UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REICAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU BIOQUÍMICA Prof: Helder Valadares Microarranjos de DNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Regianne Ferreira Silva Divinópolis, Agosto de 2013 . Microarranjos de DNA O que é? • É uma ferramenta para estudos de expressão gênica; • A técnica permite a análise dos níveis de transcritos assim como o número de cópias de todos os genes de um organismo, genotipando os milhares de variantes de sequências de DNA. 1995: Estudos Pioneiros Mark Schena e colaboradores demonstraram o uso de um microarranjo de cDNA na análise quantitativa do transcriptoma de várias linhagens e órgãos de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis thaliana. Permite a investigação de milhares de transcritos de maneira simultânea; Utilizada para analisar qualquer tipo de variação na expressão gênica entre amostras, em diferentes condições fisiológicas e patológicas O Principio da técnica baseia-se na hibridização por complementariedade das moléculas de ácido nucléico, que ocorre entre a sonda depositada na lâmina e o seu mRNA correspondente, transformado em cDNA, extraído das amostras a serem analisadas e comparadas. . Duas maneiras de construir e utilizar os microarranjos foram desenvolvidas: • Microarranjos de oligonucleotideos gerados por síntese de DNA in vitro; • Microarranjos pontuais (Spotted microarrays). . Microarranjos de Oligonucleotídeos em Alta Densidade • Fotolitografia • Suporte sólido: lâminas de quartzo; Affymetrix • Oligonucleotídeos sintetizados na lâmina com tamanhos variando em torno de 25pb (curtos) a 80pb (longos); • Centenas de arranjos individuais sintetizados em uma única lâmina. Chips de Oligonucleotídeos Construindo microarranjos de oligonucleotídeos de alta densidade por fotolitografia Investigadores tem desenvolvido novas estratégias para construir microarranjos de oligonucleotídeos. Agilent Technologies: tecnologia similar a uma impressora para destribuir os nucleotídeos de cada etapa de síntese do DNA. NimbleGen Systems: emprega um processamento digital de luz ao invés de máscaras. Produzem oligonucleotídeos mais longos (50 a 70 podendo alcançar 100 nucleotídeos). Microarranjos Pontuais (Spotted Microarrays) Década de 1990; Pat Brown e seus colegas desenvolveram uma estratégia diferente para gerar microarranjos – evoluída da técnica dot blot. Surgimento de sistemas robotizados que permitiram a elaboração de lâminas com alta densidade de spots e a otimização de métodos de detecção da fluorescência, que atingiram a sensibilidade necessária para as medidas de intensidade geradas pelos fluoróforos. Fragmento de DNA imobilizado: Oligonucleotideos pré- sintetizados, cDNAs produzidos em projetos de seqüenciamento, ou ainda produtos de amplificação por PCR. A plataforma sólida mais utilizada na confecção dos arranjos é a lâmina de vidro, do tipo usado em microscopia, que depois de ter as sondas imobilizadas na sua superfície é normalmente referida como slide ou simplesmente lâmina de microarray. • Seleção dos clones de cDNA vindos de algum banco de clones. • Os fragmentos selecionados são fixados nas lâminas de vidro por um robô chamado Arrayer em posições específicas conhecidas como “spots”. Depósito dos cDNAs nas lâminas de vidro Arrayer depositando os cDNAs nas lâminas de vidro. Como a técnica funciona? • mRNA a ser medido é fragmentado e os fragmentos marcados com corantes fluorescentes; • Fragmento de mRNA hibridiza com a sequência complementar de oligonucleotideos do microarranjo; • Intensidade de fluorescência em cada ponto corresponde a um gene particular e é usada como uma medida da quantidade de cada mRNA na amostra biológica que está sendo testada. • Detecção de sinais emitidos apenas por pareamentos perfeitos; Leitura de um microarranjo pelo scanner a laser Microarranjo digitalizado Basicamente, são três as etapas envolvidas em um experimento com microarranjos: Preparo das amostras, Hibridização, Detecção, visualização e interpretação dos dados. Preparo da Amostra Extração de mRNA: amostra teste e controle; Transcrição reversa: iniciada com poli(dT) e incorporação de análogos fluorescentes de nucleotídeos; Grupamentos químicos fluorescentes ( fluoróforos): Cianinas 3( Cy3 verde) e Cianinas 5 ( Cy5 vermelho). Preparo da Amostra Hibridização Neste passo, o mRNA controle (marcado a verde) juntamente com o mRNA teste (marcado a vermelho) são vertidos sobre a superfície da lâmina de vidro; Incubação a 42°C: cDNA da mistura se liga (hibridização) ao DNA complementar no microarranjo. o “microarranjo” é lavado de modo a remover as moléculas de cDNA que não tenham encontrado alvos complementares nas lâminas. O “microarranjo” está então pronto a ser digitalizado – “scanneado”. Hibridização Fornos Utilizados na etapa de Hibridação Detecção,visualização e interpretação dos dados. Scanner CCD: Na tecnologia CCD as lâminas são excitadas com uma luz branca em toda sua extensão e uma câmera fotografa a imagem decorrente da emissão de intensidade proveniente dos compostos fluorescentes (Cy3 e Cy5) presentes nos alvos (populações celulares de interesse) que foram utilizados para a hibridização; Scanner a laser: Os scanners a laser fazem uma varredura na lâmina com um raio laser nos comprimentos de onda específicos digitalizando a imagem gerada. Leitura do microarranjo pelo scanner a laser para digitalização da imagem Aplicações e Perspectivas • Estudos de perfis de expressão gênica de todos os genes de um determinado genoma. • Identificação de sequências gênicas (ou mutações) • Estudo de diferentes tipos de Câncer • Patogenicidade de Doenças Infecciosas • Indústria Farmacêutica • Mapeamento Genômico Metodologia SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) É uma técnica que quantifica em larga escala a expressão de genes de uma dada população de RNAs mensageiros. Esta técnica gera etiquetas (tags) de cDNA que são concatenadas (ligadas) e sequenciadas para, em seguida, serem analisadas e anotadas. Sistema Aberto: Não exige o conhecimento prévio das sequências dos genes em estudo. Baseia-se na variabilidade da extremidade 3’ não-traduzida do mRNA. A Técnica SAGE foi desenvolvida na Univeridade Johns Hopkins nos Estados Unidos (centro de Oncologia) pelo Dr. Victor Velculescu em 1995. Baseia-se em dois princípios: 1. Uma sequência de nucleotídeos (tag) de 9-10 pares de bases (pb) possui informação suficiente para a identificação de um transcrito único, pois uma sequência de apenas 9 pb pode distinguir 262.144 (4 9 ) transcritos. 2. A ligação (concatenação) dos tags permite a análise eficiente dos transcritos de um modo serial, pelo sequenciamento de múltiplos tags contidos em um único clone. 1. Isolamento do RNAm O RNA mensageiro é isolado do resto do material gênico. O RNAm é convertido em cDNA. Como funciona a Técnica SAGE? 2. Geração das Tags Utilizando um enzima de restrição (NlaIII) os sitios CATG são clivados. Uma segunda enzima de restrição (BsmFI) cliva as sequências 10 pb a frente do sítio CATG. As Tags de são isoladas do resto do material gênico. 3. Formação de Ditags As Tags são separadas em dois conjuntos. Com o uso de dois adaptadores as Tags de cada conjunto são unidas, duas a duas 4.União em Concatâmeros e sequenciamento As Ditags são unidas em grandes sequências, chamadas concatâmeros e, finalmente, sequenciadas. Concatâmeros: múltiplos tags contido em um único gene permite uma análise serial eficiente. Cromatograma após sequenciamento de Clones SAGE. Vantagens Potencial para definir, qualitativamente e quantitativamente o transcriptoma de um tecido sem o prévio conhecimento da sequência completa; Medida absoluta da expressão gênica; Novos meios de otimização tem sido publicados com o intuito de permitir sua eficiência e permitir maiores aplicações. Desvantagens • Necessidade de sequenciamento abundante para cada um dos tecidos e/ou condições estudadas • Necessidade de quantidades significativas de mRNA para a construção de bibliotecas de tags; • Certa inespecificidade devido ao tamanho extremamente pequeno dos tags, além de eventuais erros no sequenciamento. Nova Estratégia: MicroSAGE Adaptação para aplicação em protocolos realizados com amostras menores; Simplificação devido a incorporação dos procedimentos em um único tubo; Modificações tornaram possível analisar a expressão gênica de amostras 500-5000 vezes menores. Aplicações da Técnica • Analisar diferenças entre os padrões de expressão gênica de células cancerosas e células normais. Examinando que transcritos estão presentes numa célula. • Permite uma análise rápida e detalhada dos milhares de transcritos de uma célula. • Permite comparar diferentes tipos de células, gerar perfis que vão ajudar a entender as células saudáveis e o que há de errado em patologias. Referências Watson; D. James; Myers; M. Richard (et. al); DNA Recombinante: Genes e Genomas, 3ª ed., Porto Alegre, Artmed: 2009 – pg 335-344. BURNSIDE, J.; NEIMAN, P.; TANG, J.; BASOM, R.; TALBOT, R.; ARONSzAJN, M.; BURT, D.; DELROW, J. Development of a cDNA array for chicken gene expression analysis. 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