Obtencion de Células Mononucleares a Partir de Sangre Periférica

OBTENCION DE CÉLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DESANGRE PERIFÉRICA En el análisis del sistema inmune es necesario evaluar las células que se desarrollan y activan en forma específica o inespecífica, en cada tipo de respuesta. De allí el interés por separar las células y evaluarlas en forma diferenciada. En muchos de los experimentos in vivo e in vitro que llevan a cabo los inmunólogos son precisas poblaciones linfocitarias puras. Las principales fuentes de linfocitos de animales de experimentación son el timo, el bazo y los ganglios linfáticos periféricos. En los estudios llevados a cabo en seres humanos la fuente de linfocitos más cómoda es la sangre periférica, pero también se pueden obtener células del bazo, las amígdalas o los ganglios linfáticos mediante procedimientos quirúrgicos. Hay que tener en cuenta que las poblaciones celulares obtenidas a partir de cada una de estas zonas es diferente de las demás en lo que respecta a la madurez de los linfocitos y a la proporción relativa de los diversos tipos de células que contiene. La inmunología dispone de varios métodos para la separación rápida de poblaciones linfocitarias, dentro de ellas contamos con la separación en gradientes de densidad, la formación de rosetas, la separación celular por medio de partículas magnéticas, Identificación de linfocitos por Inmunofluorescencia y la identificación por Citometría de flujo. Nosotros en la práctica realizaremos la técnica de separación por gradientes de densidad, la cual se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los granulocitos, y se utiliza para separar conjuntamente todos los linfocitos sanguíneos. ...................... Las muestras de médula que no son diluídas en el momento de su obtención deben rechazarse.... PBS.. por ml....... Cloruro de Sodio.0 litros....... Agua destilada ....... Obtención a partir de ganglio: a) Se coloca el ganglio en un mortero...4 con HCl 6 N.................... Agua destilada c... ésta acción facilitará la salida de las células............. Ajustar pH a 7........ A partir de esta emulsión se obtendrán las células a investigar... extraer 2 – 5 ml de médula ósea en una jeringa que contenga 10 ml de PBS y 150 UI de heparina................... Médula ósea: Por punción medular o de cresta iliaca. extraer la sangre en una jeringa que contenga heparina a concentración de 10 U.. 2..........0 ml Obtención de muestras para estudio de sangre periférica: i......35 grs.... PBS (Solución salina amortiguadora con fosfatos) 3....... Fosfato dibásico de sodio (7 H2O)....... Fosfato monobásico de sodio....... 2.... Solución de Ficoll Hipaque 2..... mantener en agitación lenta a temperatura ambiente................. No dejar transcurrir más de 4 horas antes de procesar la muestra... Por venipuntura.. ii.................. Esta dilución es indispensable para obtener una adecuada separación de células mononucleares.......Materiales:     Microscopio Óptico Gradillas para Tubos Cámara de Neubauer Láminas Portaobjeto     Tubos de vidrio (13x100 – 12x75) Pipetas pasteur Centrífuga Laminillas Cubreobjeto Reactivos: 1... se cubre con PBS y se punza con una aguja... .......p. 1.... Azul de Tripán al 1% acuoso 4..... PBS-Glicerol Ficoll 400. 30 ml.. Otra forma es obteniendo por venipuntura sangre venosa en un tubo con EDTA. 115. 9 grs........0 ml Hipaque al 50%...... 0....0 ml Glicerol..45 grs........ La agitación y tratamiento hasta el procesamiento es igual que para sangre periférica. 17 grs....s...... mezclar y puede ser conservada a temperatura ambiente hasta por 48 horas.......... 7.. ..........I...................... Centrifugar a 1000 – 3000 r. Las muestras de médula ósea ya diluídas no deben diluirse nuevamente. Diluír la muestra de sangre periférica heparinizada o con EDTA 1:2 (2 ml de sangre + 2 ml de PBS ). En un tubo sobre un volumen de 2 ml de ficoll-hipaque. Método: 1.b) Otra forma es colocar el ganglio en un mortero y presionarlo con el pilón y a la vez se va agregando PBS.p. La mezcla se evita si la muestra se desliza por la pared del tubo en tanto éste se mantiene inclinado. .m. Tubo con sangre 2ml más 2 ml del buffer PBS 2. formándose así un “machacado” de donde se obtendrán las células a investigar. que es la parte 3. depositar cuidadosamente en zona la muestra diluída. durante 20 – 30 minutos en centrífuga refrigerada o a medio ambiente. Tubo con 2 ml de sangre más 2 ml de PBS y luego añadimos Ficoll. Separar de la interfase formada la capa de linfocitos con una pipeta de Pasteur. separamos y lo lavamos 2 veces con PBS. Al separar el Halo con células mononucleares. colocando una gota de azul de Tripán al 1% + 1 gota de células en una lámina porta-objetos.Halo con células mononucleares. Las células muertas se verán de color azul y las vivas o viables se verán refringentes.000 r. para su estudio de linfocitos T 4. Una buena obtención de mononucleares debe presentar menos del 5% de células muertas. durante 10 minutos cada vez. 5.) 7. .c. Contar en cámara de Neubauer o en contador electrónico y ajustar en PBS la densidad requerida ( Un millón de células por c. centrifugando a 3. cubrirla con una laminilla cubre-objetos y observar al microscopio. eso lo extraemos.m. Podemos realizar comprobación de viabilidad celular.p. Al último 6. Lavar las células mononucleares dos veces con PBS. solo las células muertes se verán de color azul. actividad enzimática. adherencia. antígenos de superficie. Esta metodología tiene la particularidad que además de separar grupos celulares. En el microscopio observamos las células con Azul de tripan que sirve para ver si es VIABLE. los que se pueden distinguir por su morfología.Esquema de la gradiente de densidad. es decir por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada. permite mantener una buena viabilidad celular para realizar otros análisis. No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona. capacidad fagocítica. Notas: La separación por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologías utilizadas para este fin. . Interpretación Observaremos como los componentes de la muestra se ubicaran a diferentes niveles dentro del tubo según su propia densidad. La capa de mononucleares obtenida es bastante pura y contiene linfocitos y monocitos. ¿En qué consiste la separación celular por medio de partículas magnéticas? Separación Inmunomagnética Estas técnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas formadas por un material superparamagnético (es decir. estreptavidina. Microesferas MACS© (Magnetic-activated cell sorting) (Miltenyi Biotec) Son partículas supe paramagnéticas formadas por óxido de hierro y polisacáridos (dextranos). Dynabeads© (Life technologies) Son unas esferas de poliestireno en cuyo interior hay partículas superparamagnéticas que contienen hierro. b. Su tamaño es uniforme.. Son muy pequeñas. ni la actividad de las células. las esferas crean un campo magnético de gran intensidad que atrae fuertemente las microesferas MACS© y las células unidas a ellas. mientras que las células que no se han unido a las microesferas MACS© fluyen libremente a través de la columna. La separación se lleva a cabo haciendo pasar la muestra a través de una columna que contiene una matriz de esferas ferromagnéticas recubiertas de un material inerte que no daña las células.CUESTIONARIO 1. Cuando se coloca la columna sobre un imán. Los anticuerpos se unen de manera específica a un antígeno presente en la superficie de un tipo celular concreto y. a. se pueden separar las células unidas a los anticuerpos de las demás. mediante un simple imán. ni la función. no alteran ni la estructura. No son tóxicas y son biodegradables. y se encuentran unidas a anticuerpos específicos. Se necesita un campo magnético muy intenso porque las microesferas son muy pequeñas y las células están mínimamente marcadas. Al ser tan pequeñas. homogéneamente distribuidas. Existen en el mercado dos sistemas de separación de células basados en el uso de esferas metálicas unidas a anticuerpos: Dynabeads© y MACS©. Sobre su superficie se pueden unir covalentemente diversos ligandos biorreactivos: anticuerpos primarios. anticuerpos secundarios. oligonucleótidos. con un diámetro aproximado de 50 nm. que solo son magnéticas en presencia de un campo magnético) recubierto de un polímero. con un diámetro de 4. etc.5 micras (comparable al tamaño de una célula). . .5 y 7. incolora o amarillo pálida. Es un derivado triyodado del ácido benzoico con 47. y el pH ha sido ajustado entre 6.06% de yodo unido orgánicamente.a) Hypaque meglumina Marca del diatrizoato de meglumina.2.077). La solución es transparente.¿Qué es el Hipaque? 3. es un agente de diagnóstico.. por ello.¿Qué es el Ficoll? El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1. radiopaco y soluble en agua. y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos). 3. que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica.7 con . Está constituido por un anión yodado (diatrizoato) y un catión radiolúcido (meglumina). Es una solución acuosa estéril con 60 g de la sal meglumínica del ácido diatrizoico por cada 100 ml de solución. Es una solución relativamente termoestable y puede ser autoclavada sin que se produzcan efectos deletéreos.6.6-triyodobenzoato (sal).000 como agente estabilizador secuestrante. La solución es hipertónica a la sangre.13. Cada ml contiene 370 mg de yodo y 3.415 mosm/kg (determinado por VPO). La viscosidad de la solución es 6. La viscosidad es de 9 cp a 37º C.12 cp a 37º C. meglumina y sodio. muy soluble en agua.7 usando Na2CO3 con HCI o NaOH.ácido diatrizoico o solución de meglumina. con una osmolalidad de 2016 mosm/kg (determinado por VPO). Es un derivado triyodado del ácido benzoico con 37% (p/v) de yodo unido orgánicamente. Se presenta bajo la forma de una solución acuosa estéril al 76 %. Químicamente corresponde a 3. con una osmolalidad de 1. El diatrizoato sódico corresponde al 3. Cada 1 ml contiene aproximadamente 282 mg de yodo unido orgánicamente.4. El diatrizoato meglumina corresponde al 1-deoxi-1-(metilamino)-Dglucitol-3. El pH ha sido ajustado entre 6 y 7. El pKa es 3.4 para el ácido diatrizoico. 4.5 -diacetamida-2. Se ha agregado edetato de calcio disódico al 0. incolora o amarillo pálida.b) Hypaque-76 Marca de diatrizoato de meglumina y diatrizoato sódico.5diacetamida-2.5-diacetamida-2.triyodobenzoato monosódico.17 cp a 25º C y 4. 3.4. Es un sólido microcristalino. radiopaco soluble en agua. . Es hipertónica a la sangre. es un agente de diagnóstico. 6-triyodobenzoato de meglumina (C11H9I3N2O4.C7H17NO5) con un peso molecular de 809.68 mg (0. Está constituido por un anión yodado radiopaco -diatrizoato. La solución es transparente.01% como agente estabilizador secuestrante. incoloro. que contiene 66% (p/v) de diatrizoato de meglumina y 10% (p/v) de diatrizoato sódico. Es el yodo unido orgánicamente del anión la parte de la molécula que opacifica las estructuras internas para visualización por medio de los rayos X y la fluoroscopía. pero debería ser protegida de la luz fuerte.16 mEq) de sodio. La solución al 60% contiene edetato de calcio disódico 1:10. Una solución al 13% (p/v) es isotónica.y los cationes radiolúcidos. Estas células sanguíneas son un componente crítico en el sistema inmune. como los linfocitos o los monocitos. concretamente para combatir las infecciones. luego los estudiaremos y por último en el informe posterior extraeremos Linfocitos T. el receptor de linfocitos T (también llamado TCR. Estas células tienen núcleos de forma ovoide que ocupan la mayoría del espacio intracelular. CONCLUSIÓN . También se ocupan de realizar la cooperación para desarrollar todas las formas de respuestas inmunes. Los linfocitos T son los responsables de coordinar la respuesta inmune celular constituyendo el 70 % del total de los linfocitos que segregan proteínas o citocinas. Se diferencian de los linfocitos B y de las células NK (o célula Natural Killer. un polisacárido hidrofílico que separa capas de la sangre. en español «asesina natural») por poseer un receptor especial en la superficie de la membrana. que el HIV infecta Los linfocitos T o células-T pertenecen al grupo de leucocitos que son conocidos como linfocitos. Por ejemplo. básicamente detallaremos en el primer informe como extraer células mononucleares a partir de sangre periférica. con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la capa del plasma.INTRODUCCIÓN        En estos 2 informes que presentaremos a continuación. se emplean en la investigación del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4. Sin embargo. Este buffy contiene las PBMCs. Estas células se obtienen a menudo de la sangre usando ficol. Una Célula mononuclear de sangre periférica (PBMC) es una célula sanguínea caracterizada por poseer un único núcleo redondo. Las PBMCs tienen vastos usos clínicos y en investigación. como la producción de anticuerpos por los linfocitos B. por su denominación en inglés T cell receptor). en un frotis microscópico de sangre no es posible distinguir uno de otro a simple vista. La muestra usada debe ser fresca. Los glóbulos rojos de carnero pueden ser lavados en solución salina fisiológica hasta que no se observe hemólisis o sea el sobrenadante debe ser incoloro y transparente. permite mantener una buena viabilidad celular para realizar otros análisis. La formación completa de las rosetas se da a las 18 – 24 horas a una temperatura de 2 – 8 °C (refrigeración) Realiza el cálculo de los linfocitos T de la muestra trabajada. No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona.       La separación por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologías utilizadas para este fin. . es decir por las paredes del tubo y de inmediato debe ser centrifugada. Esta metodología tiene la particularidad que además de separar grupos celulares.