FORMACIÓN ON-LINEMÓDULO II: UNIDAD 1 CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL PRODUCTO ACABADO Y SEMIELABORADO Introducción y Objetivos de la Unidad Según el Reglamento 1223/2009 sobre productos cosméticos, el fabricante de dichos productos es el responsable de su seguridad. Esto significa que, desde el punto de vista microbiológico, el producto situado en el punto de venta debe tener un número bajo de microorganismos y estar libre de algunos específicos. Por otra parte, debe asegurarse de que los microorganismos que puedan llegar al producto cosmético durante su uso habitual no proliferarán afectando adversamente a su calidad y seguridad, es decir, de que esté bien conservado. El riesgo dependerá de la capacidad que tenga el producto de albergar un crecimiento microbiano; como veremos en el Módulo IV, la probabilidad de que algunos productos cosméticos se contaminen es extremadamente baja, debido a características fisicoquímicas como una baja actividad de agua, un pH extremo, etc. En estos casos el producto estaría exento de análisis microbiológico. Sin embargo, la mayoría de cosméticos ofrece condiciones óptimas para la proliferación microbiana, como agua, nutrientes y otros factores de crecimiento. Además, las condiciones de fabricación y almacenamiento a temperatura ambiente, el pH alrededor de la neutralidad, la humedad relativa a la cual pueden almacenarse y las condiciones de utilización por parte de los consumidores hacen que sean un medio óptimo para el crecimiento microbiano, lo que puede suponer un peligro para el consumidor y un deterioro de las características del producto. Para evitarlo, la calidad del producto acabado se debe asegurar mediante la aplicación de unas Buenas Prácticas de Fabricación (BPF, Módulo III) durante la producción – además del control de las materias primas, la utilización de conservantes y estrategias de conservación adicionales (Módulo IV) y el control microbiológico del producto semielaborado y acabado, que es el objetivo que ahora nos ocupa. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 1 de 51 FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado En esta Unidad nos centraremos en el control microbiológico utilizando las técnicas clásicas de Microbiología y en base a la Normativa UNE-EN-ISO. Haremos un especial énfasis en la comprobación de la idoneidad o aptitud de los métodos de recuperación de microorganismos, aspecto imprescindible en cualquier análisis microbiológico en Cosmética. Además, conoceremos los límites de contenido microbiano que recomiendan diferentes Organizaciones, ante la carencia de legislación en este aspecto. Los objetivos de esta Unidad son, por tanto: - Conocer los principales tipos de microorganismos que pueden contaminar un producto cosmético según sus características. - Saber cómo se realiza un muestreo para el análisis microbiológico. - Saber cómo se lleva a cabo el análisis microbiológico completo de una muestra cosmética y cuáles son los requerimientos aconsejados en cuanto a contenido microbiano para comercializar los productos acabados. - Saber cómo se realizan los ensayos de aptitud de los métodos descritos y reconocer la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización de los conservantes. Índice de la Unidad 1. Generalidades ......................................................................................................... 3 2. Normativa aplicable .................................................................................................. 6 3. Muestreo .................................................................................................................. 9 Producto semielaborado (granel) .............................................................................................. 9 Producto elaborado (unidades envasadas) ............................................................................. 10 Preparación de las muestras ................................................................................................... 12 4. Recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras ....................... 15 Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad) ............................................................ 16 En superficie o por extensión .................................................................................................. 17 Filtración a través de membrana ............................................................................................. 18 Cálculo de resultados .............................................................................................................. 19 MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 2 de 51 FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado 5. Detección de microorganismos aerobios mesófilos (enriquecimiento) ........... 21 6. Detección de microorganismos patógenos ........................................................ 22 Detección de Escherichia coli .................................................................................................. 23 Detección de Staphylococcus aureus ..................................................................................... 24 Detección de Candida albicans ............................................................................................... 26 Detección de Pseudomonas aeruginosa ................................................................................. 27 7. Comprobación de la idoneidad del método (neutralización y recuperación) ... 28 Validación y neutralización. Generalidades ............................................................................. 28 Idoneidad del método de siembra por inclusión ...................................................................... 31 Idoneidad del método de la siembra en superficie .................................................................. 35 Idoneidad del método de filtración a través de membrana ..................................................... 35 Idoneidad del método de detección de bacterias mesófilas aerobias y hongos por enriquecimiento........................................................................................................................ 36 Idoneidad del método de detección de microorganismos patógenos ..................................... 37 Interpretación de los resultados de los ensayos de idoneidad ................................................ 40 Validación de un método alternativo ....................................................................................... 40 8. Límites ................................................................................................................... 41 UNE-EN ISO 17516:2014. ....................................................................................................... 41 SCCS, Scientific Committee on Consumer Safety- Europa .................................................... 42 USA (PCPC, Personal Care Product Council) ........................................................................ 42 Farmacopea Europea / USA.................................................................................................... 42 España. Ministerio de Sanidad y Consumo............................................................................. 43 9. Bibliografía ............................................................................................................ 44 Anexo 1...................................................................................................................... 46 Anexo 2...................................................................................................................... 49 Anexo 3...................................................................................................................... 51 1. Generalidades El control microbiológico de los productos cosméticos es de suma importancia para garantizar la seguridad del consumidor y también para mantener la calidad del cosmético, sobre todo de cara a la imagen de la empresa que los comercializa. En los años 60 los problemas microbiológicos se centraban en evitar el crecimiento visible de mohos en la superficie de los productos, pero en 1969 un informe de la FDA (Food and Drug Administration - USA) mostraba que el 25% de los cosméticos estaban contaminados y que predominaban las bacterias Gram negativas. A partir de MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 3 de 51 FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado ahí, la CTFA (Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association) en el mismo país creó comités para la garantía de calidad microbiológica de los productos cosméticos para estudiar la situación y redactar guías sobre Microbiología y también sobre Buenas Prácticas de Fabricación para la industria. En la segunda mitad de los años 70, la atención se focalizó en los cosméticos que se aplican alrededor de los ojos, después de que hubiera habido casos de ceguera producidos por máscaras de pestañas contaminadas con Pseudomonas aeruginosa. Debido a ello, se desarrollaron los ensayos de eficacia conservante (Challenge Tests), que veremos en el Módulo IV. Actualmente, se han dado casos de infecciones en hospitales debidas a colutorios contaminados por Burkholderia en personas inmunodeprimidas. Los microorganismos más habituales que pueden contaminar los productos cosméticos de base acuosa (champús, geles de baño, lociones, acondicionadores capilares, etc.) son bacterias Gram negativas, tanto si el origen es el entorno de fabricación como si es en su utilización por el consumidor (ver Tabla I), ya que habitan principalmente en lugares con presencia de agua. Entre las bacterias Gram negativas, son de especial importancia las que pertenecen a la familia de las pseudomonadáceas (géneros Pseudomonas, Burkholderia, Xanthomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, etc.). Son microorganismos que se adaptan fácilmente a cualquier ambiente, siempre que éste sea acuoso. Su principal origen es el agua de fabricación o materias primas diluidas en agua, como las soluciones de tensioactivos, opacificantes, polímeros, etc. Pueden metabolizar virtualmente casi cualquier sustrato; como ejemplo, Burkholderia cepacia es capaz de metabolizar hasta 100 moléculas orgánicas conocidas. También, dentro del grupo de Gram negativas, es fácil aislar enterobacterias como las del género Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, Klebsiella, etc. No son tan flexibles metabólicamente como las anteriores, pero también se encuentran frecuentemente en ambientes acuosos. Los microorganismos Gram positivos no son tan versátiles como las bacterias Gram negativas y en productos con tensioactivos (aniónicos y particularmente catiónicos) es difícil encontrarlos, puesto que sus formas vegetativas son muy sensibles a ellos, así como a los conservantes más comúnmente utilizados en cosmética. Pueden aparecer como esporas (bacilos esporulados) en productos que no se han fabricado en MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 4 de 51 FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Control microbiológico del producto acabado condiciones higiénicas o con materias primas contaminadas y, sobre todo, en productos pulverulentos, que pueden ser fuente de infección por Clostridium. Por otra parte, la presencia de estafilococos o micrococos (microorganismos de la piel) indicaría una manipulación humana deficiente. Tabla I. Microorganismos aislados, de mayor a menor frecuencia, en los productos cosméticos dependiendo del origen. Origen: consumidor Bacterias Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp Stenotrophomonas maltophilia Acinetobacter spp Moraxella spp Enterobacter spp Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae K. oxytoca Serratia spp Staphylococcus aureus S. epidermidis Sarcina spp Propionibacterium spp Corynebacterium spp Streptococcus mutans Bacillus spp Clostridium perfringens C. tetani Hongos Candida albicans Rhodotorula spp Penicillium spp Aureobasilium pullulans Scopulariosis spp Origen: fabricación Burkholderia cepacia B. picketti Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp Acinetobacter spp Moraxella spp Enterobacter spp Citrobacter freundii Klebsiella pneumoniae K. oxytoca Serratia marcescens Serratia spp Salmonella spp Ochrobacterium anthropi Proteus spp Aeromonas sobria Bacillus spp Candida lipolytica Saccahromyces cerevisiae Penicillium spp Aureobasidium pullulans Paecilomyces variotii Tras las bacterias Gram negativas, los mohos y levaduras son la causa más frecuente de contaminación de productos cosméticos. Estos microorganismos los encontraremos en productos con una baja actividad de agua, como pomadas, ceras, etc. y serán indicativos de un ambiente poco higiénico o de materias primas/material de acondicionamiento contaminados. Los mohos crecen siempre en la superficie de los productos de una forma característica (requieren oxígeno para su crecimiento) y es MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 5 de 51 mientras que en productos de pH entre 3 y 10 podremos encontrar también microorganismos alterantes. 2. Normativa aplicable Los métodos de control microbiológico aquí descritos se basan en el recuento de bacterias aerobias mesófilas y hongos (mohos y levaduras). 6 de 51 . y en concreto P. Productos retirados del mercado europeo por contaminación microbiana en el periodo 2005-2008. además. En general. Control microbiológico del producto acabado una de las causas que peor imagen generan de la empresa cosmética. 2008. Como se puede observar. La Tabla II recoge una lista de los productos cosméticos retirados del mercado europeo en el periodo 2005-2008. Tabla II. Staphylococcus aureus. los productos con un pH alrededor de la neutralidad será donde podamos encontrar microorganismos patógenos. y en la detección de los patógenos: Pseudomonas aeruginosa. Escherichia coli y MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. siempre prefieren un ambiente ácido para su proliferación.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Lundov and Zachariae. las bacterias Gram negativas. Los hongos. son las más frecuentemente aisladas. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. aeruginosa. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas. y estandarizar las técnicas microbiológicas. Microbiología. Microbiología. etc. - UNE-EN ISO 18415:2012 Cosméticos.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Microbiología. por lo que se aconseja el método de enriquecimiento. Dos de las premisas que siempre marcan las Normas es que puedan ser llevadas a cabo por cualquier empresa. por limitados recursos que tenga. Detección de Pseudomonas aeruginosa. En el Cuadro 1 se explica la importancia de cada grupo de Normas y lo que han aportado al campo de la Microbiología Cosmética. - UNE-EN ISO 18416:2015 Cosméticos. Microbiología. Microbiología. Detección de Escherichia coli. Cuando se realizan los ensayos para determinar la contaminación microbiológica es indispensable asegurar que cualquier conservante presente en la muestra ha sido inactivado. - UNE-EN ISO 16212:2011. Control microbiológico del producto acabado Candida albicans. ya que hasta su publicación no había un consenso acerca de cómo realizar los ensayos microbiológicos a nivel global. - UNE-EN ISO 21150:2015 Cosméticos. Detección de microorganismos específicos y no específicos. - UNE-EN ISO 22717:2015 Cosméticos. - UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. además de determinar cuántos microorganismos hay en una muestra. No existe ningún método oficial de control microbiológico de cosméticos a día de hoy. Detección de Candida albicans. aunque se pueden seguir otros (Farmacopeas. Se intenta. - UNE-EN ISO 21148:2010 Cosméticos. Instrucciones generales para el examen microbiológico. Detección de Staphylococcus aureus. Enumeración de levaduras y mohos. los métodos descritos en esta Unidad están basados en las siguientes Normas ISO (International Standard Organization). En caso contrario. es necesario detectar cualquier microorganismo que esté presente (patógeno o no) aun a niveles muy bajos. Cosméticos. Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico. 7 de 51 . a su vez. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Ministerio de Sanidad. que todas las Normas estén coordinadas entre sí. - UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. llegaríamos a interpretaciones erróneas de los recuentos MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - UNE-EN ISO 22718:2015 Cosméticos. Microbiología. Microbiología. a su vez Normas UNE-EN. Microbiología. Microbiología. En según qué casos.). Microbiología. UNE-EN ISO 22718:2015. Mediante la comprobación de la ausencia de crecimiento bacteriano después de un enriquecimiento. por experimentos que lo demuestren o por referencias bibliográficas. UNE-EN ISO 18415:2012: Normas acerca de la detección de patógenos y microorganismos específicos y no específicos. con el fin de determinar si las Normas son aplicables. Esta Norma era necesaria. El objetivo es asegurar que las técnicas generales que se utilizan para llevar a cabo los exámenes microbiológicos en productos cosméticos sean las mismas en todos los laboratorios que las adopten. recuento y siembra y estandarización de inóculos. Las aportaciones más importantes de estas dos Normas son: - Importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización. Incluye también la premisa de poder evaluar el riesgo en base al historial del producto. UNE-EN ISO 22717:2015. Se pueden utilizar otros métodos (rápidos) siempre que se validen. Anexos referentes a técnicas de identificación. UNE-EN ISO 18416:2015. Incluye un capítulo de ejemplo de cálculo de resultados. este grupo incluye la importancia de comprobar la idoneidad de la neutralización. Esta Norma no la desarrollaremos en esta Unidad. sino en el Módulo IV. Enumeración de levaduras y mohos Muestran las directrices generales para la detección y enumeración de microorganismos mesófilos aerobios (bacterias. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. almacenamiento. la premisa de pueden utilizarse otros métodos siempre que se validen y el consejo de llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico previo. Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico. Prevención de Riesgos Laborales del personal del laboratorio y de prevención de contaminación del medio ambiente. Aconseja llevar a cabo un análisis de riesgo microbiológico con el fin de determinar si la Norma es aplicable. Preparación de los equipos y del material de laboratorio. El resultado del análisis de riesgos permite determinar qué nivel de análisis es necesario para asegurar la calidad del producto. - UNE-EN ISO 21149:2010 Cosméticos. ejemplos de diluyentes y medios de cultivo y un Anexo de los neutralizantes de moléculas antimicrobianas. ya que asesora a la industria y a las autoridades reguladoras en la definición de productos acabados que presentan un bajo riesgo de contaminación durante su producción y/o uso. Por ello. Exigencia de rigor en el cálculo. Exige la formación del personal. Es factible utilizar procedimientos alternativos siempre que se demuestre su equivalencia. Obtención de resultados homogéneos. UNE-EN ISO 16212:2011. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Control microbiológico del producto acabado o detecciones obtenidos. Al igual que las dos Normas anteriores. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas. UNE-EN-ISO 21150:2015. Algunas de las aportaciones importantes que se encuentran en el texto son: - Recomendación de cómo tienen que ser las instalaciones y equipamiento. hongos) presentes en los productos cosméticos: - Mediante el recuento de colonias en agar no selectivo después de la incubación aeróbica o bien. UNE-EN ISO 29621:2011 Cosméticos. debe confirmarse previamente la validez del método de recuento y de la detección de patógenos mediante una comprobación de la idoneidad de los neutralizantes y del método utilizado (ver apartado 7).FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Microbiología. después de efectuar un análisis de riesgos y a juicio de un profesional. esterilización. 8 de 51 . o incluso concluir que la aplicación de rutina de las Normas Internacionales de Microbiología para cosméticos no es necesaria. Microbiología. Cosméticos. Cuadro 1 Los objetivos de las Normas ISO de Microbiología Cosmética y algunas de las aportaciones a este campo se listan a continuación: UNE-EN ISO 21148:2010. Instrucciones generales para el examen microbiológico. dependiendo del tipo de producto y condiciones de fabricación y envasado.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Producto semielaborado (granel) Algunas de las instrucciones que deben seguirse para conseguir una muestra representativa de un granel serían las siguientes: MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. por escrito y aprobado un plan de muestreo. etc. ambos según Normativa ISO. medio neutralizante. Este último método es útil si la muestra presenta propiedades inhibidoras del crecimiento microbiano que no pueden neutralizarse o diluirse adecuadamente. 3. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. debe tener establecida la caducidad de los análisis del producto semielaborado y un plan de actuación en caso de obtener Resultados Fuera de Especificaciones (OOS) o. Estos temas los estudiaremos en el Módulo III (Buenas Prácticas de Fabricación). siempre que se haya demostrado previamente su idoneidad en la recuperación de los microorganismos para el método escogido. Microbial Data Deviations (MDD). En el anexo 1 se detallan los diluyentes y medios de cultivo aconsejados para los análisis y en el anexo 2 los neutralizantes recomendados. Unidad 3). diluyente. También es muy importante guardar muestras representativas del producto acabado en la muestroteca. Es aconsejable también para el análisis del agua como materia prima (Módulo II.. Control microbiológico del producto acabado Para el recuento de microorganismos aerobios y detección de patógenos puede utilizarse el método de siembra en placa o el método de filtración a través de membrana. La Normativa también contempla la utilización de cualquier otro medio de cultivo. en graneles y producto acabado. la Norma UNE-EN-ISO 21148: Instrucciones generales para el examen microbiológico. 9 de 51 . específicamente en Microbiología. Además. pero también de graneles. o bien para muestras que presentan una contaminación microbiana muy baja. ya que nos puede ayudar posteriormente a la investigación de alguna desviación. Muestreo La empresa cosmética debe tener definido. Para la realización de los ensayos es muy aconsejable tomar como referencia. para el trabajo en el laboratorio microbiológico. de material inerte (acero inoxidable. se establecen diferentes niveles de muestreo que dependen de varios factores o de niveles de actuación previamente establecidos. A la hora de realizar el muestreo se debe tener en cuenta que es necesario disponer de unidades tomadas en diferentes momentos del envasado para que éstas sean lo MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. fecha de muestreo y firma de la persona que realiza el muestreo. etc. sacamuestras. Procedimientos de muestreo para la inspección por atributos. 10 de 51 . parte del contenedor de donde se ha extraído. siempre que esté asegurada la homogeneidad del producto. tabulados según el nivel de calidad aceptable (NCA). no es posible realizar el número de análisis que se muestra en dicha tabla. plástico o vidrio) y estéril. éste debe señalizarse colocándole un adhesivo de muestreo. Control microbiológico del producto acabado - La extracción de muestras se debe realizar con utensilios limpios (espátulas. en general. - Si la muestra se ha extraído de un contenedor. - Se debe tomar una muestra por cada partida de producto granel y la toma se debe realizar por las válvulas o bocas de acceso al reactor o depósito fijo o móvil. lote. en lotes de producción formados por un número elevado de unidades. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - Las muestras extraídas se deben identificar convenientemente. indicando como mínimo el nombre o referencia interna. En la práctica. En el caso de que la homogeneidad no esté asegurada o se requiera un nivel exhaustivo de control microbiológico (definido más adelante para el producto acabado) debería analizarse muestras de la parte inferior y superior del reactor o depósito. Producto elaborado (unidades envasadas) En el anexo 3 se muestra una tabla de unidades a muestrear dependiendo del tamaño del lote.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. - La cantidad de muestra a extraer debe ser la suficiente como para realizar los análisis por triplicado de forma separada. Parte 1: Planes de muestreo para las inspecciones lote por lote. por lo que.). cucharas. según UNE-ISO 2859-1:2012. FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. etc. Control microbiológico del producto acabado más representativas posibles de un lote. 1 unidad cada 2 h y 1 unidad al final del envasado. podríamos definir un nivel mínimo de muestreo. proceso de fabricación en continuo. factores como el volumen del lote. paros o averías en la línea durante el envasado de un producto. - Es un producto destinado a población especialmente sensible (bebés. Dicho control más exhaustivo estaría justificado cuando: - Es una primera fabricación de un producto o se ha cambiado algún ingrediente relevante. personas inmunodeprimidas (hospitales). - Se ha cambiado alguna etapa en la producción.). - Ha habido problemas de contaminación previos. Basándonos en esta premisa y únicamente como ejemplo. pieles atópicas. 11 de 51 . hacen recomendable incrementar el nivel de muestreo de la siguiente manera: - Cuando el envasado de un lote de producto puede durar más de 1 turno (8 h). se recomienda tomar unidades que proceden de cada uno de los depósitos que forman parte del mismo lote. 200 o 1000 kg). 1 unidad a la mitad y 1 unidad al final. En caso de un nivel exhaustivo pueden multiplicarse las muestras por dos. se recomienda tomar 2 unidades al inicio. - Si el producto a granel que se va a envasar está almacenado en varios depósitos/recipientes de baja capacidad (por ejemplo. y siguiendo el mismo criterio definido anteriormente. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. por ejemplo. de la siguiente forma: - Toma de 2 unidades al inicio del envasado del lote. - Cuando se está envasando y se produce un paro/avería en la línea durante un periodo de tiempo superior a 2 h. en un lote de producto de gran volumen almacenado en depósito de elevado tonelaje o fabricaciones en continuo. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sin embargo. al reiniciar de nuevo el envasado se recomienda tomar 2 unidades y seguir con la pauta establecida. ancianos. higiene íntima. contenedores de 100. Preparación de las muestras Todas las operaciones de toma de muestra y de homogenización de la misma deben realizarse en las máximas condiciones de asepsia. ya que. Unidad 2. Este procedimiento es necesario sobre todo en el caso de productos de un volumen pequeño. monodosis etc. con el fin de evitar contaminaciones externas: - La muestra debe procesarse en una cabina de seguridad biológica (CSB) y llevar guantes. si el procedimiento de análisis implica la combinación o mezcla de muestras. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Acondicionamiento La gran cantidad de tipos de muestras que existen en la industria cosmética hace que el acondicionamiento y la dilución. - Debe desinfectarse la parte externa del envase de la muestra con etanol preparado al 70% antes de la toma de muestra. Control microbiológico del producto acabado - Se ha realizado alguna actuación en la maquinaria de producción/envasado. Este tema lo estudiaremos en el Módulo IV.) y condiciones que aseguren que no se contamina la muestra durante el ensayo. este proceso sólo se debe realizar en el laboratorio y utilizando material nuevo y estéril para cada muestra. deben utilizarse materiales estériles o asépticos (jeringuillas. - En todas las operaciones posteriores. suspensión o dispersión de la muestra sean tareas en algunos casos no muy sencillas. ciertos productos no requieren un control tan exhaustivo. etc. Por el contrario. En este punto. sean cuales sean las características de la muestra. cuchillas. cabe decir que. como los clasificados de bajo riesgo microbiológico. espátulas. ésta debe poderse procesar de modo que no dañe a los posibles MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. como máscaras. 12 de 51 . pero también puede realizarse con las muestras que provienen de un mismo momento de envasado.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. disolver o suspender en el diluyente estéril apropiado. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. se deja reposar la muestra después de pulverizarse en un recipiente estéril para que desaparezca el gas y se diluye posteriormente. se desecha la primera parte de la muestra. - En el caso de espumas. un análisis del líquido escurrido si estos soportes se encuentran humedecidos. en condiciones de máxima asepsia. con el fin de obtener un número de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) comprendido entre los límites recomendados (30-300 UFC/placa). 13 de 51 . - Los polvos compactos deben disgregarse antes de mezclarlos. por cualquiera de los métodos que luego se describen.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. que no tenga actividad biocida. La dilución 1/10 es la recomendada para el análisis. - Las pastillas de jabón y otras muestras moldeadas se cortan con cuchilla estéril. de espátulas estériles. - En el caso de aerosoles. En el caso de que sospechemos que existe una elevada contaminación. en paralelo. Algunas de las acciones que se pueden realizar son las siguientes: - Los líquidos. Sin embargo. Control microbiológico del producto acabado microorganismos presentes y. es decir. se deben realizar diluciones decimales sucesivas en el diluyente escogido. puede suceder que esta dilución no sea la idónea para neutralizar las moléculas antimicrobianas del producto y recuperar los microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. Puede realizarse. antes de 45 min. Dilución Consiste en pesar o medir la muestra y diluir. y siempre en condiciones asépticas. - En el caso de toallitas cosméticas o parches. geles. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. si es necesario. éstos se extraen de su envase y se sumergen en el caldo neutralizante. por supuesto. en un mortero estéril con bolas de vidrio estériles. se pulveriza directamente dentro de un recipiente estéril y se diluye posteriormente. La muestra diluida debe procesarse. cremas y polvos se deben agitar bien dentro de su envase primario con ayuda. por su naturaleza.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Para pesar la muestra pueden utilizarse espátulas estériles. A veces es útil disgregar la muestra aspirando con la propia jeringa varias veces la muestra en el diluyente. puede realizarse una composición de muestras. - Dejar la muestra en contacto de 15 a 20 minutos (el que se haya determinado) para asegurar la completa inactivación de los conservantes. También puede ser necesario realizar una dilución más alta cuando la muestra no permita. agua de peptona tamponada) necesaria para completar un volumen final para una dilución 1/10. como hemos visto antes. Control microbiológico del producto acabado por lo que se deberá aumentar el volumen de diluyente (o reducir la cantidad de muestra) o probar diferentes neutralizantes. En este punto. Es recomendable que la cantidad de muestra sea de. una dilución 1/10. o jeringas desechables. por ejemplo las tres unidades del inicio del proceso de envasado y así sucesivamente. puede diluirse directamente en agua de peptona tamponada estéril. puede mantenerse esta temperatura hasta obtener una mezcla homogénea no más de 10 minutos. 14 de 51 . Muestras grasas Mezclar la muestra inicial con 5 g de polisorbato 80 estéril precalentado a una temperatura de 40ºC. que deben realizarse antes de los análisis de recuentos o detecciones de microorganismos. Los compuestos neutralizantes recomendados figuran en el anexo 2. Añadir la cantidad de diluyente (por ejemplo. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. y formar una emulsión. aunque en general todos los caldos neutralizantes que se comercializan contienen ya los neutralizantes más usuales. siempre en condiciones de asepsia. 1 g. Por otra parte. al menos. calentada previamente a 40ºC. Muestras miscibles en agua El proceso sería como sigue: - Diluir a una concentración 1/10 en un diluyente con neutralizantes y agitar hasta su completa solubilización. Este hecho se determina tras efectuar los ensayos de idoneidad (apartado 7). removiendo con una espátula estéril. - Si la muestra no presenta conservantes. Antes de realizar la siembra. como el polisorbato 80. agitar de nuevo la muestra. estafilococos coagulasa negativos.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Dentro de este grupo de microorganismos encontramos bacterias de la familia de las psedomonadáceas. Control microbiológico del producto acabado Muestras pulverulentas Tomar la cantidad de muestra necesaria y suspender en el diluyente apropiado. ya que los medios aconsejados contienen cloranfenicol. detectaremos éstos de forma selectiva. 15 de 51 . especies de Bacillus. enterobacterias. Recuento de bacterias aerobias mesófilas. Sin embargo. La metodología para el recuento de estos microorganismos dependerá del tipo de muestra a analizar y la sensibilidad que escojamos. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. ya que pueden crecer en estas condiciones. En el caso del recuento de mesófilos aerobios pueden detectarse colonias de hongos además de bacterias en el medio de cultivo para el recuento. En el caso del recuento específico de hongos. suspenderlos en el peso adecuado de diluyente neutralizante para conseguir una dilución 1/10. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Dentro de este grupo podemos encontrar microorganismos patógenos. Cada una de estas metodologías se describe a continuación. mohos y levaduras Las bacterias mesófilas aerobias son microorganismos que pueden desarrollarse en un medio nutritivo a 30-35ºC en condiciones aerobias. Otro tipo de muestras En el caso de otro tipo de muestras. 4. Si la muestra no contiene conservantes. para facilitar el desprendimiento de los posibles microorganismos de la muestra. por ejemplo toallitas o parches. es aconsejable añadir un tensioactivo no iónico. etc. lo más habitual es que se detecten microorganismos no patógenos para el ser humano pero que pueden alterar las características organolépticas del producto cosmético. y dejar solidificar. habitual en los productos cosméticos. Deben sembrarse. - Mezclar por rotación la muestra con el agar. el método es como sigue: - De la muestra diluida.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Brevemente.5 ± 2. fundido y mantenido a 48±3º C. evitando mojar la tapa de la placa. como mínimo. previamente rotulada en su base con el número de referencia de laboratorio. tomar 1 ml y depositarlo en una placa Petri vacía. - Incubar las placas en posición invertida a 32. a las 48 h podemos observar colonias. la dilución sembrada y la fecha de análisis. Este microorganismo. Se deja solidificar y se incuba el tiempo suficiente para que se desarrollen colonias microbianas. que indicarán el número de microorganismos cultivables presentes en la muestra. - Control de esterilidad del medio con agar nutritivo: depositar en una placa de Petri 20-25 ml del medio de cultivo elegido. Dejar solidificar e incubar como se describe anteriormente. pero en el caso de control microbiológico de tensioactivos aniónicos diluidos y productos con un elevado contenido en agua como son geles de baño.5ºC durante 72 h ± 6 h. dos placas por dilución. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. En general. es aconsejable prolongar la incubación 24 h más. 16 de 51 . para permitir el crecimiento de colonias de posibles microorganismos como Burkholderia. champús y acondicionadores capilares.5ºC. incubar de 3 a 5 días a 25 ± 2. - En el caso de recuento de hongos. - Añadir unos 20-25 ml del medio sólido para el recuento adecuado. Control microbiológico del producto acabado Siembra en masa (o por inmersión o en profundidad) La siembra en masa consiste en mezclar una alícuota de la muestra (o de una dilución de la misma) con un medio nutritivo no selectivo que contenga agar (ver medios sólidos para el recuento en el anexo 1). forma colonias muy pequeñas y difíciles de visualizar. Si hay agua en la superficie. si se ha realizado una dilución 1/10 del producto. por lo que es mucho más fácil aislarlas y observar su morfología que en el método de siembra en masa. se recomienda: a) Prolongar la incubación 24 h más y observar si ha habido un crecimiento de la colonia. contar el número de colonias que se han desarrollado en cada placa.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. b) Sembrar alguna placa más y guardarla a 4ºC. Calcular el número de UFC/g ó ml de muestra. lo que dificultaría este tipo de siembra. En estos casos. Cuadro 2 Hay ocasiones en las que. las placas pueden MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - Preparar previamente placas con el medio sólido para el recuento de elección. Control microbiológico del producto acabado - Control de esterilidad del diluyente: depositar en una placa de Petri 1 ml del diluyente sin muestra problema y añadir el medio con agar de igual forma.01% de resazurina recién preparada y esperar 15 minutos. c) Detección de colonias por la reducción de resazurina (descrito seguidamente): Método de reducción de resazurina Una vez incubadas las placas y antes de proceder a su lectura. Las colonias microbianas toman una coloración rosada por reducción de la resazurina. las colonias crecidas quedan en la superficie de la placa. El límite de sensibilidad de este método es de <10 UFC/ g ó ml de muestra. - Después de la incubación. Es aconsejable haberlas preparado con 48 h de antelación para comprobar que no están contaminadas y para que la superficie no tenga demasiada agua. En superficie o por extensión Se basa en repartir homogéneamente una alícuota de la muestra por toda la superficie de la placa de medio de cultivo. La comparación visual entre las placas incubadas en la estufa y las guardadas en la nevera puede aclarar si se está en presencia de crecimiento microbiano o de restos de producto. 17 de 51 . verter sobre ellas 10 ml de una solución al 0. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. teniendo en cuenta la dilución efectuada y el volumen sembrado (ver apartado “cálculo de resultados”). Incubar como se describe anteriormente. es difícil distinguir entre partícula de muestra o colonia. Mediante este método. por la propia naturaleza de la muestra. se debe comprobar con el proveedor de filtros la compatibilidad de las membranas). La sensibilidad de este método es de <100 UFC/g ó ml si se ha realizado una dilución 1/10 de la muestra. junto con la dilución sembrada. - Depositar. en ese caso para el agua desionizada. 100 µl de la dilución inicial en la superficie de la placa. En la Unidad 3 de este módulo veremos un esquema del proceso de filtración. mediante una micropipeta. - Tras la incubación. 18 de 51 . - Dejar 10 minutos a temperatura ambiente e incubar las placas de forma invertida. No se recomienda para aquellos productos que puedan colmatar el filtro aun muy diluidos. - Mediante un asa de Drigalsky esterilizada (flameada con alcohol) y fría o bien un asa de Drigalsky desechable. para los que puedan formar espuma o para los productos que puedan dañar el filtro debido a su composición (por ejemplo aquellos con disolventes. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - Realizar los controles de esterilidad sembrando 100 µl del diluyente. teniendo cuenta que se han sembrado 100 µl (ver apartado “cálculo de resultados”). - Rotular las placas en su base con el número de referencia de laboratorio y la fecha de análisis. Realizar el ensayo por duplicado. tal y como se explica en el apartado anterior. Filtración a través de membrana Este método se recomienda en aquellos casos en los que la contaminación microbiana de las muestras es muy baja (<10 UFC/g ó ml) o cuando sea imposible la neutralización de los agentes conservantes presentes en la muestra mediante dilución (dato obtenido en el ensayo previo de idoneidad). Control microbiológico del producto acabado abrirse dentro de la Cabina de Seguridad Biológica conectada y mantenerlas así unos minutos. En este caso. hasta que el líquido quede completamente absorbido. contar las colonias crecidas y calcular las UFC/g ó ml de muestra. repartir el inóculo por toda la superficie mediante un movimiento de rotación.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. 45 µm de diámetro de poro. transferir el filtro a la superficie de una placa de Petri que contenga unos 20-25 ml del medio sólido apropiado para el recuento. 19 de 51 . filtrando la cantidad correspondiente.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. a las condiciones que se explican en los apartados anteriores. Tapar las placas e incubar en posición invertida. El límite de sensibilidad de este método es de ausencia de UFC en los g ó ml de muestra filtrados. Desechar aquellas que tengan menos de 30 colonias. Control microbiológico del producto acabado Brevemente. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - Realizar el control de esterilidad del diluyente. Calcular el número de UFC/g ó ml de la muestra (ver apartado “cálculo de resultados”). - Hacer una media del número de colonias de las placas correspondientes a la misma dilución. Asegurarse de que toda la superficie del filtro se queda en contacto con el agar. desechando aquellas que presenten número superior a 300 (100 en el caso de filtración a través de membrana) o superior a 150 (en el caso de hongos). excepto si provienen de la única y mínima dilución efectuada. Cálculo de resultados - Contar el número de UFC obtenidas en las placas. Para evitar que queden burbujas. - Con ayuda de unas pinzas estériles. contar el número de colonias que se han desarrollado en cada placa. es aconsejable depositar el filtro en la superficie suavemente. - Realizar el proceso por duplicado. - Filtrar a través de un filtro de membrana estéril de 0. el método es como sigue: - Tomar 10 ml de muestra diluida previamente y diluir en 90 ml de agua de peptona tamponada. - Después de la incubación. - Lavar tres veces el filtro con 100 ml de líquido de lavado estéril (ver anexo 2). empezando por un extremo. el resultado se expresa como ausencia en X gramos o mililitros de muestra (aquellos de la muestra inicial que se hayan filtrado). si se había realizado una dilución 1/10 del producto. redondeando al número superior en el caso del número 5. si no se observan colonias en las placas correspondientes a la dilución inicial. - Expresar el resultado como UFC/g ó ml de la muestra. - En el caso de la técnica de siembra en superficie. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - Un recuento de 2 colonias en las placas de control negativo (control del diluyente y control del medio de cultivo con agar) invalida los ensayos efectuados. - En el caso de la técnica de siembra en placa en masa. - El resultado siempre se expresará en notación exponencial con un número entero y una cifra decimal. si no se observan colonias en las placas.2 x 103 UFC/ g ó ml de muestra. - Multiplicar por la inversa de la dilución efectuada. se expresará el resultado como < 10 UFC/ g ó ml. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 43 + 40 = 41. 20 de 51 .FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. de la que hemos sembrado 1 ml en el medio sólido.5 2 - La media de las dos placas será: - Redondear a 42. Control microbiológico del producto acabado - Multiplicar el resultado obtenido por la inversa de la dilución efectuada. si no se observan colonias en las placas correspondientes a la dilución inicial. - El resultado final será: 4. si se había realizado una dilución 1/10 del producto. - En el caso de la técnica de filtración a través de membrana. Ejemplo: - Obtenemos 43 y 40 colonias en las dos placas correspondientes a una dilución de 10-2 (ó 1/100). se expresará el resultado como <100 UFC/g ó ml. nos indica un riesgo que no tenemos controlado y que podría ser un problema importante si no actuamos en consecuencia. higiene íntima. - Se ha realizado alguna actuación en la maquinaria de producción/envasado. personas inmunodeprimidas (hospitales). ancianos. pieles atópicas. Este método es aconsejable utilizarlo en los siguientes casos (como mínimo): - Es una primera fabricación de un producto o se ha cambiado algún ingrediente relevante. pero no permite el recuento. Es importante que estos microorganismos se identifiquen. - Es un producto destinado a población especialmente sensible (bebés. Aunque los límites recomendados por diferentes Organismos sobre contaminación microbiológica en el producto acabado sitúan ésta como 100-1000 UFC/g de microorganismos no considerados patógenos (ver apartado 8). De esta forma detectamos cualquier microorganismo que haya accedido al producto y no haya sido inhibido inicialmente por el sistema conservante. la presencia de microorganismos.) - Ha habido problemas de contaminación previos. - Qué microorganismos son habituales (house) en la planta (Módulo III). en teoría. Detección de microorganismos aerobios mesófilos (enriquecimiento) Mediante este método pueden detectarse menos de 10 UFC/g ó ml de muestra de. Control microbiológico del producto acabado 5. virtualmente. cualquier microorganismo aerobio mesófilo cultivable presente en ella. Un valor de UFC/g ó ml por debajo del límite recomendado no implicaría. etc. - La eficacia del sistema conservante. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - La calidad de las materias primas. detectada por este método. - Se ha cambiado alguna etapa en la producción. ya que la detección y la identificación generan una información muy valiosa que nos puede orientar sobre: - Las condiciones de producción (higiene de las instalaciones o del procesado).FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. el MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. 21 de 51 . MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. como hemos visto antes. este método no sería aconsejable. En ausencia de crecimiento.5ºC durante 48-72 h.5 ± 2. la detección de Staphylococcus aureus. - Sembrar en masa 1 ml en agar nutritivo o bien realizar una siembra mediante asa de Kolle en una placa de medio nutritivo no selectivo. La detección de otro tipo de microorganismos (incluyendo los indicadores de contaminación fecal. si las condiciones productivas son óptimas. Detección de microorganismos patógenos Para los cosméticos. en aquellos casos en los que no podemos neutralizar por ningún otro medio las propiedades antimicrobianas de la muestra. pero sí que nos está advirtiendo de que las condiciones de producción no son las mejores o bien que el sistema conservante de la fórmula. Este método se aconseja. por su naturaleza. siempre presentan una contaminación basal. inocular 10 ml de esta dilución en 90 ml de un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) e incubar siguiendo las mismas condiciones de tiempo y temperatura. 22 de 51 . El método es como sigue: - Incubar la dilución 1/10 en diluyente neutralizante a 32. Si se ha diluido la muestra en agua peptonada. y otros productos tópicos. como Escherichia coli) podría ser de interés dado que estos microorganismos pueden sugerir condiciones higiénicas inadecuadas durante el proceso de fabricación. - También puede realizarse este método filtrando la muestra inicial e incubando en las mismas condiciones el filtro sumergido en un caldo nutritivo. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Control microbiológico del producto acabado rechazo del lote. Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans puede ser relevante puesto que pueden producir infecciones en la piel y ojos.5ºC durante 24 h. En el caso de productos cosméticos que. no es el adecuado.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. - Incubar las placas a 32.5 ± 2. 6. ya que se detectarían siempre microorganismos. expresar el resultado como ausencia de microorganismos en X g ó ml (dependiendo de los gramos o mililitros que se hayan analizado). no esporulado. seguido de un aislamiento en un medio de agar selectivo y ensayos de identificación posteriores.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. se debe comprobar y validar la neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto (ver apartado 7). aunque existen algunas cepas de E. - Si la muestra no presenta conservantes. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. para permitir la detección de los microorganismos viables. Se debe neutralizar la posible inhibición del crecimiento microbiano en la muestra. de forma alternativa se puede diluir o suspender directamente 10 g en 90 ml de caldo triptona y soja. dejar unos minutos en contacto y transferir 10 ml de esta mezcla a 90 ml de un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja). 23 de 51 . su presencia en un producto cosmético indica que éste ha tenido contacto con. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. etc. El método para la detección de E. se pueden diluir los 10 g de muestra en dicho diluyente neutralizante. coli es como sigue: - Si la muestra presenta conservantes. coli en un medio líquido no selectivo (caldo de enriquecimiento). coli infecciosas y toxigénicas para el ser humano. debido a su origen. colutorios.) la presencia de E. coli podría indicativo de otras bacterias de transmisión fecal-oral. Es un bacilo Gram negativo. La supervivencia de estas bacterias en medios fuera del natural es limitada. por lo que. El método se basa en la detección de E. Por estas razones. y por tanto está contaminado por. por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Control microbiológico del producto acabado Detección de Escherichia coli E. móvil. previamente al análisis. Para cosméticos cuyo uso pueda implicar una ingestión accidental (dentífricos. coli es un microorganismo de la familia de las enterobacterias. Se encuentra en el intestino del ser humano principalmente y. diluir o suspender 10 g de muestra en 90 ml de diluyente neutralizante Alternativamente. materia de origen fecal. la importancia de su detección en la mayoría de cosméticos es la indicada en primer término. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes y. E. oxidasa negativa. - Incubar a 32. En el caso de productos filtrables. sembrar una placa de McConkey con una cepa de referencia de E. Detección de Staphylococcus aureus S. Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de E. En medios no selectivos forma colonias lisas generalmente pigmentadas en amarillo debido a la producción de un pigmento carotenoide. oxidasa negativa. S. Son inmóviles. Para confirmar los resultados. Control microbiológico del producto acabado - Incubar la dilución o suspensión descrita a 32. - Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar McConkey. coli. que es una de las características que definen a las especies patógenas de estafilococos. crecimiento en medio selectivo que contenga sales biliares formando colonias características (por ejemplo medio EMB-Levine Eosina-Azul de metileno). aureus produce el enzima coagulasa. aureus es un microorganismo Gram positivo catalasa positiva.5 ± 2. 24 de 51 . que aparece al microscopio óptico en agrupaciones irregulares.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. fermentación de lactosa. no esporulados y son capaces de multiplicarse a altas concentraciones de cloruro sódico. A diferencia de otras especies de estafilococos. se puede filtrar la muestra diluida. Las colonias están formadas por bacilos Gram negativos oxidasa negativa. coli son: bacilos Gram negativos. (1) Las principales características para la identificación de E.5 ± 2. sumergir el filtro en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba. por lo que comúnmente se conoce a esta especie como estafilococo dorado. coli en 10 g ó ml de producto. en forma de coco.5 ºC durante 20 h como mínimo y 72 h como máximo. realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado. catalasa positiva.5 ºC durante 24-48 h. coli en agar McConkey son granates con un halo de precipitación alrededor. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. producción de indol. y tras el lavado de la membrana. Como control positivo del crecimiento. Las colonias de E. forúnculos. etc. aureus posee una gran capacidad para sobrevivir en un ambiente adverso y. sembrar una placa del medio selectivo con una cepa de referencia S. estafiloquinasas. S. - Incubar a 32. producción de enzimas como catalasa. debe validarse la detección de este microorganismo en el producto en cuestión (ver apartado 7). acaba produciendo infección. aureus. coagulasa. epidermis íntegra. o la secreción de diversas toxinas como la exotoxina epidermolítica. β-lactamasas. como Manitol Hipersalino o Vogel Johnson.5 ºC durante 20-72 h. foliculitis. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Baird Parker. Control microbiológico del producto acabado El principal reservorio de S. aureus es el ser humano (especialmente en las fosas nasales de portadores sanos así como en los pacientes infectados). etc. que en buena parte se aplican en este órgano. Presenta asimismo un elevada capacidad de adherencia a diversos sustratos in vitro. enterotoxinas o la toxina del síndrome de shock tóxico). coli) en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial. el síndrome de la piel escaldada. La colonización puede darse sobre la mucosa nasal. El método para su detección es como sigue: - Proceder de igual forma que en apartado anterior (detección de E. Al igual que en el caso de E. lipasas. heridas en fase de cicatrización. Como control positivo del crecimiento.5 ± 2. aureus interacciona con múltiples receptores del hospedador a través de diversos componentes de superficie. Pueden utilizarse otros medios selectivos. S. Es un importante patógeno de la piel y puede provocar infecciones como el impétigo.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Además. hialuronidasa. componentes antigénicos de la pared. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. orofaringe. coli. úlceras crónicas cutáneas. por la acción de sus determinantes de patogenicidad (cápsula mucoide polisacárida. por lo que es muy importante su detección en los productos cosméticos. 25 de 51 . celulitis. albicans puede producir infecciones en la piel.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. se puede filtrar la muestra diluida y tras el lavado del filtro. La infección puede comprometer casi cualquier superficie en el cuerpo. coagulasa positiva. húmedas y con pliegues como las axilas y la ingle. agrupados irregularmente. pero se presenta con mayor frecuencia en áreas cálidas. Detección de Candida albicans C. (1) Las principales características para la identificación son: cocos Gram positivos. Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado. Las colonias están formadas por cocos Gram positivos en grupos irregulares y catalasa positiva. También es responsable de la candidiasis vaginal y de infecciones en la mucosa bucal. Como en los casos anteriores. previamente debe validarse la detección de este microorganismo en el producto en cuestión (apartado 7). catalasa positiva. brillantes y rodeadas por un halo claro con precipitación. Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de S. aureus en 10 g ó ml de producto. cremosas y con forma convexa en la superficie de un medio no selectivo. Control microbiológico del producto acabado Las colonias de S. sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba. En el caso de productos filtrables. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. albicans es una levadura que forma colonias blancas a beige. 26 de 51 . como las mucosas. El método para su detección es como sigue: - Proceder de igual forma que en los apartados anteriores en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial. C. las candidiasis más graves (candidiasis diseminadas) se observan en personas inmunodeprimidas o con enfermedades subyacentes que predisponen a la infección. Además de otras zonas corporales. aureus en Baird-Parker son negras. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Sin embargo. 5 ºC durante 20-72 h. aeruginosa es también causa de sepsis en pacientes con graves quemaduras. especialmente del agua. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. se puede filtrar la muestra diluida y tras el enjuague del filtro. En el caso de productos filtrables. tras la tinción Gram. muy grandes respecto a las de bacterias. Es un microorganismo que se puede aislar a partir de una gran variedad de fuentes ambientales. abscesos de la esclerótica y endolftalmia. Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de C.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Por tanto. sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba. 27 de 51 . Detección de Pseudomonas aeruginosa Es un bacilo Gram negativo oxidasa positiva. - Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado. albicans. y es una causa frecuente de queratitis bacteriana. y tiene un gran potencial para contaminar diferentes substratos. - Incubar a 32. Pseudomonas puede causar infección en la córnea. de color violeta. tanto por su potencial patogenicidad como por su capacidad de afectar algunas propiedades fisicoquímicas de la fórmula cosmética. se pueden observar células ovoides. a veces con células en gemación. Forma colonias características en medios como el agar Biggy o Nickerson. Al microscopio. P. (1) Las colonias de C. aeruginosa es un patógeno oportunista y raramente provoca infecciones en personas sanas. albicans en agar Saboraud son blancas (como el color del yeso). albicans en 10 g ó ml de producto. sembrar una placa de cada medio con una cepa de referencia C. su presencia es indeseable en los productos cosméticos.5 ± 2. Control microbiológico del producto acabado - Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Sabouraud-cloranfenicol. P. Como control positivo del crecimiento. También puede causar infecciones en heridas y de las uñas. sobre todo en aquellas personas cuyas manos están frecuentemente sumergidas en el agua. el humor acuoso y el vítreo de los ojos. FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. sembrar una placa del medio con una cepa de referencia P. Forma el pigmento piocianina en el agar P Pseudomonas. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. como un ensayo por ejemplo) que se cumplen los requisitos para una aplicación o utilización prevista (ISO 9000:2000). (1) Las principales características para la identificación son: bacilos Gram negativos. oxidasa positiva. se puede filtrar la muestra diluida y tras el lavado del filtro. Como control positivo del crecimiento. - Incubar a 32. Control microbiológico del producto acabado El método para su detección es como sigue: - Proceder de igual forma que en los apartados anteriores en cuanto a la dilución e incubación de la muestra inicial. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Comprobación de la idoneidad del método (neutralización y recuperación) Validación y neutralización. aeruginosa. Realizar los ensayos bioquímicos de identificación (1) o bien utilizar un sistema de identificación miniaturizado. sumergirlo en un caldo nutritivo (por ejemplo de triptona y soja) y seguir el proceso como se indica más arriba.5 ± 2. En el caso de productos filtrables. Generalidades Validar significa confirmar. En Microbiología es particularmente importante para evitar obtener falsos negativos y para no poner en riesgo la salud de los consumidores. mediante evidencias objetivas (es decir. aeruginosa en agar Cetrimide son pigmentadas (de color amarillo-verdoso-marrón) con fluorescencia bajo la luz UV. Es decir. Las colonias de P. Las colonias están formadas por bacilos Gram negativos oxidasa positiva. mediante datos que verifiquen la veracidad. el proceso de validación tiene por objeto comprobar que un método es aceptable para el uso que se ha previsto. Los resultados se expresarán como ausencia o presencia de P. 7.5 ºC durante 20-72 h. - Realizar una siembra del caldo de enriquecimiento con el asa de Kolle en agar Cetrimide. aeruginosa en 10 g ó ml de producto. 28 de 51 . la comprobación de la aptitud del método debe realizarse siempre ante un nuevo producto/reformulación. comprobamos la idoneidad del método. equipos. De esta manera. etc. nos encontraremos con una gran diversidad de productos a analizar y con la variabilidad y diferentes concentraciones de los ingredientes conservantes y otros antimicrobianos en las muestras. En el análisis microbiológico de productos cosméticos trabajamos básicamente con dos tipos de comprobación de la idoneidad del método: MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. materia prima. el proceso de comprobación de la idoneidad corrobora si nuestro método es capaz de detectar y recuperar el número de microorganismos conocido que habremos inoculado previamente. Control microbiológico del producto acabado Sin embargo. Por eso. el aspecto en el medio sólido de las colonias formadas. la no toxicidad del diluyente y la neutralización de los conservantes del producto que puedan estar inhibiendo el crecimiento microbiano. que poseen una gran variabilidad inherente a su naturaleza. el tiempo de incubación. forma de dispersar la muestra (solubilizante. los desarrollados internamente. 29 de 51 . como hemos visto anteriormente. Además. analistas.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. sobre todo en el caso de utilizar un solubilizante o una temperatura un poco elevada en aquellas muestras difíciles de disolver o suspender. En nuestro caso. Como en este tema desarrollamos métodos normalizados. etc. Esta prueba también permite comprobar que el método funciona en nuestro laboratorio. con nuestros medios de cultivo. el término “validación” se recomienda para aquellos métodos no normalizados. temperatura…). se evidencia que el procesado de la muestra no afecta a los microorganismos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Es decir. además de que se dispersan de forma no homogénea en la muestra. No debemos olvidar que trabajamos con organismos vivos. a conocer más el producto al que haremos el Control de Calidad rutinario posterior respecto a la dilución a aplicar y diluyente. también. es recomendable hablar de idoneidad o aptitud del método. nos ayuda a familiarizarnos con el producto a analizar. Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración). Además. los normalizados aplicados fuera de su alcance o si hay ampliaciones o modificaciones (UNE-EN-ISO 17025:2000. Nos ayuda. etc. más que de validación estricta. como hemos visto anteriormente. los vayamos a detectar mediante un método rápido) seguirán con su acción sobre los microorganismos presentes. Neutralizar los conservantes de la muestra a ensayar es de vital importancia. Un ejemplo son los alcoholes. 30 de 51 . Sin embargo esta técnica no es aplicable a todo tipo de muestras. polisorbato 80. hace que la neutralización sea. Además de estas moléculas. y comprobamos si el método es capaz de recuperarlos. ya que si éstos están aún activos cuando permitamos desarrollarse a los microorganismos en una placa (o. Para ello. Este tema lo veremos con más detalle en el Módulo IV. lecitina. - Adición de compuestos neutralizantes al diluyente de la muestra: es el método más empleado y se explica en el Cuadro 3. en la mayoría de casos. los caldos neutralizantes llevan en su composición todos aquellos requerimientos nutritivos que se necesitan para realizar un MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. diluida en el caldo neutralizante.) que. tienen en su composición tres o cuatro moléculas neutralizantes (tiosulfato de sodio. efectiva. La neutralización puede conseguirse por tres métodos: - Dilución: hay moléculas que se inactivan rápidamente en dilución. por lo que. probablemente. debido a su coeficiente de dilución (ᶯ) elevado. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Control microbiológico del producto acabado - Cuantitativa: permite cuantificar el número de microorganismo presentes en la muestra. no podrán formar colonias. - Cualitativa: nos permite detectar la presencia o ausencia de un determinado microorganismo o grupo de microorganismos. junto con la propia dilución que se efectúa (1/10 como mínimo). bien deshidratados o bien listos para usar.45 µm excluye cualquier sustancia inhibitoria del crecimiento microbiano. de la misma manera. inoculamos un número de microorganismos conocido en la muestra problema. Los caldos neutralizantes que se comercializan. etc. - Filtración: el proceso de filtración con filtros de 0. cisteína.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. bien por reacciones químicas (como el tiosulfato de sodio) o bien por la disposición de las moléculas. que engloban o forman complejos con los conservantes (ver Figura 1). puesto que sus componentes revivifican a los microorganismos de la muestra. C: constante de unión del conservante al tensioactivo. tomando como ejemplo conservantes como los parabenos. como el polisorbato 80). Valor cualitativo de R de diferentes conservantes cosméticos y el polisorbato 80. Figura 2. S: concentración de tensioactivo. como sucede en el caso de los tensioactivos no iónicos (sobre todo aquellos muy etoxilados. se genera una gráfica como la que se muestra en la Figura 2. Para el método de recuento también son válidos. que se encuentran en condiciones de estrés debido a los ingredientes cosméticos. Conservante R Metilparabeno Alto Etilparabeno Alto Propilparabeno Alto Butilparabeno Alto Amonios cuaternarios Alto Clorhexidina Alto Fenoxietanol Medio Bronopol Bajo Quaternium 15 Bajo Diazolidinil urea Bajo Clorfenesina de Cosméticos. Tabla III. Relación entre parabeno total y parabeno libre (R) en función de la concentración de agente neutralizante (polisorbato 80). Posibles interacciones de los tensioactivos no iónicos con los conservantes La relación de un conservante con una molécula inactivadora. en este caso un tensioactivo no iónico como el polisorbato 80. Bajo Sonia Leranoz y Pilar Orús MCC – Microbiología y Conservación Alcohol bencílico Bajo Triclosán Bajo Yodopropinil butil carbamato Bajo Ácido benzoico Bajo Pág. Figura 1. Control microbiológico del producto acabado enriquecimiento de la muestra y permitir que los microorganismos puedan multiplicarse.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Cuadro 3 Neutralización química Existen moléculas (ver anexo 2) que neutralizan las sustancias antimicrobianas. 31 de 51 . puede definirse por la siguiente ecuación: R=SC+1 donde: R: relación conservante total: conservante libre (no unido al tensioactivo). La Tabla III recoge una comparación de valores cualitativos de R con diferentes conservantes cosméticos y el polisorbato 80. Si representamos R en función de la concentración de polisorbato. Staphylococcus aureus ATCC 6538 (o cepa equivalente. Control microbiológico del producto acabado Idoneidad del método de siembra por inclusión Microorganismos Para ensayar la eficacia de los neutralizantes y la recuperación de microorganismos. el segundo o el tercero debe ser de 36-48 h (UNE-EN-ISO 21148). recomienda una incubación de estos subcultivos de 18-24 h y en el caso de C. etc. instalaciones.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. por ejemplo CECT 239). una representativa de bacterias Gram negativas y otra de Gram positivas. . pero también puede ser útil validar el método con aquellas cepas de microorganismos que hayamos aislado de productos. por ejemplo CECT(2) 111).Candida albicans ATCC 10231 (o cepa equivalente.5ºC durante 18 a 24 h. . y un hongo (para validar el método de recuento de mohos y levaduras): . es decir.5ºC ± 2. 32 de 51 . (2) Colección Española de Cultivos Tipo. Para el ensayo de idoneidad se aconseja utilizar cepas que no sean particularmente resistentes a los conservantes o las condiciones impuestas por el producto. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. por ejemplo CECT 1394). Alternativamente. (1) American Type Culture Collection. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág.Pseudomonas aeruginosa ATCC(1) 9027 (o cepa equivalente. La Normativa ISO recomienda trabajar con el segundo o tercer subcultivo a partir del stock de microorganismos. trabajar en el “peor caso” posible o con los microorganismos en principio más sensibles. albicans. se puede usar como especie Gram negativa Escherichia coli ATCC 8739 (CECT 516). Se incuba a 32. como son las cepas de colección. Método Un esquema del proceso se muestra en la Figura 3. se siembra cada cepa en la superficie de agar nutritivo no selectivo. En el caso de bacterias. se utilizan dos cepas bacterianas. - Antes del ensayo. es decir. por duplicado. 10-3 en el caso de C. lo hacen menos (o la dispersan más). El ajuste del número de células puede realizarse por ejemplo espectrofotométricamente. por duplicado. para un mismo valor de DO tendremos un mayor número de células pequeñas y menos de las grandes. ajustando el %T (Transmitancia) al 50% o. diluyendo hasta obtener un número de UFC/ml entre 1-3x102 (dilución 10-6 ó 10-4 en el caso de C. mientras que las más pequeñas. Por esta razón. Sembrar 1 ml en una placa de Petri. Esta suspensión estandarizada y sus diluciones deben utilizarse antes de 2 h. - Realizar los mismos pasos para cada microorganismo. a 580-600 nm de longitud de onda1. albicans). como los cocos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. albicans). se raspa la superficie del cultivo con un asa estéril y se resuspende en un diluyente adecuado (por ejemplo solución de Ringer o de NaCl al 0.5. es útil preparar una batería de diluciones de la suspensión inicial y generar una gráfica que relacione el %T (o DO) con las UFC/ml. Dejar 15-20 min de contacto. El %T y la DO depende sobre todo de la forma de la célula: las células más grandes. alternativamente la Densidad Óptica (DO) a 0. - Mezclar 9 ml de la dilución de la muestra con 1 ml de una suspensión del microorganismo que contenga entre 1x103 y 3x103 UFC/ml (dilución 10-5 en el caso de bacterias. - En paralelo. realizar el ensayo control. - Diluir la muestra en el caldo neutralizante a la dilución 1/10 (o mayor.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. pero sin muestra. utilizar el mismo diluyente y la misma suspensión del microorganismo. Control microbiológico del producto acabado - Para preparar la suspensión bacteriana o fúngica.25%) para obtener una suspensión estandarizada de unas 1x108 UFC/ml (1x106 UFC/ml en el caso de C. si no se ha podido validar la primera). - Realizar un recuento inicial del número de microorganismos de la suspensión inicial. para hacer una suspensión de células tan grandes como las de las levaduras. es decir. (1) Para conocer qué concentración celular tenemos en una suspensión de una determinada especie de microorganismo respecto al %T (o DO) y a una determinada longitud de onda. como las células de Pseudomonas o las de las levaduras “absorben” más luz. verter agar nutritivo e incubar a la temperatura adecuada. albicans). - Transferir 1 ml a una placa Petri. la suspensión deberá tener un aspecto lechoso para conseguir el %T o DO necesaria. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. y verter entre 15 y 20 ml del medio de agar nutritivo adecuado fundido. 33 de 51 . y al revés en el caso de %T. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Control microbiológico del producto acabado - Después de incubar durante 24 a 72 h a 32. agentes neutralizantes o una combinación de ambos). albicans).5 ºC (3 a 5 días a 25 ± 2.5 ºC ± 2. - Contar las colonias de las placas que proceden del producto diluido y comparar los resultados con los recuentos obtenidos en el control. 34 de 51 . el 50% del recuento del control. Si el recuento es menor del 50% respecto al control. tal y como se explica en el texto. Esquema del ensayo de idoneidad del método de recuento de bacterias mesófilas aerobias mediante siembra en masa. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos.5 ºC en el caso de C. La idoneidad de la neutralización y del método de recuento queda comprobada a esta dilución 1:10 si el recuento en las placas que provienen del producto diluido e inoculado es de.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. se debe modificar el procedimiento (diluyentes. Para validar el recuento de hongos (C. albicans) modificar las concentraciones de inóculo y la temperatura de incubación.3x108 UFC/ ml) Diluir hasta 10-5 Muestra 1000 -3000 UFC/ml Realizar recuento inicial 10 g producto + 90 ml diluyente neutralizante 15-20 min 1 ml 1 ml 10 ml diluyente (control) 10 ml muestra diluida 1 ml 1 ml Incubar a 30-35ºC durante 24-48h Figura 3. al menos. Suspensión del microorganismo a validar (1. comprobar primeramente que la dilución inicial contenía el número de UFC esperado (recuento inicial). se preparan las placas control con el mismo diluyente y la misma suspensión del microorganismo.5ºC en el caso de C. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. albicans). 35 de 51 . albicans). - Después de la incubación durante 24 a 72 h a 32. Transferir la membrana a la superficie de un medio de agar nutritivo adecuado. Idoneidad del método de filtración a través de membrana - Se preparan las suspensiones microbianas como se explica en el apartado de comprobación de la idoneidad del recuento por inclusión. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - Se mezclan 9 ml de la muestra inicial diluida con 1 ml de la suspensión del microorganismo que contenga entre 1x104 y 5x104 UFC/ml (o de la dilución 10-4.5 ºC (3 a 5 días a 25 ± 2. el 50% del recuento del control. albicans) con el volumen de la dilución de la muestra empleada en el ensayo. si se van a dispersar 0. se cuentan las colonias de las placas y se comparan los recuentos obtenidos para la muestra y el control. pero sin muestra.1 ml en la superficie de una placa de agar solidificado por duplicado.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. diluyente o diluyente neutralizante. - Mezclar la cantidad adecuada de suspensión estandarizada de microorganismos que corresponda aproximadamente a 100 UFC (dilución 10-6. Control microbiológico del producto acabado Idoneidad del método de la siembra en superficie - Se preparan las suspensiones microbianas como se explica en el apartado anterior. - La aptitud del neutralizante y el método de recuento queda probada a una dilución 1:10 si el recuento a partir del tubo con el producto diluido es de. al menos. En paralelo. 10-2 en el caso de C.5 ºC ± 2.1 ml. agentes neutralizantes o una combinación de ambos). - Filtrar inmediatamente todo el volumen y lavar la membrana usando volúmenes definidos de agua. Del mismo modo que en el apartado anterior. se debe modificar el procedimiento (diluyentes. si el recuento es menor del 50% respecto al control. Se siembran dichos 0. 10-4 en el caso de C. En sólo uno de los tubos (ensayo de idoneidad). el 50% del recuento de las del control. se debe modificar el procedimiento (diluyentes. se inoculan 0. - Mezclar bien e incubar los dos tubos (ensayo de aptitud y control) a 32. En este caso se utilizan las mismas cepas de referencia que en el apartado anterior.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Después de incubar durante 24 a 72 h a 32. 106 en el caso de la levadura) y se diluye para obtener un recuento final entre 100 y 500 UFC/ml (dilución 10-6 o 10-4 en el caso de C. al menos. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Control microbiológico del producto acabado - En paralelo.5 ºC ± 2. si el recuento es menor del 50% respecto al control. albicans). - Determinar el número de UFC en dicha suspensión estandarizada. 36 de 51 . agentes neutralizantes o una combinación de ambos). sembrando 1 ml de la suspensión a una placa Petri por duplicado en un agar nutritivo e incubando a la temperatura adecuada.5 ºC en el caso de C.1 ml de la suspensión de microorganismos que se ha preparado anteriormente. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. El control se filtra y se lava en las mismas condiciones. se prepara un control en las mismas condiciones. La idoneidad del método de filtración a través de membrana y el diluyente queda comprobada si el recuento en las placas del ensayo de idoneidad es de. Idoneidad del método de detección de bacterias mesófilas aerobias y hongos por enriquecimiento En la Figura 4 se muestra un esquema del proceso. pero sin producto.5 ºC ± 2. - Se prepara una suspensión estandarizada de cada cepa (108 UFC/ml. Del mismo modo que en los apartados anteriores. albicans). - Preparar por duplicado la dilución inicial de la muestra en las condiciones seleccionadas para el ensayo (al menos 1 g o 1 ml de producto en el volumen definido de caldo de enriquecimiento) por ejemplo en tubos asépticos de 10 ml.5 ºC durante 20 a 24 h. se cuentan las colonias de las membranas y se comparan los recuentos obtenidos para la muestra y para el control.5 ºC (3 a 5 días a 25 ± 2. entre 15 y 20 ml de medio de agar nutritivo no selectivo. - Después de la incubación. aeruginosa: crecimiento del cultivo amarillento o verdoso en la placa del ensayo de idoneidad y sin crecimiento en la placa control.1 y 0. - Se incuban las placas a 32.5 ml sobre la superficie de una placa Petri que contenga. Idoneidad del método de detección de microorganismos patógenos En la Figura 4 se muestra un esquema del proceso. aproximadamente. inocular entre 0. - Antes del ensayo. la aptitud del ensayo queda probada si el microorganismo de interés se recupera en la placa que procede del tubo inoculado. Si en las placas que proceden del tubo control (sin inocular) se recupera crecimiento (en este caso nuestro producto tendría una contaminación basal).5 ºC durante 24 a 48 h. Control microbiológico del producto acabado - Para cada tubo incubado. la suspensión normalizada de microorganismos contenía entre 100 y 500 UFC/ml (recuento inicial). o Para P. comprobar que. para cada cepa.5 ºC ± 2. albicans: crecimiento de colonias de color blanco en la placa del ensayo de idoneidad y sin crecimiento en la placa control. También puede sembrarse la alícuota por inclusión. o Para C.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. aureus: cultivo pigmentado en amarillo en la placa del ensayo de idoneidad y sin crecimiento en la placa control. 37 de 51 . Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - La neutralización y el método de detección quedan validados si el crecimiento microbiano en el tubo inoculado presenta las características que a continuación se definen: o Para S. se inocula la superficie de agar nutritivo adecuado (no selectivo y no neutralizante) con los cuatro microorganismos de interés: MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Con un asa estéril se siembra una alícuota de la mezcla incubada sobre la superficie de medio de agar selectivo apropiado (McConkey para E. Se mezclan e incuban ambos tubos (ensayo de idoneidad y control sin inocular) a la temperatura adecuada de 20 a 24 h.para S. albicans). como se describe en apartados anteriores. Baird-Parker –MSA o Vogel Johnson. - Se inoculan 0. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 38 de 51 . 8 una suspensión 6 estandarizada de aproximadamente 1 x 10 UFC/ml (1 x 10 UFC/ml en el caso de C. albicans). aureus ATCC 6538 o CECT 239 o C. - Preparar por duplicado la dilución inicial de la muestra en las condiciones seleccionadas para el ensayo (al menos 1 g o 1 ml de producto en el volumen definido de caldo de enriquecimiento) por ejemplo en tubos asépticos de 10 ml. coli. Se incuban las placas a la temperatura adecuada de 24 a 48 h. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. tal y como se describe en el apartado anterior. aureus. albicans ATCC 10231 o CECT 1394 o P. Cetrimide para P. En sólo uno de los tubos (ensayo de idoneidad). albicans). - Preparar una dilución de la suspensión estandarizada para obtener un recuento final de entre 100 y 500 UFC por ml (dilución 10-6. Control microbiológico del producto acabado - o E. - Realizar un recuento de la suspensión diluida para cada cepa. aeruginosa y Saboraud-cloranfenicol para C.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1.1 ml de la suspensión de microorganismos que se ha preparado anteriormente. - Se realiza un aislamiento de cada tubo o recipiente (ensayo de idoneidad y control sin inocular).1 ml de la suspensión de los microorganismos en el tubo correspondiente a la prueba de aptitud. se inoculan 0. 10-4 en el caso de C. aeruginosa ATCC 9027 o CECT 111 Realizar. coli ATCC 8739 o CECT 516 o S. la suspensión normalizada de microorganismos contenía entre 100 y 500 UFC/ml. 39 de 51 . Si en las placas que proceden del tubo control (sin inocular) se recupera crecimiento (en este caso nuestro producto tendría una MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. La neutralización y el método de detección quedan probados si el crecimiento microbiano en las placas del ensayo de idoneidad presenta el aspecto característico para cada microorganismo.1 ml 10 ml muestra diluida 10 ml muestra diluida TUBO ENSAYO VALIDACIÓN TUBO CONTROL Incubar durante 24-48h Sembrar en medio adecuado (selectivo si es para microorganismos específicos) Figura 4. Esquema del ensayo de idoneidad de la detección de microorganismos (patógenos y otros mesófilos aerobios). Suspensión del microorganismo a validar (1.5x108 UFC/ ml) Diluir hasta 10-6 Muestra 100 -500 UFC/ml Realizar recuento 10 g producto + 90 ml diluyente neutralizante 15-20 min Inocular 0. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Control microbiológico del producto acabado - Después de la incubación.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. para cada cepa. comprobar que. todo indica que todavía existe actividad antimicrobiana y que es necesaria una modificación en las condiciones del método. Si las modificaciones surten efecto. Esto quiere decir que métodos como los rápidos (que veremos en la Ud. se debe modificar el método de recuento y/o detección de microorganismos para ese producto. no solo comprobar la idoneidad del método. 40 de 51 . 5). se deben validar los métodos no normalizados. Interpretación de los resultados de los ensayos de idoneidad Si no existe crecimiento en las placas de la prueba de aptitud. como hemos visto hasta ahora. Si a pesar de la incorporación de una cantidad adecuada de agente inactivador y el incremento sustancial en el volumen del caldo nutritivo todavía no es posible recuperar un cultivo viable como se ha definido anteriormente. o mediante la incorporación de una cantidad suficiente de agente inactivador en el caldo nutritivo. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. como todas aquellas modificaciones importantes que se hagan de un método normalizado deben validarse. Una validación completa incluye determinar todos los parámetros que se muestran en la Tabla IV según se trate de un test cualitativo (detección de microorganismos) y cuantitativo (recuento de microorganismos) respecto al método de referencia. o de una combinación adecuada de modificaciones que permita el crecimiento de las bacterias y hongos. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. o en la de recuentos microbianos y/o en la de las detecciones de microorganismos. Control microbiológico del producto acabado contaminación basal). Validación de un método alternativo Según la Norma ISO-UNE-EN 17025.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. todo indica que no es probable que el producto pueda contaminarse con las especies de microorganismos ensayadas. la aptitud del ensayo queda probada si el microorganismo de interés se recupera en la placa que procede del tubo inoculado. los normalizados aplicados fuera de su alcance o si hay ampliaciones o modificaciones de los métodos oficiales o normalizados. Las modificaciones pueden ser un incremento en el volumen de caldo nutritivo siendo la cantidad de producto la misma. El desarrollo de los diferentes ensayos se escapa de los presentes objetivos del curso. los desarrollados internamente. Límite: 70% de recuperación Trabajar con más de 5 suspensiones en el rango y 10 réplicas de cada una. no existen niveles legislados en cosmética. aureus. P. ≤10 UFC/g ó ml Categoría 2: resto de productos ≤10 UFC/g ó ml (S. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Límites Los límites que se muestran a continuación. 41 de 51 . 8. Límite: 15-35% Trabajar con más de 5 suspensiones en el rango y más de 5 réplicas de cada una. son sólo a título indicativo ya que.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. albicans. Parámetros a determinar en una validación de un método alternativo (cualitativo o cuantitativo) respecto al de referencia según US Pharmacopoeia <1123>. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. C. Parámetro Test cualitativo Test cuantitativo Exactitud No Sí Precisión (cv) No Sí Especificidad Límite detección Sí Sí Sí Sí Límite de cuantificación No Sí Linealidad (r ) No Sí Rango operacional Robustez Repetibilidad Reproducibilidad No Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí 2 Observaciones Trabajar con más de 5 suspensiones en el rango. Trabajar con más de 5 suspensiones en el rango y más de 5 lecturas de cada una. UNE-EN ISO 17516:2014. E. hasta la fecha. Patógenos Recuento mesófilos aerobios Categoría producto cosmético (bacterias + hongos) Categoría 1: productos específicamente destinados a niños menores de tres años o aquellos para uso alrededor de los ojos. aeruginosa. coli) 2 (1) Ausencia en 1 g ó ml 3 (2) Ausencia en 1 g ó ml (1) El resultado se considera fuera del límite si es ≥ 200 UFC/g. (2) El resultado se considera fuera del límite si es ≥ 2000 UFC/g. establecidos por diferentes Organismos nacionales e internacionales. Control microbiológico del producto acabado Tabla IV. P. 42 de 51 . albicans en 1 g ó ml *sólo se han considerado aquellas preparaciones que pueden considerarse cosméticos. aureus. aeruginosa) Categoría 1: Productos específicamente destinados a niños menores de tres años o aquellos para uso alrededor de los ojos o en membranas mucosas. <10 UFC/g ó ml en 1 g ó ml Categoría 2: resto de productos <10 UFC/g ó ml en 1 g ó ml 2 Ausencia en 1 g ó ml 3 Ausencia en 0.Europa Patógenos Categoría producto cosmético* Recuento mesófilos aerobios (S. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Personal Care Product Council) Patógenos Categoría producto cosmético Recuento mesófilos aerobios (S. Scientific Committee on Consumer Safety. aureus.1 g ó ml *Debe analizarse como mínimo 1 g ó ml de muestra USA (PCPC. <10 UFC/g ó ml Categoría 2: resto de productos <10 UFC/g ó ml 2 Ausencia en 1 g ó ml 3 Ausencia en 1 g ó ml Farmacopea Europea / USA Recuento mesófilos Recuento mohos Patógenos aerobios y levaduras (S. C. albicans. E. P. aeruginosa) 2 <10 UFC/g Ausencia en 1 g ó ml 2 <10 UFC/g Ausencia en 1 g ó ml 2 <10 UFC/g Ruta de administración* Cutánea <10 UFC/g ó ml Mucosa bucal/gingival <10 UFC/g ó ml Vaginal <10 UFC/g ó ml Ausencia en 1 g ó ml y ausencia de C. coli) Categoría 1: productos específicamente destinados a bebés o aquellos para uso alrededor de los ojos. C. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. aeruginosa. P. albicans. aureus. Control microbiológico del producto acabado SCCS. 43 de 51 . coli) 2 Ausencia en 1 g ó ml 3 Ausencia en 1 g ó ml MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. E. Ministerio de Sanidad y Consumo. albicans. <10 UFC/g ó ml Categoría 2: resto de productos <10 UFC/g ó ml (S. aureus. Patógenos Categoría producto cosmético Recuento mesófilos aerobios Categoría 1: productos específicamente destinados a bebés o aquellos para uso alrededor de los ojos. P. aeruginosa. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. C. Control microbiológico del producto acabado España.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. A practical approach. Microbiología. Microbiología. - UNE-EN ISO 21150:2015. Microbiología. Microbiología. 2007. Límites microbiológicos. Cosméticos . Directrices para la evaluación del riesgo y la identificación de productos de bajo riesgo microbiológico.1. - Devleeschouver MJ and Siquet F. Marcel Dekker Inc. - Geis.6. Bibliografía - UNE-EN ISO 21148:2010. 132:1825-31. Cosméticos. Instrucciones generales para el examen microbiológico. Microbiología. US (2006). - UNE-EN ISO 29621:2011. Microbiología. A guidance document on microbiological control of cosmetic products. 2. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. - UNE-EN ISO 22717:2015. Project 1336. <1223>. Stability Control: Microbiological tests (Ch. Control microbiológico del producto acabado 9. Procedimientos de muestreo para la inspección por atributos. - UNE-EN ISO 16212:2011. - Kutty PK et al. - EN-ISO 17025:2000.4 - Farmacopea US. 64). 5. Cosmetic Microbiology. Microbiología. <1225>. Fundamentos y vocabulario. - UNE-EN ISO 18416:2015. Detección de Candida albicans. Sistemas de gestión de la calidad. Detección de microorganismos específicos y no específicos. Chest. <1227>. New York 2005. 44 de 51 . Cosméticos. Cosméticos. - UNE-EN ISO 21149:2010. Taylor and Francis. Danish Ministry of the Environment 2010.12. PA (ed. - UNE-EN ISO 22718:2015. - Farmacopea Europea 2. Cosméticos. In Barel AO et al (eds) Handbook of cosmetic science and technology. Detección y recuento de bacterias aerobias mesófilas. - UNE-EN ISO 9000:2005.Microbiología. 2nd edition. tabulados según el nivel de calidad aceptable (NCA).6. - Detmer A and Jorgensen C. Enumeración de levaduras y mohos. Cosméticos. <62>. Parte 1: Planes de muestreo para las inspecciones lote por lote. Cosméticos. - UNE-EN ISO 18415:2012. Microbiología. Detección de Pseudomonas aeruginosa. Cosméticos.13. Microbiología. Cosméticos. <61>. Detección de Staphylococcus aureus. <1231>. Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración. - UNE-ISO 2859-1:2012. - UNE-EN ISO 17516:2014. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Detección de Escherichia coli. <1111>.). Cosméticos. Multistate outbreak of Burkholderia cenocepacia colonization and infection associated with the use of intrinsically contaminated alcohol-free mouthwash. FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos. Análisis microbiológico. USA. Wood TO. 2009. Int Microbiol. AOAC Int. Current trends in cosmetic microbiology. Household and Personal Care Today. Toiletries and Fragrance Association (CTFA). 2001. - ENAC. 2:11-13. - Microbiological Guidelines. Cosmetic Microbiology. - Method Validation of U. 1994. September 2015. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Intrinsically contaminated alcohol-free mouthwash implicated in a nosocomial outbreak of Burkholderia cepacia colonization and infection. - AOAC International Methods Committee Guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis. Comité Asesor de Cosmetología. Documento aclaratorio. - Molina-Cabrillana J. Today. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (Sección Catalana). Control microbiológico del producto acabado - Lundov MD and C Zachariae. 27:1281-2. Toiletry. cosmetics and preservation. 2005. - Scientific Committee on Consu. The SCCS’s notes of guidance for the testing of cosmetic substances and their safety evaluation. 2002. - Microbiology Guidelines Cosmetic. Organización Mundial de la Salud 2010. 1979. Int J Cosm Sci 30:471-474. 9th Revision. Infect Control Hosp Epidemiol. and Fragrance Association 2007. 2008. 45 de 51 . - ISO 16140 Standard (2002): Microbiology of food and animal feeding stuffs — Protocol for the validation of alternative method.S. Microbes. - Buenas prácticas de la OMS para laboratorios de control de calidad de productos farmacéuticos. 2007. Ministerio de Sanidad y Consumo. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - Reid FR.er Safety. 2002. Environmental Protection Agency Microbiological Methods of Analysis. USA. 8:7679. - Perry B. Monografías AEFI. NT-32. 28:185-186. Arch Ophtalmol. - Orús P and S Leranoz. 2012. The causative role of contaminated eye cosmetics. Pseudomonas corneal ulcer. - Validación del método de control de la contaminación microbiana en productos no obligatoriamente estériles. - ENAC. et al. Recalls of microbiological contaminated cosmetics in EU from 2005 to May 2008. 1993. EPA 2009. - Manual para el Control Microbiológico de los Productos Cosméticos. 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Control microbiológico del producto acabado Anexo 1 Medios de cultivo recomendados según Normativa ISO-EN-UNE Recuento de bacterias mesófilas. - Eugon LT100 - Diluyente lecitina-polisorbato 80 (LP) - Caldo Letheen Modificado Medios sólidos para el recuento: - Agar Eugon LT100 - Agar LT100 - Agar SCD - Agar patata-dextrosa-cloranfenicol – para hongos - Agar glucosa-peptona-cloranfenicol – para hongos - Agar malta-cloranfenicol – para hongos Detección de microorganismos mesófilos aerobios por enriquecimiento: Diluyentes generales: - Agua de peptona tamponada. mohos y levaduras: Diluyentes generales: - Agua de peptona tamponada. - Solución de triptona y cloruro sódico Medios de cultivo sólidos para la preparación de inóculos: - Agar SCDA (digerido caseína y soja) - Agar TSA (triptona y soja) - SDCA (Saboraud-Dextrosa-Cloranfenicol) – para hongos - Agar Saboraud-Dextrosa – para hongos Caldos neutralizantes: - Caldo SCDLP-20 (digerido caseína y soja-lecitina-polisorbato 20). Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. 46 de 51 . - Solución de triptona y cloruro sódico MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. agar Vogel Jonson. Medios para la validación - Agar SCDA - Agar TSA - Agar Saboraud-dextrosa con o sin cloranfenicol (adicional para C. albicans). MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Agar manitol hipersalino (MSA). 47 de 51 . coli). coli: agar Mc Conkey. Control microbiológico del producto acabado Caldos neutralizantes: - Eugon LT100 - Caldo SCDLP-80 (digerido caseína y soja-lecitina-polisorbato 80) - Caldo Letheen Modificado - Caldo Dey-Engley Medios sólidos para la detección - Agar SCDA (digerido de lecitina y soja) - Agar TSA (triptona y soja) Detección de microorganismos específicos: Diluyentes generales: - Agua de peptona tamponada. agar Levine. albicans). - Caldo GPLP-80 (glucosa-peptona-lecitina-polisorbato 80) (adicional para la detección detección de C. Medios selectivos sólidos para la detección - E. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. - Agar patata-dextrosa (adicional para C. - Solución de triptona y cloruro sódico Caldos neutralizantes: - Eugon LT100 - Caldo SCDLP-80 (digerido caseína y soja-lecitina-polisorbato 80). - S.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. - Caldo Letheen Modificado - Caldo Dey-Engley - Caldo lactosado con o sin neutralizantes (adicional para la detección de E. aureus: agar Baird-Parker. albicans). 48 de 51 .FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. agar maízpolisorbato 80. agar patata-dextrosa-cloranfenicol. - Pseudomonas aeruginosa: agar Cetrimide. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. agar Pseudomonas (agar P). MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. Control microbiológico del producto acabado - Candida albicans: agar Saboraud-cloranfenicol. Se incluye también la composición de líquidos de lavado cuando se utiliza la filtración a través de membrana en el análisis (según Normativa ISO). sulfatos. óxido de etileno condensado en alcohol graso Polisorbato 80. 3 g/l.. Compuestos oxidantes Tiosulfato sódico Líquido de lavado: tiosulfato sódico. Líquido de lavado: agua destilada. 30 g/l + saponina. 30 g/l + dodecil sulfato sódico. 9 g/l. 9 g/l. polisorbato 80.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. 30 g/l + L-histidina. agentes liberadores Glicina. 5 g/l. Control microbiológico del producto acabado Anexo 2 Sustancias y mezclas conservantes que pueden utilizarse para inactivar los conservantes presentes en los productos cosméticos). polisorbato 80. tensioactivos catiónicos Lecitina. Aldehídos.Imidazoles g/l + lecitina. 9 g/l. 30 g/l + lecitina. etc. saponina. fenoxietanol. 30 g/l + saponina. Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. 4 g/l + lecitina. 1 g/l. Anilidas Lecitina. Polisorbato 80. Tiosulfato sódico. 49 de 51 . MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. 5 g/l. Liquido de lavado: triptona. 1 g/l + L-cisteína. feniletanol. 30 g/l + lecitina. Compuestos de amonio cuaternario. Conservante Compuesto químico capaz de neutralizar la actividad antimicrobiana del conservante Ejemplos de mezclas neutralizantes Polisorbato 80. 3 g/l + polisorbato 80. 3 g/l. tioglicolato sódico. 30 g/l + saponina. 30 g/l + L-histidina. Lecitina. 3 g/l. polisorbato 80. Isotiazolinonas. 30 Lecitina. Polisorbato 80. 5 g/l. 1 g/l + NaCl. tensioactivos no iónicos Óxido de etileno condensado en alcohol graso. histidina de formaldehído Polisorbato 80. triptona 1 g/l + NaCl. polisorbato 80. 3 g/l. dodecil sulfato sódico. polisorbato 80. 1 g/l Líquido de lavado: polisorbato 80. óxido de etileno condensado en alcohol graso. bisulfito sódico. saponina.5 g/l. 0. 5 g/l. 20 g/l + polisorbato 80. 3 g/l. triptona 1 g/l + NaCl. 3 g/l+ L-histidina. mercaptanos. aminas. Compuestos fenólicos: parabenos. 7 g/l + lecitina. 4 g/l Líquido de lavado: agua destilada. saponina. 0. Compuesto químico capaz de Conservante neutralizar la actividad antimicrobiana Ejemplos de mezclas neutralizantes del conservante Polisorbato 80. 0. 9 g/l.5 g/l o 5 g/l.5 g/l. Líquido de lavado: tioglicolato sódico. Hg). Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Tioglicolato sódico. L-cisteína. polisorbato 80.8 g/l o 1.5 g/l.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. polisorbato 80 Liquido de lavado: triptona. 30 g/l + lecitina. compuestos orgánicos de mercurio Bisulfato de sodio. Zn. 5 g/l. ácidos tioglicólicos L-cisteína. Sales metálicas (Cu. 30 g/l + saponina. Biguanidas Lecitina. compuestos sulfhídricos. 50 de 51 . 0. Control microbiológico del producto acabado Cont. MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos. 3 g/l. 1 g/l + NaCl. 51 de 51 . Niveles de inspección generales Tamaño del lote N-I N-II N-III 2a8 2 2 3 9 a 15 2 3 5 16 a 25 3 5 8 26 a 50 5 8 13 51 a 90 5 13 20 91 a 150 8 20 32 151 a 280 13 32 50 281 a 500 20 50 80 501 a 1200 32 80 125 1201 a 3200 50 125 200 3201 a 10000 80 200 315 10001 a 35000 125 315 500 35001 a 150000 200 500 800 150001 a 500000 315 800 1250 500001 ó más 500 1250 2000 MCC – Microbiología y Conservación de Cosméticos.FORMACIÓN ON-LINE Unidad 1. Procedimientos de muestreo para la inspección por atributos. Control microbiológico del producto acabado Anexo 3 Unidades a muestrear dependiendo del tamaño del lote. tabulados según el nivel de calidad aceptable (NCA). Sonia Leranoz y Pilar Orús Pág. Parte 1: Planes de muestreo para las inspecciones lote por lote. (UNE-ISO 2859-1:2012.
Report "Modulo II Unidad 1 Control microbiologico acabados 2016.pdf"