PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FISICOQUÍMICOS PARA LA CARACTERIZACIÓN Y USO DEL PROPÓLEOS A NIVEL INDUSTRIAL

UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA SEDE VIÑA DEL MAR - JOSÉ MIGUEL CARRERAPARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FISICOQUÍMICOS PARA LA CARACTERIZACIÓN Y USO DEL PROPÓLEOS A NIVEL INDUSTRIAL Trabajo de Titulación para optar al Título Profesional de Técnico Universitario en QUÍMICA, ANALÍTICA Alumno: Sr. Jonathan Valladares Salazar Profesor Guía: Dr. Manuel Saavedra González MENCIÓN QUÍMICA 2009 Para mis padres con mucho cariño… Gracias a sus esfuerzos y dedicación a mi formación como persona. A Ilse por su cariño y apoyo incondicional durante todo este largo tiempo. Agradezco en forma mu especial a Don Patricio Fernández, Don Fredy Valdés y APICAS, por la gran ayuda proporcionada; y a todas las personas que con sus conocimientos y aportes contribuyeron a la realización de este trabajo. RESUMEN Keywords: Propóleos – Propiedades fisicoquímicas – Características organolépticas – Apicultura. El propóleos es un producto apícola resinoso y complejo, con una apariencia variable, producto de la mezcla de sustancias resinosas, gomosas y balsámicas. Estas son recolectadas por la abeja (Apis mellifera) de distintas fuentes botánicas, las que son transportadas a la colmena, donde son modificadas física y químicamente, para cumplir con la función de proteger a la misma de distintos patógenos y evitar la propagación de enfermedades. Gracias a la compleja composición que posee, tiene innumerables propiedades terapéuticas que han sido estudiadas en todo el mundo. Los compuestos identificados en propóleos de colmenas ubicadas en emplazamientos cercanos entre sí no difieren significativamente, aunque desde el punto de vista cuantitativo pueden ser variables. Ello implica que los propóleos deben ser caracterizados en función de la zona geográfica de ubicación de las colmenas, para poder ser comercializados. El presente trabajo tiene como objetivo principal establecer parámetros organolépticos y fisicoquímicos que permitan caracterizar el propóleos, para su comercialización a nivel industrial, a través de la determinación de las características organolépticas y propiedades fisicoquímicas del propóleos, recolectado en la localidad de Tapihue, Casablanca, Quinta Región de Chile. Las características organolépticas determinadas son: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. Las determinaciones fisicoquímicas realizadas son: cera, impurezas mecánicas, compuestos fenólicos totales, índice de oxidación, compuestos flavonoides totales, índice de yodo, pérdida por calentamiento, cenizas, sustancias extraíbles en n-hexano, resinas solubles en etanol y espectro de absorción UV-visible. Todo lo anterior, según metodologías estipuladas en la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 y la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008. A partir de los resultados obtenidos en los análisis realizados se puede concluir que, en general, las propiedades del propóleos analizado se sitúan dentro de los parámetros de calidad exigidos por la norma Rusa, y que cumple con todos los parámetros de calidad exigidos por la norma Argentina, por tanto puede ser utilizado a nivel industrial y competir en el mercado externo. ÍNDICE PARÁMETROS ORGANOLÉPTICOS Y FISICOQUÍMICOS PARA LA CARACTERIZACIÓN Y USO DEL PROPÓLEOS A NIVEL INDUSTRIAL RESUMEN ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE TABLAS SIGLAS Y SIMBOLOGÍA INTRODUCCIÓN OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES 1.1. PROPÓLEOS 1.1.1. Definición técnica 1.1.2. Características fisicoquímicas del propóleos 1.1.3. Composición universal del propóleos 1.2. RECOLECCIÓN DEL PROPÓLEOS 1.2.1. Método técnico (uso de mallas) 1.2.2. Método artesanal (raspado) 1.2.3. Recomendaciones para la recolección de propóleos 1.2.4. Almacenamiento, conservación y transporte 1.3. USOS DEL PROPÓLEOS 1.3.1. Usos en la colmena 1.3.2. Usos del propóleos en el hombre 1.3.3. Formas de propóleos 1.4. CARACTERIZACIÓN Y CALIDAD DEL PROPÓLEOS 1.4.1. Caracterización del propóleos de acuerdo a normas 1.4.2. Calidad del propóleos CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 2.1. TOMA DE MUESTRA 2.1.1. Tamaño de la muestra 2.1.2. Acondicionamiento de la muestra 2.2. DETERMINACIONES ORGANOLÉPTICAS 2.2.1. Procedimiento 2.3. DETERMINACIONES FISICOQUÍMICAS 2.3.1. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Rusa 2.3.2. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Argentina CAPÍTULO 3: RESULTADOS 3.1. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS 3.2. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS 3.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Rusa 3.2.2. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Argentina DISCUSIÓN CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS ANEXO A: FOTOGRAFÍAS EXPERIMENTALES ANEXO B: PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA ANEXO C: DETERMINACIÓN DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS ANEXO D: GRÁFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIÓN ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1-1. Propóleos recién cosechados Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recolección de propóleos Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recolección de propóleos Figura 1-4. Raspado, para la recolección de propóleos Figura 1-5. Extracto alcohólico de propóleos Figura 1-6. Características organolépticas que permiten evaluar la calidad del propóleos ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propóleos Tabla 1-2. Consideraciones clínicas asociadas al uso de los propóleos Tabla 1-3. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Rusa Tabla 1-4. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Argentina Tabla 3-1. Características organolépticas del propóleos analizado Tabla 3-2. Resultados de la determinación del porcentaje de cera Tabla 3-3. Resultados de la determinación del porcentaje de impurezas mecánicas Tabla 3-4. Resultados de la determinación de los compuestos fenólicos Tabla 3-5. Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma Rusa) Tabla 3-6. Resultados de la determinación cualitativa de los compuestos flavonoides Tabla 3-7. Resultados de la determinación del índice de yodo Tabla 3-8. Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Rusa Tabla 3-9. Resultados de la pérdida por calentamiento Tabla 3-10. Resultados de la determinación de cenizas Tabla 3-11. Resultados de la determinación de sustancias extraíbles en n-hexano Tabla 3-12. Resultados de la determinación de resinas solubles en etanol Tabla 3-13. Resultados de la determinación de impurezas mecánicas Tabla 3-14. Resultados de la determinación de compuestos fenólicos totales Tabla 3-15. Resultados de la determinación de flavonoides totales Tabla 3-16. Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma Argentina) Tabla 3-17. Resultados determinación del espectro de absorción UV-visible Tabla 3-18. Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Argentina SIGLAS Y SIMBOLOGÍA SIGLAS INN INTA NCh PM UV : Instituto Nacional de Normalización. : Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. : Normas Chilenas. : Peso Molecular. : Ultravioleta. UNSE : Universidad Nacional de Santiago del Estero, Argentina. SIMBOLOGÍA a b cm g ºC h L m m² mg ml mm min N nm ppm r s Tº : Intercepto de la recta o curva de calibrado. : Pendiente de la recta o curva de calibrado. : Centímetro. : Gramo. : Grados Celsius. : Hora. : Litro. : Metro. : Metro cuadrado. : Milígramo. : Mililitro. : Milímetro. : Minuto. : Normalidad. : Nanómetro. : Partes por millón. : Coeficiente de regresión. : Segundo. : Temperatura. INTRODUCCIÓN El propóleos es un producto apícola utilizado desde tiempos remotos por sus propiedades medicinales, es una sustancia gomo-resinosa, producto del procesamiento por parte de la abeja (Apis mellifera), de resinas vegetales de variado tipo. Las abejas utilizan el propóleos para recubrir todas las grietas y abertura de la colmena. Además de cumplir esta función, el propóleos evita contaminaciones debido a que posee acciones fungicida y antibiótica. Es una sustancia de compleja composición química, ya que contiene más de ciento sesenta compuestos activos, entre ellos, flavonoides (principalmente quercetina), ácido benzoico y ácido cafeico y sus derivados [2,8]. Su composición es compleja y variada por cuanto depende de la flora y de las condiciones geográficas y climáticas donde se elabora el producto. Actualmente existe una demanda mundial creciente de este producto apícola, ya que es utilizado en diversas actividades y en numerosos países, que cuentan con normas, reglamentación y aprobación oficial para su empleo a nivel industrial. Esto ha traído como consecuencia la necesidad de su estudio, control de calidad y caracterización en general. En Chile, éste es un recurso natural que no ha sido explotado y aprovechado en su plenitud, existiendo un manejo artesanal de él, además no se cuenta con normas que permitan la caracterización y evaluación de calidad del propóleos, para poder ser utilizado a nivel industrial; por tanto se necesita establecer parámetros que permitan caracterizar el propóleos, además se requiere de un amplio estudio y difusión de las diferentes propiedades y beneficios de él [5]. En el presente trabajo se realiza la caracterización organoléptica y fisicoquímica de un propóleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta Región de Chile, a través de análisis organolépticos y fisicoquímicos, estipulados en dos normas internacionales (norma Rusa RST-RSFSR-317-77 y norma Argentina IRAMINTA-15935-1:2008), utilizadas para su caracterización. El desarrollo de este trabajo se fundamenta en que para comercializar en el mercado internacional el propóleos chileno es necesario caracterizarlo y cumplir con exigencias de calidad, requeridas por los países importadores. En este sentido, la concepción más actualizada de su caracterización y control de calidad consiste en el desarrollo de dos etapas de análisis, para el uso de propóleos a nivel industrial, estas son: • Determinación de las características organolépticas • Determinación de las propiedades fisicoquímicas El desarrollo de los análisis se lleva a cabo en el Laboratorio de Química de la Universidad Técnica Federico Santa María, Sede Viña del Mar, José Miguel Carrera; durante los meses de Noviembre y Diciembre del año 2008. Establecer parámetros que permitan caracterizar y utilizar a nivel industrial el propóleos, a través de la determinación de las características organolépticas y propiedades fisicoquímicas, permitirá la elaboración de normas de calidad adecuadas a este producto a nivel nacional, que sirvan como elementos útiles para su control, verificación y para caracterizar el producto ofrecido, cuando él mismo sea destinado a la exportación para poder cumplir con las exigencias del mercado internacional. OBJETIVO GENERAL Establecer parámetros organolépticos y fisicoquímicos que permitan caracterizar el propóleos, a través de análisis realizados a un propóleos, empleando dos normas internacionales utilizadas para su caracterización y control de calidad. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar las características organolépticas del propóleos, a través de lo establecido en ambas normas. • Verificar las propiedades y composición fisicoquímica del propóleos a través de análisis estipulados en ambas normas. • Analizar estadísticamente los resultados obtenidos. • Detectar la norma que permite una mejor caracterización del propóleos. CAPÍTULO 1: ANTECEDENTES GENERALES 1. ANTECEDENTES GENERALES 1.1. PROPÓLEOS Definición de acuerdo a la Real Academia Española: Sustancia cérea con que las abejas bañan la colmena o vasos antes de empezar a obrar. 1.1.1. Definición técnica Mezcla compleja de origen biológico elaborado a partir de resinas, bálsamos, gomas y otras exudaciones de algunas especies vegetales (pino, abeto, sauce, abedul, varias especies de álamo, fresno, roble, etc.), que la abeja Apis mellifera recoge y modifica, adicionándoles cera, polen y enzimas entre otros materiales, con el propósito de proteger la colmena de las adversidades del medio, asegurando estabilidad térmica y protección contra problemas microbiológicos [2 ,5 ,8]. Fuente: Bracho, 2008 Figura 1-1. Propóleos recién cosechados También se entiende por propóleos el producto compuesto de sustancias resinosas, gomosas y balsámicas, ceras, aceites esenciales y polen, de consistencia viscosa, elaborado por las abejas (Apis mellifera), a partir de ciertas especies vegetales, que son transportadas al interior de la colmena y modificadas parcialmente con sus secreciones salivares [8]. Esta sustancia, elaborada por las abejas, es conocida por el hombre desde tiempos remotos. La utilizaban los sacerdotes egipcios y más tarde, los griegos, quienes lo denominaron propóleos. El término ‘propóleos’ proviene del griego propolis pro: que significa delante de, y polis, que quiere decir ciudad [2]. Por su consistencia y estructura, los propóleos pueden clasificarse en dos grupos: los de naturaleza fluida y los balsámicos-oleorresinosos. Los primeros presentan una fracción importante de agentes volátiles, mientras que en los balsámicos predomina la consistencia densa, con bajo contenido de compuestos volátiles, susceptibles de polimerización y que con frecuencia se percibe el aroma de las plantas en forma concentrada; en general son sustancias viscosas, semisólidas y cauchosas [11]. 1.1.2. Características fisicoquímicas del propóleos Su color puede variar desde amarrillo verdoso, verde oscuro a marrón oscuro, puede ser de color verde, pardo, castaño o rojizo, e incluso puede ser casi negro, dependiendo de su origen botánico [8], algunos son firmes, mientras que otros son gomosos y elásticos. El aroma puede ser placentero a yemas de álamo, miel, ceras y vainilla o se puede relacionar con la flora nativa del sector, en algunos casos el propóleos suele ser amargo, picante y hasta astringente [3, 8, 11]. El propóleos es soluble en alcohol etílico y en solventes como el éter, bencina y acetona entre otros; pero a excepción del alcohol etílico, estas sustancias son tóxicas y no deben utilizarse para la elaboración de extractos de propóleos. El propóleos presenta una consistencia variable, dependiendo de su origen [8], de las condiciones geográficas y climáticas donde se elabora el producto. Hasta los 15°C es duro y se torna más maleable a medida que aumenta la temperatura. Su punto de fusión varía entre 60 a 70°C, llegando en algunos casos hasta 100°C [12]. Cuando se calienta el propóleos lentamente a baño maría se separa en dos partes; una gruesa se deposita en el fondo y la otra sobrenadante en la superficie (cera de propóleos) [4]. 1.1.3. Composición universal del propóleos Su composición química es bastante compleja. La composición del propóleos varía dependiendo de las fuentes vegetales de origen y de su función específica dentro de la colmena [8]. Básicamente se compone de un 50-55% de resinas y bálsamos, 3040% de cera de abeja, 5-10% de aceites esenciales o volátiles, 5% de polen y 5% de materiales diversos (orgánicos y minerales) [2]. En líneas generales, en todos los propóleos se encontraran: Resinas y bálsamos aromáticos Cera Aceites volátiles Polen Sustancias orgánicas y minerales 1.1.3.1. Compuestos identificados en propóleos Se han identificado más de ciento sesenta compuestos, de los cuales un 50% son compuestos fenólicos, a los cuales se les atribuye la acción farmacológica. En términos de acción farmacológica, los principales constituyentes del propóleos son los compuestos fenólicos. Estos se caracterizan por la presencia de al menos un grupo oxhidrilo unido directamente a un anillo aromático [8].Los principales compuestos fenólicos identificados son: • Aldehídos aromáticos (vainillina e isovainillina). • Cumarinas, esculetol, escopoletol. • Ácidos aromáticos y sus ésteres. • Triglicéridos fenólicos. • Flavonoides. En la naturaleza se pueden encontrar diversos tipos de compuestos fenólicos, entre los que se pueden citar, los ácidos fenólicos (benzoico, cafeico, ferúlico y cinámico) y los flavonoides. Algunos compuestos fenólicos de origen vegetal resultan familiares, al menos por su acción organoléptica; por ejemplo, la vainillina, el anetol y el eugenol [8]. 1.1.3.2. Flavonoides identificados en propóleos Los flavonoides son compuestos químicos de origen botánico con una marcada actividad biológica y han sido usados como indicadores de la calidad del propóleos. Los propóleos están constituidos fundamentalmente por flavonoides, derivados de esteres y ácidos fenólicos. Walker y Crane en 1987 reportaron la presencia de 38 flavonas, 12 derivados del ácido benzoico, 14 derivados del alcohol cinamílico y el ácido cinámico, 12 componentes entre alcoholes, cetonas y fenoles, 7 terpenos, 11 esteroides, 7 azúcares y 2 aminoácidos. Los flavonoides son constituyentes principales de resinas y bálsamos 50-55 % 7,5-35 % 10 % 4-5% 5% [11]. Los flavonoides absorben radiación electromagnética en la zona UV - VIS y de esta forma representan una protección natural para las plantas contra la radiación UV del sol. Esto explica el efecto protector sobre la piel de ciertos preparados en base a propóleos. Por otra parte presentan una barrera química de defensa contra microorganismos (hongos, bacterias y virus) [8]. Tabla 1-1. Flavonoides identificados en el propóleos Flavonas Acacetina Crisina Amarilla Pectolinarigenina Tectocrisina Apigenina Flavonoles Galangina Izalqinina Kampferol Quercetina Ramnocitrina Flavononas Pinostrobina Sakuranetina. Flavononoles Pinobanksina Fuente: Caneo (2006) Los flavonoides, desde el punto de vista estructural, corresponden a un sistema de tres anillos fusionados en una secuencia de carbonos que presenta un heterociclo central en una estructura C6C3C6, que ha sido discutida ampliamente por su estabilidad y reactividad. Estos compuestos suelen presentar a lo menos tres hidroxilos fenólicos, condición que facilita su clasificación y reactividad frente al tricloruro de aluminio y 2,4-Dinitrofenilhidracina (2,4D) [11]. 1.1.3.3. Otras sustancias identificadas en propóleos Además de una gran cantidad de compuestos fenólicos, se han identificado en el propóleos otros compuestos: • Alcoholes • Ácidos alifáticos y ésteres • Aminoácidos • Chalconas y Dihidrochalconas • Flavononas • Flavonas y Flavonoles • Hidrocarburos, ésteres y éteres • Ácidos grasos • Cetonas • Terpenos • Esteroides • Azúcares • Minerales • Vitaminas Ácidos aromáticos: cafeico, ferúlico, cinámico, cumárico, gálico y salicílico. Ácidos grasos: palmítico, oleico, esteárico, linoleico, linolénico, araquidónico, cerótico y mirístico. Terpenos: cimeno, cineol, limoneno, bisabolol, xantorreol y alfa-acetoxibetulenol. Minerales: aluminio, plata, bario, boro, cromo, cobalto, cobre, estaño, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, níquel, plomo, selenio, silicio, estroncio, titanio, vanadio y zinc. Vitaminas: Pro-vitamina A, vitamina B1, B2, y B3. 1.2. RECOLECCIÓN DEL PROPÓLEOS La recolección del propóleos de la colmena ha sido realizada casi siempre por simple raspado, con una espátula de acero inoxidable, de las paredes interiores de la colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propóleos, este es un método bastante engorroso. En el mercado existen rejillas para la recolección de propóleos que se colocan debajo de la tapa y que consisten en una lámina plástica con ranuras que las abejas se apresuran a rellenar con propóleos, lo que permite su fácil retirada y recolección. Posteriormente se congelan y una simple presión sobre las mismas permitirá que los propóleos se desprendan de las ranuras [12].Los métodos más utilizados para la recolección del propóleos de la colmena son: el método técnico (uso de mallas y el método artesanal (raspado). 1.2.1. Método técnico (uso de mallas) Se ha experimentado con éxito el empleo de mallas o rejilla plástica con agujeros de aproximadamente 1,5 - 3,0mm., como las mallas matrizadas y mosquiteras. Mallas matrizadas: placas de material plástico (41 x 25cm y aprox. 0,4 cm de espesor), en las cuales se encuentran estampadas la ranuras donde se depositará el propóleos. Mallas mosquiteras: tejidos de hilos plásticos de 55 x 45cm, que se termosella en los bordes antes de utilizar; es recomendables que sean blancas o de colores claros, evitando el color negro (hasta no demostrar que este color sea contaminante). No se utilizan mallas metálicas porque contaminan el propóleos y las de fibra de vidrio tienden a romperse con el manipuleo. Fuente: Salamanca (2000) Figura 1-2. Uso de mallas matrizadas para la recolección de propóleos Fuente: Salamanca (2000) Figura 1-3. Uso de mallas mosquiteras para la recolección de propóleos El método consiste en cortar secciones de la malla del tamaño de la superficie de la colmena y colocarlos sobre los marcos de la última alza de la colmena [12].Es útil colocar estas últimas en forma simétrica sobre el ancho del alza y luego de algunas semanas moverlas hacia el otro extremo, de tal modo de incentivar a las obreras a que se enfrenten a los nuevos espacios vacíos, lo cual permitirá obtener una mayor recolección. Cualquiera de estas mallas que se vaya a utilizar es conveniente instalarlas en primavera y otoño, pudiendo ser retiradas en cualquier época del año, previo congelado en un freezer. Posteriormente, se congelan entre -10° y -20°C, para desprender fácilmente el propóleos, durante por lo menos una hora, lo que torna a la resina rígida y frágil, fácil de separar de la malla mediante "manipuleo". El congelado generalmente se realiza durante 1 ó 2 horas [7]. 1.2.2. Método artesanal (raspado) Consiste en raspar con una espátula de acero inoxidable las paredes interiores de la colmena, cuadros y otros lugares donde las abejas depositan el propóleos. Para un adecuado raspado, hay retirar las alzas y cuadros al preparar las colmenas para la invernada, ya que se aprovecha este momento para confinar la colonia al menor espacio posible y el material excedente será transportado al taller del apicultor. Además en esa época la temperatura baja facilita la separación del propóleos de la madera y el estado rígido de la resina limita la posible contaminación con trozos de madera, abejas y otros contaminantes macroscópicos. No todas las variedades de abejas propolizan con la misma intensidad, una misma colmena propolizará diferentes cantidades en distintas épocas y aún puede haber diferencias en las cantidades producidas en cada año, pues las abejas trabajan según sus necesidades y posibilidades [4]. La apariencia externa de los propóleos puede variar de una extracción a otra, vale indicar que los propóleos sólo pueden retirarse de las colmenas cuando se cosechen por medio de raspado dos veces al año, ésto por razones de protección de la misma colmena [12]. Fuente: Salamanca (2000) Figura 1-4. Raspado, para la recolección de propóleos 1.2.3. Recomendaciones para la recolección de propóleos  Utilizar una espátula de acero inoxidable, sin mucho filo para reducir el riesgo de arrastrar virutas de madera, para la recolección de propóleos por raspado.  Cuidar de no raspar donde haya pintura sobre la madera, pues ésta es uno de los mayores responsables de la contaminación del propóleos y es fácilmente detectable.  Realizar el raspado del propóleos que se encuentra en las superficies interiores de la colmena: tapa, cuadros y cajas, desechando el que se encuentra en el fondo, pues generalmente está muy contaminado.  La recolección se debe realizar con las manos y espátula libres de restos de miel, tierra o cualquier otra sustancia que pueda contaminarlo.  Durante la cosecha, el propóleos no debe exponerse a la incidencia directa de los rayos solares, evitándose su almacenamiento cerca de fuentes de calor.  No debe mezclarse con la cera que se encuentra en la tapa, entre los marcos y sobre ellos. Siempre debe tratar de evitarse que el propóleos se compacte. Para lograrlo, el propóleos recolectado no se debe comprimir con las manos para formar pelotas, por el contrario, se debe mantener en formas de escamas y/o trozos sueltos.  En ningún caso se deberá recolectar el propóleos a partir de chapas o superficies metálicas, el carácter ácido del producto por lo general ha permitido la reacción de dicha superficie induciendo concentraciones indeseables.  Durante el trabajo con las abejas no se deben usar tratamientos químicos, porque estas sustancias químicas pueden contaminar el propóleos. Si se utilizan tratamientos químicos para controlar la varroa es imperativo sacar el propóleos antes de aplicar cualquier tratamiento. La cosecha del propóleos puede variar entre 100g y 400g por colmena al año, dependiendo de una serie de factores como el método utilizado para la recolección del propóleos [12]. Con el método de mallas pueden alcanzarse hasta los 500g, mejorando la calidad, sin incrementar demasiado los costos de producción [7]. 1.2.4. Almacenamiento, conservación y transporte El primer paso luego de obtenido el propóleos, es la limpieza del mismo con una pinza, cuidando de retirar contaminantes macroscópicos como abejas, trozos de madera, pasto, etc. Se debe cuidar de retirar aquellos trozos de propóleos que puedan venir con pintura adherida, ya que ésta es una de las principales fuentes de contaminación.  Una vez recolectados, deben almacenarse en frascos de vidrio o de preferencia en bolsas de polietileno, se sugiere no embalar más de un kilogramo para facilitar su análisis posterior.  Es apropiado conservarlo en frascos de vidrio de color ámbar, que lo proteja de las altas temperaturas y en especial de la luz.  Su temperatura de conservación idónea es 15°C, a más de 20°C comienza a desactivarse y permite la reproducción de algunos parásitos.  Si el propóleos recolectado se va a almacenar por largo tiempo, se debe conservar sometiéndolo a temperaturas que oscilen entre –10° y –20°C durante 48 horas. 1.3. USOS DEL PROPÓLEOS 1.3.1. Usos en la colmena El propóleos en la colmena cumple diversas funciones que son difíciles de priorizar, generalmente las abejas lo utilizan para:  Barnizar el interior de la colmena (incluidos los panales) con fines desinfectantes.  Cerrar grietas, reducir vías de accesos y consolidar los componentes estructurales, para evitar las corrientes de aire o el frío.  Reducir al mínimo las vías de acceso (piqueras) o crear obstáculos que impidan la entrada de enemigos, tales como, mariposas y otros insectos  Evitar las vibraciones de los panales cuando las colmenas están situadas sobre árboles, que mueven sus copas por el viento.  Recubrir los cadáveres de los enemigos que se hayan introducido en la colmena (escarabajos, roedores, lagartijas, etc.), que quedan embalsamados evitando su descomposición. Esta propiedad del propóleos ya era conocida por los egipcios los sacerdotes lo utilizaban para momificar los muertos [2,8]. De todas las variantes en que lo emplean es seguramente la de barnizar toda la colmena, la más importante; constituye un modo de escudo protector de los moradores contra una amplia gama de microorganismos, que ayudados por el calor y la humedad procedente de la colmena, vivirían sobre las paredes perjudicándolos, para este fin es amasado con las mandíbulas y va siendo colocado con gran perseverancia hasta que toda la madera esté cubierta [12]. 1.3.2. Usos del propóleos en el hombre La utilización del propóleos en diversos ámbitos, radica en sus propiedades antimicrobianas, bacteriostáticas y bactericidas, proporcionadas por los ácidos oxibenzoico, metoxibenzoico, cafeico, ferulico, etc. Por su parte, los flavonoides (con más de cuarenta acciones farmacológicas) son la base de su versatilidad terapéutica. Sus cualidades antioxidantes (además de reducir el efecto de los radicales libres) son responsables de la acción antiviral, al inhibir el desarrollo de virus patógenos. Además de su amplio efecto antibacteriano, el propóleos estimula la reacción inmunológica del organismo, complementando ambas funciones sin producir alteraciones de la flora bacteriana, cosa que ocurre con los antibióticos de síntesis. También se lo emplea con buenos resultados en el tratamiento de amigdalitis y faringitis. Los profesionales que emplean su voz son grandes consumidores de miel con propóleos y caramelos o jarabe de propóleos. Además, este producto natural brinda resultados ventajosos en infecciones respiratorias altas, cuando se los administra en forma de colutorios o inhalaciones, sólo o asociado a antibióticos [8]. Dentro de las principales actividades en las que se utiliza el propóleos, destacan:  La medicina humana y veterinaria.  La agricultura.  La apicultura.  La industria de alimentos.  La cosmetología.  La farmacología.  La odontología. Se han encontrado resultados positivos al usar propóleos en el tratamiento de procesos tales como:  Gripe.  Sinusitis.  Otitis.  Laringitis.  Bronquitis.  Asma bronquial.  Neumonía crónica.  Tuberculosis pulmonar. En farmacología, se utiliza para la preparación de productos farmacéuticos, como remedios, gracias a su gran cantidad de propiedades; en la industria alimenticia, para la conservación de alimentos; en cosmetología, para la fabricación de una gran cantidad de productos, como cremas; en odontología, incrementa la salud bucal por sus principios antisépticos, antibióticos y antiinflamatorios; se utiliza para el tratamiento de abcesos, caries, aftas, gingivitis e higiene bucal. Además estimula la generación de la dentina (esmalte dental) e impide la formación de caries y placa bacteriana. La farmacopea actual menciona su uso como hipocolesterolemiante o reductor de la tasa de colesterol en sangre por el hecho de disminuir la absorción de las grasas a nivel intestinal. La acción antimicrobiana del propóleos está reconocida mundialmente y así lo avalan los numerosos trabajos realizados en este campo en Europa, en los cuales se informa que sus extractos poseen acción antibacteriana, antiviral y antimicótica. Su utilización se ha mantenido durante siglos hasta nuestros días, en que se están realizando investigaciones científicas sobre el empleo de preparados a base de propóleos en los campos de la biología, la medicina humana y la medicina veterinaria. Tabla 1-2. Consideraciones clínicas asociadas al uso de los propóleos Casos Alergología Angiología Colonproctología Dermatología Endocrinología Gastroenterología Geriatría Inmunología Oftalmología alérgicas; dermatitis Actividad Asma bronquial; inmunodepresiones con manifestaciones alérgica; neurodermatitis; rinofaringitislaringitis alérgicas Úlcera en las extremidades inferiores de causa vascular Hemorroides; fístulas anales y perianales; colitis ulcerativa Acné; dermatitis seborreica; psoriasis; verrugas vulgares; verrugas plantares; condilonas; epiteliomas; pitiriasis; micosis; vitiligo. Hipercolesterolemias; hipertriglicerclemias Parositósis, especialmente Giardiasi; úlceras pépticas; gastritis Úlceras decúbito Inmunodepresiones Conjuntivitis virales, bacterianas y alérgicas Rinitis bacteriana, viral y alérgica; faringitis y laringitis; en amigdolectomía. Artritis reumatoidea, osteomielitis, micosis vaginal; parasitosis; Otorrinolaringología postoperatorio de extirpación de pólipos nasales; hemostático Otros paiplomatosis, heridas sépticas de difícil cicatrización. Lupus eritematoso, estrés; neurosis; demencia senil Fuente: Salamanca (2000) 1.3.2.1. Propiedades biológicas y terapéuticas [8] A partir de la década del sesenta se efectúan las primeras investigaciones científicas que develan la compleja estructura del propóleos y ponen de manifiesto numerosas aplicaciones farmacológicas. Científicos de diferentes disciplinas profundizaron en su estudio, por lo que hoy se tiene respuesta a muchos interrogantes acerca de los mecanismos de acción que explican sus propiedades antimicrobianas, cicatrizantes, estimulantes del sistema inmunológico y antioxidantes. Su notable capacidad cicatrizante, desinfectante y antiinflamatoria lo hace indicado para heridas, quemaduras y afecciones de la piel. La compleja composición le confiere al propóleos capacidad:  Antibacteriana.  Antifúngica.  Antiviral.  Cicatrizante.  Antiinflamatoria.  Bioestimulante y regenerante.  Antioxidante. Capacidad antibacteriana: Fue una de las primeras propiedades constatadas. Múltiples estudios bacteriológicos in vitro confirmaron su acción bacteriostática y bactericida. Los principales responsables de esta propiedad son los flavonoides galangina y pinocembrina, y los derivados del ácido benzoico, ferúlico y cafeico. Itoh y colaboradores del Instituto de Investigación Zenyaku Kogyo Co evaluaron la capacidad antimicrobiana de diferentes tipos de propóleos ante el Helicobacter pylori. Hay gran cantidad de evidencias que permiten atribuir a esta bacteria la génesis de la gastritis, la úlcera gastroduodenal e incluso el cáncer gástrico. Una muestra de origen argentino demostró poseer la mayor capacidad antibacteriana ante esta bacteria, siendo los principales responsables los flavonoides pinocembrina, en primer lugar, y luego la galangina y la crisina. Los tratamientos actuales consisten en la utilización de uno o más antibióticos, costosos, de eficacia dudosa, y que no están exentos de efectos secundarios. Un estudio realizado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford, publicado en Microbiologie Research, informa que el ácido cinámico y algunos flavonoides desactivan la energía de la membrana citoplasmática, inhibiendo la motilidad bacteriana, haciéndola más vulnerable al ataque del sistema inmunitario y potenciando los antibióticos. Capacidad antiviral: En Francia, los Dres. Amoros y Sauvager, de la Facultad de Medicina de Rennes, confirmaron la acción virulicida frente a los tipos uno y dos del herpes, pero también ante poliovirus. Establecieron que el propóleos reduce la síntesis del ADN viral y que los responsables son los flavonoides, que actúan en sinergismo con un éster del ácido cafeico y el ácido ferúlico. Otro tipo de patología viral que responde favorablemente al propóleos es el Herpes Zoster (culebrilla), patología con expresión cutánea, dolorosa, de pobre respuesta a los tratamientos convencionales. Tratado precozmente en el período eruptivo, la remisión se acorta y se evita la neuralgia postherpética. Otro virus como el VIH también ha llamado la atención. Un grupo de investigadores del Albert Einstein College of Medicine de Nueva York publicó, en 1997, un trabajo en el que explican cómo determinaron la capacidad del propóleos de suprimir la replicación del VIH-1 y su efecto inmunoestimulante. Capacidad cicatrizante y antiinflamatoria: El propóleos ganó espacios importantes en el tratamiento de heridas por su capacidad antibacteriana, y por su notable capacidad cicatrizante y antiinflamatoria. Estas últimas son comparables a la capacidad de antiinflamatorios de síntesis como el diclofenac. Se señaló al ácido cafeico como responsable de inhibir la dihidrofolato reductasa, porque reduce la producción de interleuquinas y prostaglandinas. En 1996 se publicó un trabajo elaborado en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Oxford, en el cual los autores atribuyen esta acción del propóleos a un éster del ácido cafeico (CAPE), al ácido cafeico y a la quercetina. Actuando a nivel de los macrófagos, suprime la producción de prostaglandinas y leucotrienos. Empleando modelos "in vivo" e "in vitro" constataron que el propóleos suprime la vía de la lipooxigenasa del ácido araquidónico. Capacidad inmunomoduladora: Diversos trabajos demuestran que el propóleos estimula la inmunidad inespecífica y la inmunidad específica; y tanto la inmunidad celular (mediada por los linfocitos T) como la humoral (mediada por los linfocitos B). En ratones infectados con el virus influenza tipo A y tratados con propóleos, se constató un aumento de los linfocitos T, un mayor nivel de fagocitosis y una menor mortalidad, en comparación con animales testigo no tratados. Los autores determinaron que se estimula la liberación del factor inhibidor de la migración de los leucocitos. Capacidad antioxidante: En los últimos años ha ganado importancia el consumo de antioxidantes, en especial los de origen natural, para la prevención de enfermedades de gran trascendencia como la arterioesclerosis, el reuma e incluso el cáncer. Los antioxidantes, como la vitamina E (alfa tocoferol), impiden la oxidación lipídica (por transformación del colesterol LDL en colesterol HDL), reduciendo el riesgo de enfermedades cardiovasculares, y además neutralizan los radicales libres, que son los responsables del envejecimiento celular. El propóleos posee una potente capacidad antioxidante. El propóleos ha ganado espacios importantes en el tratamiento de heridas, por su capacidad antibacteriana y por su notable capacidad cicatrizante y antiinflamatoria. Posee una potente capacidad antioxidante, que le permite adquirir insospechables perspectivas de desarrollo [2]. Para mantener sus propiedades requiere que se lo preserve de la luz y de las altas temperatura, dada las delicadas características biológicas de sus componentes. A pesar de que la temperatura de la colmena es de 34-35°C, extremadamente favorable para la reproducción de microorganismos, el propóleos permite que permanezca estéril. 1.3.3. Formas de propóleos Las principales formas de encontrar este producto apícola en el mercado son: Propóleos en bruto: es el obtenido directamente de la colmena, sin purificar. Productos con agregados de propóleos: spray de propóleos, caramelos, miel con propóleos y tintura de propóleos. Extracto de propóleos: es el producto semielaborado, que se obtiene procesando el propóleos en bruto con alcohol etílico, de manera de extraer los componentes biológicamente activos. A partir del extracto obtenido se pueden desarrollar una gran variedad de productos, como tinturas y cremas [2]. Fuente: López del Villar y Ubillús Celi (2004) Figura 1-5. Extracto alcohólico de propóleos En la actualidad, existe en el mercado farmacéutico internacional una infinita gama de productos que usan el propóleos y cada vez adquiere más importancia en las farmacopeas y cosmética moderna debido a sus valiosas propiedades terapéuticas [7]. Se le puede encontrar en tres formas de presentación: Sólida: en pasta para masticar, granulado o en polvo. Semisólida: pomadas y ungüentos. Líquida: solución alcohólica o acuosa. 1.4. CARACTERIZACIÓN Y CALIDAD DEL PROPÓLEOS 1.4.1. Caracterización del propóleos de acuerdo a normas Los estándares oficiales de calidad, utilizados para su caracterización y la evaluación de su calidad, existen para el propóleos en varios países del este europeo y en otros lugares del mundo, la mayoría de estándares se refieren al producto en bruto y a veces, a sus extractos. Los límites máximos y mínimos para ciertos compuestos químicos están determinados, pero son pocas las pruebas estandarizadas que están disponibles para determinar la actividad biológica de varios componentes. En algunos países existen normas que permiten caracterizar y avaluar la calidad del propóleos: • Norma Rusa RST-RSFSR-317-77. • Norma Húngara MSZ 08/0184-79. • Norma Ramal Búlgara ON 25 72 483-84. • Norma Ramal Cubana NRAG 1135-94. • Reglamentación del Ministerio de Agricultura de Brasil: Reglamento técnico para fijar la identidad y calidad de propóleos. 1999. • Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008. En Brasil, la Instrucción Normativa Nº 3/01, establece las inspecciones físicoquímicas y metodología de análisis para el propóleos en bruto y su extracto, en Bélgica y Grecia poseen normativa para productos apícolas que incluyen el propóleos [8]. Cada región presenta condiciones de flora diversa, dependiente de fenómenos locales, influenciados por la temperatura, las precipitaciones, el tipo de suelo, la humedad relativa, brillo solar y la evapotranspiración. En este sentido es indispensable considerar la similitud en algunos componentes básicos de algunos vegetales, cuyas características particulares vendrán dadas por las diversas combinaciones de los elementos que las constituyen. Esto se comprenderá mejor al analizar la relación entre la composición química de los propóleos y sus propiedades medicinales. Los componentes identificados en muestras de propóleos analizados permiten establecer relaciones directas con las propiedades medicinales que se le han atribuido [12]. Los compuestos identificados en propóleos de colmenas ubicadas en emplazamientos cercanos entre sí no difieren significativamente, aunque desde el punto de vista cuantitativo pueden ser variables. Ello implica que los propóleos deban ser estudiados y caracterizados en función de la zona geográfica de ubicación de las colmenas, para determinar sus propiedades, compuesto químicos presentes y características físicas y organolépticas. Para caracterizar el propóleos hay que determinar: el porcentaje de cera , las impurezas mecánicas, los compuestos fenólicos, el índice de oxidación, flavonoides totales, el índice de yodo, la humedad, la cenizas, las resinas, el aspecto externo, color, sabor, estructura, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. La caracterización de este producto de la colmena es fundamental para la diferenciación del producto y conlleva una mejor ubicación a nivel comercial. 1.4.1.1. Norma Rusa RST-RSFSR-317-77 Esta norma establece los requisitos técnicos, organolépticos y fisicoquímicos que deben cumplir el propóleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados. Requisitos técnicos según la norma a. El propóleos debe corresponder con las exigencias de la presente norma. b. Los índices organolépticos y fisicoquímicos deben corresponder con las exigencias señaladas (ver tabla 1-3). c. No se permite el calentamiento del propóleos en su procesamiento primario. Tabla 1-3. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Rusa DENOMINACIÓN DE LOS INDICES Aspecto externo Color Olor VALORES ACEPTADOS Pelotas granos o briquetas Verde oscuro, pardo o gris con matices verde, amarillo, Castaño oscuro o rojo Característico, resinoso, aromático ( la mezcla de olores de la miel ) de las hierbas aromáticas, del pino y del álamo Sabor Estructura Cera Índice de oxidación Reacción cualitativa ante los compuestos flavonoides Impureza mecánica Compuestos fenólicos Índice de yodo Amargo, algo fuerte Espesa. Con deformaciones Heterogéneas No más del 30 % No mayor de 22 s Positiva No más del 20 % No menos de 30 % No menor de 35 % 1.4.1.2. Norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008 Esta norma establecen los requisitos organolépticos y fisicoquímicos que deben cumplir el propóleos en bruto, para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados. Esta norma se aplica al propóleos en bruto, a granel y fraccionado. Requisitos técnicos según norma a. Los índices organolépticos y fisicoquímicos deben corresponder con las exigencias señaladas (ver tabla 1-4). b. El propóleos en bruto no debe contener sustancias extrañas a sus procesos de producción y elaboración. c. No se admite el agregado de aditivos. d. Los materiales de los utensilios que se utilicen para la recolección del propóleos en bruto (por ejemplo, espátulas, mallas y trampas) deben ser bromatológicamente aptos. e. Debe ser envasado en envases de material bromatológicamente apto, almacenados en un sitio fresco y oscuro. El envase debe ser tal que le confiera al producto una protección adecuada respecto de la humedad, la luz y la temperatura excesiva. Tabla 1-4. Índices organolépticos y fisicoquímicos, según norma Argentina DENOMINACIÓN DE LOS INDICES Aspecto externo Color VALORES ACEPTADOS Homogéneo o heterogéneo, de Preferencia en trozos no comprimidos. Amarillo, pardo, verdoso, marrón, rojizo, negro y otros similares, variando conforme a su origen botánico y/o geográfico Resinoso o balsámico, según su origen botánico y/o geográfico. Variable, de suave y balsámico a fuerte y picante, según su origen botánico y/o geográfico. Maleable o rígido, según su origen botánico y/o geográfico. Máximo 10% Máximo 5% Máximo 35% Máximo 22 s Máximo 25% Mínimo 5% Mínimo 35% Mínimo 1,0% Máximo de absorción entre 270 y 315 nm. Olor Sabor Consistencia a T° ambiente Pérdida por calentamiento Cenizas Sustancias extraíbles en n-hexano Índice de oxidación Impurezas mecánicas Compuestos fenólicos Resinas solubles en etanol Flavonoides Espectrograma UV-VIS Fuente: Norma Argentina IRAM-INTA N°15935-1:2008 1.4.2. Calidad del propóleos La calidad de los propóleos está directamente relacionada con los métodos de recolección, almacenamiento y conservación [6].Si bien la calidad del propóleos depende del tipo de flora y del ambiente; es decisivo en este sentido el trabajo del apicultor. La calidad del producto resultante estará directamente relacionada con:  Almacenamiento y conservación.  Lugar de procedencia.  Flora predominante en la zona.  Zona de la colmena desde donde se extrajo.  Método de recolección utilizado. La calidad de propóleos va a estar básicamente determinada por la cantidad de principios activos que puedan extraerse de ellos, si el propóleos se conserva por más de un año, su actividad biológica comienza a decrecer. Una forma simple de determinar la calidad de una muestra, consiste en oprimir una pequeña parte entre los dedos índice y pulgar, si sentimos consistencia terrosa la muestra es de poca calidad por la presencia de un exceso de mezclas mecánicas, si es demasiado maleable tendrá una cantidad excesiva de cera por lo tanto su calidad será también inferior. Para que las propiedades del propóleos recogido no se pierdan o alteren, es recomendable acopiarlo en frascos de vidrio color ámbar, hasta que se entregue para su utilización. Se debe tener la precaución de no almacenar grandes volúmenes, para evitar que se compacte desmereciendo significativamente la calidad del propóleos. Es muy difícil establecer lineamientos para el propóleos, ya que presenta diferentes colores, olores y composición. La mayoría de propóleos fresco tiene un olor resinoso agradable. Deberá tener el menor contenido de cera posible y estar libre de residuos contaminantes que se puedan ver a simple vista. Las múltiples y variadas propiedades del propóleos, dependen de sus componentes, y justifican la necesidad de una correcta evaluación de su calidad, y si bien distintos países disponen de parámetros oficiales para dicha evaluación, son escasos los ensayos de que se disponen para medir su actividad biológica [5]. Para que la calidad de un propóleos se considere buena debe cumplir los siguientes requisitos: a. Estar libre de contaminantes tóxicos. b. Contener bajos porcentajes de cera, materia insoluble y cenizas. c. Definir su procedencia botánica para determinar el tipo de compuestos activos. d. Tener contenidos elevados de principios activos. Para evaluar la calidad del propóleos además de la inspección visual y de sus características físicas y organolépticas (aspecto, consistencia, sabor, color y olor), que proporcionan una apreciación subjetiva del producto y cierta relación con su calidad real, se deben determinar los contenidos de principios activos que permiten una evaluación real y objetiva [5]. Por tanto es necesario determinar los contenidos de: fenoles, flavonoides, cera, cenizas, entre otros. Fuente: Farré, Frasquet y Sánchez (2004) Figura 1-6. Características organolépticas que permiten evaluar la calidad del propóleos Un análisis primario de cualquier muestra de propóleos permitirá determinar en líneas generales la presencia cera, que siempre estará íntimamente mezclada a los mismos, en proporciones relativamente altas (20-30%). Las muestras obtenidas por raspado de cuadros presentan mayores cantidades; resinas y bálsamos aromáticos (4050%), aceites esenciales (5-10%), polen (4-5%) y mezclas mecánicas (10-30%), que se encuentran en los propóleos empleados con fines constructivos, donde al parecer han sido acondicionados para aumentar su consistencia [12]. La cera y las mezclas mecánicas constituyen casi siempre entre el 40 al 50% de la masa total, no habiéndose podido demostrar su actividad terapéutica; se debe señalar que los microelementos detectados se encuentran en su mayor parte en las mezclas mecánicas, siendo precisamente el resto lo que corresponde a la parte biológicamente activa, la calidad de los propóleos estará determinada por su presencia y será inversamente proporcional a las cantidades de materias insolubles. CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1. TOMA DE MUESTRA Se toma una muestra de propóleos a través del método de raspado del apiario seleccionado, de distintas colmenas que conforman el apiario, previa enumeración de las colmenas y selección de algunas de ellas de forma aleatoria a través de la NCh (norma chilena) oficial 43.Of61, selección de muestras al azar, INN-Chile; para formar un muestra compuesta (no menor de 200g) representativa del apiario, que se denominó: MP- A. Recolectada en el mes de Noviembre del año 2008 (ver anexo A), a la muestra se le consignan los siguientes datos, tabulados en una ficha entregada previamente: • Ubicación del apiario: localidad de Tapihue, Casablanca. Quinta Región de Chile. • Tamaño del apiario: 300m2. • Identificación del apicultor: Fredy Valdés Álvarez. • Método de recolección: raspado. • Época de cosecha: primavera. • Cantidad de colmenas: 126. • Cantidad de colmenas seleccionadas para la toma de muestra: 20. 2.1.1. Tamaño de la muestra Se determina el tamaño de la muestra a través de un plan de muestreo simple, utilizando un nivel de inspección “normal” para usos generales, considerando las colmenas como lotes y seleccionando las colmenas a través de la tabla de números al azar: Tamaño del lote (N) = 126. Letra-código del tamaño de la muestra: F. Tamaño de la muestra(n): 20. Punto de partida (fila, columna): 15,11. Colmenas seleccionadas: 1,17,19,21,23,29,40,42,53,55,67,71,76,77,104,110,119,120, 122,124. 2.1.2. Acondicionamiento de la muestra Antes de iniciar las determinaciones en el laboratorio, hay que acondicionar la muestra eliminando las impurezas visibles que acompañan al propóleos, tales como virutas de madera, partes de abejas, restos de pintura, restos vegetales, etc. La muestra de propóleos en bruto se mantiene refrigerada para su conservación adecuada; a bajas temperatura el propóleos se vuelve rígido, lo cual favorece su molienda. Una vez congelado, debido a su consistencia y en algunos casos a su heterogeneidad, la muestra de propóleos en bruto se fracciona mecánicamente en tres trozos, un trozo se utiliza para realizar las determinaciones organolépticas, el otro para realizar las determinaciones fisicoquímicas, este se muele en un mortero de porcelana, manualmente, y el último se guarda en el laboratorio para realizar análisis de arbitraje. Después de la molienda deben conservarse refrigerados, protegidos de la luz en recipientes de vidrio color ámbar, hasta que se lleve acabo los análisis. 2.2. DETERMINACIONES ORGANOLÉPTICAS Las determinaciones organolépticas de la muestra de propóleos, como materia prima, se lleva a cabo analizando cualitativamente los parámetros sensoriales descriptivos, utilizando el protocolo de la UNSE-INTA (ver anexo B), realizadas por un grupo de diez apicultores semientrenados que califican los atributos a través de un “análisis descriptivo de categorización cuantitativa relativa”. Este análisis consiste básicamente en realizar la descripción de las características organolépticas del propóleos asignándole valores cuyo orden creciente o decreciente se ajusta al carácter de más intenso o aceptable para el propóleos; hasta obtener las características que más se ajustan a la realidad de la muestra analizada (ver anexo C). Descriptores organolépticos: color, aspecto externo, estructura, olor, sabor, consistencia a temperatura ambiente e impurezas visibles. 2.2.1. Procedimiento Para determinar el color, se coloca la muestra sobre una superficie blanca y se compara el color con una escala de colores, en un ambiente con buena iluminación. Calificando el color según tonalidades predominantes en la muestra. • Color: negro , marrón, marrón oscuro, marrón claro, verde oscuro, verde, verde claro, gris, amarillo, tintes castaños, tintes rojizos, tintes naranjas, marrón verdoso, verde amarillento, tintes castaño rojizo, tintes castaño naranja, marrón amarillento, amarillo verdoso, marrón verdoso amarillento. La determinación del color, constituye una de las características organolépticas más importantes para clasificar los propóleos de orígenes diversos [3]. Para determinar el aspecto externo y estructura, se compara con las referencias gráficas de un propóleos estándar actualmente comercializado. Determinando el aspecto externo y estructura por observación. Aspecto externo: Polvo, granulado, masa irregular con brillo, masa irregular opaca, trozos irregulares opacos, trozo irregulares con brillo. Estructura: Homogénea o heterogénea. Para la evaluación del olor y sabor, se retira una porción de la muestra a fin de que el envase no interfiera en la percepción olfativa. Posteriormente, la muestra se coloca en la parte media de la lengua por unos segundos y se compara el sabor con un propóleos estándar actualmente comercializado. Para determinar el olor, se huele la muestra y se compara el olor con un propóleos estándar actualmente comercializado. Olor: Inodoro, levemente reinoso, resinoso, resinoso aromático, resinoso muy aromático. Sabor: Insípido, dulce, salado, amargo, picante. Para determinar su consistencia a temperatura ambiente, se retira una porción de la muestra y se coloca en un vidrio reloj, hasta que alcance la temperatura ambiente en el laboratorio. Determinando la consistencia por opresión de la muestra con los dedos y comparándola con un propóleos estándar actualmente comercializado. Consistencia a temperatura ambiente: Muy blando, blando, poco blando o duro. • Para determinar las impurezas visibles, se retira una porción de la muestra y se coloca en un vidrio reloj, y con la ayuda de pinzas se determinan las impurezas por observación. 2.3. DETERMINACIONES FISICOQUÍMICAS • • • 2.3.1. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Rusa 2.3.1.1. Determinación del porcentaje de cera La cera de abejas corresponde a una secreción natural, producida por dos pares de glándulas, ubicadas en la zona central del abdomen de las abejas jóvenes. Esta secreción está compuesta principalmente por ésteres de ácidos grasos y alcoholes, siendo una sustancia insoluble en agua. Fundamento teórico Determinación del contenido de cera presente en la muestra, por gravimetría sobre el residuo de cera, obtenido por calentamiento del propóleos en solución acuosa, ya que este es insoluble en agua, posterior filtración y secado en estufa a 80°C. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Pesar al 0,1 mg, 3 g de muestra en un vaso precipitado de 250 ml, agregar 200 ml de agua destilada y mezclar. - Hervir por 15 a 20 min. - Cumplido el tiempo, enfriar con un chorro de agua, si es que no ha alcanzado la temperatura ambiente y filtrar. - Tarar un papel filtro, colocar en la estufa a 80°C y pesar cada cierto tiempo hasta obtener un peso constante. Se considerará peso constante, cuando la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg. Expresión de cálculo % Cera = A x 100 B Donde: A= B= masa del residuo, en g. masa inicial de la muestra, en g. 2.3.1.2. Determinación del porcentaje de impurezas mecánicas Las impurezas mecánicas son todos los elementos ajenos al propóleos, que han sido incorporados durante el proceso de recolección y manipulación de éste, por ejemplo: patas de abejas o parte de ellas, residuos de papel, plástico, madera, resto de pinturas, etc. Fundamento teórico Determinar el contenido de impurezas mecánicas presentes en la muestra, a través de un análisis gravimétrico del residuo obtenido, al adicionar solución de cloroformo-acetona 2:1 a 1g de propóleos, posterior filtración de él y donde las impurezas son insolubles en esta solución. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Cloroformo, PM = 119,38 g/mol, grado p.a., Vimaroni. - Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler. - Solución de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa esmerilada 20 ml de cloroformo y 10 ml de acetona. Procedimiento - Pesar 1g de muestra en un vaso precipitado de 250ml. - Adicionar 15 ml de solución de cloroformo-acetona 2:1, agitar y mantener en descanso durante 1h a temperatura ambiente y posteriormente filtrar. - Guardar el filtrado para la determinación de compuestos fenólicos (2.3.1.3.). - Lavar el papel filtro con el residuo, con 15 ml de solución de cloroformoacetona 2:1. Colocar el papel filtro sobre un vidrio reloj. - Secar a temperatura ambiente, llevar a desecador y pesar cada cierto tiempo hasta obtener peso constante. Se considerará peso constante, cuando la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 0,5 mg. Expresión de cálculo % Impurezas mecánicas = (M3 – M2) x 100 M1 Donde: M1 = M2 = M3 = masa de la muestra inicial en g. masa del papel filtro, en g. masa del papel filtro conteniendo el residuo, en g. 2.3.1.3. Determinación de los compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son ácidos aromáticos, poseen en común un anillo aromático con uno o más sustituyentes hidroxilos, junto a los flavonoides, le confieren al propóleos sus múltiples aplicaciones farmacéuticas; los principales compuestos fenólicos del propóleos son: ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido cinámico y ácido benzoico, entre otros. Fundamento teórico Determinar los compuestos fenólicos en la muestra de propóleos, a través de un análisis gravimétrico del residuo obtenido, al tratar el filtrado obtenido en la determinación de impurezas mecánica con óxido de aluminio, posterior filtrado y lavado con cloroformo-acetona 2:1. Se basa en la adsorción de los compuestos fenólicos del propóleos, sobre el óxido de aluminio activado, y la máxima capacidad de dilución en la solución cloroformo-acetona. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Óxido de aluminio, grado p.a., May and Baker, lote: 6155. - Cloroformo, PM = 119,38g/mol, grado p.a., Vimaroni. - Acetona, PM= 58,08, grado p.a., Winkler. - Solución de cloroformo-acetona (2:1): mezclar en un matraz de 250 ml con tapa esmerilada, 10 ml de cloroformo y 5 ml de acetona. Procedimiento - Tomar el filtrado obtenido en la determinación de impurezas mecánica (2.3.1.2) y agregar 15 g de óxido de aluminio. - Agitar y filtrar. - Lavar el papel filtro con la solución cloroformo-acetona 2:1 hasta eliminar todo el óxido de aluminio. Registrar como “A”. - Paralelamente, tomar otro papel filtro, a este último agregar 15 g de oxido de aluminio más 5 ml de la solución cloroformo-acetona 2:1. Registrar como “B”. - Colocar ambos papeles filtro en la estufa a una temperatura de 80° C por 30 min. - Enfriar en el desecador y pesar ambos papeles filtro hasta obtener peso constante. Expresión de cálculo % Compuestos fenólicos = (B – A) x 100 M Donde: A= B= M= masa del papel filtro “A”, en g. masa del papel filtro “B”, en g. masa de la muestra inicial, en g. 2.3.1.4. Determinación del índice de oxidación (según norma Rusa) Este índice se define como el tiempo de decoloración, medido en segundos, de una solución de KMnO4 0.1000N, se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre compuestos fenólicos del propóleos (fenoles y compuestos insaturados). Depende de los compuestos fenólicos y en menor medida de los ácidos grasos insaturados de cadena larga. Fundamento teórico Determinación del índice de oxidación, para verificar las propiedades antioxidantes, midiendo el tiempo de decoloración de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N. Agregado a 2 ml de una suspensión acuosa de propóleos (obtenida mediante una extracción de 0,2 g de propóleos con 5 ml de alcohol etílico 95º, posterior agregado de 100 ml de agua destilada y filtrado) y 1 ml de solución de H2SO4 al 20 % (V/v). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Cronómetro. Reactivos y soluciones - H2SO4 al 20% (V/v). - Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., artículo Nº1010080000, lote: 61190257213. - KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1000 ml de agua destilada y mantener a ebullición suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24 h protegido de la luz, filtrar a través de filtro Gooch G4 y guardar en botella ámbar. Estandarizar el KMnO4 con una solución estándar de Na2C2O4 0,1000N. Procedimiento - Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado de 250 ml, agregar 5 ml de alcohol etílico. - Dejar reposar aproximadamente 1 h a temperatura ambiente y agregar 100 ml de agua destilada, filtrar. - Tomar una alícuota de 10 ml del filtrado y llevar a un matraz aforado de 100 ml. Aforar con agua destilada. - De esta solución tomar una alícuota de 2 ml y llevar a un tubo de ensayo, adicionar 1 ml de H2SO4 al 20% (V/v). - Agitar por 1 min y agregar 1 gota de KMnO4 0,1000 N, con un cronómetro, registrar el tiempo en el que ocurre el cambio de color. Expresión de cálculo El tiempo en que desaparece el color rosado de la solución, corresponde al índice de oxidación que esta dado en segundos (s). 2.3.1.5. Determinación cualitativa de los compuestos flavonoides Los flavonoides son pigmentos provenientes de exudados vegetales, con múltiples aplicaciones biológicas: antibacteriana, antimicótico, antiviral, antioxidante, cicatrizante, entre otras. Contienen quince átomos de carbono en su núcleo básico y están configurados bajo un sistema C6-C3-C6, en el cual dos anillos aromáticos llamados “A” y “B” están unidos por una unidad de tres átomos de carbono, que pueden formar o no un tercer anillo, que en caso de existir es llamado anillo “C”. Fundamento teórico Determinar la presencia de compuestos flavonoides en el propóleos, basado en la formación de compuestos coloreados, por reacción de los flavonoides con el acetato de plomo y el hidróxido de sodio. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Acetato de plomo II, grado p.a., Merck, lote: 107375. - Acetato de plomo al 10% (P/v): pesar 10g de acetato de plomo, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar. - NaOH, grado p.a., Loba Chemie, artículo: 5900, lote: Nº A023706. - NaOH al 20% (P/v): pesar 20g de NaOH en balanza granataria, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar. - Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., articulo Nº1010080000, lote: B11081. Procedimiento - Pesar 0,2 g de muestra en un vaso de precipitado y agregar 5 ml de alcohol etílico. - Colocar el vaso de precipitado en baño maría por 3 min. Enfriar y filtrar la solución. - Tomar una alícuota de 1 ml del filtrado, llevar a un vaso precipitado de 100 ml y añadir 10 ml de alcohol etílico. - De esta solución tomar una alícuota de 1 ml, llevar a un tubo de ensayo (tubo “A”), y adicionar 1 gota de NaOH al 20% (P/v). - Paralelamente, en otro tubo de ensayo (tubo B) tomar 1 ml de la solución y agregar 0,5 ml (10 gotas) de acetato de plomo al 10% (P/v). - Observar el cambio de color resultante. Expresión de cálculo La solución del tubo “A” debe colorearse rápidamente de un color anaranjadoamarillento, y oscurecerse. La solución del tubo “B” dará un color amarillo-verdoso y precipitará. 2.3.1.6. Determinación del índice de yodo Se define el índice de yodo como el número de gramos de yodo que pueden ser absorbidos por 100 g de grasa. El índice de yodo representa el verdadero grado de insaturación de las grasas o ácidos grasos, solamente cuando los enlaces dobles de los ácidos grasos no son conjugados (en los que los dobles enlaces de la cadena carbonada están siempre separados, por lo menos, por dos enlaces sencillos); en caso contrario la absorción del halógeno no es cuantitativa. Fundamento teórico Determinar los gramos de yodo que pueden ser absorbidos, bajo condiciones determinadas por 100g de grasa a través de la valoración del yodo liberado con Na2S2O3*5H2O 0,1000N, utilizando como indicador almidón al 5% (P/v). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Ácido acético glacial, grado p.a., Merck, lote: A968192823. - KI 10 %: pesar 10 g de KI, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml disolver con 40 ml de agua destilada y aforar. - Na2S2O3*5H2O 0,1000 N: pesar en balanza granataria 12,6 g de Na2S2O3*5H2O, agregar 5 gotas de cloroformo, traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 500 ml y aforara con agua destilada; estandarizar la solución con cobre electrolítico. - Solución bromo–yodo: pesar 13,2 g de yodo cristalizado en un vaso precipitado, disolver con mínima cantidad de ácido acético glacial, colocar a baño maría hasta disolución a una temperatura entre 60 y 70ºC, enfriar y añadir 3 ml de bromo p.a.; traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml y aforar con ácido acético glacial. - Almidón al 5% (P/v): disolver 5 g de almidón soluble p.a., con agua destilada caliente en un vaso precipitado (hacer una pasta) hasta transparencia y traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Procedimiento - Pesar 0,05 g de muestra de propóleos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapa esmerilada. - Agregar 2,5 ml de cloroformo y 6,25 ml de la solución bromo-yodo. Tapar el matraz y colocar en la oscuridad por 1 h. - Agregar 5 ml de KI 10 %, 50 ml de agua destilada y 4 a 7 gotas de la solución de almidón al 5% (P/v). - Agitar y valorar con la solución de Na2S2O3*5H2O 0,1000N, hasta observar decoloración de la solución. - Hacer un blanco de reactivos en las mismas condiciones experimentales de la muestra. Expresión de cálculo Índice de yodo = (B - A) x N x 0,1269 x 100 = [gI2 /100g de muestra] M Donde: A: B: M: N: ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en la muestra. ml de del Na2S2O3*5H2O gastado en el blanco. masa de la muestra, en g. normalidad del Na2S2O3*5H2O. 2.3.2. Determinaciones fisicoquímicas, por norma Argentina 2.3.2.1. Pérdida por calentamiento Fundamento teórico Determinar la pérdida de masa por calentamiento, expresadas en g/100g de propóleos, a través de un análisis gravimétrico, secando una porción de muestra en estufa a 105°C, y pesando la muestra seca hasta obtener peso constante. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Tarar una cápsula de porcelana limpia, previamente secada en estufa a 100°C ± 2°C, y en mufla a 550°C ± 25°C. - Pesar al 0,1 mg, en una cápsula de porcelana, aproximadamente 4 g de propóleos. - Calentar en estufa regulada a 100°C ± 2°C durante 2 h. Luego retirar la cápsula, colocarla en un desecador hasta que llegue a temperatura ambiente, y pesar la cápsula con la muestra. - Así tratada, reservar la cápsula para la determinación de cenizas (2.3.2.2.). Expresión de cálculo H (A – B) x 100 C = Donde: H= A= B= C= pérdida por calentamiento, en g/100g de muestra. masa de la cápsula con la muestra húmeda, en g. masa de la cápsula con la muestra seca, en g. masa de la muestra inicial, en g. 2.3.2.2. Determinación de cenizas Fundamento teórico Determinar la materia inorgánica, expresadas en gramos de cenizas por 100 g de propóleos, por gravimetría, calcinando una porción de muestra en mufla a 500°C, y pesando las cenizas obtenidas hasta conseguir peso constante. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. Procedimiento - Colocar en un horno de mufla la cápsula de porcelana con la muestra seca provenientes de (2.3.2.1.), previamente quemada en mechero bajo campana. - Incinerar a 550°C ± 25°C, hasta obtener cenizas sin residuos carbonosos. - Retirar cuidadosamente la cápsula, del horno de mufla y dejar enfriar en un desecador hasta que se alcance la temperatura ambiente. - Pesar hasta obtener peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg. Expresión de cálculo C (A – B) x 100 D = Donde: C= A= B= D= contenido de cenizas, en g/100g de muestra. masa de la cápsula con las cenizas, en g. masa de la cápsula, en g. masa de la muestra húmeda, en g. 2.3.2.3. Determinación de sustancias extraíbles en n-hexano Si bien otras normativas denominan este requisito como ceras, el método aplicado determina otras sustancias extraíbles en n-hexano distintas de las ceras. Fundamento teórico Determinación de sustancias extraíbles en n-hexano por un análisis gravimétrico, sobre el residuo obtenido mediante una extracción con n-hexano, en un equipo Soxhlet, durante el tiempo necesario para extracción total, comprobable, de la cera, posterior destilación del n-hexano, secado de las sustancial extraíbles en estufa a 105°C y obtención de peso constante de las sustancias extraíbles. Equipos y materiales - Equipo para extracción (Soxlhet). - Equipo de destilación. - Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80°C. - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones n-hexano, grado p.a., Merck, Artículo: 1043672500. Procedimiento - Pesar aproximadamente 2 g de la muestra al 0,1 mg, colocar en un cartucho de celulosa seco, o bien envolver en un papel de filtro seco, ambos previamente tarados, y colocar en el cuerpo de un extractor de Soxlhet. - Tarar el balón del extractor de Soxlhet, previamente secado en estufa a 80°C. - Colocar en él, un volumen adecuado de n-hexano, (aproximadamente una vez y media el volumen del sifón), conectar al extractor y comenzar a calentar hasta que el solvente entre en ebullición. - Mantener en esas condiciones durante 6 h, a una velocidad de aproximadamente 120 gotas a 150 gotas de condensado por minuto. - Sacar el remanente de la muestra del extractor, secar y reservar para las determinaciones de resinas solubles en etanol e impurezas mecánicas (según 2.3.2.4. y 2.3.2.5. respectivamente). En el balón queda la cera disuelta en nhexano. - Evaporar el solvente por destilación. Después de evaporado el n-hexano, colocar el balón en la estufa de 80°C por lo menos 30 min. - Colocar el balón en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg. Expresión de cálculo SE (A – B) x 100 M = Donde: SE = A = B = M = contenido de sustancias extraíbles en n-hexano, en g/100g de muestra. masa del balón con sustancias extraíbles, en g. masa del balón vacío, en g. masa de la muestra, en g. 2.3.2.4. Determinación de resinas solubles en etanol Fundamento teórico Determinación de resinas en propóleos, por gravimetría del residuo obtenido mediante una extracción con alcohol etílico 95°, en un equipo Soxhlet, con posterior destilación del alcohol ,secado de la resina en estufa a 80°C y obtención de peso constante. Las resinas representan la fracción útil del propóleos. Equipos y materiales - Equipo para extracción (Soxlhet). - Equipo de destilación. - Cartuchos de celulosa o papel de filtro, secados en estufa a 80°C. - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., artículo Nº1010080000, lote: 611902640. - Tricloruro de fierro, grado p.a., Scharlau, lote: Hi0336 - Solución de FeCl3 al 10% (P/v): pesar 10 g de FeCl3 p.a., transvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, disolver y aforar con agua destilada. Procedimiento - Colocar el remanente de cada una de las muestras, resultantes de la extracción de sustancias extraíbles (según 2.3.2.3), en el cuerpo de un extractor Soxlhet. - Colocar en el balón del extractor Soxlhet un volumen adecuado de alcohol etílico 95º, armar el equipo para la extracción y comenzar a calentar hasta que el solvente entre en ebullición. Mantener en esas condiciones durante 6 h como mínimo, a una velocidad de aproximadamente 120 gotas a 150 gotas de condensado por minuto. - Continuar la extracción, hasta que el líquido en contacto con la muestra se encuentre incoloro. El punto final de la extracción se controla agregando una gota de este alcohol, a un tubo de ensayo que contenga una solución de FeCl 3 al 10% (P/v). - Si el color de la solución cambia de amarillento a verdoso, ello indica la presencia de sustancias fenólicas y por lo tanto es necesario continuar con la extracción. En caso contrario se da por finalizada la extracción. - Transvasar cuantitativamente el contenido del balón a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con alcohol etílico 95º. Tomar una alícuota de 50 ml y colocar en un balón de destilación previamente pesado. Eliminar completamente el alcohol etílico mediante el equipo de destilación. - Coloca en un frasco color ámbar, con tapa y con capacidad adecuada, el volumen restante (50 ml), reservar para la determinación de fenoles totales, flavonoides y espectro de absorción UV (según 2.3.2.7., 2.3.2.6. y 2.3.2.9., respectivamente). - Sacar del extractor el remanente de la muestra y reservar para la determinación de impurezas mecánicas (según 2.3.2.5.). - Las resinas quedan en el balón de destilación, el cual se coloca en una estufa a 80°C, para evaporar los restos de alcohol etílico 95º. Después de evaporado el alcohol, retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg. Expresión de cálculo  ml , Aforo  [ A − B] ×   ×100  ml , Alícuota  R= M Donde: R= A= B= M= Aforo = contenido de resinas, en g/100g de muestra. masa del balón con resinas, en g. masa del balón vacío, en g. masa de la muestra, en g. volumen al cual se diluye el extracto etílico total de resinas, en ml. Alícuota = volumen tomado para evaporar el alcohol etílico, en ml. 2.3.2.5. Determinación de impurezas mecánicas La impureza mecánica es todo resto de madera, metales, mallas, hilos, insectos y materiales que pudieran encontrarse en el propóleos en bruto[8]. Fundamento teórico Determinación de impurezas mecánicas por gravimetría del residuo insoluble que queda en el cartucho del Soxhlet luego de la determinación de resinas según 2.3.2.4, empleando alcohol etílico 95°, posterior secado del cartucho en estufa a 105°C y obtención de peso constante. Equipos y materiales Material usual de laboratorio. Procedimiento - Secar en la estufa a 80°C los remanentes de cada una de las muestras provenientes de la determinación de resinas, según 2.3.2.4. (en cartucho o encerrada en papel). - Retirar de la estufa, colocar en un desecador hasta temperatura ambiente y pesar. - Repetir el último procedimiento hasta lograr peso constante, lo cual se verifica cuando dos pesadas sucesivas no difieren entre sí en más de 5 mg. Expresión de cálculo IM (A – B) x 100 M = Donde: IM = A= B= M= contenido de impurezas mecánicas, en g/100g de muestra. masa del cartucho o papel filtro con el remanente, en g. masa del cartucho o papel filtro, en g. masa de la muestra, en g. 2.3.2.6. Determinación de compuestos fenólicos totales El método empleado permite cuantificar los compuestos fenólicos totales presentes en el propóleos, y se expresan como equivalentes de ácido gálico. Se basa en la reacción de oxidación de los fenoles, por acción del reactivo fosfotúngstico, y la aparición de una coloración azul por la reducción del reactivo a óxidos azules de tungstenos y molibdenos. Fundamento teórico Determinación de compuestos fenólicos totales por espectrofotometría, con el reactivo de Folin-Ciocalteu, trabajando a 765 nm sobre los extractos alcohólicos obtenidos según 2.3.2.4, y empleando ácido gálico como patrón. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Espectrofotómetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. - Baño de agua que opere a una temperatura de 50ºC. Reactivos y soluciones - Ácido gálico monohidratado, grado p.a., Sigma, lote: WE8343. - Solución patrón de ácido gálico de 0,5 mg/ml (500ppm): Disolver 0,05 g de ácido gálico p.a. en agua destilada y llevar a un matraz aforado de 100ml. Mantener la solución refrigerada a 4ºC y utilizar después de 48 h de haberla preparado. - Alcohol etílico al 10% (V/v): tomar 10 ml de alcohol etílico p.a. y llevar a un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua destilada. - Reactivo de Folin-Ciocalteu, Merck, lote: 80300769, artículo: 1.09001.0100. Nota: el reactivo de Folin-Ciocalteu se puede preparar a partir de los siguientes componentes: • 100 g de wolframato de sodio hidratado p.a. • 25 g de molibdato de sodio hidratado • 50 ml de ácido fosfórico de 85 ml/100 ml p.a. • 100 ml de ácido clorhídrico de 36 ml/100 ml p.a. • 150 g de sulfato de litio hidratado. • Bromo (ampollas). Mezclar los reactivos mencionados dentro de un balón de 1000 ml y se calienta a reflujo suave, durante 10 h. Dejar enfriar, y luego se lava el condensador con 50 ml de agua destilada, la que se escurre sobre el balón. Añadir 150 g de sulfato de litio hidratado y una o dos gotas de bromo. Llevar a ebullición, sin el condensador, dentro de una campana de extracción de gases, hasta que la solución quede libre de bromo (lo que se evidencia porque el color verde se torna amarillo brillante). - Carbonato de sodio anhidro, grado p.a., Merck, artículo: 1.06392.1000, lote: A968192823 - Solución de carbonato de sodio 1,5 N: Disolver 159 g de carbonato de sodio anhidro p.a. en 700 ml de agua destilada caliente, enfríar traspasar cuantitativamente a un matraz aforado de 1000 ml y completar con agua destilada. Procedimiento - Tomar una alícuota de 5 ml de cada uno de los extractos alcohólicos obtenidos en la determinación de resinas (según 2.3.2.4.) y colocar en un matraz aforado de 100 ml. completar con agua destilada y agitar. - Tomar una alícuota de 1 ml de la solución anterior y colocar en un matraz aforado de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de FolinCiocalteu, agitar suavemente y dejar reposar durante 2 min. - Añadir 4 ml de la solución de carbonato de sodio y completar el volumen con agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un baño de agua a 50°C durante 5 min, y enfríar hasta temperatura ambiente. - Homogeneizar el contenido de los matraces antes de efectuar la medición. - Colocar la solución en una cubeta de vidrio y leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en lugar de la muestra. - Con el valor de absorbancia obtenido interpolar en la curva de calibración. Preparación de la curva de calibración - Tomar alícuotas de 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml y 25 ml de la solución patrón de acido gálico y colocar en matraces aforados de 25 ml. Completar el volumen con una solución de alcohol etílico al 10% (V/v). Las diluciones así preparadas contendrán 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,4 mg/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente, de ácido gálico. - Tomar 1 ml de cada una de las soluciones patrón diluidas y colocar en matraces aforados de 25 ml, agregar 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de FolinCiocalteu, agitar suavemente y dejar en reposo durante 2 min. - Añadir 4 ml de la solución de carbonato de sodio y completar el volumen con agua destilada, sin agitar. Finalmente, calentar en un baño de agua a 50°C durante 5 min y enfríar hasta temperatura ambiente. - Colocar las soluciones en cubetas de vidrio y leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas condiciones conteniendo los reactivos, y utilizando 1 ml de agua destilada en lugar de la solución patrón diluida (stock). - Las diluciones así preparadas contendrán 0 mg/ml (blanco); 0,004 mg/ml; 0,008 mg/ml; 0,012 mg/ml; 0,016 mg/ml y 0,020 mg/ml, respectivamente, de ácido gálico. Expresión de cálculo Tener en cuenta que el extracto alcohólico (normalmente de 100 ml) se obtuvo a partir de 50 ml del extracto alcohólico provenientes de la determinación de resinas al procesar la muestra. FE (ABS – a) x 5000 b M = Donde: FE = contenido de fenoles totales, expresado como su equivalente en ácido gálico, en g/100g de muestra. ABS = absorbancia leída a 765 nm en la muestra. b= a= M= pendiente de la recta obtenida en la curva de calibración. intercepto de la recta obtenido en la curva de calibración. masa de la muestra utilizada en la determinación de sustancias extraíbles en nhexano, en g. 5000 = factor de dilución para expresar la concentración, en g/100g de muestra. 2.3.2.7. Determinación de flavonoides totales Las flavonas y flavonoles, desde el punto de vista reactivo, forman complejos estables con el tricloruro de aluminio y son susceptibles de analizar mediante espectrofotometría UV- visible. Fundamento teórico Determinación de flavonoides totales por espectrofotometría del complejo flavonoides-AlCl3, de color amarillo formados específicos para flavonas y flavanoles (3,5-hidroxiflavonas y 3,5-hidroxiflavonoles) en medio metanólico, a 425 nm, sobre los extractos alcohólicos obtenidos en la determinación de resinas (según 2.3.2.4), empleando quercetina dihidratada como patrón. Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Espectrofotómetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. Reactivos y soluciones Observación: Debido a la peligrosidad de los reactivos utilizados en esta técnica se debe utilizar propipeta en todas las mediciones de volumen. - Quercetina dihidratada, grado HPLC, 99,0% de pureza, Calbiochem, lote: D00047624, artículo: 551600. - Solución stock de quercetina de 1 mg/ml: Disolver 100 mg de quercetina dihidratada en 100 ml de metanol. Conservar en la oscuridad y refrigerada. - Solución patrón de quercetina de 100 μg/ml (100ppm): Tomar 10 ml de la solución stock y disolver en matraz aforado de 100 ml con metanol. Se debe conservar en la oscuridad y refrigerada. - Alcohol metílico, grado HPLC, J. T. Baker, lote: B38E2. - Solución de tricloruro de aluminio al 5% (P/v): Pesar 10g de tricloruro de aluminio p.a. y disolver en 200 ml de metanol. Observación: trabajar bajo campana con mucho cuidado, empleando guantes, ya que el tricloruro de aluminio es muy corrosivo e higroscópico. Procedimiento - A partir de los extractos alcohólicos obtenidos en la determinación de resinas (según 2.3.2.4), pipetear 0,1 ml de cada uno de ellos en sendos matraces de 25 ml, agregar 0,5 ml de solución de tricloruro de aluminio y aforar con alcohol metílico. - Preparar un blanco con 0,1 ml de alcohol etílico y 0,5 ml de solución de tricloruro de aluminio, y aforar con alcohol metílico en un matraz aforado de 25 ml. - Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, colocar en una cubeta de vidrio y leer la absorbancia a 425 nm. Si la absorbancia es mayor que 0,400 repetir la determinación tomando un volumen menor de extracto alcohólico. Del mismo modo, si se obtiene una lectura muy baja, aumentar el volumen de dicho extracto Preparación de la curva de calibración - Para realizar la curva de calibración: preparar soluciones de 2 μg/ml, 4 μg/ml, 6 μg/ml, 8 μg/ml y 10 μg/ml de quercetina, respectivamente. - En sendos matraces aforados de 25,0 ml pipetear 0,0 ml; 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml y 2,5 ml de la solución patrón de quercetina. Agregar 0,5 ml de la solución de tricloruro de aluminio a cada una de ellas y al blanco. Aforar a 25 ml con alcohol metílico. - Dejar los matraces 30 min en la oscuridad, y leer las absorbancias a 425 nm. Expresión de cálculo Tener en cuenta que el extracto alcohólico (normalmente de 100 ml) se obtuvo a partir de 50 ml de cada uno de los extractos alcohólicos provenientes de la determinación de resinas al procesar la muestra. FlT (ABS – a) x 2,5 b M = Donde: FlT = contenido de flavonoides totales de propóleos, expresado como su equivalente en quercetina dihidratada, en g/100 g. ABS = absorbancia leída a 425 nm en la muestra. b= a= M= 2,5 = pendiente de la recta obtenida en la curva de calibración. intercepto de la recta obtenido en la curva de calibración. masa de la muestra utilizada en la determinación de sustancias extraíbles en n-hexano, en g. factor de dilución para expresar la concentración, en g/100 g. 2.3.2.8. Determinación del índice de oxidación (según norma Argentina) Fundamento teórico Determinación del índice de oxidación, en segundos, midiendo el tiempo de decoloración de 0,05 ml de KMnO4 0,1000N. Agregado a 2 ml de una suspensión acuosa de propóleos (obtenida mediante una extracción de 0,2 g de propóleos con 5 ml de alcohol etílico al 95º durante 1 hora, con posterior agregado de 100 ml de agua destilada y filtrado), y 1ml de solución de H2SO4 al 20 % (V/v). Se basa en el poder oxidante del KMnO4, sobre compuestos fenólicos del propóleos (fenoles y compuestos insaturados). Equipos y materiales - Material usual de laboratorio. - Cronómetro. Reactivos y soluciones - H2SO4 al 20% (V/v). - Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., artículo Nº1010080000, lote: 61190257213. - KMnO4 0,1000 N: disolver 3,16 g de KMnO4 con 1L de agua destilada y mantener a ebullición suave por aproximadamente 30 min. Dejar reposar por 24 h protegido de la luz, filtrar a través de filtro Gooch G4 y guardar en botella ámbar. Estandarizar con Na2C2O4 0,1000 N (previamente seco a 110ºC por 2 h). Procedimiento - Pesar 0,2 g de la muestra de propóleos y colocar en un Erlenmeyer de 125 ml, añadir 5 ml de alcohol etílico 95º y dejar en reposo durante 1 h. - Agregar 100 ml de agua destilada, agitar, filtrar a través de un papel de filtro y recoge el filtrado en un vaso precipitado. - Colocar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo, añadir 1 ml de solución de H2SO4 al 20% (V/v) y agitar durante 1 min. Finalmente, agregar en el tubo 0,05 ml (1 gota) de la solución de permanganato de potasio 0,1000 N. - Poner en marcha el cronómetro en el preciso momento en que la gota entra en contacto con la solución acidulada de propóleos, agitando constantemente. La gota debe caer directamente sobre la solución y no sobre las paredes del tubo. - Registra el tiempo, en segundos, que la solución tarda en decolorarse. Expresión de cálculo El tiempo en que desaparece el color rosado de la solución, corresponde al índice de oxidación que esta dado en segundos. 2.3.2.9. Determinación del espectro de absorción UV- visible Dada la naturaleza aromática, los compuestos fenólicos importante para su identificación. Fundamento teórico Determinar el espectro de absorción UV- visible del extracto alcohólico obtenido en la determinación de resinas, para comprobar la presencia de compuestos fenólicos al registra un máximo de absorbancia entre 270 nm y 315 nm. Equipos y materiales - Espectrofotómetro UV-visible Secoman, modelo Anthelie light. Rango: 199900 nm. - Cubetas de cuarzo, de 1cm de paso óptico, para trabajar en la región UV del espectro. - Material usual de laboratorio. Reactivos y soluciones - Alcohol etílico 95º, Oxiquim S.A., artículo Nº1010080000, lote: 611902640. muestran intensa absorción en la región UV del espectro, siendo éste método espectral especialmente Procedimiento - A partir del extracto alcohólico obtenido en la determinación de resinas (según 2.3.2.4), efectuar una dilución de 1 en 1000 con alcohol etílico. - Realizar un barrido completo de longitudes de onda desde 240 nm hasta 420 nm. - Graficar los valores de absorbancia medidos en función de la longitud de onda de la radiación. Expresión de cálculo La presencia de compuestos fenólicos resulta positiva si se registra un máximo de absorbancia entre 270 nm y 315 nm. CAPÍTULO 3: RESULTADOS 3. RESULTADOS 3.1. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS El análisis sensorial de las características organolépticas, permitió establecer los atributos óptimos para la muestra de propóleos analizado. Tabla 3-1. Características organolépticas del propóleos analizado Característica organoléptica Color Aspecto externo Sabor Estructura Olor Consistencia a temperatura ambiente Impurezas visibles Resultado Marrón verdoso Trozos irregulares con brillo Amargo Heterogéneo Resinoso aromático Poco blando Virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas 3.2. RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS 3.2.1. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Rusa Tabla 3-2. Resultados de la determinación del porcentaje de cera Media aritmética 38,34 Desviación estándar ±2,10 Análisis 1 2 3 % Cera 39,36 39,73 35,92 Valor aceptado No más del 30 % Tabla 3-3. Resultados de la determinación del porcentaje de impurezas mecánicas %Impurezas mecánicas 35,90 37,71 35,10 Media aritmética 36,24 Desviación estándar ±1,34 Valor aceptado No más del 20 % Análisis 1 2 3 Tabla 3-4. Resultados de la determinación de los compuestos fenólicos %Compuestos fenólicos 8,09 7,62 10,17 Media aritmética 8,62 Desviación estándar ±1,36 Valor aceptado No menos de 30 % Análisis 1 2 3 Tabla 3-5. Resultados de la determinación del índice de oxidación (según norma Rusa) Índice de oxidación(s) 9,05 7,80 7,91 Media aritmética 8,25 Desviación estándar ±0,69 Valor aceptado No mayor de 22 s Análisis 1 2 3 Tabla 3-6. Resultados de la determinación cualitativa de los compuestos flavonoides Análisis 1 2 3 Compuestos flavonoides + + + Resultado aceptado + Tabla 3-7. Resultados de la determinación del índice de yodo g de I2/100g de propóleos 60,56 63.09 62,06 Media aritmética 61,90 Desviación estándar ±1,27 Valor aceptado No menos de 35 g de I2/100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-8. Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Rusa Características fisicoquímicas (*) %Cera Índice de oxidación( s) (*) %impurezas mecánica (*)%Compuestos fenólicos Compuestos flavonoides (*)Índice de yodo(gI2 /100g de muestra) Resultado 38,34 ± 2,10 8,25 ± 0,69 36,24 ± 1,34 8,62 ± 1,36 + 61,90 ± 1,27 Valor aceptado No más del 30 % No mayor de 22 s No más del 20 % No menos de 30 % + No menos de 35 gI2/100g (*) = resultado expresado en la media aritmética y la desviación estándar. 3.2.2. Resultados de los análisis fisicoquímicos, realizados según norma Argentina Tabla 3-9. Resultados de la pérdida por calentamiento g /100g de propóleos 2,51 2,06 2,22 Media aritmética 2,26 Desviación estándar ±0,23 Valor aceptado Máximo 10,0g/100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-10. Resultados de la determinación de cenizas g /100g de propóleos 1,66 1,36 1,51 Media aritmética 1,51 Desviación estándar ±0,15 Valor aceptado Máximo 5,0g /100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-11. Resultados de la determinación de sustancias extraíbles en n-hexano g /100g de propóleos 22,60 28,47 26,03 Media aritmética 25,7 Desviación estándar ±2,95 Valor aceptado Máximo 35,0g /100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-12. Resultados de la determinación de resinas solubles en etanol g /100g de propóleos 49,67 48,13 46,24 Media aritmética 48,01 Desviación estándar ±1,72 Valor aceptado Mínimo 35,0g /100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-13. Resultados de la determinación de impurezas mecánicas Análisis 1 2 3 g /100g de propóleos 10,38 9,95 11,08 Media aritmética 10,47 Desviación estándar ±0,57 Valor aceptado Máximo 25,0g /100g Tabla 3-14. Resultados de la determinación de compuestos fenólicos totales g /100g de propóleos 10,35 9,84 9,96 Media aritmética 10,05 Desviación estándar ±0,27 Valor aceptado Mínimo 5,0g /100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-15. Resultados de la determinación de flavonoides totales g /100g de propóleos 2,75 2,77 2,75 Media aritmética 2,76 Desviación estándar ±0,01 Valor aceptado Mínimo 1,0g /100g Análisis 1 2 3 Tabla 3-16. Resultados de la determinación del índice de oxidación ( según norma Argentina) Índice de oxidación (s) 7,83 7,62 7,56 Media aritmética 7,67 Desviación estándar ±0,14 Valor aceptado Máx. 22s Análisis 1 2 3 Tabla 3-17. Resultados determinación del espectro de absorción UV-visible Máximo de absorbancia 290nm 300nm Media aritmética 293,93 Desviación estándar ±5,77 Valor aceptado (Máx. de absorbancia) entre 270-315nm Análisis 1 2 3 290nm Tabla 3-18.Características fisicoquímicas del propóleos analizado, según norma Argentina Características fisicoquímicas (*)Pérdida por calentamiento (*)Cenizas (*)Sustancias extraíbles en n-hexano (*)Resinas solubles en etanol (*) Impurezas mecánicas (*)Compuestos fenólicos totales (*)Flavonoides totales Índice de oxidación(s) Espectro de absorción UV- visible(nm) Resultado 2,26 ± 0,23 1,51 ± 0,15 25,7 ± 2,95 48,01 ± 1,72 10,47 ± 0,57 10,05 ± 0,27 2,76 ± 0,01 7,67±0,14 293,93 ± 5,77 Valor aceptado Máximo 10,0g/100g Máximo 5,0g /100g Máximo35,0g/100g Mínimo 35,0g/100g Máximo 25,0g/100g Mínimo 5,0g/100g Mínimo1,0g/100g Máximo 22s Máx. de absorbancia entre 270-315nm (*) = resultado expresado en g/100g de propóleos. DISCUSIÓN Con respecto a las características organolépticas del propóleos analizado (tabla 3-1), determinadas por un grupo de diez apicultores semientrenados a través de un “análisis descriptivo de categorización cuantitativa relativa”, utilizando el protocolo de la UNSE-INTA (anexo B); el color marrón verdoso que presenta el propóleos, se debe al tipo de vegetación existentes en cercanía del apiario y la flora predomínate en la zona. El aspecto externo (trozos irregulares con brillo) y estructura (heterogénea) no difieren en forma significativa con otros propóleos nacionales e internacionales, que se presentan en trozos irregulares, el brillo se debe a la cera de abeja presente en el propóleos. Su heterogeneidad se debe a que el propóleos es una mezcla compleja que se vuelve más heterogénea utilizando el método de recolección de raspado. El olor del propóleos (muy aromático), demuestra que el propóleos es un producto natural aromático, a pesar de su baja concentración en aceites esenciales [3]. El sabor que presenta el propóleos (amargo) es atribuido a las resinas y algunos compuestos químicos presentes en el propóleos. La consistencia a Tº ambiente del propóleos (poco blando a los 20ºC) tiene directa relación con características geográficas y climáticas de la zona de la cual se tomó la muestra, ya que Casablanca se caracteriza por ser un valle prelitoral que presenta un clima más bien frío, neblinas matinales y una amplitud térmica entre el día y la noche. La temperatura media del verano es de 25°C y la anual es de 14,4°C, los meses amenazantes con heladas son Agosto y Octubre, de Noviembre (mes de recolección del propóleos) a Abril se considera más bien seco. En cuanto a las impurezas visibles presentes en el propóleos (virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas) principalmente se debe al método de recolección utilizado. Según los resultados de los análisis realizados a través de la norma Rusa (tabla 3-8), el propóleos presenta un índice de oxidación de 8,25 ± 0,69 s, atribuido a los compuestos fenólicos presentes en el propóleos, este resultado depende de la subjetivada y criterio analítico por parte del analista, ya que se estima el tiempo en que desaparece el color rosado de la solución, cumpliendo con el valor exigido en la norma; un índice de yodo de 61,90 ± 1,27 gI2/100g de muestra, representando el grado de insaturación de las grasas o ácidos grasos presentes en el propóleos, cumpliendo con el valor exigido en la norma; a demás presenta reacción positiva ante la presencia de compuestos fenólicos, cumpliendo con los parámetros de calidad exigidos para estos análisis; no así el porcentaje de impurezas mecánicas obtenido (36,24 ± 1,34%), el porcentaje de cera (38,34 ± 2,10%) y porcentaje de compuestos fenólicos (8,62 ± 1,36%). El no cumplimiento de estos parámetros de calidad se debe al método de raspado utilizado para la recolección del propóleos, lo que determinó la incorporación al producto de distintos tipos de impurezas: astillas de madera, cera, partes de abejas, restos de pinturas, etc. que en algunos casos se pueden separar del propóleos y en otros casos quedan incorporadas, disminuyendo la calidad del mismo. Los resultados obtenidos a través de las metodologías estipuladas en la norma Rusa, pueden estar condicionados por una serie de factores analíticos, como la falta de experiencia por parte del analista en el desarrollo de estos análisis; perdidas de muestras en el desarrollo de los análisis, etc. Ya que la mayoría de las determinaciones se realizaron a través de análisis gravimétricos. De acuerdo a los resultados obtenidos de los análisis fisicoquímicos realizados al propóleos, según la norma Argentina (tabla 3-18) el propóleos presenta un 2,26 ± 0,23% de pérdida por calentamiento; 1,51 ± 0,15% de cenizas, que representa la materia inorgánica presente en el propóleos; 25,7 ± 2,95% de sustancias extraíbles en n-hexano, obteniéndose un menor porcentaje con respecto al porcentaje de cera obtenido según la norma Rusa, ya que las metodologías analíticas utilizadas son distintas; 48,01 ± 1,72% de resinas solubles en etanol, representando la fracción útil del propóleos; 10,47 ± 0,57% de impurezas mecánica, obteniéndose un porcentaje menor en comparación al obtenido a través de la norma Rusa, ya que la metodología analítica utilizada es distinta; 10,05 ± 0,27% de compuestos fenólicos totales, expresado como su equivalente en ácido gálico, que le otorgan las propiedades biológicas al propóleos; 2,76 ± 0,01% de flavonoides totales, expresado como su equivalente en quercetina dihidratada, este análisis junto con la determinación de fenoles totales constituyen las determinaciones más importantes ya que los flavonoides junto a los fenoles le otorgan al propóleos sus propiedades biológicas y terapéuticas. Según los resultados de ambos análisis (determinación de compuestos fenólicos y flavonoides totales), el propóleos en estudio cumple satisfactoriamente con los parámetros de calidad exigidos en la norma, otorgándole al propóleos grandes posibilidades de comercialización a nivel nacional e internacional. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Después de llevar acabo los análisis organolépticos y fisicoquímicos, realizados al propóleos, en el Laboratorio de Química de la Universidad Técnica Federico Santa María, Sede Viña del Mar, José Miguel Carrera, se puede llegar a las siguientes conclusiones: El propóleos recolectado de localidad de Tapihue, Casablanca, Quinta Región de Chile, presenta un aspecto de trozos irregulares con brillo, una estructura heterogénea, un color marrón verdoso, un olor resinoso aromático, un sabor amargo, con una consistencia poco blanda a temperatura ambiente (20ºC). Además de presentar virutas de madera, restos de pintura y partes de abejas. De acuerdo a la norma Rusa RST-RSFSR-317-77 que establece e identifica los requisitos organolépticos y fisicoquímicos mínimos exigidos, que debe cumplir el propóleos para ser utilizado como materia prima en el desarrollo de productos relacionados; los resultados de las características organolépticas se sitúan dentro de los parámetros de calidad exigidos por la norma mencionada. Los resultados de las propiedades fisicoquímicas, generalmente se sitúan dentro de los parámetros de calidad exigidos, a excepción del porcentaje de cera, impurezas mecánicas y compuestos fenólicos, ya que los valores de calidad exigidos en estos análisis son muy elevados en comparación con la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008. Según la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, los resultados de las propiedades organolépticas y fisicoquímicas se sitúan dentro de los parámetros de calidad exigidos por la norma mencionada, sin excepción alguna, superando en todos los casos los valores de calidad mínimos exigidos, por tanto el propóleos cumple con los parámetros de calidad estipulados en esta norma internacional, y puede ser utilizado a nivel industrial y competir en el mercado externo. Se puede concluir que realizando una adecuada recolección del propóleos a través del método de raspado, utilizando una espátula de acero inoxidable, es posible obtener propóleos que cumplan satisfactoriamente con los requisitos de calidad mínimos exigidos por la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, a pesar de que en algunos casos no se pueden separar las impurezas mecánicas del propóleos, disminuyendo la calidad del mismo. Recomendaciones: Para analizar organolépticamente el propóleos se recomienda utilizar el protocolo de la UNSE-INTA, de la Argentina, ya que los descriptores organolépticos estipulados en este protocolo, permiten una buena y completa caracterización organoléptica del propóleos, a través de análisis sensoriales. Se recomienda analizar y caracterizar fisicoquímicamente el propóleos por la norma Argentina IRAM-INTA-15935-1:2008, ya que al comparar esta con la norma Rusa, esta permite una mayor cuantificación de los compuestos químicos presentes en el propóleos; las técnicas y métodos analíticos empleados en esta norma, son mas actualizados que los empleados en la norma Rusa RST-RSFSR-317-77, y permiten la cuantificación más precisa de los compuestos químicos del propóleos (compuestos fenólicos, flavonoides, resinas totales, sustancias extraíbles en n-hexano, etc.) que son muy importantes para determinar su calidad . Se considera conveniente el uso de mallas en la colmena para la recolección de propóleos, ya que no solamente se evita la incorporación de impurezas por raspado, sino también se obtiene un producto con mayor cantidad de resinas totales y compuestos fenólicos, y menor cantidad de cera, proporcionándole una mayor calidad al propóleos recolectado. Este producto apícola está incrementando su demanda externa es por ello que se debe mejorar las prácticas apícolas llevadas a cabo en Chile, tanto para su recolección, almacenamiento y transporte; para contar con un producto de buena calidad que pueda competir a nivel internacional y al que pueda asignársele un valor agregado . BIBLIOGRAFÍA 1. ASTUDILLO, Luis. Biologically active compounds from chilean propolis. Boletín de la Sociedad Chilena de Química. 2000; vol. 45, p 577. 2. BEDASCARRASBURE, Enrique. 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[consulta 26 de agosto del 2008].Disponible en: <http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasCientificas/ZootecniaTropical/zt2502/arti/ salamanca.htm> ANEXOS ANEXO A: FOTOGRAFÍAS EXPERIMENTALES Apiario seleccionado: localidad de Tapihue, Casablanca Quinta Región de Chile Recolección del propóleos, por el método de raspado Muestra de propóleos recolectado ANEXO B: PROTOCOLO DE LA UNSE-INTA RECEPCIÓN DE MUESTRAS PROPÓLEOS EN BRUTO Número Identificación Peso Remitente Observaciones Fecha Origen Recolección g CARACTERIZACIÓN ORGANOLÉPTICA Aspecto externo Polvo Granulado Masa irregular con brillo Masa irregular opaca Trozos irregulares opacos Trozo irregulares con brillo Estructura Homogénea Heterogénea Consistencia a T° ambiente Muy blando Blando Poco blando Color Duro Negro Marrón Sabor Marrón oscuro Insípido Marrón claro Dulce Verde oscuro Salado Verde Amargo Verde claro Picante Gris Amarillo Olor Tintes castaños Inodoro Tintes rojizos Levemente Reinoso Tintes naranjas Resinoso Marrón verdosoResinoso aromático Verde amarillento Resinoso muy aromático Tintes castaño rojizo Tintes castaño naranja Marrón amarillento Amarillo verdoso Marrón verdoso amarillento ANEXO C: DETERMINACIÓN DE LOS ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS Tabla C-1. Determinación del color Color Negro Marron(, Marron oscuro Marron claro Verde oscuro 1 2 3 4 Analista 5 6 7 8 9 10 % 0 0 0 0 0 Verde Verde claro Gris Amarillo Tintes castaños Tintes rojizos Tintes naranjas Marrón verdoso Verde amarillento Tintes castaño rojizo Tintes castaño naranja Marrón amarillento Amarillo verdoso Marrón verdoso Amarillento X X X X X X X X X X 0 0 0 0 40 0 0 60 0 0 0 0 0 0 Tabla C-2. Determinación del sabor Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Insípido Dulce Salado Amargo X X X X X X X X 20 0 0 X 80 0 Picante X Tabla C-3. Determinación del aspecto externo Masa irregular con brillo Analista Polvo Granulado Masa irregular opaca Trozos irregulares opacos Trozo irregulares con brillo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X X X X X X X X X X % 0 0 0 0 20 80 Tabla C-4. Determinación de la estructura Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Homogénea Heterogénea X X X X X X X X X X 100 0 Tabla C-5. Determinación del olor Resinoso muy aromático Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Inodoro Levemente resinoso Resinoso X Resinoso aromático X X X X X X X X 0 0 10 70 X 20 Tabla C-6. Determinación del sabor Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Insípido Dulce Salado Amargo X X X X X X X X 20 0 0 X 80 0 Picante X Tabla C-7. Determinación de la consistencia a temperatura ambiente Muy blando Poco blando X X X X X X X X X 80 Analista 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 % Blando Duro X 0 10 10 ANEXO D: GRÁFICOS PARA CURVAS DE CALIBRACIÓN Ecuación de regresión lineal fenoles totales y = bx + a Donde: a = -0,018 b = 115,9 r = 0,9990 y = 115,9x + (-0,018) Curva de calibrado ajustada fenoles 2,50 2,00 absorbancia 1,50 1,00 0,50 0,00 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 Concentración (mg/ml) Gráfico D-1. Absorbancia v/s concentración (mg/ml) de fenoles Ecuación de regresión lineal flavonoides totales y = bx + a Donde: a = -0,0014 b = 0,0790 r = 0,9997 y = 0,0790x + (-0,0014) Curva de calibrado flavonoides 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0,00 Absorbancia 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 Concentración (ppm) Gráfico D-2. Absorbancia v/s concentración (ppm) de flavonoides