TITULOObtención del colorante de la semilla de achiote (Bixa orellana) utilizando microorganismos celulolíticos Achiote (Bixa orellana) seeds colorant extraction using cellulolytic microorganisms Hernández González María1, Tirado Gallegos Juan Manuel1, Iliná Anna2, López Trujillo Ramiro1, Rebolloso Padilla Oscar Noé1, Ruelas Chacón Xóchitl1. Resumen El presente estudio se llevo a cabo con la finalidad de extraer el colorante bixina, presente en la semilla del achiote, ampliamente utilizado por la industria alimentaria, mediante un tratamiento que ofrezca además de buenos rendimientos, un producto libre de componentes tóxicos. El proceso se basa en el uso de microorganismos productores de celulasas, capaces de degradar la pared celular de las semillas donde se encuentra el pigmento para facilitar su liberación en un medio acuoso, obteniéndose rendimientos del 81%, mayores a los ofrecidos por extracción acuosa y ligeramente menores que los obtenidos con tratamiento ácido- base, cuestionados por la comunidad Europea, obteniéndose una pasta que muestra picos en el intervalo de los 1600 cm- 1 representativo de los grupos carbonilos característicos de la estructura de la bixina. Palabras clave: Bixina, achiote, microorganismos celulolíticos. Abstract This assay was carried out to extract bixine, a colorant attached to achiote seeds, widely used in food industry, by a method which may offer besides good yields, a toxin free product. The process is based on the use of cellulolytic microorganisms able to degrade the seed’s cellular wall, where the pigment is attached, in order to facilitate the pigments liberation in a watery medium. 81% of the pigment was recovered, this percentage is higher than the one offered by the aqueous treatment and lower than the one offered by the acid-basic procedure, not well accepted by the European community. The final paste obtained showed peaks near to 1600 cm-1 representative of the carbonyl groups characteristic of the bixine structure. Key words: Bixine, achiote, cellulolytic microorganisms Introducción El color de los alimentos es un atributo que tiene mucho peso dentro del juicio del consumidor, este puede llegar a ser determinante para que un comestible sea aceptado o rechazado. (Badui, 1993). La industria alimentaria utiliza una serie de sustancias , mejor conocidas como aditivos; que tienen como función primordial impartir alguna coloración en particular o simplemente resaltar la que por la naturaleza tienen las materias primas o, en su caso, de los procesos tecnológicos en la coloración del producto final. 71 y la de bixina se realizó de acuerdo a las normas oficiales mexicanas. excepto las de celulosa. Todas las determinaciones se realizaron en base a los métodos establecidos por la AOAC en 1980. cárnica. fibra cruda. et al. condimentaría. En los últimos tiempos los colorantes sintéticos han sido cuestionados debido a sus efectos toxicológicos. Los aditivos que son utilizados como sustancias colorantes pueden ser ___________________________________________________ 1 Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. celulosa. Metodología experimental Se trabajó con semillas enteras de achiote procedentes del estado de Chiapas. 2003). 2001). sobre todo en los países desarrollados. cada uno presenta sus limitantes y ventajas. dando como resultado un extracto exento o con un mínimo de impurezas químicas. (1968). adquiridas en un mercado del municipio de Acala. etc. humedad. que disminuya los riesgos que implica al consumidor el uso de solventes o los tratamientos ácido – alcalinos. se debe buscar un método de extracción de fácil aplicación. Una vez efectuada la caracterización de la semilla se procedió a seleccionar e identificar y seleccionar cepas fúngicas con probada actividad celulolítica. Se evaluaron 7 cepas. se procede a la extracción de los pigmentos presentes en los tejidos vegetales o animales por medio de diferentes métodos. farmacéutica. Las semillas fueron mantenidas en envases plásticos y almacenados en condiciones de oscuridad. en función a la producción de celulasas. lignina y bixina. Las posibilidades de incrementar el rendimiento y la pureza del colorante obtenido del achiote siguen siendo tema de estudio. pero que tiene el inconveniente de que el producto final contiene al máximo 30 a 40% de pigmentos (Vázquez. que eleve el grado de rendimiento. esta compuesto en su mayoría por el carotenoide bixina. grasa. Para los objetivos de la investigación. es un colorante natural exento de certificación. cosmética. El colorante obtenido de las semillas de achiote (Bixa orellana). ello ha provocado que el uso de colorantes naturales vaya en aumento y sustituyendo a los sintéticos (Salas. 72 . lignina. Para abastecer la creciente demanda de colorantes naturales sin problemas de legislación. a consumir alimentos con un mínimo o nulo contenido de sustancias sintéticas. se procedió a realizar análisis de ceniza. inclusive algunos han sido eliminados de algunas legislaciones. las cuales fueron proporcionadas por la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Coahuila.. 2 Universidad Autónoma de Coahuila obtenidos por síntesis química en la industria (colorantes sintéticos) o provenir de fuentes naturales como los vegetales (colorantes o pigmentos naturales). que se utiliza en la industria láctica. y fibra que se hicieron de acuerdo a Vansoest. Lo anterior aunado a la tendencia que tienen los consumidores. La extracción más rudimentaria se basa en un lavado con agua en ebullición y a escala industrial se ha implementado un proceso de extracción alcalino que es de fácil aplicación. Después de 7 días de incubación a 28ºC se evaluó su actividad sobre la celulosa aplicando la técnica del rojo congo de acuerdo con los lineamientos propuestos por Iliná (2002). Resultados y discusión Los resultados arrojados por el análisis químico efectuado a la semilla muestran 1. hasta obtener la mayor cantidad de colorante posible.4% de bixina. Posteriormente se inoculó cada unidad experimental con un inóculo que contenía 2. 16. La caracterización de las cepas se realizó observando los microorganismos tanto macroscópica como microscópicamente.52% de grasa.1 g de KCl y 0.. esporulación y asimilación de nutrientes. 3 y 7 preparado de acuerdo a la técnica propuesta por Lynch et al (1987). fue sometido a un proceso final de evaporación en horno a una temperatura entre 60-65ºC hasta la eliminación completa de la humedad residual. se procedió a aplicar un análisis por espectroscopia infrarroja (IR) a los extractos obtenidos. de MgSO4.51% de cenizas y 4. de KH2PO4.1 g.000. 0.9% de fibra cruda.02 g.6 g. Todos los análisis fueron realizados de acuerdo a los lineamientos propuestos por Barnett et al. El material obtenido en las operaciones antes citadas. para determinar las condiciones que ofrecen una mayor liberación de colorante. prensado y filtrado. 9.74% de celulosa. 30º y 35 ºC. esto.61% de humedad. de semillas de achiote. 3. Una vez seleccionadas e identificadas las cepas fúngicas se procedió a establecer un proceso fermentativo aeróbico en medio acuoso. Terminado el proceso de biocatálisis. cada sistema fue esterilizado en autoclave. como única fuente de carbono en 200 ml de Buffer a pH de 5. (1987) y Romero (1993). esto se traduce en un elevado contenido de materia seca que se caracteriza por su alto contenido en fibras.000 de esporas/ml. Después del proceso de esterilización se recuperó el colorante mediante tratamientos en medio acuoso por calentamiento. A fin de determinar la pureza del extracto recuperado.0 g. los primeros se determinaron de acuerdo a los lineamientos propuestos por Dubois (1956) con fenol sulfúrico. La determinación del rendimiento se realizó por análisis gravimétrico. Se puede observar que el menor componente de la semilla utilizada en la presente investigación fue el agua. 0. 0. De esta etapa se logró seleccionar tres cepas para su posterior caracterización. 3.76% de lignina.05.. durante 144 hrs.1 g. el cual contenía 0. mediante análisis de morfología. para detener el crecimiento y actividad fúngica. y se mantuvo en baños María para el control de la temperatura a 25º. Durante este tiempo se monitoreó la formación de azúcares totales y reductores. los azúcares reductores se analizaron de acuerdo con Miller (1959). Los hongos fueron viabilizados en un medio líquido y posteriormente inoculados en placas de agar carboximelticelulosa (CMC). de K2SO4 y 2. mediante la preparación de la pastilla de KBr con la muestra del colorante en polvo y se analiza en un espectrofotómetro Perkin – Elmer. Los datos arrojados por el análisis gravimétrico fueron sometidos a un análisis de varianza factorial con p>0. 1. por lo cual la semilla pude 73 . de NaNO3. 05) CEPA PROMEDIOS DE MÍNIMOS CUADRADOS Cepa 7 A 3. la cepa 5 y la cepa 2 resultaron estadísticamente iguales.43 cm. ya que en el análisis estadístico fue la mejor.funcionar en el proceso de Biocatálisis como una fuente de carbono caracterizada por fibras que pueden ser desdobladas por complejos enzimáticos presentes en organismos como los hongos.05 cm. En la figura 1 se pueden observar los pesos de pasta de achiote obtenidos después de terminado el tiempo en cada tratamiento.91 cm.90 cm. Cuadro 1. presentando menor actividad que la cepa 7. fueron sometidos a un análisis de varianza con una p<0.05). pero mayor que el resto de las cepas. como las medias analizadas por la prueba de t-Student (p<0.05. El análisis de medias permite concluir que la cepa con mayor producción de celulasas es la cepa 7. Cepa 9 E 2.40 cm. Cepa 2 B C 3. ya que así se manifestó en el monitoreo de azúcares el cual mostraba constante formación y consumo de los mismos a diferencia de las demás interacciones. Las cepas 7 y 5 fueron identificadas como genero Aspergillus ssp. Cepa 5 B 3. Por otro lado. Cepa 8 C D 3. Los resultados obtenidos aplicando la técnica del rojo congo. y la 2 como una mezcla entre Aspergillus y Penicilium por lo cual solo las dos primeras fueron probadas en el proceso de biocatálisis. Finalmente fue posible establecer que las mejores condiciones para degradar la pared celular de la semilla del achiote fue la interacción presentada entre la cepa 7 a pH 7 y temperatura de 35ºC. esto con la finalidad de elegir con mayor seguridad cual o cuales microorganismo son los que más se adecuan a la investigación. para seleccionar la cepa con mayor actividad celulolítica. Resultados de rojo congo analizados mediante t-Student (p<0.23 cm.63 cm. Cepa 3 E 2. existiendo diferencia significativa con el resto. Cepa 4 D 2. Se observa que la cepa 7 ofrece los mayores rendimientos bajo todas las condiciones de trabajo.10 cm. Cepa 1 C D 3. Los resultados del análisis se reportan en el cuadro número 1. 74 . 4 g de bixina por 100 g de semilla como se citó anteriormente.51 80 m 'b' esporas 70 2927.24 50 1598.0 3000 2000 1500 1000 600.05 %T 60 3271. a las cuales se encuentra adherido el pigmento de interés.7 % de extracción ya que la semilla contiene 1.Figura 1. Conclusiones En los resultados obtenidos se observó que el mayor constituyente de de la semilla de achiote (Bixa orellana) son las fibras.13 g de bixina lo que representa el 80.12 1266.2 g de extracto colorante. representativo de los dobles enlaces presentes en las estructuras orgánicas. características de la bixina.88 90 879. De las cepas evaluadas. 105.10 25.2 100 715. De la misma manera que en el análisis de varianza. se observa que la interacción que ofrece el mayor rendimiento es cepa 7. así como un pico en el intervalo de los 1700 a 1880 cm-1 aproximadamente. presentando 1. la que presentó mayor actividad celulolítca. los cuales contienen 0.0 cm-1 Figura 2 Espectro de Infrarrojo para pasta obtenida.39 1974. pH 7 y temperatura de 35ºC. el cual es representativo de los grupos carbonilos. por lo que se espera que de 100 g de semilla se obtengan 1.0 4000. En la figura 2 se muestra un espectro infrarrojo (IR) para la pasta colorante recuperada. identificada como 75 .022 g de bixina total obtenidos a partir de una muestra de 2 g. de acuerdo a la técnica del rojo congo.96 40 30 1048.00 1373.96 825. destacándose un pico sobresaliente cercano a 1600 cm -1. fue la designada como 7. Pasta colorante obtenida para cada tratamiento .98 772. L. Métodos de Laboratorio. México D. Dubois.. J. Nueva editorial interamericana. 1993. H. 28:530. M. D. Vansoest. Literatura citada AOAC. pp. Hamilton. P. M. J. 2002. e inferior al reportado utilizando los métodos alcalinos.. 51: 780 p Vázquez. Rebers. lo cual fue confirmado al monitorear la formación y consumo de azúcares totales y reductores presentando un comportamiento típico para este tipo de hongos excretando la enzima al medio para obtener carbohidratos simples y asimilarlos constantemente. F. H. D. Oficial Methods of Análisis of the Association of Official Alytical Chemists. J. 1980.Aspergillus. Chem. pp. Lynch. Spare. Iliná A. Las condiciones antes citadas ofrecen un rendimiento de extracción de bixina de hasta un 80 % comparado a lo obtenido con agua. P. R. Addison Wesley Longman de México. Tabasco. para la cepa 7 identificada como Aspergillus spp. D. Química de los alimentos. V. 38 p. Estudio preliminar de la degradación de bixina en polvo en los diferentes tipos de empaques y temperaturas establecidas. H. Trillas. S. P. de C. G. M.. con su consecuente efectividad en la degradación de la materia en cuestión para facilitar la liberación del pigmento. D. Educación Alimentaria. and Smith. Instituto Tecnológico de Villahermosa. 97. Ed. Thirteenth edition. A.1968. Tesis ING. F. sin contener los residuos químicos tóxicos que se presentan en dicha extracción. Ed.. R. C. 2003. Inwood. 353 p. S. S. A. Anal. el tratamiento con Aspergillus resultó un 30% mas efectivo que los antes mencionados. Chem. F. 2ª ed. Villahermosa. México. S. 1956. 1987. 1446-1447. fueron de pH 7 y temperatura de 35ºC. J. Guilles. DE C. K. 76 . A. y Wine. celulosa y silicio por el método de permanganato. México. Salas. “Colorimetric meted for determination of sugars and related substances”. F. D. manual indispensable en educación para la salud. Mellor. Determinación de fibra por el método ácido detergente/ determinación de lignina. K. A. México. Anal. J. L. Comparando los procesos usando las otras cepas estudiadas y sin inóculo.. 2001. México. Antes citado. Vol 2. Manual de Prácticas de crédito 1 Introducción a la Biotecnología U. Badui. Fue posible establecer que las condiciones para el óptimo desarrollo fúngico. cuestionados recientemente por la unión Europea.
Report "Obtención Del Colorante de La Semilla de Achiote Utilizando Microorganismos Celulolíticos"