MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN Y DE BARRIDOAlmanza Noguez Julio Cesar Microscopio electrónico Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios ópticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. Principales partes del microscopio electrónico • Fuente de electrones que ilumina la muestra (objeto). El haz de electrones que incide sobre la muestra es generado por un Filamento de tungsteno. • Lentes electromagnéticas (convergentes) que dirigen el haz de electrones hacía la muestra. Las lentes electromagnéticas son las encargadas de enfocar el haz de electrones, las cuales se componen esencialmente de un conjunto de placas mantenidas a un diferente potencial, esta diferencia, acelera el haz de electrones. Estas placas tienen un orificio en el centro por donde pasan los electrones y la curvatura del campo eléctrico que se genera permite el enfoque de la imagen. • Sistema que capta e interpreta la imagen. Depende de la muestra y del tipo de análisis que se quiera realizar. c) Detector de energía dispersiva este detector captura los rayos X generados por la muestra. .Los detectores del microscopio electrónico son: a) Detector de electrones secundarios este se utiliza para obtener imágenes de alta resolución. lo que permite obtener mediante un software la composición elemental de la muestra. b) Detector de electrones retro dispersados este detector permite obtener imágenes de composición y topografía de la superficie. . . gracias a la generación de intensos campos electromagnéticos en diversas bobinas electrificas. El flujo electrónico atraviesa de forma diferencial las muestras biológicas previamente tratadas. denominadas “lentes” .Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Se basa en la generación de un flujo de electrones condensados en un pequeño espacio. . En la parte inferior del microscopio una pantalla fluorescentes percibe la imagen formada. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. . no mayores de un par de miles de ángstroms. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas. . 1 y 0. pero suelen estar comprendidos entre 0.5 mm. . Después de atravesar el ánodo conectado a tierra.Funcionamiento del TEM La fuente de electrones esta constituida por un hilo de volframio en forma de horquilla. rodeado por una pantalla cilíndrica polarizada negativamente respecto al filamento. la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del condensador. La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa. pero generalmente esta precaución se omite en el estudio de muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es excesivo. Después de atravesar el objeto. Los diámetros de los diafragmas del condensador varían según el tipo de instrumento. como para variar la abertura de iluminación relativa en el objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100 µ de diámetro para interceptar los electrones esparcidos . donde muchos electrones se esparcen. el haz penetra en el campo de la lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. y separando esta pantalla del camino del haz. el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300. será necesario el uso de una o mas lentes protectoras que vuelvan a aumentar la imagen primaria. Las distancias usuales entre lente e imagen. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente . y otro tanto de esta última al objeto. .0001 mmHg con ayudas de bombas de difusión rápidas en serie con bombas rotatorias. se impresiona una placa fotográfica con dicha imagen. mientras que del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de transmisión pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm. el sistema completo deberá ser rígido y capaz de alcanzar un vacío de 0. Tipos de señales producidas en un material al incidir un haz de electrones HAZ DE ELECTRONES Electrones Electrones Secundarios (SE) Retrodispersados (BSE) Electrones Auger Rayos – X (EDS) Catodoluminiscencia Calor MUESTRA Electrones Elásticamente Difractados Electrones Inelásticamente Difractados Electrones no Difractados . afectando al mínimo su estructura original.. tanto de muestras materiales como biológicas.Preparación de muestras TEM Todas las técnicas de preparación. . menores a 100 nm. persiguen el objetivo de adelgazar o conseguir secciones muy finas del espécimen. inclusión en resina y polimerización. la preparación de estas muestras siempre sigue el mismo protocolo básico: fijación química. tales como el osmio. al cabo de un tiempo. en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tinción con metales pesados. A continuación se busca la máxima dispersión sumergiendo la solución en un baño de ultrasonidos y. el wolframio o el uranio. En la preparación de este tipo de muestras sólo hay que diluir una cantidad muy pequeña de muestra en un disolvente orgánico que no la afecte. habitualmente dicloro etano o acetona. La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material polimerizado. También se puede utilizar agua si no hay alternativa. . ya se puede depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para ser observada directamente una vez se haya secado. Para ello se utiliza un ultra micrótomo que sí está disponible en el Servicio. deshidratación en series de concentraciones crecientes de alcohol o acetona. lavado. Preparación de muestras biológicas para el TEM Preparación de muestras de materiales en polvo para el TEM En general. Según el objetivo perseguido. se introduce este disco en el “Ion Milling” para que sea atacado por ambos lados con sendos haces de iones de argón hasta que estos realizan un pequeño orificio central. En primer lugar el usuario ha de aportar una muestra que no supere las 200 µm. de diámetro con el “Ultrasonic Disk Cutter” pues este es el tamaño de la muestra que se puede introducir en el TEM. Una vez conseguido. . el primer paso es cortar un disco de 3 mm. alrededor del cual queda una zona suficientemente delgada. El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una zona central de unas 20 µm. A continuación. con el “Dimpling Grinder”. Preparación de muestras materiales compactas para el TEM Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es necesario la utilización de varios aparatos. de grosor. 000X MET.Bacilos en división 60. Mitocondria . pero también el que produce un haz de mayor tamaño. • Filamento de hexaboruro de lantano: mayor duración y haz más fino. • Filamento de tungsteno: el más económico. . pero ofrece el haz más fino. Corta duración. es más caro y precisa aún mayor vacío.Microscopio electrónico de barrido Un microscopio electrónico de barrido funciona con un haz de electrones producido por una fuente de electrones que puede ser un cañón termoiónico (filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano) o un cañón de emisión de campo FEG (Field Emission Gun). También es más caro y precisa un vacío mayor. • Emisor de efecto de campo: continuando la progresión. 5 y 50 kV. Al cañón se le aplica un potencial eléctrico que acelera el haz de electrones hacia la columna. los electrones chocan e interactúan con la muestra produciendo varias señales que podrán ser recogidas de acuerdo a los detectores presentes. éste es focalizado por medio de lentes electromagnéticas sobre la muestra. Todas estas señales están relacionadas entre sí y dependen en gran medida de la topografía. El voltaje de aceleración de los electrones puede variar entre 0. el número atómico y el estado químico de la muestra . Preparación de la muestra Las características ideales de una muestra para microscopia electrónica de barrido son: • Que sea conductora eléctrica. • Que de un buen contraste. . • Que sea estable en el vacío de la cámara del MEB. desbaste. Muestras no biológicas: Muestras metalografías y ceramográficas: Se hace el corte. deshidratación con etanol y secador de punto crítico. recubrimiento conductor por metalización. Montaje en resina epóxica o conductora.Muestras Biológicas: Bajo vacío: Control de los niveles de humedad y vacío. Probable uso de platina de enfriamiento. pulido a espejo y ataque químico de acuerdo a lo que quiera observarse o medirse Muestras en polvo: Montaje en porta muestras con cinta de carbono para su fijación. Alto vacío: Fijación. . según se requiera. Muestras poliméricas: Metalización y cortes por ultra micrótomo. Muestras para litografía: Recubrimiento con resina PMMA (polimetil metacrilato). sí es necesario Muestras no conductoras: Recubrimiento con carbono u oro /oro paladio dependiendo del tipo de imágenes o análisis que se desee obtener. es decir la muestra debe observarse de inmediato .Si la muestra no es buena conductora o si es buena conductora pero no da un buen contraste debido. El recubrimiento con cromo con el que se logran películas con una granularidad del orden de 1nm. Sin embargo el cromo se oxida rápidamente a un oxido no conductor. entonces se debe recubrir con una capa delgada de material conductor el mas utilizado es el oro y debe de ponerse una capa de 10 nm de espesor se utiliza para ver los electrones secundarios. Uno de los tipos de metalizadores de carbono se muestra esquemáticamente en el gráfico. . Este elemento es el carbono. En el caso de precisarse un análisis elemental (estudio microanalìtico ) en una muestra no conductora es necesario recubrir la superficie de un elemento lo más transparente posible a los RX. el osmio reducido a forma metálica se deposita sobre la muestra cubriéndola con una película amorfa. Es decir actualmente el método reportado mas eficiente para recubrir muestras no conductoras o de bajo numero atómico. .El recubrimiento de osmio asistido por plasma se sublima en la cámara de vacío. no se utiliza sino que se habla de contraste. aproximadamente 50 veces mas finos que un corte histológico observado al microscopio de luz que normalmente es de 500nm (0. lo que contrasta con lo claro de las zonas no impregnadas con metales. Además los cortes deben contrastarse. como acetato de uranilo y citrato de plomo que aumenta la electrono densidad en el sitio en que se produce la deposición.5¹m). . Esto hace que algunas zonas aparezcan oscuras o negras en la pantalla. lo que usualmente se llama tinción en microscopía de luz. aunque ese término.Corte de la muestra Los cortes deben tener un grosor máximo de 100 nm (1000 XX). Consiste en una impregnación de tejido con sales de metales pesados. que se refiere a color. . . llamado cilindro de Wehnelt o placa catódica. que permite que los electrones emitidos por el filamento se focalicen en un punto ligeramente por debajo del cilindro de Wehnelt.Componentes del SEM Cañón electrónico : La fuente emisora de electrones más utilizada es un filamento de tungsteno que se calienta al rojo-blanco por medio de una corriente eléctrica. en un vacío del orden de 10-5 Torr. Entre el ánodo acelerador y el filamento se coloca un electrodo adicional. UNIDADES Función trabajo Constante de Richarson Temperatura de operación Densidad de corriente Tamaño del haz Brillo Energía desprendida Vacío Vida útil eV A/m2k2 K A/m2 m A/m2sr eV Pa hr TUNGSTENO 4.5 10-4 500 .4 4 x 105 1700 106 10 5 x 1010 1.5 6 x 105 2700 5 x 104 50 109 3 10-2 100 LaB6 2. Lentes electromagnéticas (hiero blando o piezas polares) • Condensadoras: su misión es afinar el haz. • Proyectoras: junto a la intermedia. • Objetivo: forman la imagen inicial del especimen. proporcionan el nivel de aumento de la imagen inicial. definiendo su tamaño y el nivel de convergencia. • Intermedia: aumenta la imagen inicial y define el foco. . Haz incidente de alta energía Electrones secundarios Electrones retrodispersados Electrones auger Rayos X Luz visible Electrones absorbidos Pares huecos y electrones Rayos X de Bremsstrahlung Electrones dispersados elásticos Haz transmitido Electrones dispersados inelásticos . Por esta razón se utilizan para obtener un mapa con información sobre la composición superficial de la muestra. y son utilizados para obtener información sobre la composición de pequeñísimas partes de la superficie de la muestra. • Electrones Auger: cuando un electrón secundario es expulsado del átomo. otro electrón más externo puede saltar hacia el interior para llenar este hueco. . El exceso de energía provocado por este desplazamiento puede ser corregido emitiendo un nuevo electrón de la capa más externa. Estos son los llamados electrones Auger. • Electrones retrodispersados: se producen cuando un electrón del haz choca frontalmente con el núcleo de un átomo de la muestra. siendo repelido en sentido contrario fuera de la muestra. Estos electrones son de muy baja energía (por debajo de 5eV). proporcionando la suficiente energía a uno o varios de los electrones interiores para saltar fuera de la muestra. Precisamente por eso proporcionan una valiosa información topográfica de la muestra. por lo que deben encontrarse muy cerca de la superficie para poder escapar. La intensidad de dicho efecto varía proporcionalmente con el número atómico de la muestra.•Electrones secundarios: se producen cuando un electrón del haz pasa muy cerca del núcleo de un átomo de la muestra. éstos son característicos de cada elemento de la muestra. A diferencia de los electrones auger de baja energía. Electrones transmitidos o no dispersados: Son los que atraviesan la muestra limpiamente sin interactuar con ella. el exceso de energía también puede ser balanceada mediante la emisión de rayos X. los rayos X proporcionan información analítica de un volumen considerable de la muestra. por lo que se utilizan para obtener información sobre la composición de la muestra. Son inversamente proporcionales al grosor de la muestra y producen las zonas más claras o brillantes de la imagen de transmisión . Rayos X: en el proceso descrito anteriormente. que proporciona información tanto de los elementos presentes en la muestra como de la naturaleza de sus enlaces. En materiales cristalinos. estos electrones son desviados en un ángulo fijo que viene marcado por la longitud de onda del haz y la distancia entre los planos atómicos de la muestra (Ley de Bragg). proporcionando imágenes de difracción de electrones que revelan valiosos detalles sobre la estructura espacial de los átomos en la muestra observada. de gran importancia en el estudio de estructuras cristalinas. Estos electrones también son utilizados en espectroscopía de pérdida de energía de electrones (EELS). • Electrones dispersados inelásticamente: Aquellos que son desviados de su trayectoria original por los átomos de la muestra con pérdida de energía. siendo posteriormente transmitidos o bien dispersados de nuevo. y posteriormente transmitidos a través de ella. . La interferencia de estos electrones con los transmitidos aumentan dramáticamente el contraste y son esenciales para obtener imágenes de alta resolución (HRTEM).• • Electrones dispersados elásticamente: Aquellos que son desviados de su trayectoria original por los átomos de la muestra sin pérdida de energía. Los que son dispersados por segunda vez elásticamente forman las llamadas líneas de Kikuchi. . . se detectan mediante un cristal de centello. . Los electrones secundarios que se desprenden de cada punto. Este cristal está unido al extremo de un bastón de Lucita.DETECTORES Detector de centelleo para electrones secundarios. que tiene el otro extremo descansando contra la ventana del tubo fotomultiplicador. de Si para electrones dispersados y de Si(Li) para rayos X. cuya superficie se mantiene a un potencial positivo de 10 a 12 kV. Espectros de energía de rayos X con una resolución de 128 eV. . Detector de Si(Li) refrigerado con NL para rayos X. Detección cualitativa de elementos. Imagen de los elementos en la muestra.
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