Microbiologia Manual

1INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA Laboratorio de Ingeniería Ambiental MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Miguel Ángel Rendón Sagardi Ingeniería Química LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 2 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 3 MANUAL DE PRÁCTICAS ELABORADO Y REVISADO POR: M.C. GUSTAVO ADOLFO MIRANDA ROSAS M.C. RAÚL PÉREZ ÁVILA PERTENECIENTES AL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA DEL INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL DE CONTROL: 07010179 EQUIPO: 2 CALIFICACIÓN FINAL: _____________________________________ LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .4 DATOS GENERALES NOMBRE DE LA MATERIA: MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL SEMESTRE: SEXTO NOMBRE DEL MAESTRO TITULAR: M. RAÚL RÉREZ ÁVILA NOMBRE DEL ALUMNO: MIGUEL ÁNGEL RENDÓN SAGARDI NO.C. FLUCTUACIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMÓSFERA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES 6. DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE 8.5 ÍNDICE DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 1. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN 7. MEDIOS DE CULTIVO 5. AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS 9. CINÉTICA DE FERMENTACIÓN 10. MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM 4. MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO 3. CONTINGENCIA AMBIETAL 2. 6 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Se considerará retardo si el alumno se presenta a realizar su práctica de 10 a 15 minutos después de la hora establecida. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .7 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL ASISTENCIA AL LABORATORIO La asistencia al laboratorio será de acuerdo al horario y calendario de prácticas programadas. destruyan o maltraten material. únicamente resultados y observaciones personales. El alumno una vez concluidos los análisis de cada práctica anotará en la hoja del formato oficial. No se podrá abandonar el laboratorio sin la autorización del maestro. los responsables deberán pagar por el daño ocasionado o reponer los aparatos o equipo dañado. Cuando por mala fe. mientras dure la práctica. desperdicien sustancias. REPORTE DE PRÁCTICAS Cada alumno debe tener una libreta (engrapada o cosida. instrumentos. El recorrido de campo lo avalará el profesor que hizo el recorrido anotando fecha y firma. equipo o instalaciones. Pasado ese tiempo no se admitirá a ningún alumno dándose por vista la práctica. negligencia o descuido.) en donde hará sus anotaciones personales de “recorrido de campo” y dentro del laboratorio. no de espiral) tamaño esquela (de 10 por 15 cm. Es obligatorio el uso de bata blanca en el laboratorio y los implementos necesarios de protección personal. Si el trabajo fue en equipo (o personal en equipo) se reportarán los resultados del equipo y cada uno anotará los resultados obtenidos personalmente. Toda el agua que se genere al realizar la práctica será depositada en un lugar especial (cubeta de residuos) para su tratamiento y disposición final. Al o los alumnos que se les sorprenda realizando lo anterior se les retirará de la práctica y cuando el caso lo amerite podrá cancelarse su derecho de asistencia al laboratorio. tarjas o sumideros. reportes (de equipo y personales) Mantener limpia y ordenada El área de trabajo permanentemente. revistas. No arrojar residuos sólidos a los lavabos. Entregue al maestro las sustancias sobrantes. así como los medios de cultivo. Estrictamente prohibido ingerir alimentos dentro del laboratorio. guarde la calma. libros. así como vocabulario soez dentro del laboratorio.8 Al final del periodo el alumno entregará su libreta y sus hojas de reporte para evaluar su desempeño y acreditar la calificación del laboratorio que será reportada al maestro de teoría. tesis. LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL ENERO 1998 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . peleas o juegos. La calificación del laboratorio se acreditará cuando el alumno no tenga adeudos de material. Ayude a sus compañeros de ser necesario y siga la ruta de evacuación. El alumno se enterará de los dispositivos de seguridad del laboratorio y en caso de contingencia dará la voz de aviso inmediatamente. No se permiten bromas. no las tire. En caso de siniestro siga las instrucciones del encargado del laboratorio. Al terminar el experimento limpie muy bien el material del equipo y mesa de trabajo. se pretende que quien termina este curso con éxito (teóricopráctico). En particular. observar. estudiarlos y. tenga los elementos necesarios de los procedimientos y habilidades que les permitan manipular los materiales y microorganismos con rapidez. Se puede concluir de lo anterior que el trabajar con seres vivos. Es importante tener en cuenta que dada la amplitud de actividades que se abarcan en algunas prácticas. reactivos y colorantes empleados en las prácticas. se ha querido dar al estudiante en éste manual de prácticas un compendio de instrucciones claras y precisas que le permitan introducirse en los aspectos completamente básicos de la microbiología. algunos de los ejercicios requieren de más tiempo que el asignado en cada sesión. con objeto de poderlos encontrar. clínicas u hospitales. algunas experiencias se realizarán en tiempos extras y no necesariamente cuando lo indique el calendario. distinguir y caracterizar en su ambiente. no todos los ejercicios aquí planteados se pueden realizar dentro del tiempo normalmente disponible por sesión. hasta la microbiología aplicada. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . agua. con la finalidad de entender algunos procesos ambientales como las relaciones de los microorganismos con el ambiente en el que se desarrollan o la biodegradación de contaminantes. con lo cual se estará en condiciones de controlarlos. Todo esto. Los cultivos microbianos señalados en cada práctica pueden ser sustituidos según el criterio del profesor y la disponibilidad de las cepas que en algunos casos no es posible conservar y se deben obtener directamente del suelo. De tal manera que muchos de los experimentos que se creen que se obtendrán resultados aparentemente obvios no necesariamente corresponderán con el resultado deseado. etc. precisión y limpieza. seguridad. Al final se incluye un apéndice con algunas técnicas. utilizarlos para un proceso de interés. sin embargo. es decir.9 PRÓLOGO Integrar en un solo manual de prácticas de laboratorio los conocimientos básicos de la microbiología general y de la microbiología ambiental supone ser muy ambicioso. El orden en que se presentan las prácticas no necesariamente será el que se siga durante el desarrollo del curso. Por lo anterior. describir. es trabajar con entidades variables. hasta cierto punto. instituciones de investigación. fórmulas de algunos medios de cultivos. Limpiar la mesa de trabajo con una solución germicida antes de empezar y al terminar el trabajo. 6. No se permitirá la entrada a personas ajenas al laboratorio. nombre del alumno. y reactivos debidamente cerrados y ordenados. equipo. 7. 11. 4. material para incubar. Solo podrá quitársela al salir de éste. 15. Recogerse el cabello antes de entrar al laboratorio. fumar. 5. 12. colocar el material debidamente separado en los lugares asignados para ello: material contaminado para esterilizar. sin etiquetas. 13. La hora de entrada debe cumplirse puntualmente. Si fuera posible. Depositar en los botes de basura todo el material de desecho no contaminado. 8. Al finalizar cada sesión. Informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra. En caso de emergencia. 2. No debe lavarse material de ningún tipo durante la sesión práctica. etc. El material para incubar debe llevar la siguiente identificación: grupo. 17. No se debe pasear entre las mesas de laboratorio. 16. pregunte. inmediatamente cerrar la llave de gas ya apagar cualquier aparato con el que se esté trabajando. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. 14.10 REGLAMENTO DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE INGENIERÍA AMBIENTAL Tomando en consideración que se trabaja básicamente con microorganismos y estos pueden ser patógenos reconocidos o potenciales. Colocar todos los objetos personales en los lugares asignados para ello. algodón. RECUERDE: NO CORRO. Dejar fuera solamente el material que se va a utilizar. cerillos. material sucio para lavar. NO EMPUJO. 1. se deberán seguir estrictamente las indicaciones de este reglamento. Si no entiende. NO GRITO. Leer cuidadosamente el instructivo antes de empezar la práctica y seguir las instrucciones del profesor. La puerta del laboratorio deberá mantenerse en lo posible siempre cerrada. No se permitirá el acceso al laboratorio a quien llegue con retraso. 18. 9. como papel. No se debe menospreciar el riesgo a la salud que representan muchas de las sustancias que se emplean ni las preocupaciones en el uso de mecheros de gas debiendo dar aviso de inmediato en el caso de fugas o derrames. Lavarse meticulosamente las manos antes de salir del laboratorio. 10. fecha y nombre del microorganismo o experimento. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Hablar solo lo necesario. De manera ordenada y rápida salir del laboratorio. aplicarse maquillaje e introducirse objetos a la boca. beber. el trabajo debe realizarse sentado. 3. Abstenerse de comer. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Integrar las funciones generales de los microorganismos en los diferentes ecosistemas. 4. Utilizar adecuadamente las técnicas microbiológicas que permitan manipular los microorganismos para su aislamiento.11 OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 1. selección. Aprender el vocabulario y los conceptos teóricos y experimentales que permitan conocer la naturaleza y diversidad de los microorganismos y el lugar que ocupan entre los seres vivos. 5. Reconocer las interrelaciones que se presentan entre los microorganismos y el ambiente. estudio de las características fisiológicas de cultivo. modificación. identificación y clasificación. Reconocer la importancia de los microorganismos como modelos de investigación científica. utilización y control. 3. 2. propagación. 12 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .13 Practica No.C. 1 Miguel Ángel Rendón Sagardi M. 14 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . los efectos que producen sobre la salud y la forma de disminuir su incidencia nociva. Los envases de vidrio deben transportarse protegidos (ver transporte) y las botellas de dos litros deben disponer de un asa que facilite su manejo.15 CONTINGENCIA AMBIETAL PRÁCTICA No. radiación solar) puedan tener sobre el material del envase. volcado). 1 OBJETIVO: Contribuir a la instrumentación de una tarea eficiente y segura en el ámbito del Laboratorio de Microbiología Ambiental. evitar el trasvase y traslado de un lugar al otro del laboratorio. mediante procedimientos que prevengan. • • • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . El envase deberá ser acorde al producto a contener y a las cantidades que se deben dispensar. Los recipientes de pequeña capacidad que contengan sustancias corrosivas (ácidos y álcalis) deberán ubicarse separados entre sí y sobre bandejas de polietileno de alta densidad o policarbonato según su compatibilidad para retener derrames (rotura. Los envases plásticos deben ser revisados con frecuencia. químicos y biológicos. protejan y/o eliminen los riesgos físicos. FECHA DE REALIZACIÓN: 01 de septiembre de 2009 • Envases • Los reactivos deberán estar contenidos en recipientes de tamaño adecuado para facilitar su uso. Deberá tenerse en cuenta el posible efecto corrosivo que las sustancias químicas y agentes físicos (temperatura. Todos los docentes involucrados en el dictado de los trabajos prácticos de materias que utilicen productos químicos deben conocer sus propiedades físico-químicas. Los recipientes de vidrio se utilizarán sólo para guardar pequeñas cantidades de productos. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: RIESGOS QUIMICOS • Todo producto químico es un contaminante tóxico potencial que puede comportar riesgos por sí mismo o producir reacciones más peligrosas en contacto con otros. etc.16 • Cada reactivo debe estar identificado correctamente mediante etiquetas normalizadas. con lo cual todo material de origen biológico es un contaminante tóxico potencial que puede comportar riesgos por sí mismo. cultivos celulares y endoparásitos humanos. parásitos. El docente a cargo de los turnos de trabajos prácticos debe restringir el ingreso al laboratorio sólo a aquellas personas cuyas tareas lo justifiquen. • Nivel de Seguridad I: Agente no patógeno. Cada persona es responsable directa de la zona de trabajo que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. quienes deberán estar informadas y capacitadas convenientemente. suero.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material. etc. Las sustancias químicas se catalogarán y reconocerán por medio de colores de acuerdo a su peligrosidad. Utilizable para prácticas microbiológicas estándar. así como las posibles rutas de penetración. alergia o intoxicación. • • TRABAJOS PRÁCTICOS CON MATERIALES BIOLÓGICOS En la entrada de todos los laboratorios debe existir información sobre el nivel de seguridad con el que se trabaja. sangre. Sólo este nivel de riesgo está permitido para los laboratorios de enseñanza de grado. perfectamente identificados y rotulados. con inclusión de los genéticamente modificados. vectores. Los residuos deberán ser separados y envasados en recipientes adecuados de vidrio. Desechos generados • En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos. El laboratorio de Microbiología Ambiental se encuentra ligado a estos riesgos. • RIESGOS BIOLOGICOS Los agentes biológicos son todos aquellos microorganismos. infección o transmisión. material para adsorber derrames (tierra de diatomeas. arena. hongos. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. animales. o cualquier agente modificado genéticamente o proveniente de seres vivos. antisueros. plástico o bolsas plásticas. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . y es por esto que: • Todo el personal docente debe conocer el nivel de riesgo que implica la manipulación de microorganismos. plasma. susceptibles de originar algún tipo de infección. barbijos. Barrera 2: está dispuesta alrededor del trabajador e incluye ropa protectora (delantales. diluciones y medios sembrados o inoculados será informada al docente de inmediato. Riesgo individual elevado o comunitario escaso (por ejemplo. el nombre y forma de ubicar al profesional responsable en caso de accidente y los requerimientos que deben cumplir las personas que ingresen al laboratorio. zapatos cerrados. • El uso de máscaras protectoras para ojos. así como cualquier equipo diseñado para prevenir la diseminación de los agentes infectivos por aerosol o aire. informar la especie con la que se trabaja. para los otros niveles es necesario una cabina. la cual se dejará actuar y se recogerá con papel absorbente que será luego autoclavado. Las siguientes medidas de contención primaria son necesarias para prevenir el escape de agentes infecciosos en el ambiente del laboratorio y proteger a las personas. nariz o boca está recomendado para el manejo de microorganismos peligrosos o manipulaciones de otros agentes biológicos que puedan conducir a la formación de aerosoles y especialmente en caso de trabajar con hongos.17 • Nivel de Seguridad II: Agente patógeno que puede provocar enfermedades en humanos o animales pero tiene pocas probabilidades de producir riesgo grave para el personal o su entorno. Agentes patógenos que suelen ocasionar enfermedades graves o mortales y que puede propagarse fácilmente (epidemias). Riesgo individual moderado y comunitario limitado. para el Nivel de Seguridad I puede alcanzar con un mechero. Se tomarán las precauciones debidas para cada desinfectante. etc. la zona será tratada nuevamente con desinfectante. Por ejemplo. Barrera 1: está dispuesta alrededor del microorganismo e incluye las buenas prácticas microbiológicas. guantes. Nivel de Seguridad III: Agente patógeno que suele ocasionar enfermedades humanas graves pero no se propaga de una persona a otra. • • En aquellos laboratorios en que se desarrollen actividades con microorganismos que no pertenezcan al Grupo I. El derrame o caída de muestras contaminadas. Una vez limpia. • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . se debe exponer en la puerta el símbolo de Riesgo Biológico durante el tiempo en que se realicen las tareas.) así como medidas de higiene y supervisión médica. aerosoles o transmisión por aire). Nivel de Seguridad IV: Riesgo individual y comunitario elevados. Se procederá a tratar el área afectada con solución desinfectante que corresponda. Los jefes de trabajos prácticos y coordinadores deberán implementar que las manipulaciones más riesgosas. Todos los elementos corto punzantes utilizados serán desechados en descartadores apropiados (recipientes rígidos que no permitan su apertura). etc. abrigos o bolsas sobre las mesadas trabajo. Las pipetas usadas. etc. heladeras. como el trasvasamiento de cultivos.18 • En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos. baños termostatizados. centrífugas refrigeradas. hornos de hibridación. congeladoras. los cultivos se inactivarán y se procederá como en el punto anterior. Se tomarán los recaudos necesarios para que los recipientes individuales estén contenidos en otros de mayor capacidad para prevenir la diseminación de material orgánico dentro del autoclave en situaciones de daño o derrame. perfectamente identificados y etiquetados y bajo la responsabilidad del docente a cargo del laboratorio. Los docentes deberán estar entrenados en el manejo correcto de cada instrumento: fuentes de poder. autoclaves. sean realizados por los docentes en zonas aptas para esa tarea. espectrofotómetros. El almacenamiento de recipientes con cualquier material biológico debe efectuarse en cuartos. portaobjetos y otros elementos abiertos deberán colocarse en un recipiente con solución desinfectante para su posterior descontaminación y lavado o descarte. El área de trabajo debe estar limpia. termocicladores. microscopios. a) Siempre desinfectar y ordenar la zona de trabajo antes de comenzar.. • • • • • Tratamiento y disposición de los desechos generados • Todos los cultivos se autoclavarán antes de su disposición final y los residuos generados se tratarán como residuos domiciliarios. ordenada sin libros. Lavarse las manos meticulosamente cada vez que deje de trabajar y secarse con papel descartable. En caso de trabajar con hongos toxicogénicos. Está terminantemente prohibido verter muestras o cultivos en las piletas. al terminar o si se hace un intervalo. proceder de igual forma pero no tocar los residuos antes de que el desinfectante hubiera actuado. • • • • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . estufas. duchas. deben ser conocidos por todo el personal docente. zapatos cerrados). una vez desinfectados. beber. abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo. No deben colocarse libros. deberán ser envueltos en papel grueso. • • • CONTINGENCIA O EMERGENCIAS • Los planes de contingencia que permitan contener derrames o fugas. fumar o maquillarse en el laboratorio. cuádruplo y colocado en caja de cartón. arena. comunicados a los alumnos al inicio del ciclo lectivo y cumplido estrictamente. Toda herida o abrasión. extintores. incendios. material para recoger derrames (tierra de diatomeas. recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento. Los restos recipientes de vidrio rotos. • BUENAS PRÁCTICAS • Las buenas prácticas incluyen reglas.) e implementos de limpieza para recolectar desperdicios en caso de rotura de material. asegurándose de que no queden bordes y aristas potencialmente cortantes. el sentido común y la solidaridad en el ambiente de trabajo. preferentemente de algodón y mangas largas que no será utilizado fuera del laboratorio.19 • • No está permitido encapuchar las agujas antes de ser desechadas. En el laboratorio debe existir un contenedor especial para vidrios rotos. • • • El área de trabajo debe estar limpia y ordenada. aún los pequeños cortes que puedan producirse durante el trabajo práctico deben ser informados obligatoriamente al docente. No está permitido pipetear con la boca. etc. Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles. además de contar el equipo de protección personal. Se deberá usar vestimenta adecuada (guardapolvos que cubran la ropa de calle. accidentes. No se permitirá comer. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . lavaojos. sismos. salidas. 20 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 2 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.C.21 Practica No. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 22 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 23 MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO PRÁCTICA No. 2 OBJETIVO: El alumno conocerá las partes del microscopio de campo luminoso, su funcionamiento y cuidados para conservarlo en las mejores condiciones de trabajo y así lograr buenas observaciones utilizando los diferentes objetivos. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Una de las herramientas más útiles e importantes en microbiología es el microscopio. Todas las formas vivientes con las que se experimentan en Microbiología son prácticamente invisibles a simple vista y es esencial estar plenamente familiarizado con el Microscopio al empezar cualquier curso de Microbiología. Desde el punto de vista óptico, se reconocen dos tipos de microscopios: el que solamente usa una lente, también llamada lupa, que es el microscopio simple y el que se usa por lo menos dos lentes, microscopio compuesto, en el cual la imagen producida por la primera lente o sistema de lentes (objetivo) es ampliada por la segunda lente o sistema de lente (ocular) AUMENTO MAXIMO UTIL (x) 1500 1500 2500 LIMITE DE RESOLUCIO N (nm) 100-200 100-200 100 FECHA DE REALIZACIÓN: 08 de septiembre de 2009 TIPO DE MICROSCOPIO APLICACIÓN EN MICROBIOLOGÍA Campo luminoso Campo oscuro Ultravioleta LUZ Fluorescencia Contraste de fases Con focal Barrido ELECTRONICO Transmisión EFECTO TUNEL Muy usado con objetos teñidos. Para microorganismos vivos o difíciles de teñir. Para obtener mayor aumento y resolución que en campo luminoso. Para objetos con fluorescencia natural o por tinción; muy útil en identificación. Para ver estructuras de microorganismos vicos, sin teñir. Permite estructuras superficiales con una imagen tridimensional. Permite ver imágenes en dos y tres dimensiones. Para observar organelos y ultra estructuras de microorganismos. Observación de macromoléculas o átomos. 1500 1500 1500 15000-100000 6000-400000 1000000100000000 100-200 100-200 100-200 1 a 10 1 <0.1 a 1 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 24 Partes de un microscopio compuesto de campo brillante: Sistema Función Fuente de luz Selecciona la longitud de onda de la luz. Recoge la luz de la lámpara y la concentra en Condensador el objeto. Regula la cantidad de luz que sale de la Diafragma de campo lámpara. Regula la luz del condensador y permite Diafragma de condensador contrastar el objeto. Sistema de lentes de aumento. Pueden ser Objetivos secos o de inmersión en aceite. Conjunto de lentes de aumento que Ocular colectan, enfocan y envían la luz al ojo donde se forma la imagen virtual. Tornillos micrométricos Acerca o aleja rápidamente o lentamente el objeto y el sistema óptico. y macrométricos Revolver Sostiene y permite el cambio de los objetivos. Platina Sostiene la preparación o portaobjetos. Pie y brazo Sostiene la parte óptica. Parte Lámpara Filtro Iluminación Óptica Ajuste Soporte CUIDADOS DEL MICROSCOPIO: 1. Transportar el microscopio en forma vertical, tomándolo del brazo con la mano y de la base con la otra. 2. Colocar cuidadosamente microscopio en la mesa. Es conveniente asegurar que no exista vibraciones o aparatos que la provoquen (vórtex, agitadoras, etc.) en la mesa donde se coloquen. 3. Limpiar el soporte metálico del microscopio con una tela que no deje pelusa y la parte exterior del sistema óptico con papel seda. Si las lentes se encuentran demasiado sucias pueden limpiarse con un hisopo de algodón impregnado con agua. En caso extremo acudir a un experto. JAMAS LIMPIAR LAS LENTES CON SOLVENTES ORGÁNICOS. 4. Evitar arrastrar, golpear o inclinar el microscopio. 5. NUNCA DEBE LIMPIARSE CON EL DEDO EL ACEITE DEL OBJETO DE INMERSIÓN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 25 MANEJO DEL MICROSCOPIO: 1. Iluminación del campo visual: • • • • Conectar y prender la lámpara. Acercar el objeto a la preparación. Subir el condensador hasta el tope. Abrir o cerrar el diafragma del condensador hasta tener un campo adecuadamente iluminado y con el mayor contraste posible. Recuerde que los campos excesivamente iluminados disminuye el contraste de la estructura del objeto que se observa y que los campos poco iluminados no permiten distinguir los colores. 2. Colocar la preparación en la platina y sujetarla con las pinzas. 3. Enfoque la preparación. • • Cuando sea necesario, colocar el cubre objetos en la preparación. Enfocar la preparación con el objeto seco débil (10x) usando primero el tomillo macrométrico y después el tornillo micrométrico hasta obtener una imagen clara. Sin mover los tornillos, cambiar el objeto seco fuerte (40x) y mover el tornillos micrométrico hasta enfocar de nuevo. Para observar con el objeto de inmersión ponga el cubre objetos sobre la muestra. Dejar caer una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación, con cuidado cambiar el objeto de inmersión e intentar enfocar la preparación en el tornillo micrométrico. Cuando se está enfocando una preparación que se desea observar con el objeto de inmersión nunca se debe mover el tornillo macrométrico. Es importante tener cuidado al estar buscando el enfoque correcto ya que a veces por descuidado se presiona demasiado el porta objeto hasta que se rompe. Al terminar de hacer las observaciones, limpiar el microscopio como se indico anteriormente y entregarlo: a) Con la lámpara apagada, el cable enrollado y sujeto con una liga. b) Con la platina hasta el tope inferior. c) Con el revólver colocado en el objeto de menor aumento a donde no lo tiene. Colocar en el lugar asignado y cubrirlo con la funda. Avise a los profesores de cualquier irregularidad que note en el microscopio. • • • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL y extiéndala sobre el portaobjetos. Epidermis de cebolla. Microscopio de campo brillante. Cultivo mixto de protozoarios (agua estancada) TÉCNICA: Preparación húmeda (montaje húmedo): a) Limpie perfectamente los portaobjetos y coloque con cuidado una pequeña gota del cultivo protista o cualquier otra muestra. 6. Presente imágenes ante los diferentes objetivos: seco (10x). 5.26 ACTIVIDADES MATERIAL: 1. c) Para observarse. e inmersión (100x). coloque una gota pequeña de agua destilada sobre el portaobjetos y mézclela con una muestra del sólido que le interese. b) Si la muestra es cultivo sólido. para que pueda ser disuelto en el agua. Tela suave. Portaobjetos y cubreobjetos. seco fuerte (40x). en zona estéril y siguiendo la técnica aséptica tome una muestra con la pipeta Pasteur o con el asa. MATERIAL BIOLÓGICO: 1. b) Con cuidado cubra la gota con un cubreobjetos perfectamente limpio. 2. REPORTE DE LA PRÁCTICA: 1. 3. Preparación seca (frotis): a) Si la muestra es líquida. 2. Ayúdese con una pipeta Pasteur o con varias asadas. siga los pasos que se indican en el manejo del microscopio hasta tener una imagen nítida. deje secar al aire. 4. Hisopos de algodón. Pipetas Pasteur o asa bacteriológica. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Deje secar al aire. Resumir en un cuadro sinóptico las principales partes del microscopio compuesto. 2. Azul de metileno. 27 ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Realizamos un frotis húmedo con el agua estancada y observamos con diferentes objetivos: Seco (10x) Seco fuerte (40x) Colocamos una porción de epidermis en el portaobjetos y observamos con diferentes objetivos: Seco (10x) Seco fuerte (40x) LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . retiramos el exceso y montamos la preparación para proceder a observar: No realizamos observaciones con el objetivo de inmersión (100x). pues las muestras que teníamos eran húmedas. y el contacto del cubreobjetos con el lente podría haberlo dañado.28 Agregamos colorante a la muestra. 29 Partes del microscopio: Mapa conceptual de las partes del microscopio: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . CUESTIONARIO: ¿Cuáles son las diferencias bajo el microscopio más obvias entre los microorganismos observados? R= La forma. ¿Qué partes de la ultraestructura de una bacteria solamente se puede observar por microscopía electrónica? R= Gracias al microscopio electrónico se hizo posible observar con detalle la estructura interna de las bacterias. Todavía se trabaja en el perfeccionamiento de estas técnicas. en el caso de la cebolla logramos apreciar la forma de las células en su epidermis. por lo cual. observada con los diferentes objetivos: Seco (10x) El panorama con el objetivo seco.30 Esquemas de las observaciones del agua estancada. Seco fuerte (40x) Con este objetivo se logra apreciar el agua con más detalle. conocimos las partes del microscopio compuesto y pudimos apreciar diferentes morfologías mediante su uso. no permite observar a detalle. pues pudimos apreciar diferentes morfologías. la anatomía está en una fase de desarrollo acelerado. aunque el campo visual se reduce. CONCLUSION: Durante esta práctica. aunque nos proporciona un gran campo visual. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 31 Practica No.C. 3 Miguel Ángel Rendón Sagardi M. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 32 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . rugosa o granular g) Aspecto: puede ser húmedo o seco h) Luz reflejada: puede ser brillante o mate. embonada. f) Superficie: puede ser lisa. filamentos.33 MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM PRÁCTICA No. se encuentra una gran variedad. b) Color: las colonias pueden tener varios colores. 3 OBJETIVO: El alumno describirá y reconocerá la morfología colonial así como la realización de la técnica de coloración de Gram con especies bacterianas conocidas. c) Forma: pueden ser puntiformes. suelo. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie de la caja. esta última a su vez puede ser convexa. La observación cuidadosa de las colonias muestra que éstas varían en apariencias. con una distancia que permita distinguir y describir la morfología colonial que incluye: a) Tamaño: se describe en milímetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeñas que miden apenas una fracción de milímetro hasta aquellas que llegan a medir 10mm o más. Por definición un buen aislamiento en placas es aquel que nos da colonias aisladas. crateriforme o umbilicada. d) Bordes: pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos. agua o alimento. circulares o irregulares. Las colonias puntiformes son tan pequeñas que no se pueden distinguir el resto de sus características. debido a pigmentos propios a absorción de algunas sustancias del medio. e) Elevación: la colonia puede ser plana o elevada. planta. pulvinada. Una colonia microbiana está constituida por individuos de la misma especie provenientes de una célula o de un grupo de ellas. se deben obtener colonias separadas o aisladas. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Si se quiere trabajar con un cultivo puro. proyecciones como dientes de sierra enrollados. FECHA DE REALIZACIÓN: 11 de septiembre de 2009 FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Morfología colonial: Cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal. Sólo raramente se encontrará un solo tipo de microorganismo. esta última puede ser butirosa. La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la estructura y composición química de muchos componentes celulares entre los LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL i) j) . es fácil confundir un punto o bastón sobre un fondo de un mismo color con algún artefacto. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram. y otros efectos similares.34 Luz transmitida: puede ser transparente. Esta característica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto puede ser la última en describirse. se desarrollo para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirtió que era útil para la diferenciación de bacterias. En los tejidos que tenían bacilos tuberculosos. violeta de genciana con anilina y los tejidos circulantes con café de Bismark o vesubiano. Producción de pigmentos: algunas bacterias producen pigmentos solubles en agua. k) Consistencia: dura o suave. Tinción de Gram: La observación microscópica de las bacterias es más fácil cuando se tiñe. translúcida u opaca. Las bacterias teñidas por esta coloración se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positiva y las que se decoloran con el decolorante y se tiñen con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como la safranina o la fucsina básica aunque puede usarse verde de malaquita para los observadores daltónicos) o Gram negativas. La certeza de tener un cultivo puro así como el reconocimiento de un cultivo mixto o impuro permite la caracterización correcta de un microorganismo. En esta tinción diferencial las bacterias se teñían de color púrpura oscuro usando la llamada solución Ehrlich. o friable. Este problema apareció cuando las muestras de tejidos infectados se tifien con azul de metileno buscando a las bacterias incluidas. las características de morfología colonial viene a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos. patólogo danés que en 1884 introdujo un colorante de contraste después de la decoloración. l) Otras: en ciertos medios de cultivos el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de la colonia. y también permite en muchos casos corroborar la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminación. acidificación que de manifiesta con un indicador pH incorporado al medio de cultivo. El primer intento para resolver el problema fue decolorar los cortes después de la coloración. esto fue efectivo pero en otras bacterias se decoloraba igual que los tejidos y no se ganaba nada. como la hemolisis en gelosa sangre. Originalmente la coloración de Gram. Con la experiencia en la observación de cultivos. que puede difundir al medio ambiente. Sin embargo. las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y varios agentes químicos y son más resistentes a la desintegración por tratamiento mecánico que las Gram negativas. es decir atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la porosidad reducida de la gruesa pared celular que ocurre durante de la etapa del lavado diferencial con etanol al 95%. las Gram negativas la delgada capa de peptidoglicana no impide la extracción del complejo colorante-mordente en la decoloración. El colorante secundario o de contraste tifie fácilmente a las células decoloradas. El complejo colorante-mordente. En general. ambos grupos de bacterias se tiñen con el colorante primario (cristal violeta) y mordente (yodo). En cambio. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta principalmente de una capa de peptidoglicana relativamente gruesa (20-80nm).35 que destaca la pared celular. Las diferencias básicas en la estructura superficial de las bacterias Gram positivas y negativas contribuyen a aclarar la diferencia en la respuesta a la coloración Gram. las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicana delgada (5-10nm) además de una membrana externa constituida de fosfolípidos y lipolisacáridos. Durante la tinción de Gram. El rompimiento mecánico o disgregación enzimática de la pared celular de los Gram positivos los hace teñirse como Gram negativos. Gram negativas. En cambio. que como grupo. son más susceptibles a otros antibióticos como la estreptomicina. GRAM POSITIVO Fijación Cristal violeta Lugol GRAM NEGATIVO Decoloración Alcohol-cetona Safranina LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Anote las observaciones. Segundo caso LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 5. Después añada cuidadosamente un colorante y déjelo por espacio de un minuto. tome una muestra con el asa y extendiéndola sobre un portaobjetos perfectamente limpio y deje secar al aire. Asa bacteriológica Puente de tinción Portaobjetos Cubreobjetos Mechero EQUIPO: 1. Azul de metileno PROCEDIMIENTO: PREPARACIÓN DE UN FROTIS Y TINCIÓN Primer caso 1.36 ACTIVIDADES MORFOLOGÍA COLONIAL: MATERIAL BIOLÓGICO: Cultivos de 24-48 hrs. 3. 4. Bacillus megaterium. 3. Staphylococcus aureus. de Escherichia coli. Cristal violeta 3. Safranina 2. 2. MATERIAL: 1. Si se tiene un cultivo líquido. Suavemente lave el frotis con agua. Observe cada uno de los objetos. 4. 5. Saccharomyces cerevisiae. 2. Microscopio REACTIVOS: 1. deje secar al aire. 4.37 1. 2. Evitar los frotis que se vean espesos. 3. Extienda ésta suspensión hasta hacer un frotis. Flamee el asa con el mechero y deje enfriar al aire cerca de la llama. MATERIAL: 6. Evitar que el colorante actué por tiempos muy prolongados o muy cortos. Secar cerca del mechero puede deshidratar o quemar los frotis. primero coloque una pequeña gota de agua destilada sobre un portaobjetos perfectamente limpio. AI ocupar los portaobjetos deberán estar limpios de cualquier material extraño 2. Cubreobjetos 10. Evitar hacerlo por donde están los frotis. Sujetar por los lados al portaobjetos. Portaobjetos 9. Saccharomyces cerevisiae. 1. Si se tiene una placa con cultivo. Continué con el proceso descrito anteriormente. de Escherichia coli. de otra manera no podrá apreciar con exactitud al microscopio 3. Puente de tinción 8. TINCIÓN DE GRAML: MATERIAL BIOLÓGICO: Cultivos de 24-48 hrs. 4. por lo que se debe considerar las siguientes recomendaciones. 5. Tome con el asa una pequeña colonia de la palca y haga una pequeña suspensión bacteriana con la gota que está en el portaobjetos. Asa bacteriológica 7. Bacillus megaterium. Enterobacter aerogenes. PRECAUCIONES: Al realizar esta técnica se puede cometer errores que son comunes y que entorpecen una buena interpretación al hacer la observación. Staphylococcus aureus.. Proteus sp. puede arriesgar a contaminarse con el microorganismo. Saccharomyces cerevisiae. Mechero EQUIPO: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Lavar vigorosamente y con exceso de agua. 7. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .38 2. 4. Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco. 8. decolorar añadiendo gota a gota al alcohol-cetona durante 5 a 15 segundos. Dejar actuar por más tiempo el decolorante arrojará resultados falsamente negativos. 5. 2. elimina el frotis. Un frotis mal fijado al portaobjetos puede ocasionar durante los lavados arrastre a las bacterias. Lavar inmediatamente con un chorro de agua suave. Safranina Cristal violeta Bicarbonato de sodio al 5% Lugol Alcohol – cetona Aceite de inmersión PROCEDIMIENTO: 1. 9. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. sin embargo. Este es el paso crítico de la tinción. se pueden cometer errores que hacen variar el resultado y consecuentemente la interpretación. colorante o complejo frotis-colorante del portaobjetos. Cubrir los frotis con solución de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. 6. 3. Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua. Un cultivo viejo influye en los resultados obtenidos durante la tinción de Gram. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. PRECAUCIONES: La tinción de Gram en general es muy sencilla de hacer. El momento exacto para terminar la coloración con agua es cuando dejan de fluir "hilos colorantes" por el frotis. Microscopio REACTIVOS: 4. Hacer frotis con una de las bacterias y fijarla con calor. 3. Dejar secar al aire. 4. 2. 5. Cubrir los frotis con safranina y dejar actuar durante un minuto. Los errores detectados frecuentemente son: 1. 39 ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Morfología colonial: Tomamos el asa bacteriológica y la pusimos a la flama del mechero Bunsen hasta que se pusiera al rojo vivo. coli sobre el portaobjetos esparciéndola levemente y posteriormente pasándola por la flama del mechero una tres veces procurando que no se quemara: Colocamos el portaobjetos en el puente y aplicamos safranina y dejamos reposar de 1 minuto a minuto y medio y posteriormente lavamos con agua destilada: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . con el fin de esterilizar y posteriormente dejamos enfriar: Colocamos la bacteria E. En el seco fuerte 40x no se tomo fotografía. hay que recordar la bacteria es un bacillo en forma de bastón. Posteriormente llevamos al microscopio pero sin colocar el cubreobjetos: En las siguientes fotos se muestra la bacteria Escherichia coli aglomeradas como cadenas. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .40 Colocamos el portaobjetos de nuevo en el puente y dejamos secar hasta que el agua sobrante se evapore y no se vea rastro alguno. En el seco débil 10x pudimos distinguir la bacteria pero en forma de pequeñísimos círculos. En el de Inmersión 100x ya se observa con mucho más nitidez las cadenas aglomeradas de la bacteria la macha naranja es el tinte rojo. una muestra de E. coli: Hicimos el frotis seco la bacteria en cada portaobjetos y fijamos con calor. colocamos una pequeña cantidad de colorante cristal violeta a cada uno de los frotis y dejamos reposar de medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrimos el colorante y lavamos con la piseta: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . con la ayuda del asa.41 Tinción Gram: En cuatro portaobjetos identificados con un plumín permanente (del 1 al 4) colocamos. (Recordad que no hay que poner directamente el frotis en la llama y hacerlo por lapsos de tiempo): Una vez seco el frotis. y lo hicimos con el 3 y 4). Dejamos actuar durante 15 segundos. y dejamos actuar durante medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrimos el reactivo y lavamos con un chorro suave de agua. Lavamos inmediatamente con un chorro suave de agua. Este es el paso crítico de la tinción. del 1 al 4: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Luego colocamos el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco.42 Posteriormente cubrimos los frotis con una pequeña cantidad de solución de Lugol (NOTA: omitimos el portaobjetos numero 1. Dejamos actuar de medio minuto a 1 minuto y posteriormente escurrir el reactivo y lavamos con un chorro suave de agua. y lo hicimos del 2 al 4). Dejamos secar y observamos cada portaobjetos. Posteriormente colocamos en pequeña gota de colorante de safranina únicamente al portaobjetos 4. El momento exacto para terminar la coloración con agua es cuando deja de fluir “hilos colorantes” por el frotis. decoloramos añadiendo gota a gota alcohol-cetona (NOTA: omitimos el portaobjetos número 1 y 2. Lugol y Alcohol-Cetona Frotis con Cristal Violeta. Esta bacteria se encuentra en el tracto intestinal de los mamíferos. Todas las células se tiñen a está considerada como azul violeta el material biológico En el más utilizado en Paso 2 experimentación. La especie comprende Todas las células siguen varios grupos que se del mismo color azul establecen según su violeta actividad. y de cómo se va Las células Gram Positivas siguiendo cada paso en (G+) se ven azul-violeta y las Gram Negativas (G-) la tinción de Gram hasta concluir en Gram rosas o rojas Negativa Frotis con Cristal Violeta Frotis con Cristal Violeta y Lugol Frotis con Cristal Violeta. En el En las fotografías se Paso 3 puede notar como los G bacillos en forma de bastones se aglomeran como si estuvieran G formando cadenas o tiras. que pertenece a la familia de las Enterobacteriáceas. Las especies En el de Escherichia coli Paso 3 oportunistas producen infecciones sólo si abandonan el colon. bacteria con forma de bastón (bacilo). La Escherichia coli es un organismo adecuado Las células Gram Positivas para la investigación por siguen de color azulvioleta mientras que las de su crecimiento rápido y Gram negativa se porque su cultivo es decoloran sencillo.43 Esquemas de las fotos obtenidas en cada porta objetos Forma Forma de Identificación En el Paso 1 Agrupación Escherichia coli. Lugol y Alcohol-Cetona y Safranina LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de la coloración de Gram? R= Es cuando se le agrega el alcohol-cetona pues cuando dejan de fluir hilos colorantes por el frotis 3. BIBLIOGRAFIA Brock Biología de los Microorganismos. Diga el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram positivas y tres Gram negativas diferente citadas en la práctica. dysenteriae y H. reconocimos la morfología colonial y aprendimos la técnica de tinción diferencial de Gram con especies bacterianas conocidas. COLI ES GRAM NEGATIVA Cada uno de los integrantes del equipo llevo acabo el mismo procedimiento en un solo portaobjetos y llegamos a la misma conclusión. CONCLUSIÓN Durante esta práctica. Editorial PEARSON Prentice Hall. 2. y las que se decoloran con el alcohol-cetona y se tiñe por contraste de rosa o rojo. C. Madigan. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . CUESTIONARIO 1. diphtheriae y M. John M. Gram Positivas: Saccharomyces . Autores: Michael T. ¿Qué importancia tiene la técnica de coloración de Gram en la identificación de las bacterias? R=Por medio de esta tinción se puede diferenciar las bacterias y se pueden dividir en dos grupo: las que retienen el violeta de genciana o cristal-violeta que son las Gram Positivas. Edición. R= Gram Negativas: Escherichia coli . S. 10ma.44 LA BACTERIA E. influenzae. tuberculosis. Martinko y Jack Parker. C.45 Practica No. 4 Miguel Ángel Rendón Sagardi M. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 46 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Estos cambios pueden llegar a inhibir el crecimiento del microorganismo. Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el O2 y CO2. Micro-aerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de O2 libre.47 MEDIOS DE CULTIVO PRÁCTICA No. 4 OBJETIVO: El alumno preparará diversos medios de cultivo utilizando agar y fuentes fuente de carbono y sales minerales. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Para diseñar un medio de cultivo se debe tener en cuenta no sólo los nutrientes requeridos por el microorganismo que se desea estudiar. la cual no debe plantear problemas de variación de LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . los cuales son: • Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto determinado. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia de O2 libre. además de los requerimientos nutricionales del microorganismo. • Suministro de luz: Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación. el más utilizado en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4. sino también las condiciones físicas que le permitan crecer. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O2 libre clasificándose en 4 grupos: • • • • FECHA DE REALIZACIÓN: 22 de septiembre de 2009 • • Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre. galactósidos. por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor. • • Grado de humedad Presión osmótica: generalmente se trabaja en condiciones de isotonía (300 miliosmoles). ya que no se disuelve por el efecto de las sales. Además de los polisacáridos. calcio. ni se consume por la acción de la mayoría de los microorganismos. potasio. fundamentalmente.48 temperatura. Químicamente. • Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas y la velocidad con que se efectúan. las cuales están influidas por la temperatura. en concreto de miembros orientales del género Gelidium. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en: • • • Psicrófilas (psicrofílicas): capaces de desarrollarse a 0° C o menos. De los cuales no LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . que lo han hecho hasta ahora insustituible. Su temperatura óptima es alrededor de los 15° C. etc. determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio. tales como sodio. Termófilas (termofílicas): crecen mejor entre 45 y 60° C. por lo cual la temperatura puede. el agar es una mezcla compleja de sales de polisacáridos. • • Agar El agar (llamado antiguamente agar-agar) es un gel coloidal formado por hidratos de carbono. Esterilidad Protección: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminación microbiana ambiental. en parte. el agar contiene numerosos cationes asociados. Mesófilas (mesofílica): crecen mejor entre 25 y 40° C. magnesio. como coloides y espesantes. de extendido uso comercial. Es un excelente medio de cultivo de bacterias. aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotónicas e hipertónicas. y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas. Las grandes moléculas que lo constituyen determinan sus cualidades sobresalientes. Medios sólidos: Su proporción de agar es siempre por encima del 15%. 2. 3. infusión de cerebro. Composición: 1. otros elementos como estimuladores de crecimiento pero siempre a concentraciones conocidas. Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. etc. A continuación. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. K. Tales como: adicción de sangre. suero o extractos de tejidos de animales y plantas. vitaminas. etc. Medios de enriquecimiento: Son medios complejos. se caracterizarán los tipos de medios de cultivo según su estado y composición. Ca. Referente a las propiedades y contenidos del agar.49 está. y a veces según las características de medio. sales minerales. época de cosecha y madurez del alga. 4. Medios sintéticos o químicamente definidos: Llevan fuentes de carbono. procedencia geográfica. pero siempre suele presentar cierta cantidad que le proporcione una consistencia semisólida. peptona. claramente. normalmente. 2. aminoácidos. Medios semisólidos: Son medios intermedios entre los medios líquidos y sólidos. establecida su influencia sobre las propiedades de este producto. dependen de la materia prima empleada. adicionando cristal violeta se inhibe el LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. factores de crecimiento. Mg. extracto de carne. sales que suplan iones (P. Estado: 1. con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). su proporción de agar suele ser suele ser inferior al 5%. nitrógeno. básicamente. 3. entre otros. Medios líquidos o caldos: No contiene agar y su composición (además de agua) suele contener al menos una fuente de carbono.). Medios complejos o de composición indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura. Fe. peptonas. Agar McConkey: Medio diferencial para la detección. Medio de cultivo de uso común: Agar Nutriente: Medio para fines generales que promueve el crecimiento de la mayoría de los microorganismos poco exigentes. Los hidratos de carbono y la infusión de papa favorecen el crecimiento de levaduras y hongos. en tanto que por el bajo rango de pH. Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en la muestra depende tan solo de la reacción ácida (pH 5. apareciendo en la colonia el color rojo. 7. aislamiento y enumeración de bacterias coniformes y patógenas intestinales en aguas. de comestibles y de otros materiales. Caldo Nutritivo: Medio de uso general. Su acción diferencial está basada en que los microorganismos capaces de fermentar lactosa producen una caída de pH. Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes así como para los no exigentes. junto con una absorción del colorante. utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.6). 5. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos. Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.50 crecimiento de los Gram Positivos (G+). productos lácteos y muestras biológicas. Clostridios y anaerobios pueden crecer también cuando se incuban bajo condiciones de anaerobiosis. Por ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos. Agar Sabouraud: Medio para la detección y aislamiento de hongos en muestras mediante técnica de filtración por membrana. Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y enumeración de levaduras y mohos a partir de alimentos y otros materiales. McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). la flora acompañante se reduce significativamente. 6. acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Agar Salmonella-Shigella: Medio para el aislamiento de salmonelas y de Shigella de heces. las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanecen incoloras. b. al ser el equipo número dos nos tocó preparar: Algodón Matraces elenmeyer Cajas de Petri Espátula Mechero Mortero con Pistilo Tubos de ensayo LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . en nuestro caso. fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para la identificación rápida de los albicans. d. e. f. g. c.51 Agar Levine: Medio para el aislamiento y la diferenciación de los Escherichia coli y enterobacterias. Cuadro de Crecimiento: Agar nutriente Staphylococcus aureus Escherichia coli NO SI Agar McConkey NO SI Agar Levine NO SI Agar Chapman SI NO Agar Papa dextrosa NO NO Agar SalmonellaShigella NO NO Agar Sabouraud SI SI Agar Sangre NO SI Caldo Nutritivo SI SI MATERIAL: a. Agar Chapman: Medio para la detección de Staphylococcus patógenos en muestras de alimentos y otros materiales mediante la técnica de filtración por membrana. EQUIPO: a) Balanza granataria b) Olla exprés REACTIVOS: a) Agares g) Caldo Nutritivo PROCEDIMIENTO: Cada equipo preparó dos medios de cultivo diferentes. 3±0. utilizado para el crecimiento de microorganismos exigentes así como para los no exigentes.0 g. 1. 6. 3.0 g.9±0.5 g.5 g.2 30. Posteriormente poner algodón y tapar con papel aluminio la boca (caso agar). 3. 7. De la flora bacteriana del suelo solo pueden desarrollar las bacterias no exigentes. Clostridios y anaerobios pueden crecer también cuando se incuban bajo condiciones de anaerobiosis. bacterias del suelo y otros microorganismos. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 5.0 g. 0 .52 Caldo nutritivo: Medio de uso general.01 g. 0. Agar Czapek-dox: Medio de cultivo para hongos saprófitos. 3. Fórmula para 1000ml de agua destilada: Peptona de gelatina Extracto de carne de res pH final Disolver 8 gramos en un litro de agua destilada.0 g.01 g. En este medio la única fuente de carbono es la sacarosa y el nitrato aporta nitrógeno. 0. 1. pese la porción correspondiente de polvo para preparar el medio de cultivo. 2. Utilizando la balanza granataria. Se recomienda para el aislamiento de Aspergillus y Penicillium.0 g.2 . Fórmula para 1000ml de agua destilada: Sacarosa Nitrato de sodio Sulfato de magnesio Fosfato dipotásico Cloruro de potasio Sulfato ferroso Agar pH final Disolver 5 gramos en un litro de agua destilada. 0. Deposite en el matraz y llena afora con agua destilada y posteriormente homogeniza dando círculos en la punta de la llama del mechero de bunsen. Después sacar y meter al microondas para que cambie a estado liquido. PRECAUCIONES: • • El procedimiento para la preparación de cualquier medio de cultivo debe realizarse rigurosamente para no contaminar el medio.28g. 160ml. 10. 11. Llevar a la estufa hasta que llegue a los 300 °C. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . basta disolver 8 gramos del polvo en un litro de agua. Llevar a la olla exprés con poca agua y colocar los matraces. Colocar el agar en las cajas Petri cerca de la flama del mechero de bunsen y esperar a que se solidifiquen. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Para preparar el caldo nutritivo. 9. Se disolvió. Meter al refrigerador para conservar. Se midió el volumen de agua. 7. 8. → x x = 1. Posteriormente sellar con un pedazo de masking-tape y un sello de identificación de agar. mantener 15min y luego esperar a que baje la temperatura.53 4. Se pesó. y ya que deseamos preparar 160 ml. 6. Depositar en tubos de ensayo (caso caldo) 5. Los medios de cultivo en ocasiones vienen muy duros (como piedra) así que hay que utilizar una espátula para picar y una mortero con pistilo para pulverizar.0g. Posteriormente llevar al refrigerador y dejar reposar durante 24 hrs. → 8. se tiene: 1000ml. 0g. → x x = 1. 210ml. basta disolver 5 gramos del polvo en un litro de agua. y se introdujo a la olla exprés. Para preparar el agar Czapek-dox. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Se midió el volumen de agua.05g. Se le colocó el sello de algodón y papel aluminio. y ya que deseamos preparar 210 ml. Se disolvió. se tiene: 1000ml.54 Se llenaron los tubos de ensayo para introducir en la olla exprés. → 5. Se pesó. S. Métodos Microbiológicos Edición Acribia. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . quinta edición. los cuales permiten el crecimiento y desarrollo de microorganismos gracias a que proporcionan sustancias nutritivas. aprendimos a preparar los medios de cultivos. España.55 Se saca de la olla y se llenan las cajas de Petri.A. Lyne Patricia. Zaragoza.H. CONCLUSIÓN Durante esta práctica. BIBLIOGRAFIA Collins C. 56 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 5 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.57 Practica No. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .C. 58 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. en este caso. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. 5 OBJETIVOS: El alumno inoculará diversas bacterias con el fin de observar las características de las mismas. Si las bacterias son capaces de producir fermentación. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: El cultivo es un método para la multiplicación de células o microorganismos. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van. generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. para identificar cada tipo de bacteria. El alumno realizará diluciones con el fin de observar la proliferación de bacterias en un medio determinado. Así. tras muchos ciclos reproductivos. pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. o para el crecimiento de tejidos en el que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado. algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos.59 CULTIVO DE BACTERIAS Y DILUCIONES PRÁCTICA No. se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. FECHA DE REALIZACIÓN: 29 de septiembre de 2009 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. es empleado como un método fundamental para el estudio de las bacterias. se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización. Enumerar para saber que bacteria se sembrará en cada zona. 2. Tomar las cajas de los medios con Agar Czapek-dox.60 Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología. MATERIAL: • • • • • • • • Olla exprés Asa bacteriológica Mechero Crayón Balanza granataria 6 Tubos de ensayo 6 Cajas de Petri 1 matraz REACTIVOS: • • • • • • • 2 medios de Czapek-dox 2 medios de Agar Nutritivo 2 medios de Agar dextrosa y papa 2 medio de Agar azul de metileno y eosina Agua destilada Agar nutritivo Bacterias (indicadas en la técnica) PROCEDIMIENTO: Cultivo Se utilizarán los siguientes medios. y con una crayola dividir en tres partes por la parte inferior de la caja. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . dextrosa-papa y azul de metileno-eosina ya esterilizados. preparados en la práctica anterior: • • • • 2 medios de Czapek-dox (elaborado por nuestro equipo) 2 medios de Agar Nutritivo (elaborado por el equipo 5) 2 medios de Agar dextrosa y papa (elaborado por el equipo 4) 2 medio de Agar azul de metileno y eosina (elaborado por el equipo 3) Cultivo en tres zonas: 1. pues sirven para identificar las bacterias causantes de enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estría. Sacar los tubos de ensayo de la olla y templar sin llegar a la solidificación del medio. 2. Zona 5: Muestra de agua de llave. Posteriormente llevar a incubación para su crecimiento. Zona 4: Muestra de piso. Zona 2: Saliva. Zona 7: Blanco. coli. Se utilizarán dos cajas con agar nutritivo. 3. Diluciones 1. 4. 5. 4. La técnica de siembra (inoculación) será la siguiente: Con el asa esterilizada tomamos una muestra de la bacteria. La técnica de siembra (inolulación) será la siguiente: Con el asa esterilizada tomamos la muestra correspondiente. PRECAUCIONES: • • El procedimiento para la preparación del medio de cultivo debe realizarse rigurosamente para no contaminar el medio. Posteriormente llevar a incubación para su crecimiento. 2. 3. Zona 2 sembrar E. En cada zona se sembrará lo siguiente: Zona 1: Muestra de cabello. pues se llevarán a cabo las diluciones. Preparar medio de agar nutritivo siguiendo la metodología vista en la práctica anterior. Cultivo en siete zonas: 1. La temperatura del agar donde se realizará la dilución será tal que al contacto con el brazo sea tolerable sin llegar a la solidificación del medio. Zona 3 será el blanco. 5. Esterilizar con la olla exprés en 6 tubos de ensayo. Lo anterior se repetirá en dos cajas de los 3 medios seleccionados. En una serie de tres tubos realizar la dilución de la bacteria Bacilo subtilis y en otra serie de tres tubos la de la bacteria Proteus vulgaris. Zona 3: Piel. La pasamos por la zona correspondiente en el medio haciendo una estría. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato.61 Zona 1 sembrar Staphylococcus aureus. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Dividir la caja en siete partes por la parte inferior utilizando el crayón. 4. 3. por lo que se agrupan regularmente en racimos.62 • Al finalizar la práctica las cajas se desecharán colocándolas en una bolsa y sometiéndolas a esterilización. Son grampositivas. Zona 2: Escherechia coli. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES: Cultivo en tres zonas: En cada una de las 6 cajas de cultivo: • 2 de Agar Czapek-dox • 2 de Agar dextrosa y papa • 2 de Agar azul de metileno y eosina Se realizó lo siguiente División en 3 zonas Esterilización de asa Toma de muestra bacteriana Zona 1: Staphylococcus aureus. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Zona 3: Blanco. Son inmóviles y carecen de esporas. que se dividen en más de un plano. Staphylococcus aureus: • • • Siembra Es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas. es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.63 • Agente patógeno que actúa como un microorganismo saprófito. Medio de dextrosa-papa: No se aprecia crecimiento aparente. • • Medio de azul de metileno-eosina: En caja que se aprecia en la fotografía a la izquierda se puede apreciar de mejor manera el crecimiento de las bacterias. presenta un color morado-grisáceo mientras que la E. Son gramnegativo. se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales y por ende en las aguas negras. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . solo un pequeño brillo en un lugar donde se colocó la estría. La bacteria Staphylococcus aureus. Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo). no forma esporas. Anaeróbico facultativo. se encuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las defensas de la piel caen puede causar enfermedad. coli presenta un color negruzco. Escherichia coli: • Es quizás el organismo procarionte más estudiado por el ser humano. Zona 4: Muestra de piso. Zona 3: Piel. de incubación. Cultivo en siete zonas: En las dos cajas de agar nutritivo se realizó lo siguiente: División en 7 zonas Esterilización de asa Toma de muestras Zona 1: Muestra de cabello. Zona 2: Saliva. Zona 5: Muestra de agua de llave. Zona 7: Blanco.64 Medio de Czapek-dox: No se aprecia crecimiento aparente. Siembra LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Observaciones hechas después de 48 hr. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato. solo un pequeño brillo en un lugar donde se colocó la estría. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . pues como se puede apreciar en la caja de la derecha. únicamente se aprecia el brillo donde se realizo la estría. Zona 3: Piel: No hubo crecimiento de microorganismos. De la caja de la imagen izquierda se ve que: Zona 1: Muestra de cabello: No hubo crecimiento de microorganismos. todo se mezcló. Zona 2: Saliva: Se aprecia crecimiento de microorganismos en una colonia esférica.65 Solo en la caja de la imagen izquierda no se mezclaron los crecimientos de las zonas. Diluciones: Preparación de agar nutritivo: Tomamos 6 tubos de ensaye con Agar Nutritivo ya esterilizados y en estado líquido (dado que la práctica la continuamos el día jueves 1 de octubre. Zona 7: Blanco. Observaciones hechas después de 48 hr. se realizó baño maría para disolver) Posteriormente en la primera serie de tres tubos se colocó una muestra de Bacilo subtilis y en la segunda serie Proteus vulgaris. Zona 6: Muestra tomada de suela de zapato: Se aprecia crecimiento en una mancha grande.66 Zona 4: Muestra de piso: Se poco crecimiento en una mancha amarillenta. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . de incubación. Zona 5: Muestra de agua de llave: Se aprecia crecimiento en una mancha opaca. viernes. pues debido a limpieza de la escuela por contingencia sanitaria no pudo colocarse en la estufa. Se agrupa con las enterobacteriaceae LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . facultativamente anaeróbico en forma de bacilo que habita en el tracto intestinal del hombre y varios animales. agua y materia fecal. Es decir no hubo crecimiento proporcional. domingo y parte del lunes. Catalasa-positiva. Se observa que en cada caja de Petri el crecimiento de las bacterias fue de forma proporcional ya que en el tubo de ensaye (1) había más población y en el tubo de ensaye (2) disminuía. sábado. Tiene la habilidad para formar una resistente endospora protectora. aerobio facultativo1 comúnmente encontrada en el suelo. Puede también ser aislado de la tierra. permitendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas. durante parte del jueves. Proteus vulgaris: Es una bacteria gramnegativa. posteriormente se toma la muestra del tubo de ensaye (2) y se coloca en el tubo de ensaye (3) Se colocó en tres cajas de Petri el contenido de los 3 tubos de ensaye (1).67 En cada caso: Del tubo de ensaye (1) se toma una muestra y se coloca en otro tubo de ensaye (2). y por ultimo en el tubo de ensaye (3) disminuía aún más. Se llevó a incubación al refrigerador. Bacillus subtilis: Es una bacteria grampositiva. (2) y (3) por separado y se etiquetaron para su identificación. BIBLIOGRAFIA Cultivo (microbiología). Desecho de cajas de Petri: Se esterilizaron en la olla exprés. causando infecciones urinarias. comprobamos que cada bacteria tiene cierta afinidad por un medio de cultivo específico. Wikipedia.68 y es un patógeno oportunista en humanos.wikipedia. de heridas y en abscesos hepáticos. También observación los crecimientos proporcionales de acuerdo a la cantidad de muestra. Enciclopedia en Línea http://es. se colocaron en una bolsa negra y se depositaron en el bote correspondiente.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa) CONCLUSIÓN Durante esta práctica. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . el cual le brinda los nutrientes necesarios para su crecimiento. C.69 Practica No. 6 Miguel Ángel Rendón Sagardi M. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 70 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Un objeto libre de cualquier forma de vida se dice que está estéril. generalmente se realiza en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos. cajas de Petri de vidrio o de plástico. Así. tubos de ensaye. Conocer el material y equipo más común para la esterilización y el trabajo en condiciones de esterilidad. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: La esterilización es un proceso mediante el cual se elimina por remoción o muerte todos los organismos viables de un objeto. más o menos. es decir no existe un material casi. Estas condiciones de esterilización con calor húmedo pueden variar de acuerdo con el volumen. FECHA DE REALIZACIÓN: 6 de octubre de 2009 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .71 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN PRÁCTICA No. la esterilización con calor húmedo. Existen varios métodos físicos y químicos de esterilización. tubos y demás recipientes se les pone un tapón de algodón que evitará el acceso de microorganismos del ambiente al interior. antes de esterilizarse. tipo de autoclave y naturaleza del material por esterilizar. También es necesario proteger este tapón con papel para tratar que no se humedezca con agua de condensación después de esterilizar con calor húmedo. El concepto de esterilización absoluto. En el trabajo de un laboratorio de microbiología es necesario que todo el material como pipetas. LOS RECIPIENTES QUE SE ESTERILIZAN EN AUTOCLAVE NO DEBEN ESTAR HERMÉTICAMENTE CERRADOS. Debe cuidarse que el material esterilizado se conserve estéril. la temperatura se alcanza utilizando vapor de agua a una presión de 15 psi (2 atm). 6 OBJETIVOS: Preparar para esterilizar el material de vidrio más usado en el laboratorio de microbiología. superficie o medio. a los matraces. o 99% estéril. medios de cultivo y soluciones estén estériles. Por ejemplo. la selección de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar. Algunos laboratorios utilizan tapones de plástico o metálicos en lugar de algodón con la misma finalidad. Para el control de la contaminación proveniente del aire en especies limitadas.5 horas. rickettsias. La temperatura que se utiliza es generalmente entre 160 y 180ºC durante 1. RNA y DNA) y coagulación de proteínas. clamidias y algunas espiroquetas atraviesan esos filtros de membrana. El filtrado estéril debe recibirse en un recipiente también estéril. El gas de óxido de etileno y las radiaciones ionizantes son utilizados para esterilizar material de plástico sensible al calor. incolora y sin exceso de sales de fierro. pero su escaso poder de penetración solo se le ha usado para esterilización de superficies y láminas muy delgadas de agua transparente. Los virus y algunos tipos de bacterias muy pequeñas como Bdellovidrio. el aire se esteriliza por filtración a través de mallas de fibras de diversos materiales (filtros absolutos). La esterilización con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y materiales sólidos estables al calor. se ha usado la esterilización UV. La filtración a través de membranas se usa para esterilizar soluciones de sustancias termolábiles en donde los microorganismos son detenidos en el filtro. VAPOR A PRESIÓN (AUTOCLAVE) AIRE CALIENTE (HORNO) FLAMEADO INCINERACIÓN DISCO DE MEMBRANAS RAYOS UV RAYOS IR RAYOS X RAYOS γ (COBALTO-60) OXIDO DE ETILENO FORMALDEHÍDO BETA-PROPIOLACTONA HUMEDO CALOR SECO MÉTODOS FÍSICOS FILTRACIÓN NO IONIZANTE RADIACIONES IONIZANTE GASES METODOS QUÍMICOS LÍQUIDOS En las campanas de flujo laminar que se usan como áreas estériles en el trabajo microbiológico. la cual requiere de mayor duración e intensidad porque la conducción del calor es menos rápida que un ambiente húmedo.72 La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por desnaturalización de las macromoléculas (proteínas. porque este gas LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Las cajas de Petri de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de de metal con aberturas que permiten el paso del aire caliente. La inactivación de los contaminantes ocurre por pérdida de agua y oxidación de todos sus componentes esenciales. 5. Para determinar la eficiencia del proceso de esterilización se emplean los indicadores biológicos de esterilización. Estos agentes no se recomiendan para esterilizar soluciones o medios de cultivo. 2. Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodón con la ayuda de un clip desdoblado. Anotar en los tubos su respectivo rótulo de identificación. como las jeringas hipodérmicas. EL ALGODÓN NO DEBE QUEDAR NI MUY APRETADO NI MUY FLOJO. 5ml del caldo en los 18 tubos. PROCEDIMIENTO Preparación de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprés (sustituyendo autoclave) 1. Flamear con el mechero el algodón que sobresale de la boquilla de la pipeta. junto al material que se esteriliza. la temperatura de 121ºC. Preparación de pipetas para esterilizar en autoclave. MATERIAL Pipetas para esterilizar. cuando se esteriliza con calor húmedo se utilizan. También existen cintas que con el cambio de un indicador químico muestran si se alcanzaron las condiciones de la esterilización por calor o por óxido de etileno. mantener por 15 min. Algodón Papel aluminio. cada uno de los cuales debe contener una campana.73 difunde fácilmente a través de polietileno. DEBE PERMITIR EL PASO DEL AIRE PERO SIN MOVERSE. 4. Pipeta de 10 ml. papel y cartón. 18 campanas. Después de la esterilización se incuban las esporas y se analizan si éstas sobrevivieron o no al proceso de esterilización. Colocar los tubos en la rejilla e introducir en la olla exprés. ampolletas que contienen esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a 121ºC durante 12 minutos. 18 tubos de ensayo. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Cerrar la olla esperar que aumente la presión y con ello la temperatura. Por esta razón se han usado radiaciones ionizantes como las del cobalto-60 para esterilizar artículos de plástico ya envueltos. Colocar con una pipeta de 10ml de capacidad. Prepara Caldo lactosado como medio de cultivo. Específicamente. 3. Llevados a la olla exprés. hasta alcanzar 121ºC. con su respectiva campana. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Preparación de tubos de vidrio para esterilizar en olla exprés (sustituyendo autoclave) Preparación del caldo lactosado: Llenado de tubos. y manteniendo en esta temperatura por 15 minutos: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Marcar en la envoltura el volumen.74 Envolver con papel aluminio cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor. valor de las subdivisiones menores y si es terminal o no. ¿Cuál es el método más apropiado para esterilizar en siguiente material? MATERIAL Solución de vitaminas Cajas de Petri de plástico de desecho Aceite mineral Sangre para transfusión Ropa contaminada Cajas de Petri de plástico limpias Talco MÉTODO Radiación Gases Químico Químico Calor Seco Calor Húmedo Radiación LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Envoltura de pipetas en papel alumnio: Llevadas a la estufa: CUESTIONARIO 1.75 Preparación de pipetas para esterilizar en autoclave. Martinko y Jack Parker.76 Instrumental de cirugía Sangre de desecho Cadáveres de animales de experimentación de laboratorio Radiación Filtración Radiación 2. 4. 5. 3. 10ma. BIBLIOGRAFIA Brock Biología de los Microorganismos. Editorial PEARSON Prentice Hall. como jeringas hipodérmicas. aunque solo utilizamos en esta práctica métodos físicos de esterilización seca y húmeda. ¿Cuál es el diámetros del poro en los filtros de esteres de celulosa utilizados para esterilizar por filtración? R= Son delgadas películas que derivados de celulósicos plásticas o aun metal con orificios uniformemente situados del mismo diámetro. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . CONCLUSION Durante esta práctica aprendimos que la esterilización es muy importante en la microbiología.5 micrómetros de diámetro. ¿Cuánto mide una bacteria de las pequeñas que se conocen? R= Las bacterias miden de 0. Edición. Conocimos métodos tanto físicos como químicos de esterilización. Autores: Michael T. ya que el material con el que se trabaja debe estar libre de cualquier forma de vida. ¿Con qué finalidad se le pone a las pipetas un filtro de algodón? R= Para evitar el acceso de microorganismos del ambiente al interior.2 a 1. Madigan. ¿Con qué deben obtenerse los líquidos biológicos (por ejemplo sangre) para preparar un medio de cultivo? R= Por medio de radiaciones iónicas como las del cobalto-60 para esterilizar artículos de plástico ya envueltas. John M. 77 Práctica No. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 7 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.C. 78 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 79 DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA USANDO EL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE PRÁCTICA No. 7 OBJETIVO: Determinar la calidad de una muestra de agua, mediante la determinación de coliformes, empleando el método del número más probable. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismos patógenos, los cuales son un riesgo para la salud pública al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también pueden emplearse para estimar el grado de contaminación fecal. Una de las Normas Mexicana establece un método para la detección y enumeración en agua de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva mediante el cultivo en un medio liquido en tubos múltiples y él cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra. Este método es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen una cantidad apreciable de materia en suspensión. La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación del grupo de organismos coliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte de una secuencia continua. El grado de confirmación con una muestra en particular depende parcialmente de la naturaleza del agua y parcialmente de las razones para realizar el examen. En la práctica, la detección de E. coli presuntiva da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal. FECHA DE REALIZACIÓN: 13 de octubre de 2009 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 80 El método NMP se basa en la inoculación de alicuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en una serie de tubos de un medio de cultivo líquido conteniendo lactosa. Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación ya sea a 308 o 310K (35 o 37°C). Mediante tablas estadísticas se lleva acabo él cálculo del numero más probable (NMP) de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli que pueda estar presente en 100 ml. de muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultados confirmativos positivos. CALIDAD NO. DE TUBOS CON REACCIONES POSITIVAS 3 TUBOS CON 10ml. 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 TUBOS CON 1ml. 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 TUBOS CON 0.1ml. 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 INDICE DEL NMP POR 100ml. <3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >2400 LÍMITE CONFIABLE DE 95% INFERIOR SUPERIOR CRITERIO DE ACEPTACIÓN EXCELENTE <0.5 <0.5 <0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 280 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800 NO ACEPTABLE DUDOSA ACEPTABLE RECOMENDABLE MUY BUENA BUENA REGULAR MALA 3 3 3 3 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Toma los últimos tres tubos de la primera serie y coloca 0. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . coloca 10 ml. 4. Muestras de agua 4. de la muestra de agua en cada uno.1 ml.81 En la anterior tabla se muestra el índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan tres tubos con porciones de 10 ml. Perilla PROCEDIMIENTO Se utilizaran los 18 tubos preparados con caldo lactosado en la práctica anterior. Resultados positivos indican que existe presencia de: • Organismos coliformes: son aquellos capaces de crecer de manera aeróbico ya sea 308±1K (35±1°C) o 310±1K (37±1°C) en un medio de cultivo líquido lactosado con producción de ácido y gas dentro de un periodo de 48 horas. 5. Toma otros tres tubos de la primera serie y coloca 1 ml.1 ml. Pipetas estériles 2. • 9 tubos servirán para determinar la calidad de una muestra de agua del grifo. • MATERIAL 1. de la muestra de agua en cada uno. de la muestra de agua en cada uno. y tres con porciones de 0. Repite este procedimiento con la segunda serie y la segunda muestra. con ayuda de una pipeta y perilla. 18 tubos de ensayo con caldo lactosado y tubos Durham (preparados la práctica anterior) 3. Coloca los 18 tubos en la estufa con el fin de incubar por 24 hr. Toma tres tubos de la primera serie y. tres tubos con porciones de 1 ml. 2. • 9 tubos servirán para determinar la calidad de una muestra de agua de marca comercial (purificada) 1. 3.. Purpura de bromocresol 5.5°C).5K (44±0. Organismos coliformes fecales (termotolerantes): son en primer término organismos coliformes que tienen las mismas propiedades fermentativas a 317±0. Imágenes después de la incubación: Serie 1: Agua de grifo. de muestra 3 tubos con 1ml. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Nota: Debido a que agregamos las gotas de púrpura de bromocresol antes de la siembra e incubación. 3 tubos con 10ml. Registra los resultados que muestra el vire o no vire del indicador. saca los tubos de la estufa y coloca 2 o 3 gotas de púrpura de bromocresol a cada tubo. Cumplido el plazo.1ml. tuvimos que esterilizar los tubos en la olla exprés.82 6. de muestra LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . de muestra 3 tubos con 0. 7. También se notó la presencia de gas dentro de los tubos Durham en 5 de los 9 tubos de la primera serie. de muestra 3 tubos con 0. ya que se pudo apreciar sedimentación. coli) Diferente al caso de la serie 2. lo que indica la generación de CO2. de muestra 3 tubos con 1ml. 3 tubos con 10ml. donde los tubos no presentaron cambios de color.1ml. ni presencia de sedimentos o gas: LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . de muestra En todos los tubos de la primera serie hubo presencia de microorganismos. y con ello la presencia de coliformes (E.83 Serie 2: Agua purificada marca Santorini. █ █ ██ 1 SEGUNDA SERIE = MUESTRA DE AGUA MARCA SANTORINI NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. █ █ █ 0 0. presenta 28 NMP por cada 100ml.84 Tablas de resultados: PRIMERA SERIE = MUESTRA DE AGUA DE GRIFO NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. presenta menos de 3 NMP por cada 100ml.1ml. █ █ █ 0 █ Producción de gas █ Producción de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) █ Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) █ Ningún cambio.1ml. Calidad: Excelente Criterio de aceptación: Recomendable LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . ███ ███ ██ 2 1ml. según el NMP. █ █ █ 0 1ml. Calidad: Buena Criterio de aceptación: Aceptable La muestra de agua purificada Santorini. La muestra de agua de grifo. ███ ███ █ 2 0. según el NMP. 85 CONCLUSIÓN Mediante la realización de esta práctica de conoció el método para calcular la presencia de microorganismos presentes en una muestra de agua. BIBLIOGRAFÍA NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-1994 Salud ambiental. utilizando el método del número más probable. agua para uso y consumo humano-límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 86 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 87 Práctica No. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 8 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.C. 88 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . los más usados son: el método de la estría cruzada y el método de las diluciones. Se esteriliza el asa. este debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axénico. se extiende el inóculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia el centro. cuidando que no se toque las estrías anteriores. que significa que esta formado por microorganismos de la misma especie. Se gira la caja de Petri 1/5 de la vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estrías que deben extender una pequeña porción de la pequeña serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. Para el aislamiento de microorganismos se cuentan con varios métodos. de las cuales se toman alícuotas que se siembran en medios de cultivos sólidos ya sea depositando la alícuota en la superficie y LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . pero solamente a una distancia de 1 a 2 centímetros de la orilla. El método de la estría cruzada consiste en depositar en un área de la placa de medio de cultivo sólido una asada de la muestra o cultivo mixto que sirve de inóculo. El método de las diluciones consiste en hacer una serie de diluciones.89 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR MÉTODOS DIRECTOS PRÁCTICA No. se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estrías. La operación se repite dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas que termine en o cerca de centro. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Aislamiento de microorganismos Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como poblaciones mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismos. generalmente decimales. Aplicar técnicas de cuantificación por observación microscópica directa para determinar la abundancia relativa de microorganismos en muestras de suelo y agua. 8 FECHA DE REALIZACIÓN: 20 de octubre de 2009 OBJETIVO: Aprender y practicar las técnicas de aislamiento por medio de la estría cruzada y el método de las diluciones. Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que cada grupo filogenético de microorganismos tienen. El oxígeno puede ser esencial para algunos microorganismos. Se calcula el número de UFC contenidas en un mililitro de la dilución usada para inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilución correspondiente. y cultivo en medios ricos. tener como aceptores finales de electrones al oxígeno o compuestos LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . o tienen requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona. o son inhibidas por otros microorganismos presentes. o son inhibidas por los componentes de los medios de cultivo. los microorganismos se han agrupado en: aerobios estrictos. está directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de enzimas que los protegen del efecto tóxico de los productos del oxígeno (por ejemplo. los anaerobios facultativos pueden obtener su energía tanto por procesos respiratorios como fermentativos. Con base en los requerimientos de oxigeno. anaerobios aerotolerantes y microaerofílicos. Para determinar el número de UFC en una muestra procesada por el método de las diluciones se cuenta el número de colonias formadas en las placas. superóxido dismutasa y catalasa). o bien mezclando la alícuota con un medio de cultivo fundido en un tubo y enfriado a 450 C y vaciando inmediatamente en una caja de Petri estéril. Esto es debido a que algunas de ellas viven en simbiosis obligada. selectivos o diferenciales. anaerobios estrictos. anaerobios facultativos. No todas las bacterias viables presentes en una muestra pueden cultivarse in Vitro. espora o agrupación de microorganismos de la misma especie. características peculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. etc. pero tóxico para otros. También para el éxito del aislamiento de microorganismos a partir de muestras de ambientes naturales se pueden requerir de medios de transporte especiales o de técnicas de enriquecimiento previas. de preferencia aquellas que tengan entre 30 y 300.90 dispersándola uniformemente con una varilla de vidrio. Una colonia se desarrolla en un medio sólido y procede de una sola bacteria. dependiendo de la muestra. se estima que solamente crecen en los diferentes medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes. o en los medios usados crecen muy lentamente. es decir. La capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o ausencia de oxígeno. a los que se les denomina unidades formadoras de colonias (UFC). Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando el oxígeno como aceptor final de electrones en su cadena respiratoria. mediante este tipo de crecimiento. permiten conocer el tipo. Los métodos directos para cuenta de microorganismos empleados en estudios preliminares resultan complementarios a los métodos indirectos. REINO PROTISTA Dinoflagelados: Los dinoflagelados son el segundo grupo más importante del fitoplancton. Tienen una estructura semejante a un látigo llamada flagelo. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Las cuantificaciones de microorganismos realizadas por métodos directos. Cuantificación de microorganismos La estimación de la población microbiana por métodos directos. lográndose así obtener resultados de mayor confiabilidad. se ha empleado en forma usual por diferentes investigadores. Esto es debido a que se incluyen células no viables y aún aquellas que no pueden crecer en los medios de cultivos usuales empleados en le laboratorio. en general permiten obtener valores más elevados con respectos a las determinaciones de cuenta viable. la observación directa de microorganismo en muestras de suelo y agua. la forma y las posibles agrupaciones de los diferentes microorganismos de la comunidad. Por otro lado. que es el responsable de la producción de energía en la cadena trófica oceánica. Los métodos que se han descrito se pueden adaptar a diversos tipos de hábitat. Los microorganismos microaerofílicos requieren oxígeno pero a tensiones menores de 15%. forman las mareas rojas tóxicas que matan a los peces y contaminan los mariscos. produciendo grandes poblaciones de forma inmediata. ciertas especies. que actúa como órgano de locomoción y muestran características tanto de vegetales como de animales. Los dinoflagelados pueden reproducirse con rapidez.91 orgánicos. que pueden difundirse por el citoplasma de la ameba. se forma alrededor de él una primitiva cavidad digestiva. disgregando la materia orgánica en sustancias que pueden ser utilizadas por otros seres vivos. a modo de pelos. los ácidos descomponen el paramecio en nutrientes. rodeándolo con dos grandes proyecciones de su citoplasma. los ciliados actúan en la descomposición de los organismos. Además de servir para la locomoción. llamada vacuola. En ésta. Ameba engullendo a un paramecio: Aquí se muestra a una ameba o amiba. o establecen relaciones como parásitos o simbiontes de otros organismos. un organismo unicelular carente de órganos internos. llamadas seudópodos. que atrapa a un paramecio y comienza a engullirlo. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Los protozoos ciliados viven en el agua o el suelo.92 Ciliados: Los protozoos ciliados son organismos unicelulares que se impulsan mediante unas diminutas proyecciones. los cilios también tienen la función de crear corrientes que ayudan a arrastrar pequeñas partículas alimenticias hacia el interior de una depresión pequeña de la superficie del cuerpo. a través de la cual se ingiere el alimento. Cuando el paramecio es engullido por completo. En los suelos. llamadas cilios. Tubos para realizar pruebas IMViC (Pruebas bioquímicas) Púrpura de bromocresol. MATERIAL Biológico: a) Muestras de suelo b) Muestras de agua Medios de cultivo. c) Asa bacteriológica. 5 tubos con caldo nutrido y una correspondiente azúcar. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . b) Campanas de fermentación.93 Anatomía de un protozoo (Paramecio): Estructura de la membrana Vacuola llenándose de agua Vacuola pulsátil llena de agua. soluciones y reactivos: a) b) c) d) e) 18 tubos con caldo lactosado. la cual se abre y la libera al exterior. Vidriera y diversos: a) Pipetas estériles. Agua estéril. 4. 10ml de la suspensión en tres tubos. Estufa. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Mecheros. 1ml en otros tres y 0. 3. se realizarán las pruebas IMViC. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES Dilución de tierra: Se disolvió un gramo de cada muestra de tierra en un volumen de mezcla total de 100 ml. Utilizando una muestra de agua.1ml en los últimos tres. PROCEDIMIENTO Primera parte: Cuantificación de microorganismos por métodos directos: 1. Balanza granataria. Incubar por 48 horas y aplicar dos gotas de púrpura de bromocresol para observar el cambio. que haya dado positivo en la práctica anterior. depositar en la primera serie de 9 tubos con caldo nutritivo.94 d) e) f) g) Matraz volumétrico de 100ml. Repetir el paso anterior con la segunda muestra de suelo. 2. Con las muestras de suelo se realiza una dilución de 1 gramo en un matraz volumétrico de 100 ml. Con una pipeta estéril. Pruebas bioquímica y de azucares: 1. Se realizarán las pruebas de azucares. 2. de muestra 3 tubos con 1ml. 3 tubos con 10ml.1ml. de muestra LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .95 Imágenes después de la incubación: Serie 1: Tierra de tomada de área verde en la escuela. de muestra 3 tubos con 0. de muestra 3 tubos con 0. 3 tubos con 10ml.1ml. de muestra LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .96 Serie 2: Arena. de muestra 3 tubos con 1ml. 1ml. ███ ██ ███ 0 █ Producción de gas █ Producción de acidez (verificado por el vire de azul a amarillo) █ Presencia de precipitado (crecimiento de microorganismos) █ Ningún cambio. ███ ███ ███ 1 SEGUNDA SERIE = ARENA NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. La muestra de tierra de la primera serie. ███ ███ ███ 2 0. Calidad: Mala Criterio de aceptación: No aceptable LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . presenta más de 2.400 NMP por cada 100ml. Calidad: Mala Criterio de aceptación: No aceptable La muestra de arena en la segunda serie.97 Tablas de resultados: PRIMERA SERIE = TIERRA NUMERO DE TUBO 1 2 3 NUMERO DE POSITIVOS 10ml. de solución formada con agua estéril. ██ ███ ███ 0 0. ███ ███ ███ 0 1ml. presenta igualmente más de 2. según el NMP. de solución formada con agua estéril.1ml. según el NMP. ███ ███ ███ 2 1ml.400 NMP por cada 100ml. pues en la prueba de indol.98 Pruebas bioquímicas: Trabajamos con uno de los tubos que dieron positivo (producción de gas) en la práctica anterior (muestra de agua del grifo): Prueba IMViC: Indol MV Agar Citrato Positivo Se cometió un error al aplicar el indicador. rojo de metilo y Voges-Proskauer se aplico purpura de bromocresol y no los correctos reactivos: Indol: Reactivo de Erhlich-éter Rojo de metilo: Rojo de metilo Voges-Proskauer: Hidróxido de potasio-naftol Pruebas de azucares: Caseína Dextrosa Fructuosa Sacarosa Negativo Ácido y gas Ácido y gas Ácido y gas LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 99 Se realizo tinción de Gram y se obtuvo positivo. Entonces la bacteria es: Gram: + Citratos: + Dextrosa: Ácido y gas Fructuosa: Ácido y gas Sacarosa: Ácido y gas Caseína: – CONCLUSION Mediante la realización de esta práctica realizamos diluciones de suelo en agua y determinamos la cantidad de organismos por el método de número más probable. además aplicamos técnicas que en prácticas posteriores realizaremos de manera más exacta. BIBLIOGRAFÍA Multimedia de diferencias bioquímicas http://nhscience.htm LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .edu/biol/wellmeyer/media/media.lonestar. 100 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 9 Miguel Ángel Rendón Sagardi M.101 Práctica No. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .C. 102 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . La reacción que se lleva a cabo es: HEXOSA + CELULAS → MAS CELULAS + ETANOL + DIOXIDO DE CARBONO SUSTRATO + CELULAS → MAS CELULAS + PRODUCTO O de una manera más correcta: SUSTRATO S CELULAS  →  CELULAS C + PRODUCTO P En un medio de azucarado el desarrollo de un microorganismo viene acompañado de la degradación o consumo de nutrientes y de la formación de productos. Si se dispone de una técnica efectiva de evaluación LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . La fermentación alcohólica. 9 FECHA DE REALIZACIÓN: 10 de noviembre de 2009 OBJETIVO: Llevar a cabo una fermentación alcohólica utilizando levadura (Saccharomyces cerevisae). La glucosa se degrada en un ácido pirúvico. comienza después de que la glucosa entra en la célula. El estudio de los cambios de concentración con respecto al tiempo. sustrato y producto) se les denomina cinética de fermentación. Estos microorganismos transforman el azúcar en alcohol etílico y dióxido de carbono. Este ácido se convierte luego en dióxido de carbono y etanol. con el fin de determinar la cinética de la reacción al cuantificar el sustrato y la población microbiana en la cámara de Neubauer. en estos tres tipos de elementos (células. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. La levadura más común para llevar a cabo la fermentación es la Saccharomyces cerevisae.103 CINÉTICA DE FERMENTACIÓN PRÁCTICA No. 694347 MATERIAL 1. Levadura 2. es posible seguir y estudiar la cinética de una fermentación. del nutriente limitante (sustrato) (S) y del producto formado (P). Jugo de fruta o solución azucarada. g dm3 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .104 cualitativa y cuantitativa de la concentración de una población microbiana y técnicas analíticas para determinar sustrato y producto.3284383h−1 K S = 1.  dm ⋅ h   g  C C = concentrac ión de células . Las consideraciones de ingeniería son tan importantes como los factores químicos y biológicos involucrados.  . [ ] De acuerdo al modelo de Monod: dCc µ CC = rg = max S C dt K S + CS En reactores intermitentes donde ha se lleva a cabo fermentación alcohólica con Saccharomyces cerevisae. 3. el estudio consiste en seguir en función del tiempo (t) la concentración celular (CC). se ha determinado para este modelo: µ max = 0. 4. Tubo de ensaye. 3   dm  µ = velocidad de crecimient o específico . h −1 . 1 recipiente de cristal con un volumen efectivo de 1L=1dm3 con tapón horadado. La cinética del proceso necesita ser exactamente determinada y modelada: rg = µCC Donde:  g  rg = velocidad de crecimient o celular .  3 . Cámara de Neubauer. 8. Oxigenador. Pesa un gramo de levadura y añade al reactor. REACTOR INTERMITENTE Solución Azucarada + Levadura Etanol oo o CO2 ESQUEMAS Y OBSERVACIONES LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 5. Vierte el jugo de frutas o la solución azucarada en el recipiente de vidrio (previamente esterilizado en seco) 2. Normaliza para iniciar la fermentación a 25 grados Brix (para fines de esta práctica la sacarosa será equivalente a la hexosa –sustrato-) 3. Manguera de hule. Coloca el tapón horadado y la manguera de hule. Elabora una tabla de la cinética y modela el sistema. 4. Determina las UFC y los grados Brix cada 24 horas (hasta completar 72) 7. 7.105 5. 9. Esta determinación es importante para conocer los gramos subsecuentes por regla de tres. PROCEDIMIENTO 1. el extremo opuesto de esta deberá ser introducido en el tubo de ensaye con agua (permitirá observar la producción de dióxido de carbono que no se cuantificará) 6. Microscopio. Brixómetro. 6. Oxigena la mezcla y cuantifica la cantidad de UFC con la cámara de Neubauer. la concentración del sustrato es de 250 g/dm3. (1°Brix=10g de sacarosa/ml de solución) Recordemos que para fines prácticos la concentración de sacarosa será igual a la de la glucosa.106 Preparamos una solución azucarada de panela. Tabla de observaciones: t (h) 0 24 48 72 °Brix 25 24 20 18  CS  g  3  dm  250 240 200 180 Oxigenamos la mezcla y determinamos las UFC al inicio (t=0) LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . a los 20°C deteminamos los grados Brix. y diluimos con agua destilada y esterilizada hasta obtener 25°Brix. Por lo tanto al tiempo cero. observamos el proceso de la fermentación y determinamos la velocidad con que crece la levadura. TABLA CINÉTICA: t (h) 0 24 48 72  CC  g  3  dm  1 1.05 2.15x1011 La CC se obtiene al deducir que en el tiempo inicial se agregó 1 g en un litro de solución.3 g dm 3 ⋅ h CONCLUSION En esta práctica pudimos aplicar las técnicas de conteo en la cámara de Neubauer y la cuantificación de azucares con el brixómetro.11 2. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . y ese gramo representó 4.5x1010 5x1010 9. por lo tanto las UFC/dm3 calculadas en los siguientes tiempos sirven para determinar la concentración en esos tiempos.11 2.05 2. tomando el modelo de Monod.25x1010 1.5x1010 UFC/dm3.55  CS  g  3  dm  250 240 200 180 La velocidad promedio de crecimiento de la levadura.55 0 24 48 72 4. fue de: rg = 0.107 Observación en Cámara de Neubauer 36 40 74 92 t (h) UFC/dm3  CC  g  3  dm  1 1. C. PesarsonPrentice Hall. CECSA. Fishleder. Ciencias biológicas de las moléculas al hombre. H.S. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .1979. Elementos de ingeniería de las reacciones químicas.. Fogler.A.108 BIBLIOGRAFÍA Welch. J.. 2008.. C.109 Práctica No. 10 Miguel Ángel Rendón Sagardi M. Raúl Pérez Ávila LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . 110 LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . • • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL .0 a 2. Factores ambientales • Temperatura: Dependiendo de su procedencia requerirá una temperatura óptima determinada para su crecimiento. en relación al crecimiento microbiano. película o sedimento en los medios líquidos. psicrófilo (15 a 20 °C). 9 FECHA DE REALIZACIÓN: 17 de noviembre de 2009 OBJETIVO: Identificar la manera en que influyen los factores ambientales y geográficos. FUNDAMENTOS TEÓRICOS: Se entiende por crecimiento microbiano al incremento en forma ordenada de los componentes moleculares y el consecuente incremento del número de individuos. pH: Un medio ligeramente neutro es el adecuado para la gran mayoría de los microorganismos.111 FLUCTUACIÓN DE MICROORGANISMOS EN LA ATMÓSFERA PRÁCTICA No. mesófilo (25 a 40 °C) o termófilo (45 a 60 °C). anaerobio si requiere de un ambiente carente de oxígeno pues este elemento le es tóxico. si puede crecer indistintamente en presencia o ausencia de oxígeno. Oxígeno: El microorganismos será aerobio si requiere de oxígeno para su crecimiento.8). El crecimiento de los microorganismos en los medios de cultivo sólido se evidencia por la formación de colonias (conjunto de individuos originados a partir de un solo individuo). o por la formación de turbidez. microaerofílico. Sin embargo. Como todo ser vivo.0 (óptimo 2. si la atmósfera en la que tiene que crecer no excede el 5% de oxígeno. existen microorganismos con capacidad de crecer en ambientes tan ácidos como los Thiobacillus ihioxidans que crece en medios con pH de hasta 1. o anaerobio facultativo. en un área geográfica determinada. Existen tres grupos. los microorganismos necesitan de nutrientes y determinadas condiciones para poder crecer y desarrollar sus diversas funciones vitales. La misma radiación ultravioleta puede ser germicida a longitudes de onda de 260 nm que coincide con la máxima absorción del ADN. sin embargo cuando se incrementa la • • • • LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . como un caldo de cultivo. ARN y proteínas. rayos X. La introducción de materiales y el movimiento de estos dentro del ecosistema están controlados por diversos factores tales como la solubilidad.8). De manera similar el movimiento es importante en la introducción y distribución de los nutrientes en el medio para el crecimiento microbiano. Espacio: En condiciones de laboratorio. el transporte a través de la membrana celular. mientras que en los lagos el agua no es un factor que limite la actividad microbiana. un espacio determinado. Las presiones hidrostáticas elevadas parecen inhibir la síntesis de ADN. infra-rojos. gravedad específica. En los cuerpos de agua. por cada 10 m de profundidad se incrementa aproximadamente 1 atm más. por ejemplo en suelos desérticos el agua es un factor que limita el crecimiento microbiano. Radiación: La entrada constante de la luz a los ambientes. difusión. gamma. La disponibilidad de agua en el ambiente es muy variable. Presión: En el nivel del mar la presión atmosférica es una atmósfera (1 atm = 760 mm Hg).0 a 8. etc. además de la remoción de los productos metabólicos que ocasionalmente puedan ser tóxicos. Estas radiaciones se hacen ionizantes cuando interactúan con la materia produciendo iones inestables y radicales libres que pueden provocar destrucción. • Humedad y actividad del agua: Los microorganismos requieren de agua para su crecimiento y reproducción. y la actividad de muchas enzimas por la modificación de su estructura terciana. visibles. porosidad y las características del ecosistema. Movimiento: El movimiento del aire y del agua favorece la dispersión pasiva de los microorganismos. puede no ser un factor importante para el crecimiento inicial de los microorganismos. viscosidad. mutación o muerte de los microorganismos al incidir sobre ellos. lo que sugiere que el daño del ADN es el principal mecanismo del efecto germicida. permite la formación de un espectro variado de longitudes de onda de los rayos UV. Otras en cambio pueden crecer en ambientes alcalinos como las Nitrosomonas que crecen en medios muy alcalinos con pH 10 (óptimo 8. Las Spirillum son bacterias capaces de crecer 15 veces más rápido en presiones entre 300 a 600 atm que a 1 atm.112 pues esta bacteria es capaz de producir ácido sulfúrico. 3. abrir las cajas de Petri durante 15 minutos. Acudir al cerro del borrego situado en la ciudad de Orizaba Veracruz. Una vez situados. La temperatura inicial fue de 20°C y disminuyo a los 15 minutos hasta 19°C. En la naturaleza no es así porque el microorganismo restringe su crecimiento a superficies o medios favorables. 4. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Reloj. Sincronizar relojes con el resto del grupo a fin de que la toma de la muestra se realice al mismo tiempo sin importar la distancia recorrida.113 densidad poblacional. 2. tomar la temperatura y anotar cuantas personas o animales pasan alrededor de la caja. Llevar a incubación durante 24 horas. Termómetro 3. 5. ESQUEMAS Y OBSERVACIONES A mí me tocó subir hasta la cima del cerro. se reduce la disponibilidad de nutrientes y oxígeno y se incrementan los productos de desecho que puede limitar el crecimiento. En ecosistemas terrestres. Cajas de Petri con agar nutritivo. la textura del suelo se usa como un índice del área disponible para los microorganismos MATERIAL 1. Los equipos se dividirán para posicionarse en diferentes alturas del cerro del borrego para abrir las cajas. Pasaron 36 personas y 3 perros. PROCEDIMIENTO 1. 2. Frotis Húmedo Fotografía tomada con el objetivo 10X Fotografía tomada con el objetivo 40X En el frotis húmedo se puede observar la presencia de muchos microorganismos y su las morfologías que predomina son cocos.114 Caja de Petri Observaciones En la fotografía se muestra la muestra tomada en el cerro del borrego ya cultivada. CONCLUSION Con esta práctica nos fue posible apreciar la rapidez con que las esporas de microorganismos pueden viajar en la atmósfera y desarrollarse en el momento en que encuentran las condiciones óptimas. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL . Pudimos hacer una comparación con las cajas de los demás compañeros y notar las diferencias de acuerdo a la zona de muestreo.