NTC4516_MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOSDE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DELNÚMERO MÁS PROBABLE

NORMA TÉCNICA COLOMBIANANTC 4516 2009-11-18 MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. HORIZONTAL METHOD FOR THE DETECTION AND ENUMERATION OF COLIFORMS. MOST PROBABLE NUMBER TECHNIQUE CORRESPONDENCIA: esta norma es idéntica (IDT) con respecto a su documento de referencia, la norma ISO 4831-2006. microbiología de alimentos; alimentos para consumo humano; alimentación animal; método horizontal; detección de coliformes; método de NMP. DESCRIPTORES: I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435 Prohibida su reproducción Primera actualización Editada 2009-11-25 IVONNE BERNIER LABORATORIO LABCONTROL E.A.A.A. ALCALDÍA DE BOGOTÁ .A. -KOKORIKOBASIC FARMA S. ALGARRA S. -LA CONSTANCIACORPOICA -CORPOLABCORPORACIÓN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGÍA Y LA MICROSCOPIA . sin ánimo de lucro. este último caracterizado por la participación del público en general.ARCHIVO BOGOTÁ AVESCO S. ICONTEC. E.A. es el organismo nacional de normalización. BIFAR EU CARULLA VIVERO S. ACUAGYR S. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. LABFARVE LABORATORIOS SFC LTDA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES . cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública. ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS LTDA. CONSERVAS COLOMBINA S.A.S.A. ICONTEC es una entidad de carácter privado. CONGELAGRO S. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. CASA LUKER CERVECERÍA LEONA S. GAE LTDA. FILTRACIÓN Y ANÁLISIS LTDA.A. COMPAÑIA NACIONAL DE CHOCOLATES S. ASEBIOL ASINAL ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA -ACCYTECASOCIACIÓN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGÍA BAVARIA S. AQUALAB AREPAS DOÑA ALEJA ASBIOQUIM LTDA. según el Decreto 2269 de 1993. ENZIPAN LABORATORIOS S.P.A. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología. en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ACEGRASAS S. para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo.PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación.U. INDALPE LTDA. COLOMBIANA S. La NTC 4516 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-11-18.A.LEMA- Además de las anteriores.A.A.A.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA QUIK LTDA. LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR LESNIAK EU MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA. MULTIDIMENSIONALES S.B. regionales y nacionales y otros documentos relacionados.A.A. NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.P. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN . ROCHE DIAGNOSTICS SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO LTDA. UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales.S.A.A. FRUGAL S. LA CAMPIÑA LABORATORIO A.B. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S. JOHNSONDIVERSEY KLIK S. LABORATORIO BIOCONTROL LTDA.A.MICROS DUPONT QUALICON EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ E. ..................1 5............................................................... TÉRMINOS Y DEFINICIONES ......NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) CONTENIDO Página INTRODUCCIÓN..........................4 5.................................3 DETECCIÓN DE COLIFORMES ................................................. 5.....3 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES...............................1 2.................................6 ...................................................................5 7....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................2 PRINCIPIO.....4 MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE......................................................3 5.......................4 6.................................................................................... REFERENCIAS NORMATIVAS ....................................................................................................... 4......................1 1............................................3 GENERALIDADES............................................................ EQUIPO Y VIDRIERÍA ...... MUESTREO.................. ALCANCE ....................................................................................................................................................... PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO .....3 ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP........2 5..............................................................4 MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA .2 4............................................................................3 DILUYENTES .5 8...................................................................................2 3.......1 4........... 9 ANEXO B (Informativo) .....................................................................13 DOCUMENTO DE REFERENCIA ..............................................................................................................................................12 ..................... CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS ...........7 10..........................6 MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) .................8 BIBLIOGRAFÍA ..... 9.................................................................................................................................................................................................................................................................................1 9............................................................................................. PRECISIÓN .................................................. INFORME DE ENSAYO.........6 MÉTODO DE DETECCIÓN ................................................8 12.....................................................NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) Página 9............................................2 PROCEDIMIENTO ................14 ANEXOS ANEXO A (Normativo) DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO ..................................8 11............................... En este caso. el método descrito en esta norma no detecta a todas las cepas de los microorganismos a los que se hace referencia en otras publicaciones como "coliformes (presuntivo)" (por ejemplo. Una proporción de las cepas de los microorganismos descritos en otros textos publicados como "coliformes" (incluyendo Escherichia coli) no produce suficiente gas para ser detectable mediante la utilización de un tubo Durham (es decir. las "cepas anaerógenas"). La técnica descrita en esta norma permite realizar un examen microbiológico en una porción de ensayo más grande permitiendo así la detección de un número más bajo de coliformes por gramo o mililitro de producto. La enumeración se realiza mediante el cálculo del número más probable después de la incubación en un medio líquido a 30 °C ± 1 °C o 36° ± 1 °C. Enterobacter. no necesariamente es idéntica a las definiciones correspondientes indicadas en otros textos publicados.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS DE ALIMENTACIÓN ANIMAL. Por lo tanto. Klebsiella) (véase referencia [2]). se pueden utilizar métodos diferentes específicos para tales productos. 1. si es absolutamente necesario por razones técnicas justificadas. este método horizontal puede no ser adecuado en todo detalle para algunos productos. ALCANCE Esta norma suministra directrices generales para la detección y la enumeración de coliformes. algunas cepas de Citrobacter. 1 de 14 . Sin embargo. Para los propósitos de un método de ensayo factible. se debería realizar todo el esfuerzo para aplicar este método horizontal en la medida de lo posible. MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE COLIFORMES TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE INTRODUCCIÓN Debido a la gran variedad de alimentos y productos de alimentación. y muestras ambientales en el área de producción y manipulación de alimentos. Se aplica a: productos destinados para consumo humano y para alimentación de animales. la definición de "coliformes" indicada en la sección 3 y utilizada como base para el procedimiento. Para referencias no fechadas. Bacterias Gram negativas que. GTC 171. Guía general para los ensayos de desempeño de medios de cultivo. Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs . La información suministrada en el numeral 11 brinda directrices sobre la aplicabilidad del método y sobre la interpretación de los resultados. En el caso de la leche y los productos lácteos. se aplican los siguientes términos y definiciones. Parte 1. la temperatura de incubación es de 30 °C ± 1 °C. 2 .Part 5: Specific Rules for the Preparation of Milk and Milk Products. suspensiones iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. guía para la preparación y producción de medios de cultivo. Determinación de la presencia o ausencia de estas bacterias. Para referencias fechadas. produce fermentación de la lactosa con producción de gas. 2 REFERENCIAS NORMATIVAS Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de este documento normativo. NTC 4092. reglas Generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales GTC 78. Microbiología de alimentos y productos para alimentación animal. según producto). Requisitos generales y directrices para análisis microbiológicos. Este método de enumeración se aplica cuando se espera que el número que se busca esté en el rango entre 1 ml y 100 por ml o por gramo de muestra de ensayo. Guía para la preparación de medio de cultivo. se aplica únicamente la edición citada. Microbiología de alimentos y alimentos para animales – Preparación de muestras para ensayo.1 Coliformes. en una cantidad particular de producto. cuando se realizan ensayos de acuerdo con el método que se especifica en esta norma. guía general para el aseguramiento de la calidad para la preparación de los medios de cultivo en el laboratorio. TÉRMINOS Y DEFINICIONES Para los propósitos de esta norma. se aplica la última edición del documento normativo referenciado (incluida cualquier corrección). 3.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) NOTA La temperatura está sujeta al tipo de producto. 3. Initial Suspension and Decimal Dilutions for Microbiological Examination .2 Detección de coliformes. NTC 4491 (todas las partes). 3. Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Número más probable de coliformes hallados por mililitro o por gramo de muestra de ensayo.3 Enumeración de coliformes. a una temperatura especificada (30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C. Una limitación en la aplicabilidad de esta norma está impuesta por la susceptibilidad del método a un amplio grado de variabilidad. 3. bajo las condiciones de ensayo que se especifican en esta norma. cuando el ensayo se realiza según el método que se especifica en esta norma.Preparation of Test samples. ISO FDIS 6887-5:200 9. 2 Un tubo con medio de confirmación se inocula con el contenido del tubo obtenido del numeral 4. y se incuba a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h o 48 h. 4.1 cuando se ha observado la formación de turbidez o gas o ambos.1 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con doble concentración se inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo. se inoculan con diluciones decimales de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial tubos adicionales que contengan medio con una concentración sencilla. y los tubos que contienen el medio con concentración sencilla se incuban durante 24 h o 48 h.2.2.2.1 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES GENERALIDADES Véase la NTC 4092 con respecto a la preparación. si el producto inicial es líquido. 4.2.4 Una serie de tubos con el medio de confirmación se inoculan con los cultivos provenientes de los tubos del medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración y con los cultivos de los tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 4. producción y ensayo de desempeño de los medios de cultivo.5) que muestran formación de gas.1. o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros productos.2. 4. 4. después de este periodo estos tubos se examinan para determinar la formación de gas o la turbidez que presume la detección de la formación de gas. 4. 4. 3 .3 La presencia de coliformes se confirma en el caso en que se haya observado la formación de turbidez y gas después del examen del tubo obtenido del numeral 4.6 Se calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra (es decir. si el producto inicial es líquido. Se utiliza una tabla para determinar el número más probable.2.2 Tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo líquido con una concentración sencilla se inoculan con una cantidad específica de la muestra de ensayo. 4. 4.1. el NMP) a partir de la cantidad de tubos en la serie nueva (véase el numeral 4. en los cuales se ha observado la formación de gas o la turbidez que presume la detección de la formación de gas. 5.2.1.3 Los tubos que contienen el medio de enriquecimiento selectivo con doble concentración se incuban a 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h.1 PRINCIPIO DETECCIÓN DE COLIFORMES NTC 4516 (Primera actualización) 4. Después.2. 4.5 Los tubos que se obtienen en el numeral 4.1 Un tubo con caldo de enriquecimiento selectivo se inocula con la porción de ensayo y se incuba a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h o 48 h.1.4 se incuban a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h o 48 h y se examinan para determinar la formación de gas. bajo las mismas condiciones.2.1. 5.2 ENUMERACIÓN MEDIANTE LA TÉCNICA DE NMP 4. o con una cantidad específica de una suspensión inicial en el caso de otros productos. 5.4) [que no contengan tubos Durham (véase el numeral 6.25 °C. de manera que después de la esterilización esté en 6.8 ± 0.4) que contengan tubos Durham (véase el numeral 6.2 g 1 000 ml b) Medio con concentración sencilla 20 g 5g 2.5)] en el caso del medio con doble concentración. 5. 5.5 g 10 g 0.2 Preparación Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante calentamiento.3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad.1 MEDIO DE CONFIRMACIÓN: CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE Composición 10 g 10 g 20 g 4 Producto de la digestión enzimática de la caseína Lactosa (C12H22O11·H20) Bilis de buey deshidratado .3.4.75 g 2. consulte la GTC 171.1 g 1 000 ml 5.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.75 g 5g 0.1 MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO: CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA Composición a) Medio con doble concentración Producto de la digestión enzimática de la leche y proteínas animales Lactosa (C12H22O11 ·H2O) Fosfato hidrógeno de dipotasio (K2HPO4) Fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua 40 g 10 g 5. y en tubos con dimensiones aproximadas de 20 mm x 200 mm (véase el numeral 6. Dispense el medio en cantidades de 10 ml en tubos con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.3 5.3.3. si es necesario. si es necesario.5 g 5.2 DILUYENTES NTC 4516 (Primera actualización) Véase la NTC 4491 (la parte correspondiente).5) en el caso del medio concentración sencilla.2 a 20 .4 5. El ensayo de desempeño con respecto al caldo lauril sulfato triptosa se encuentra en la GTC 171. Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. DE 027-08 o la norma internacional específica para el producto que se está examinando. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. Ajuste el pH según la NTC 4092. consulte la GTC 171. 6. de manera que después de la esterilización esté en 7.2 Incubadora. Los tubos Durham no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.2 a 20 . 6. Si no existe una norma internacional.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA Verde brillante Agua 5. pHmetro.6 6.2 ± 0. con dimensiones aproximadas de 16 mm x 160 mm y 20 mm x 200 mm. de platino-iridio o níquel-cromo.4. MUESTREO El muestreo se debería realizar de acuerdo con la norma internacional específica correspondiente para el producto en cuestión. con exactitud de ± 1 unidad de pH a 25 °C. si es necesario.1 Equipo para estilización en seco (horno) o para esterilización en húmedo (autoclave).3 Asas.7 Pipetas de descarga total. con diámetro aproximado de 3 mm.5 Tubos Durham. 6. con capacidad nominal de 1 ml y 10 ml.4) que contienen los tubos Durham (véase el numeral 6.4. con un tamaño adecuado para su uso en los tubos de ensayo con dimensiones de 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6.4).3 Ensayo de desempeño para el aseguramiento de la calidad del medio de cultivo Con respecto a las definiciones de selectividad y productividad. en particular. 7. EQUIPO Y VIDRIERÍA Equipo común de laboratorio de microbiología (véase la NTC 4092).25 °C. 6.013 3 g 1 000 ml Disuelva los diferentes componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante calentamiento. con capacidad de funcionamiento a 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C. el siguiente. Véase la NTC 4092. 6. El ensayo de desempeño con respecto al caldo lactosa bilis verde brillante se encuentra en la GTC 171. 5 . Ajuste el pH. Dispense el medio en cantidades de 10 ml en los tubos de ensayo de aproximadamente 16 mm x 160 mm (véase el numeral 6. Esterilice en autoclave ajustado a 121 °C durante 15 min. 6.2 Preparación NTC 4516 (Primera actualización) 0.4 Tubos de ensayo. 5. o asas desechables.5). se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema. según la NTC 4092. 6. si es necesario. 1.1 Dependiendo del límite de detección que se requiera.1.3.2.1. o a un tubo que contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla [véase el numera 5.3) 9.3. 9.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 8.1.2 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.2. 9.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5.1.1 PROCEDIMIENTO (véase el Anexo A) MÉTODO DE DETECCIÓN (véase la Figura A. 9.3 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (véase el numeral 9. 6 .1. 9.1a)] cuando x esté entre 1 ml y 10 ml. 9.1) en la incubadora (véase el numeral 6.1. o x ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos.2.1.2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.1.2.2. se transfieren x ml de la muestra de ensayo si es líquida. después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h). durante 48 h ± 2 h. NTC 4516 (Primera actualización) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 (la parte correspondiente). Incube a temperatura de 30 °C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o.3.3 Confirmación (véase la Figura A.1.3 que muestren formación de gas o turbidez que presuma la detección de la formación de gas. DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión.1.2.2 Inoculación e incubación 9. si no se ha observado formación de gas o turbidez que presuma la detección de dicha formación en esta etapa. si no se ha observado formación de gas en esta etapa.4 Interpretación (véase la Figura A. cuando cualquiera de estas características se observe primero (es decir.3.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9.3.4). se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este tema.2.2. 9. 9.1 9. Si no existe norma internacional específica.2 en el cual se observó la formación de gas después de 24 h ± 2 h o de 48 h ± 2 h se considera un tubo positivo.1.1b)] cuando x ≤ 1 ml.3.1) en la incubadora (véase el numeral 6.1) Un tubo de los suministrados según los numerales 9. continúe la incubación por otras 24 h ± 2 h.1 o 9.1.1.3. inocule con un asa (véase el numeral 6.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h.1. a un tubo que contengan 10 ml del medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración [véase el numeral 5.1.2) ajustada a 30 °C ± 1 o 36 °C ± 1 (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o. 9.1 para los tubos incubados según el numeral 9.1) Porción de ensayo y suspensión inicial Véase la NTC 4491 y el DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión. 2. DE 027-08 o la norma internacional específica correspondiente al producto en cuestión.1.2.1b)].2 Realice el mismo procedimiento descrito en el numeral 9.2.3.6) transfiera a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra de ensayo.2. durante 48 h ± 2 h.5 Deje los tubos con el medio de doble concentración (véase el numeral 9.2. En estos casos.1 para los tubos incubados según el numeral 9. si es líquida. Prepare una cantidad suficiente de diluciones para garantizar que todos los tubos correspondientes a la dilución final produzcan un resultado negativo.2.4 Para cada una de las diluciones adicionales.2.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h o. si no se ha observado formación de gas en esta etapa.1 Es común que exista una combinación de tres tubos para cada serie de diluciones. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6. 7 .3.2. consulte las tablas correspondientes que se incluye en la NTC 4092.6 Deje los tubos con el medio de concentración sencilla (veánse los numerales 9.2.3 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de concentración sencilla [véase el numeral 5. si es líquida.2 9. o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos. Mezcle cuidadosamente el inóculo y el medio.2. después de 24 h ± 2 h o después de 48 h ± 2 h).2.3 y 9.6 que muestren formación de gas o turbidez que presume la detección de la formación de gas.2.2. Utilizando una pipeta estéril (véase el numeral 6.2. inocule con un asa (véase el numeral 6.2 Inoculación e incubación 9. puede ser necesario inocular series que consten de más de tres tubos (por ejemplo de cinco tubos). 9.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 9.1 NTC 4516 (Primera actualización) MÉTODOS DE ENUMERACIÓN (NMP) (véase la Figura A. Utilice una pipeta estéril para cada dilución. 9.2.2.3 Confirmación (véase la Figura A. 9. 9.2 Tome tres tubos que contengan medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración [véase el numeral 5.2.2) en la incubadora (véase el numeral 6.3) 9.2.4) en la incubadora (véase el numeral 6.3.2. para algunos productos o cada vez que se requieran resultados de mayor exactitud.3.2.3.2.2.6) transfiera a cada uno de estos tubos 10 ml de la muestra de ensayo.2. 9. si no se ha observado la formación de gas o de turbidez que presuma la detección de dicha formación en esta etapa. o 10 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos.2.2.2.4). cuando se observe cualquiera de estas características (es decir.3) un tubo que contenga medio de confirmación (véase el numeral 5. exactitud o ambos casos.1 Tomando material de los tubos incubados según el numeral 9. 9. para el cálculo del número más probable. continúe tal como se describe en el numeral 9.1a)]. 9.2) Porción de ensayo. continúe la incubación durante 24 h ± 2 h adicionales.2. 9. Sin embargo.2.3.2.2. Incube a temperatura 30°C ± 1 °C o 36 °C ± 1 °C (según producto) durante 24 h ± 2 h o.2) ajustada a 30 °C ± 1 °C ó 36 °C ± 1 °C (según acuerdo) durante 24 h ± 2 h. suspensión inicial y diluciones Véase la NTC 4092 (la parte correspondiente). junto con los detalles de todo incidente que haya podido tener influencia en los resultados. todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o se consideran opcionales. 10. 11. cuente la cantidad total de tubos en los cuales se observó la formación de gas en el paso del numeral 9.4 NTC 4516 (Primera actualización) Interpretación (véase la Figura A. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS De acuerdo con los resultados de la interpretación (véase el numeral 9.1.2. indique la presencia o ausencia de coliformes en la porción de ensayo de x g o x ml de producto (véase la NTC 4092). - 8 . INFORME DE ENSAYO El informe de ensayo debe especificar: toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra. el método de ensayo utilizado. los resultados obtenidos utilizando este método se deberían utilizar con precaución. Por lo tanto.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 9. con referencia a esta norma nacional.4).3 (tubos positivos) después de 24 h ± 2 h y (si se utiliza) 48 h ± 2 h. los resultados obtenidos. Los límites de confianza se suministran en la NTC 4092. el método de muestreo utilizado.2) Para cada dilución. si se conoce. el objeto del ensayo y la temperatura de incubación utilizada.2. PRECISIÓN Se reconoce que se pueden presentar amplias variaciones en los resultados con la técnica del NMP. Calcule el número más probable a partir del número de tubos positivos en cada dilución (véase la NTC 4092). 12. 1) Proceder de la misma forma Incubación por 24 h +/.1) D 1 ml 1 Tubo con medio de concentración sencilla (9.3) (+) (-) D+3 1er caso 2docaso 3er caso Interpretación (+) (9.2.2 horas (9.2) D+1 Inoculación (9.2.1.2 h Inoculación (9.1.2h o 48 h +/.3.1.1.2h o 48 h +/.3) D+2 Incubación por 24 h +/.1) Incubación por 24 h +/.2 h 1er caso 2docaso D+4 (+) (-) Interpretación (9.1.2h o 48 h +/.4) (-) Incubación por 24 h +/.2.1.1.1.1.4) 1er caso 2docaso Figura A.2.2.2 h (9. Método de detección 9 .NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) ANEXO A (Normativo) DIAGRAMAS DE FLUJO PARA EL PROCEDIMIENTO Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos) 10 ml 1 Tubo con medio de concentración doble (9. 3.1) Inoculación (9.2.2.2.3) Proceder de la misma forma Incubación por 24 h +/.2.2h o 48 h +/.2) D 1 ml 3 Tubos con medio de concentración sencilla (9.1.4) 1er caso 2docaso Figura A.2.2.3.3.3.2.2.2.2) 1er caso 2docaso D+4 (+) (-) Interpretación (9.6) D+2 Incubación por 24 h +/.2.1) Incubación por 24 h +/.2.4) (-) Incubación por 24 h +/.2 h (9.2 h (9.2.2 horas (9.2h o 48 h +/.5) D+1 Inoculación (9.2 h (9.2.2h o 48 h +/.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) Suspensión inicial (productos sólidos) o muestras de ensayo (productos líquidos) 10 ml 3 Tubos con medio de concentración doble (9.2.2) (+) (-) D+3 1er caso 2docaso 3er caso Interpretación (+) (9. Método de enumeración 10 . 3b) Figura A. Detalles de la etapa de confirmación 11 .3) Tubo con medio de doble concentración (5.3a) Tubos con medio de concentración sencilla (5.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) Antes de la incubación Formación de gas (+) Después de la incubación Turbidez No formación de gas (-) Asas (6.3. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) ANEXO B (Informativo) MEDIOS DE CULTIVO Otro medios de cultivo indicados para la fase de confirmación aparecen relacionados en la GTC 125. 12 . Guía de referencias de métodos horizontales de análisis microbiológicos para bebidas. alimentos y alimentos para animales. W. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. USA. Identification of Enterobacteriaceae.H.NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4516 (Primera actualización) BIBLIOGRAFÍA [1] ISO 4832. Burgess Publishing Company. Colony-Count Technique.R. Horizontal Method for the Enumeration of Coliforms. 1972. Minnesota. P... Minneapolis. and Ewing. [2] 13 . Edward. 3rd edn. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA DOCUMENTO DE REFERENCIA NTC 4516 (Primera actualización) INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Horizontal Method for the Detection and Enumeration of Coliforms. 2006. Most Probable Number Technique. 14 . Geneva: ISO. 12 p (ISO 4831:2006 (E)). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs.