes o voluntarios sanos necesita la supervisión de un médico u otro profesional de la salud competente y califcado apropiadamente. La responsabilidad de la protección de las personas que toman parte en la investigación debe recaer siempre en un médico u otro profesional de la salud y nunca en los participantes en la investigación, aunque hayan otorgado su consentimiento. 17. La investigación médica en una población o comunidad con desventajas o vulnerable sólo se justifca si la investigación responde a las necesidades y prioridades de salud de esta población o comunidad y si existen posibilidades razonables de que la población o comunidad, sobre la que la investigación se realiza, podrá benefciarse de sus resultados. 18. Todo proyecto de investigación médica en seres humanos debe ser precedido de una cuidadosa com- paración de los riesgos y los costos para las personas y las comunidades que participan en la investi- gación, en comparación con los benefcios previsibles para ellos y para otras personas o comunidades afectadas por la enfermedad que se investiga. 19. Todo ensayo clínico debe ser inscrito en una base de datos disponible al público antes de aceptar a la primera persona. 20. Los médicos no deben participar en estudios de investigación en seres humanos a menos de que estén seguros de que los riesgos inherentes han sido adecuadamente evaluados y de que es posible hacerles frente de manera satisfactoria. Deben suspender inmediatamente el experimento en marcha si obser- van que los riesgos que implican son más importantes que los benefcios esperados o si existen prue- bas concluyentes de resultados positivos o benefciosos. 21. La investigación médica en seres humanos sólo debe realizarse cuando la importancia de su objetivo es mayor que el riesgo inherente y los costos para la persona que participa en la investigación. 22. La participación de personas competentes en la investigación médica debe ser voluntaria. Aunque puede ser apropiado consultar a familiares o líderes de la comunidad, ninguna persona competente debe ser incluida en un estudio, a menos que ella acepte libremente. 23. Deben tomarse toda clase de precauciones para resguardar la intimidad de la persona que participa en la investigación y la confdencialidad de su información personal y para reducir al mínimo las conse- cuencias de la investigación sobre su integridad física, mental y social. 24. En la investigación médica en seres humanos competentes, cada individuo potencial debe recibir in- formación adecuada acerca de los objetivos, métodos, fuentes de fnanciamiento, posibles confictos de intereses, afliaciones institucionales del investigador, benefcios calculados, riesgos previsibles e incomodidades derivadas del experimento y todo otro aspecto pertinente de la investigación. La 100 persona potencial debe ser informada del derecho de participar o no en la investigación y de retirar su consentimiento en cualquier momento, sin exponerse a represalias. Se debe prestar especial atención a las necesidades específcas de información de cada individuo potencial, como también a los métodos utilizados para entregar la información. Después de asegurarse de que el individuo ha comprendido la información, el médico u otra persona califcada apropiadamente debe pedir entonces, preferible- mente por escrito, el consentimiento informado y voluntario de la persona. Si el consentimiento no se puede otorgar por escrito, el proceso para lograrlo debe ser documentado y atestiguado formalmente. 25. Para la investigación médica en que se utilice material o datos humanos identifcables, el médico debe pedir normalmente el consentimiento para la recolección, análisis, almacenamiento y reutilización. Podrá haber situaciones en las que será imposible o impracticable obtener el consentimiento para dicha investigación o podría ser una amenaza para su validez. En esta situación, la investigación sólo puede ser realizada después de ser considerada y aprobada por un comité de ética de investigación. 26. Al pedir el consentimiento informado para la participación en la investigación, el médico debe poner especial cuidado cuando el individuo potencial está vinculado con él por una relación de dependencia o si consiente bajo presión. En una situación así, el consentimiento informado debe ser pedido por una persona califcada adecuadamente y que nada tenga que ver con aquella relación. 27. Cuando el individuo potencial sea incapaz, el médico debe pedir el consentimiento informado del re- presentante legal. Estas personas no deben ser incluidas en la investigación que no tenga posibilidades de benefcio para ellas, a menos que ésta tenga como objetivo promover la salud de la población repre- sentada por el individuo potencial y esta investigación no puede realizarse en personas competentes y la investigación implica sólo un riesgo y costo mínimos. 28. Si un indivividuo potencial que participa en la investigación considerado incompetente es capaz de dar su asentimiento a participar o no en la investigación, el médico debe pedirlo, además del consen- timiento del representante legal. El desacuerdo del individuo potencial debe ser respetado. 29. La investigación en individuos que no son capaces física o mentalmente de otorgar consentimiento, por ejemplo los pacientes inconscientes, se puede realizar sólo si la condición física/mental que impi- de otorgar el consentimiento informado es una característica necesaria de la población investigada. En estas circunstancias, el médico debe pedir el consentimiento informado al representante legal. Si dicho representante no está disponible y si no se puede retrasar la investigación, el estudio puede llevarse a cabo sin consentimiento informado, siempre que las razones específcas para incluir a individuos con una enfermedad que no les permite otorgar consentimiento informado hayan sido estipuladas en el protocolo de la investigación y el estudio haya sido aprobado por un comité de ética de investigación. El consentimiento para mantenerse en la investigación debe obtenerse a la brevedad posible del indi- viduo o de un representante legal. 30. Los autores, directores y editores todos tienen obligaciones éticas con respecto a la publicación de los resultados de su investigación. Los autores tienen el deber de tener a la disposición del público los resultados de su investigación en seres humanos y son responsables de la integridad y exactitud de sus informes. Deben aceptar las normas éticas de entrega de información. Se deben publicar tanto los resultados negativos e inconclusos como los positivos o de lo contrario deben estar a la disposición del público..En la publicación se debe citar la fuente de fnanciamiento, afliaciones institucionales y confictos de intereses. Los informes sobre investigaciones que no se ciñan a los principios descritos en esta Declaración no deben ser aceptados para su publicación. 101 C. PRINCIPIOS APLICABLES CUANDO LA INVESTIGACION MEDICA SE COMBINA CON LA ATENCION MEDICA 31. El médico puede combinar la investigación médica con la atención médica, sólo en la medida en que tal investigación acredite un justifcado valor potencial preventivo, diagnóstico o terapéutico y si el médico tiene buenas razones para creer que la participación en el estudio no afectará de manera ad- versa la salud de los pacientes que toman parte en la investigación. 32. Los posibles benefcios, riesgos, costos y efcacia de toda intervención nueva deben ser evaluados mediante su comparación con la mejor intervención probada existente, excepto en las siguientes cir- cunstancias: • El uso de un placebo, o ningún tratamiento, es aceptable en estudios para los que no hay una inter- vención probada existente. • Cuando por razones metodológicas, científcas y apremiantes, el uso de un placebo es necesario para determinar la efcacia y la seguridad de una intervención que no implique un riesgo, efectos adversos graves o daño irreversible para los pacientes que reciben el placebo o ningún tratamiento. Se debe tener muchísimo cuidado para evitar abusar de esta opción. 33. Al fnal de la investigación, todos los pacientes que participan en el estudio tienen derecho a ser in- formados sobre sus resultados y compartir cualquier benefcio, por ejemplo, acceso a intervenciones identifcadas como benefciosas en el estudio o a otra atención apropiada o benefcios. 34. El médico debe informar cabalmente al paciente los aspectos de la atención que tienen relación con la investigación. La negativa del paciente a participar en una investigación o su decisión de retirarse nunca debe perturbar la relación médico-paciente. 35. Cuando en la atención de un enfermo las intervenciones probadas han resultado inefcaces o no exis- ten, el médico, después de pedir consejo de experto, con el consentimiento informado del paciente o de un representante legal autorizado, puede permitirse usar intervenciones no comprobadas, si, a su juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales intervenciones deben ser investigadas a fn de evaluar su seguridad y efcacia. En to- dos los casos, esa información nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, puesta a disposición del público. 22.10.2008 Reproducida con permiso de la World Medical Association 102 ANUARIO DE INVESTIGACIÓN EN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES ANUARIO DE INVESTIGACIÓN EN ETNOMEDICINA, MEDICINAS COMPLEMENTARIAS Y UTILIZACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES A N U A R I O D E I N V E S T I G A C I Ó N E N E T N O M E D I C I N A , M E D I C I N A S C O M P L E M E N T A R I A S Y U T I L I Z A C I Ó N D E P L A N T A S M E D I C I N A L E S 2008 2008 José Federico Rivas Vilchis, Ed. J o s é F e d e r i c o R i v a s V i l c h i s , E d . ISBN : 970-31-0546-7