Micologia clinica

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE FARMÁCIA FARMÁCIA LABORATÓRIO DE MICOLOGIA CLÍNICA MICOLOGIAMICOLOGIA CLÍNICA PROF. PAULO MURILLO NEUFELD [[email protected] 2003 ÍNDICE MICOLOGIA GERAL MICOLOGIA CLÍNICA PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ASPERGILOSE BLASTOMICOSE NORTE-AMERICANA BLASTOMICOSE QUELOIDIANA [LOBOMICOSE] CANDIDÍASE COCCIDIOIDOMICOSE CRIPTOCOCOSE CROMOMICOSE DERMATOFITOSE ESPOROTRICOSE FEOHIFOMICOSE HIALOHIFOMICOSE HISTOPLASMOSE AMERICANA HISTOPLASMOSE AFRICANA MICETOMA PARACOCCIDIOIDOMICOSE PITIRÍASE VERSICOLOR RINOSPORIDIOSE ZIGOMICOSE BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO: MODELO DE LAUDO MICOLÓGICO 01 14 24 48 50 52 53 55 57 59 61 63 65 66 67 69 71 73 75 77 78 82 94 98 MICOLOGIA GERAL 1. CONCEITO Micologia é o ramo da microbiologia que estuda os fungos, organismos enquadrados em um reino bem definido, denominado de reino Fungi. 1. IMPORTÂNCIA GERAL DOS FUNGOS Os fungos têm existência bastante difusa. Eles são considerados ubiquitários por estarem presentes no solo, na água e no ar e cosmopolitas por serem encontrados em todas as partes do planeta. Estes microrganismos necessitam de matéria orgânica para a obtenção de carbono e de energia para o seu metabolismo, por isso, estarão sempre associados ao material orgânico como sapróbios ou decompositores, simbiontes, comensais e parasitas. São os efeitos decorrentes destas manifestações que, dependendo do sentido, poderão ser considerados úteis ou prejudiciais. 1.1. Ação benéfica • Decomposição: a decomposição da matéria orgânica resulta na produção de húmus e auxilia na eliminação de resíduos orgânicos. Os fungos, como decompositores, são importantes na reciclagem de elementos contidos em material orgânico de origem vegetal e animal. • Líquens: os líquens são resultantes da associação de fungos com algas. São importantes na colonização da rocha núa, transformando-a em solo aproveitável. Elaboram enzimas e ácidos que são liberados sobre a rocha, quebrando-a em suas estruturas formadoras e produzindo uma espécie de solo que permitirá a implantação dos vegetais. • Micorrizas: são estruturas formadas pela associação de raízes não lenhosas de vegetais superiores e fungos especializados do solo. As micorrizas aumentam a absorção de água e nutrientes; fornecem proteção contra ataques de pragas; aumentam a tolerância dos vegetais a excessos de metais, a condições extremas de acidez, aridez e temperatura do solo. 1 • Controle biológico de vetores: muitos fungos parasitam e matam diversos insetos que constituem verdadeiras pragas de culturas, dentre eles: Metharizium anisopliae que parasita a cigarrinha da cana-de-açúcar, Beauveria bassiana que parasita a broca da cana-de-açúcar, a broca da batata doce e a broca do coqueiro. • Alimentação: os fungos podem ser consumidos como alimentos, os cogumelos dos gêneros Agaricus campestris, Morchella hortensis, Clavaria fava, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus, Russula alutalea, Psalliota arvensis, Amanita caesarea, Boletus sp, e Helvellae sp. e trufas do gênero Tuber sp., são os mais frequentemente utilizados. Podem ainda ser empregados no preparo de numerosos alimentos como: pão (Saccharomyces cerevisiae); bebidas alcoólicas: cervejas, vinhos, uísques, rum, gim e saquê (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Aspergillus oryzae); queijos: roquefort e gorgonzola (Penicillium roquefortii), camembert (Penicillium camembertii); molhos e pastas: shoyu (Aspergillus oryzae, Aspergillus soye), missó (Aspergillus oryzae). • Indústria: os fungos são empregados em processos industriais de importância indiscutível. Podem produzir: álcool (etanol e glicerol); vitaminas ( complexo B e vitamina D); antibióticos (penicilina e griseofulvina); esteróides (progesterona); corticóides (cortisona). 1.1. Ação prejudicial • Fitopatógenos: os fungos podem devastar culturas inteiras ou determinar alterações na taxa de crescimento dos vegetais de interesse agronômico. • Deterioração de madeira e derivados: atacam madeiras de construção, dormentes de ferrovia, postes de luz e telegráficos, móveis e utensílios em geral, molduras e telas de quadros, papel e etc. • Deterioração de alimentos e intoxicações alimentares: são agentes de deterioração de alimentos, produzindo alterações organolépticas, ou seja, alterações na aparência, na consistência, no sabor e no aroma. Crescem sobre grãos, carnes, leites, ovos, mel, produtos enlatados, além de frutas, legumes e hortaliças. Podem produzir também toxinas exógenas (micotoxinas) e toxinas endógenas que quando ingeridas desencadeiam quadros de intoxicação alimentar, denominados de micotoxicoses e micetismos respectivamente. As micotoxinas são elaboradas e liberadas para o meio ambiente durante o crescimento dos fungos. Para que ocorra intoxicação (micotoxicose) é necessário a ingestão de alimentos contaminados com estas toxinas. Os gêneros mais comumente implicados na produção 2 micotoxicoses são: Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp. As endotoxinas fazem parte da própria estrutura dos fungos, não sendo liberadas para o meio ambiente. Para que ocorra intoxicação (micetismo) é necessário a ingestão do próprio fungo e não apenas da toxina, como no caso das micotoxicoses. Os fungos incriminados como produtores de micetismos são os chamados cogumelos venenosos: Amanita verna, Amanita muscaria, Amanita phalloides, Amanita pantherina, Coprinus atramentarius, Cantharellus auratialus, Lactarius tormentosum, Russula emetica, Lepiota helveola, Entoloma lividum, Gyromitra esculenta, Cortinarius orelanus, Psilocybe sp., Stropharia sp., Conocybe sp. e Tricholona sp. A ingestão de ambos os tipos de toxinas leva à produção de variado quadro anátomo-patológico como: vômitos, tremores, diarréias, hemorragias e neoplasias. • Micoses e alergias: estes microganismos podem causar diversos processos patológicos no homem e nos animais. Muitos são agentes de enfermidades conhecidas como micoses (esporotricose, causada pelo fungo Sporothrix schenckii; histoplasmose, causada pelo Histoplasma capsulatum; blastomicose, causada pelo Blastomyces dermatitidis; paracoccidioidomicose, causada pelo Paracoccidioides brasiliensis) ou agentes de processos alérgicos em indivíduos imunologicamente sensíveis, devido a inalação de elementos fúngicos em suspensão no ar. • Outros: os fungos podem se desenvolver em combustíveis (petróleo e derivados: gasolina, óleo diesel e querosene; álcool) causando enormes problemas para refinarias e para a aviação. Os aviões abastecidos com querosene podem apresentar crescimento de fungos em seu tanque de combustível, o que pode levar a entupimentos do sistema de condução do combustível ou ainda podem causar corrosão microbiológica, atacando a camada interna de poliesteruretano e as chapas de duralumínio dos tanques de querosene dos aviões. 3. CITOLOGIA DOS FUNGOS A célula fúngica é menor e mais simples do que a célula dos vegetais e animais, porém apresenta basicamente os mesmos componentes encontrados nestas células eucariontes: • Parede Celular: pode ser fundamentalmente de quitina, celulose ou composta de uma mistura das duas substâcias. Alguns fungos durante um período de seu ciclo de vida perdem a parede (esporos dos fungos aquáticos). • Lomassoma: estrutura formada a partir da membrana celular e que se localiza entre a parede e a membrana plasmática. Apresenta as seguintes funções: 3 Secreção e formação de parede celular. Proliferação de citomembranas. Micropinocitose. Síntese de glicogênio. Manutenção do turgor celular. Funções de complexo de Golgi. Estrutura de resposta a tensões, sendo produzida em momentos de parasitismo ou traumatismo. • Membrana Celular : apresenta permeabilidade seletiva, segue o modelo do mosaico fluido e, em alguns fungos que perdem a parede durante parte de seu ciclo biológico, dá a forma e protege a célula. • • • Núcleo: com membrana nuclear e fuso acromático intra-nuclear (durante a divisão celular por mitose não há desorganização da membrana nuclear). Vacúolos: existem basicamente dois tipos, o de reserva que contém glicogênio e o digestivo que contém enzimas digestivas, semelhantemente ao lisossoma. Septos: são projeções da parede celular que divide transversalmente a hifa. Os septos podem ser falsos ou verdadeiros. Os septos falsos são aqueles que apresentam um poro central que permite a passagem do citoplasma de um compartimento para o outro da hifa. Os septos verdadeiros não apresentam poro e são formados em dois momentos: no traumatismo para evitar o estravasamento do material citoplasmático para o meio ambiente e na reprodução quando um septo é formado para isolar a área reprodutiva do restante do corpo vegetativo. • Flagelo: nas células móveis (esporos de fungos aquáticos) encontram-se dois tipos, o Tinsil ou Penado que apresenta um diâmetro uniforme ornamentado externamente por fibrilas e o Whiplash ou Chicote que afila progressivamente para a extremidade livre e não é ornamentado. 4. MORFOLOGIA DOS FUNGOS. 4.1. Morfologia vegetativa: Os fungos podem ser divididos de acordo com a sua morfologia vegetativa em: • Filamentosos: as células têm forma de filamentos tubulares denominados de hifas e o seu conjunto é chamado de micélio. As hifas ou o micélio, segundo a coloração que apresentem em sua parede celular, podem ser classificadas em hialinas quando apresentam cores claras 4 ou são transparentes e demáceas quando apresentam cores escuras. Também podem ser divididas em septadas e asseptadas. • Leveduriformes: as células têm formato arredondado ou ovalado e são chamadas de leveduras. 4.1. Morfologia reprodutiva: Os esporos são as unidades reprodutivas dos fungos e se caracterizam por também apresentar formas e colorações variadas. Os principais tipos de esporos são: • • • • • • Basidiosporos: esporos sexuados exógenos, formados no exterior de células chamadas basídias. Ascosporos: esporos sexuados endógenos, formados no interior de hifas em forma de saco denominadas de asco. Conídios: esporos assexuados exógenos, formados sobre hifas reprodutivas chamadas de células conidiogênicas. Esporângiosporos: esporos assexuados endógenos, formados dentro de hifas reprodutivas chamadas de esporângios. Zoosporos: esporos assexuados endógenos, formados no interior de hifas reprodutivas chamadas de zoosporângios. Blastosporos: esporos assexuados, representados pelas gêmulas ou brotos das leveduras. As estruturas que formam e dão sustentação aos esporos são genericamente conhecidas como esporóforos. Estas estruturas apresentam denominações específicas de acordo com o tipo de esporos que produzem. Assim, quando produzem conídios, são denominados de conidióforos; quando produzem esporângios com esporângiosporos, são denominados de esporângióforos; quando produzem zoosporângios com zoosporos, são chamados de zoosporângióforos. Os esporóforos podem ser ainda simples ou compostos. Conidióforos e esporangiosporos exemplos de esporóforos simples que dão origem a esporos assexuados, enquanto que sinêmios, esporodóquios, soros e acérvulos e picnídios são exemplos de esporóforos compostos e que também dão origem a esporos assexuados (conídios). Os esporóforos compostos que dão origem a esporos sexuados são chamados de ascocarpos quando ascos e ascosporos são produzidos em seu interior e de basidiocarpos (basidióforos) quando basidiosporos são produzidos sobre as suas estruturas (basídias). Os ascocarpos podem ser divididos em peritécios, apotécios, cleistotécios e gmnotécios de acordo com seu modo de comunicação com o meio exterior. 5 5. FISIOLOGIA DOS FUNGOS 5.1 Nutrição • • • Heterotróficos para carbono. Tomada de nutrientes feita por absorção. Produção de exoenzimas e enzimas adaptativas. 5.1. Respiração • • Aeróbios. Respiração celular: Ciclo de Krebs, Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa. 5.3. Fermentação • Oxidação parcial do substrato com produção de álcool e dióxido de carbono. 5.4. Dimorfismo • Alguns fungos apresentam duas morfologias que variam principalmente em função da temperatura: filamentosos a 15o C e leveduriformes a 37o C. 5.5. Reprodução O ciclo biológico dos fungos começa e termina no esporo, que pode ser oriundo de reprodução sexuada e/ou assexuada e ainda pode ser endógeno (quando produzido no interior de células ou hifas especializadas) e exógeno (quando produzido no exterior de células ou hifas especializadas). As formas conhecidas de reproduções nos fungos são: • Assexuada (Imperfeita ou Anamórfica): divisão nuclear por mitose. Ocorre puramente por transformações do sistema vegetativo. É importante para a propagação da espécie porque produz grande número de esporos, porém, a variabilidade genética é baixa e dependente de mutações. • Sexuada (Perfeita ou Teleomórfica): divisão nuclear por meiose. É derivada da união de núcleos compatíveis. É composta de três fases: Plasmogamia: fusão ou anastomose de hifas; Cariogamia: união de dois núcleos haplóides compatíveis (formação de núcleo diplóide); meiose: divisão nuclear por meiose, retornando à condição haplóide (crossing-over meiótico). 6 Esta reprodução produz baixo número de esporos (ocorrendo apenas após um período de “stress” ambiental), mas com grande variabilidade genética. • Ciclo Parassexuado: divisão nuclear por mitose. Não ocorre em um período ou ponto específico do ciclo biológico do fungo e não há formação de estruturas de reprodução. É composto pelas seguintes fases: plasmogamia; cariogamia.; mitose (com eventual crossingover mitótico). Este ciclo fornece algumas vantagens que só seriam obtidas no ciclo sexuado. Desta forma, um certo grau de variabilidade genética é conseguido. O Ciclo Parassexuado é muito importante para aqueles fungos que não se reproduzem sexuadamente e que dependem exclusivamente de mutações para que haja alguma variação em seu código genético. O homem utiliza este ciclo, aliado a mutações artificiais, fazer melhoramento genético, ou seja , obtenção de novas linhagens em fungos de interesse comercial, industrial e médico cuja reprodução sexuada não se conhece. 6. CARACTERIZAÇÃO DOS FUNGOS Os fungos estão enquadrados no reino FUNGI, sendo suas principais características: • • • • • • • • Eucariontes: possuem membrana nuclear, o que caracteriza os núcleos verdadeiros. No interior de seus núcleos, o número de cromossomos é variável, mas sempre diferente de um. Unicelular ou Filamentoso; Parede Celular: quitinosa e/ou celulósica; Aeróbios; Aclorofilados (não fazem fotossíntese); Nutrição heterotrófica por absorção; Armazenam glicogênio e não armazenam amido; Reproduzem-se por esporos oriundos de reprodução assexuada ou sexuada. 7. TAXONOMIA DOS FUNGOS A exata posição dos fungos com relação aos outros organismos tem sido motivo de muita discussão. Inicialmente, os fungos foram tratados como pertencentes ao reino vegetal. Todavia, quando comparadas, as características dos fungos se chocavam com as características dos demais representantes deste reino. Somado a isso, algumas características observadas nas células animais eram compartilhadas pelos fungos. Com o objetivo de minimizar as diferenças, os fungos foram então separados em um reino particular. 7 Tradicionalmente, o reino Fungi tem sido dividido em dois filos (ou divisões): o Myxomycota, para as forma plasmodiais, e o Eumycota (fungos verdadeiros), para as forma não plasmodiais que são usualmente miceliais ou leveduriformes. Os fungos verdadeiros, por sua vez, têm sido classificados a partir de suas relações filogenéticas e estruturas de reprodução sexuada nos subfilos (ou subdivisões): Basidiomycotina, Ascomycotina, Zygomycotina e Mastigomycotina. A exceção fica por conta do subfilo (ou subdivisão) Deuteromycotina que não é formada a partir de graus de parentesco e nem a partir de formas sexuadas de reprodução. Nele são colocados todos aqueles fungos cuja reprodução sexuada é inexistente ou desconhecida, independentemente de sua origem filogenética (evolutiva). Na maioria das vezes, os deuteromicetos são formas assexuadas de ascomicetos ou basidiomicetos. Classificação tradicional dos fungos FILO EUMYCOTA EUCARIONTES, UNICELULARES OU FILAMENTOSOS, PAREDE CELULAR COM QUITINA E / OU CELULOSE, AERÓBIOS, ACLOROFILADOS, NUTRIÇÃO HETEROTRÓFICA POR ABSORÇÃO, GLICOGÊNIO COMO RESERVA GLICÍDICA, REPRODUÇÃO POR ESPOROS PRODUZIDOS ASSEXUADA E / OU SEXUADAMENTE. SUBFILOFILO BASIDIOMYCOTINA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (BASIDIOSPORO) FORMADO SOBRE BASÍDIAS. SUBFILO ASCOMYCOTINA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (ASCOSPORO) FORMADO DENTRO DE ASCOS. UBFILO ZYGOMYCCOTINA MICÉLIO ASSEPTADO E ESPORO SEXUADO (ZIGOSPORO) E ASSEXUADO ESPORÂNGIOS. (ESPORANGIOSPORO) FORMADOS DENTRO DE SUBFILO MASTIGOMYCOTINA MICÉLIO ASSEPTADO OU FORMA UNICELULAR E ESPORO ASSEXUADO FLAGELADO (ZOOSPORO). SUBFILO DEUTEROMYCOTINA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO ASSEXUADO NÃO FORMADO EM ESPORÂNGIOS (CONÍDIO). 8 Com o avanço das técnicas de estudo, muitos organismos anteriormente considerados fungos foram retirados do reino Fungi por apresentarem características que conflitiam com aquelas reconhecidas para este grupo. Assim, o reino Fungi foi reestruturado e atualmente passou a conter os Filo Basidiomycota, Ascomycota, Zygomycota e Chytridiomycota. O antigo Sbufilo Mastigomycotina foi retirado do reino Fungi, pois muitos organismos considerados neste taxon tinha pouca relação com os fungos verdadeiros, ficando apenas a antiga classe dos Chytridiomycetes como filo Chytridiomycota. O subfilo Deuteromycotina foi extinto por não ser uma unidade monofilética e seus componentes passaram a ser designados como “fungos mitospóricos”. Recentemente, o termo “fungo mitospórico” foi substituído pelo o termo “fungo anamórfico”. É importante ressaltar que estes termos não correspondem a uma classificação taxonômica, mas sim, apenas a uma designação sob a qual estão agrupadas as formas assexuadas de alguns fungos. Classificação moderna dos fungos REINO FUNGI EUCARIONTES, UNICELULARES OU FILAMENTOSOS, PAREDE CELULAR COM QUITINA, AERÓBIOS, ACLOROFILADOS, NUTRIÇÃO HETEROTRÓFICA POR ABSORÇÃO, GLICOGÊNIO COMO RESERVA GLICÍDICA, REPRODUÇÃO POR ESPOROS PRODUZIDOS ASSEXUADA E / OU SEXUADAMENTE. FILO BASIDIOMYCOTA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (BASIDIOSPORO) FORMADO SOBRE BASÍDIAS. FILO ASCOMYCOTA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (ASCOSPORO) FORMADO DENTRO DE ASCOS. FILO ZYGOMYCOTA MICÉLIO ASSEPTADO E ESPORO SEXUADO (ZIGOSPORO) E ASSEXUADO ESPORÂNGIOS. (ESPORANGIOSPORO) FORMADOS DENTRO DE FILO CHYTRIDIOMYCOTA MICÉLIO ASSEPTADO OU FORMA UNICELULAR E ESPORO ASSEXUADO FLAGELADO (ZOOSPORO). 9 Outra classificação proposta inclui os filos Basidiomycota, Ascomycota, Zygomycota e Deuteromycota. Nesta, nenhum dos membros do antigo subfilo Mastigomycotina é considerado fungo verdadeiro e, mesmo não sendo uma unidade monofilética, o antigo subfilo Deuteromycotina foi mantido como filo Deuteromycota. Classificação moderna dos fungos REINO FUNGI EUCARIONTES, UNICELULARES OU FILAMENTOSOS, PAREDE CELULAR COM QUITINA, AERÓBIOS, ACLOROFILADOS, NUTRIÇÃO HETEROTRÓFICA POR ABSORÇÃO, GLICOGÊNIO COMO RESERVA GLICÍDICA, REPRODUÇÃO POR ESPOROS PRODUZIDOS ASSEXUADA E / OU SEXUADAMENTE. FILO BASIDIOMYCOTA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (BASIDIOSPORO) FORMADO SOBRE BASÍDIAS. FILO ASCOMYCOTA MICÉLIO SEPTADO OU CÉLULAS DE LEVEDURA E ESPORO SEXUADO (ASCOSPORO) FORMADO DENTRO DE ASCOS. FILO ZYGOMYCOTA MICÉLIO ASSEPTADO E ESPORO SEXUADO (ZIGOSPORO) E ASSEXUADO ESPORÂNGIOS. (ESPORANGIOSPORO) FORMADOS DENTRO DE FILO DEUTEROMYCOTA MICÉLIO SEPTADO E ESPORO ASSEXUADO (CONÍDIO) NÃO FORMADO EM ESPORÂNGIOS OU CÉLULAS DE LEVEDURA GEMULANTES (BLASTOSPORO) 10 Esquema taxonômico dos principais grupos de fungos Filo Zygomycota Classe Zygomycetes Ordem Entomophthorales Mucorales Família Entomophthoraceae Mucoraceae Gênero Basidiobolus Conidiobolus Absidia Mortierella Mucor Rhizomucor Rhizopus Cunnighamella Syncephalastrum Endomyces Lodderomyces Kluyveromyces Pichia Saccharomyces Piedraia Pseudoallecheria boydii Ajellomyces Arthroderma Nannizzia Filobasidiella Schyzophillum Aureobasidium Cryptococcus Candida/Torulopsis Malazzesia/Pityrosporum Rhodotorula Trichosporon Sporobolomyces Cunninghamellaceae Syncephalastraceae Ascomycota Hemiascomycetes Endomycetales Endomycetaceae Saccharomycetaceae Loculoascomycetes Myriangiales Pleosporales Eurothiales Saccardinulaceae Microascaceae Gymnoascaceae Plectomycetes Basidiomycota Teliomycetes Hymenomycetes Blastomycetes Ustilaginales Aphyllophorales Filobasidiaceae Schyzophillaceae Deuteromycota Hyphomycetes Moniliales Moniliaceae Acremonium/Cephalosporium Dematiaceae Tuberculariaceae Aspergillus Blastomyces Chrysosporium Coccidioides Epidermophyton Geotrichum Gliocladium Histoplasma Microsporum Paecilomyces Paracoccidioides Penicillium Sepedonium Scopulariopsis Sporothrix Trichoderma Trichophyton Alternaria Cladosporium Curvularia Drechslera Exophiala Fonsecaea Helmintosporium Madurella Nigrospora Phialophora Rhinocladiella Ulocladium Wangiella Epicoccum Fusarium Phoma Ceolomycetes Sphaeropsidales 11 A classificação dos fungos está apoiada na micromorfologia das estruturas reprodutivas. Como alguns fungos podem se reproduzir tanto sexuada quanto assexuadamente, estes irão apresentar duas denominações, uma em função da morfologia sexuada e outra em função da morfologia assexuada. Isto ocorre por que as estruturas de reprodução sexuada e assexuada são morfologicamente diferentes. Assim, um mesmo fungo poderá ser conhecido pelo seu nome sexuado (perfeito ou teleomórfico) ou pelo seu nome assexuado (imperfeito ou anamórfico). Taxonomicamente, quando a reprodução sexuada for conhecida, deve se dar preferência de uso para o nome teleomórfico. Contudo, na prática, os fungos são tratados por seu nome anamórfico, já que as culturas são manipuladas, no laboratório clínico, na fase assexuada. Nomenclatura anamórfica e teleomórfica de alguns fungos de interesse médico Anamorfo Teleomorfo Anamorfo Teleomorfo Alternaria Clathrospora Leptosphaeria Pleospora Emericella Eurotium Sartorya Ajellomyces Hansenula Kluyveromyces Leucosporidium Lodderomyces Pichia Saccharomyces Arthroderma Penicillium Eupenicillium Penicilliops Talaromyces Gaeumannomyces Mollisia Rhodosporidium Petrielle Petriellidium Pseudoallescheria Aspergillus Phialophora Blastomyces Candida Rhodotorula Scedosporium Chrysosporium Scopulariopsis Chaetonium Kernia Microascus Petriella Handersonula Corynoascus Hypomyces Peckiella Thielavia Aessosporon Ceratocystis Cryptococcus Curvularia Filobasidiella Filobasidium Cochliobolus Scytallidium Sepedonium Dreschslera Fusarium Cochliobolus Pyrenophora Calonectria Giberella Micronetriella Nectria Dipodascus Endomyces Sporobolomyces Sporothrix Geotrichum Stachybotrys Melanopsamma 12 Continuação Anamorfo Teleomorfo Anamorfo Teleomorfo Histoplasma Ajellomyces Torulopsis Debaryomyces Hansenula Kluyveromyces Saccharomyces Filobasidium Hypocrea Podostroma Microsporum Paecyllomyces Arthroderma Byssochlamyces Cephalotheca Thermoascus Trichoderma Em micologia médica, uma classificação (não taxonômica) orientada segundo a enfermidade causada por esses organismos, pode ser útil. Neste esquema, os fungos são agrupados em três grandes categorias: micoses superficiais (pele, pêlos e unhas), micoses subcutâneas (músculos, ossos e tercido conectivo) e micoses profundas ou sistêmicas (diversos órgãos ou tecidos: pulmões, sistema linfático e sangüineo). Classificação clínica dos agentes fúngicos Superficiais Piedra Branca Trichosporon beigelii Piedra Preta Piedraia hortae Tinea Nigra Exophiala werneckii Candidíase Candida spp. Dermatofitose Epidermophytom floccosum Microsporum spp. Trichophyton spp. Pitiríase Versicolor Malassezia furfur Subcutânea Cromoblastomicose Cladosporium carrionii Fonsecaea compacta Fonsecaea pedrosoi Phialophora verrucosa Rhinocladiella aquaspersa Esporotricose Sporothrix schenckii Micetoma Eumicótico Acremonium spp. Aspergillus nidulans Curvularia spp. Exophiala jeanselmei Fusarium spp. Madurella spp. Pseudallescheria boydii Feohifomicose Alternaria spp. Cladosporium spp. Curvularia spp. Exophiala spp. Phialophora spp. Sistêmica Aspergilose Aspergillus spp. Blastomicose Blastomyces dermatititdis Candidíase Candida spp. Coccidioidomicose Coccidioides immitis Cryptococcose Cryptococcus neoformans Hialohifomicose Acremonium spp. Fusarium spp. Paecilomyces spp. Penicillium spp. Scopulariopsis spp. Histoplasmose Histoplasma capsulatum Paracoccidioidomicose Paracoccidioides brasiliensis Zigomicose Absidia spp. Cunninghamella spp. Mucor spp. Rhizopus spp. Syncephalastrum spp. Basidiobolus sp. Conidiobolus sp. 13 MICOLOGIA CLÍNICA 1. DEFINIÇÃO: MICOSE A patogenicidade dos fungos tem sido relacionada com a sua capacidade de desenvolvimento nos tecidos do hospedeiro. A ação espoliativa dos fungos patogênicos pode levar a um variado quadro mórbido, genericamente, denominado de micose. 1. TERMINOLOGIA 1.1. Localização Anátomo-clínica: segundo o sítio anatômico, as micoses podem ser denominadas como dermatomicose (micoses da pele), otomicose (micoses do conducto auditivo), oftalmomicose (micoses dos olhos), onicomicose (micoses das unhas) e pneumomicose (micoses dos pulmões). 1.1. Agente etiológico: segundo o fungo responsável, as micoses podem ser denominadas como aspergilose (micoses produzidas por fungos do genêro Aspergillus), paracoccidioidomicose (micose produzida pelo Paracoccidioides brasiliensis), esporotricose (micose produzida pelo Sporothrix schenckii) e etc. 3. CLASSIFICAÇÃO 3.1. Localização do processo: superficial, subcutânea e profunda 3.1. Origem do processo: primária, secundária e associadas 4. FATORES PRÉ-DISPONENTES 4.1. Fatores biológicos • Hospedeiro: raça (fatores genéticos); idade (imaturidade ou degeneração do sistema imunológico); sexo (alterações fisiológicas: gravidez, lactação e ciclo menstrual); Patologias (processos infecciosos, processos metabólicos, processos neoplásicos, desnutrição e estados imunossupressivos). 14 • Fungo: fatores indutores de fase tecidual (dimorfismo); Afinidade tecidual (equipamento enzimático); presença de cápsula; parasitismo intracelular; toxicidade (exo e endotoxinas); poder invasor (orgãos perfurantes: ação mecânica) 4.1. Fatores ecológicos • Clima: de maneira geral as micoses são mais freqüentes em climas quentes do que em climas temperados e frios. Há, porém, algumas micoses em que a influência climática é predominante. Neste casos, o fungo só sobrevive no ambiente em condições climáticas estritas. • Solo: a influência da natureza do terreno sobre o desenvolvimento sapróbio dos fungos patogênicos, em geral, é mal estudada. Entretanto, parece haver certa relação entre algumas áreas de maior prevalência de micoses e a constituição do solo (histoplasmose ou coccidioidomicose). 4.3. Fatores sociológicos • Meio Social: considera-se o solo e os vegetais como sendo o principal habitat dos fungos patogênicos, assim, compreende-se que a incidência das micoses seja maior no meio rural do que no meio urbano. • Hábitos e Costumes: podem ser um fator de predisposição ou proteção contra determinadas micoses. Alguns desses fatores estão ligados, por exemplo, ao vestuário, à segregação e à migração. • Profissão: médicos, veterinários, laboratoristas, espeleologistas, entre outros, estão mais expostos aos fungos patogênicos. • Higiene: é importante para a prevenção de muitas micoses, porém, pode ser um tanto quanto ineficaz para as doenças produzidas por fungos da microbiota. 15 5. DINÂMICA DAS MICOSES 5.1. Fontes de infecção e reservatórios • • • • Solo Vegetais Animais Homem. 5.1. Vias de infecção • • • Inalação de elementos fúngicos em suspensão no ar Traumatismo Ingestão 5.3. Vias de disseminação • • • Hematogênica Linfática Contiguidade Epidemiologia das micoses Fonte Porta de Entrada Micoses Sapróbica (solo, matéria orgânica em decomposição) Pulmão Histoplasmose Blastomicose Coccidioidomicose Paracoccidioidomicose Criptococcose Aspergilose Mucormicose Pseudoallescheriose Esporotricose Adiaspiromicose Hialohifomicose Feohifomicose Dermatofitose por geofílicos Micetoma Esporotricose Cromoblastomicose Feohifomicose Rinosporidiose Entomoftoromicose Hialohifomicose Tinea nigra fungos Epiderme e fio de cabelo Pele e tecido subcutâneo 16 Continuação Fonte Porta de Entrada Micoses Seios paranasais Mucormicose Aspergilose Feohifomicose Entomoftoromicose Rinosporidiose Aquática Pele e tecido subcutâneo, mucosa nasal e conjuntiva Pele e pêlos Epiderme e pêlos Animal Humana Dermatofitose zoofílicos Dermatofitose antropofílicos versicolor Candidíase por fungos por fungos e pitiríase Pele, membranas mucosas e trato gastrointestinal 6. TRANSMISSÃO 6.1. Micoses superficiais: a transferência de agentes fúngicos ocorre por contacto direto entre indivíduos. 6.1. Micoses subcutâneas e profundas: a doença adquirida por contacto direto é pouco freqüente. Na realidade, nestas o agente fúngico é transmitido de maneira indireta, ou seja, pelo contacto com solo, ambientes e objetos contaminados. 7. SINTOMATOLOGIA DAS MICOSES 7.1. Micoses pulmonares • Geral: sindrome gripal passageira ou pneumonia localizada em um dos lobos ou espalhada. Considerado como infecção inicial; • Tosse: produção mínima de escarro, dispnéia, taquipnéia e hemoptíase. A dor no peito é freqüentemente de natureza pleural. Roncos e fricção pleural podem ser detectados pela auscultação. Radiografias podem revelar pequeno infiltrado pulmonar e adenopatia hilar ou opacidade difusa e confluente; • Alergia broncopulamonar: sintomas característicos de asma e tosse não produtiva. Broncoespasmo episódico. Atalectasia causada por tampões mucóides nos bronquíolos. Cristais de “Charcot-Leyden” e eosinófilos no escarro. Eosinofilia do sangue periférico 17 e reação de hipersensibilidade cutânaea aos antígenos do Aspergillus spp. Elevada concentração sérica de Ig G anti-Aspergillus; • Aspergiloma (bola fúngica): crescimento de uma colônia dentro de uma cavidade pré-formada. Hemoptíase pode ocorrer a despeito de pouca ou nenhuma invasão da parede da cavidade. A disseminação é rara mesmo em pacientes submetidos a terapia com corticóides; • Invasiva: sintomas de pneumonia aguda, febre baixa e inconstante, tosse produtiva ou não produtiva, dor no peito usualmente presente e dispnéia progressiva com respiração difícil. A ocorrência de hemoptíase pode indicar enfarto e necrose do parênquima pulmonar. Radiografias do tórax podem revelar um infiltrado difuso na região hilar, fibrose finamente nodular, abscessos multifocais ou cavitários, dependendo da espécie fúngica: fibrose com pontos difusos: histoplasmose; lesão periférica tipo moeda: coccidioidomicose; lesão cavitária: histoplasmose e coccidioidomicose; bola fúngica: aspergilose, pseudoallescheriose e zigomicose; alergia: Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus 7.1. Micoses superficiais • Lesões com descamação superficial, variando no tamanho forma e coloração (acromia, hipopigmentação ou hiperpigmentação) na região do tórax e costas: infecção por Malassezia furfur (pitiríase versicolor); • Lesões descamativas, pruriginosas, eritematosas com bordos elevados e conhecidas com impigem: Epidermophyton floccosum, Micropsporum spp. e Trichophyton spp. (dermatofitoses); • Lesões descamativas, hiperqueratose, crostas, formação de escútulas: Trichophyton schoenleinii (tinea favosa); • Lesões descamativas ou crostosas confinadas em áreas úmidas e intertriginosas da pele: Candida albicans (leveduroses); 18 • Lesão nodular subcutânea no sítio de infecção com espalhamento ascendente e evolução secundária de úlceras cutâneas no trajeto dos vasos linfáticos: Sporotrix schenckii; • Lesões tumefeitas subcutâneas, pustulares, ulcerosas com tratos sinuosos drenantes e produção de grãos: micetoma; • Lesões tumefeitas subcutâneas, verrucosas, descoloradas e hemorrágicas: cromoblastomicose; • Lesões purpuráceas e cistos subcutâneas: feohifomicose; 7.3. Micoses do sistema nervoso central • Cefaléia de início insidioso que aumenta em freqüência e severidade, aconpanhada de náusea, irritabilidade e instabilidade mental e emocional: criptococcose; • Meningite e meningoencefalite: zigomicose em diabéticos descompensados em acidose; 7.4. Micoses do trato urinário • Pielonefrites associadas com terapia de longa duração com corticóides, antibióticos, imunossupressores e drogas antineoplásicas ou uso prolongado de cateteres para drenagem urinária: candidíase; • Piúria: dor no baixo ventre, ato de urinar freqüente, cistite: candidíase; 7.5. Micose ocular • infecção da cónea, da conjuntiva e do globo ocular após traumatismo ou interveção cirúrgica: aspergilose e hialohifomicose; 7.6. Micoses cardíacas • Febre baixa, murmúreo cardíaco, ecograma positivo: candidíase, aspergilose e hialohifomicose; 19 7.7. Micoses dos seios paranasais • Dor facial e hiperemia cutânea, cefaléia, febre baixa, evidência radiográfica de preenchimento dos seios paranasais: aspergilose, hialohifomicose e pseudoalescheriose. 8. HISTOPATOLOGIA DAS MICOSES A resposta tecidual à agressão dos patógenos fúngicos é tão variada quanto a diversidade dos agentes. Nas infecções dos tecidos queratinizados (pele, pêlos e unhas), geralmente, a lesão é resultado de uma resposta irritativa à presença dos fungos ou de seus metabólitos. No caso dos organismos que invadem os tecidos vivos, como aqueles que causam enfermidades subcutâneas ou profundas, se produz uma resposta piogênica uniforme. 8.1. Reações inflamatórias crônicas • Linfócitos, células plasmáticas, neutrófilos, fibroblastos e ocasionalmente células: zigomicose crônica, histoplasmose crônica e rinosporidiose 8.1. Reações piogênicas • Agudas ou crônicas, infiltrado neutrofílico supurativo: Actinomyces israelii (grânulos de enxofre e histiócitos saturados de lipídios na periferia), Nocardia asteroides e aspergilose aguda e outras infecções oportunistas 8.3. Reações piogênicas e reações granulomatosas mistas • Infiltrado neutrofílico e reação granulomatosa, linfócitos e células plasmáticas: Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis (neutrófilos ao redor de esférulas rompidas), Sporothrix schenckii (raros nos tecidos), cromoblastomicose (reação piogênica crônica, nódulos de células epitelióides e células gigante tipo corpo estranho), micetoma; além disso, podem ocorrer células gigantes espumosas semelhantes às do xantoma 8.4. Hiperplasia pseudoepiteilomatosa (após inflamação crônica da pele) • Hiperplasia das células epidérmicas, hiperqueratose e alongamento das cristas reticulares: Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, cromoblastomicose 20 8.5. Granuloma histiocítico • Histiócitos com microrganismo intracelulares, podendo se transformar em células gigantes: Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans nas meninges 8.6. Granuloma com caseificação • Reação granulomatosa, célula gigante de Langhans e necrose central: Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis 8.7. Granuloma tipo sarcóide • Não necrosante: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum 8.8. Granuloma pulmonar fibro-caseoso • Parede fibrosa espessa envolvida por células epitelióides, micorganismos dentro das células gigantes de Langhans localizadas no centro da lesão, frequentemente ocorre calcificação: Histoplasma capsulatum • • Parede fibrosa delgada, raramente calcificada: Coccidioides immitis Pobremente definida: Cryptococcus neoformans 8.9. Arterite trombótica • Trombose, necrose coagulativa purulenta, invasão dos vasos: aspergilose e zigomicose aguda: Aspergillus spp., zigomicose aguda 8.10. Fibrose • Proliferação de fibroblastos, depósito de colágenos semelhante a quelóides: Paracoccidioide loboi 8.11. Granuloma esclerosante por corpo estranho (em seios paranasais ou após infecção viral) • Hifas atípicas em células gigantes: Aspergillus spp. 21 9. IMUNOLOGIA DAS MICOSES A imunidade natural contra as micoses é muito elevada, por isso, a infecção fúngica depende da exposição maciça de microrganismos e da resistência geral do hospedeiro. Esta situação está bem demonstrada por duas categorias principais de enfermidade micótica. A primeira, infecção por fungos patogênicos verdadeiros, ocorre em pacientes que se encontram em áreas endêmicas particulares e que inalam uma quantidade elevada de elementos fúngicos em suspensão no ar. A maior parte dessas infecções são assintomáticas ou resolvem com rapidez e normalmente ocorre resitência à reinfeção. Somente em raras ocasiões, a enfermidade chega ser grave. Por outro lado, as infecções oportunistas são causadas por microrganismos presentes de maneira universal que possuem virulência muita baixa. O estabelecimento de uma enfermidade depende exclusivamente da resistência do hospedeiro. Neste casos, se o paciente se recupera desta situação, incluindo a infecção fúngica, se observa a ocorrência de resistência não específica à reinfecção. Na atualidade, até onde se sabe, os anticorpos desempenham um papel muito pequeno na defesa frente as infeções micóticas. A imunidade celular parece ser a única resistência eficaz contra a invasão dos fungos. Esta situação está bem ilustrada pelos dois tipos de infecção que ocorrem em pacientes portadores de enfermidades linfomatosas ou que apresentam defeitos genéticos da função linfocitária. Em pacientes que apresentam discrasias ou defeitos da função do linfócito T são freqüentes as infecções fúngicas oportunistas. Se o defeito só ocorre em células B, raramente ocorrem enfermidades causadas por fungos, todavia, são comuns as infecções bacterianas, em particular, as causadas por cocos Gram positivos. A importância dos mecanismos celulares de defesa também se refletem nas manifestações histológicas. No hospedeiro normal, os fungos patogênicos produzem reações piogênicas seguidas de reação granulomatosas. A resposta gerada por organismos oportunistas se traduz por necrose e supuração e o hospedeiro não é capaz de conter os microrganismos. Os fungos são fracamente antigênicos. Por esta razão, na maior parte dos casos, a sorologia não é um bom auxílio diagnóstico ou prognóstico. Além disso, a ocorrência de reações cruzadas e a falta de padronização dos antígenos tornam os procedimentos sorológicos de emprego limitado. A hipersensibilidade e alergia aos fungos se manifestam de diversas formas. Uma alergia intensa pode ser devido a inalação de conídios. Estes podem provocar asma, 22 enfermidades asmatiformes, fibrose e consolidação pulmonar. Os estados alérgicos também podem manifestar-se como processos secundários (“micedes” ou “ides”) à focos de infecção cutânea por dermatófitos (dermatofítides) ou candida (levedurídes). As lesões de “ide” ocorrem pela liberação de alérgenos fúngicos circulantes, os quais, em pessoas sensíveis, são capazes de provocar erupções cutâneas distantes do foco primário. As reações alérgicas como eritema nodoso podem ser parte da infecção primária de alguma enfermidade sistêmica como histoplasmose e coccidioidomicose. Com freqüência, a hipersensibilidade, segundo se tem demonstrado por reações cutâneas positivas, está relacionada a uma boa resistência à infecção ou reinfecção. 23 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 1. COLETA E TRANSPORTE DO ESPÉCIMEN CLÍNICO 1.1. Escarro: três amostras matutinas devem ser coletadas após levantar, mas antes do café da manhã. Os pacientes são instruidos para lavar a cavidade bucal com água imediatamente antes da obtenção do escarro. A produção de escarro pode ser induzida por nebuliação com salina se um adequado espécimen não for produzido. O espécimen de escarro deve ser colocado em um frasco estéril e enviado ao laboratório no máximo até duas horas após coletado. Se demoras são inevitáveis, o espécimen clínico deve ser refrigerado a 4o C. 1.1. Broncoscopia: escovamento brônqüico, lavagem broncoalveolar ou biópsia devem ser transportados prontamente para o laboratório em frasco fechados e estéreis. O escarro pós-broncoscopia deve ser coletado quando possível. 1.3. Fluido cerebroespinhal: fluido cerebroespinhal deve ser coletado sempre que se suspeita de infecções do sistema nervoso central. Se o processamento não for imediato, a amostra deve ser deixada a temperatura ambiente e não refrigerada, já que o fluido cerebroespinhal é um adequado meio de cultura no qual os elementos fúngicos podem sobreviver até serem subcultivados. 1.4. Urina: amostras matutinas são preferidas. Estas devem ser coletadas em frascos estéreis e transportadas imediatamente para o laboratório. Demoras no processamento não devem exceder 1 horas, todavia, se atrasos forem inevitáveis, a amotra deve ser mantida a temperatura de 4o C. 1.5. Secreções prostáticas: algumas micoses profundas, notadamente a blastomicose e menos comumente a histoplasmose e coccidioidomicose, podem ser diagnosticadas pela coleta do líqüido prostático. A bexiga é primeiro esvasiada, em seguida, processasse uma massagem prostática. as secreções devem ser inoculadas diretamente em apropriado meio de cultura; também 5-10ml de urina devem ser coletados em um recipiente a parte. 24 1.6. Exudatos: a pele sobre as lesões pustulares deve ser desinfectada e o exudato aspirado, usando uma seringa e agulha estéreis. A seringa pode servir com recipiente de transporte. Biópsias das lesões podem ser necessárias, se o aspirado falhar na recuperação dos fungos. 1.7. Pele, pêlos e unhas: a lesão deve ser higienizada com gaze embebida em álcool 70% para remover as bactérias contaminantes. As amostras de pele devem ser obtidas por raspados das margens das lesões com uma lâmina de bisturi ou com bordo cortante da lâmina de microscopia. O material de unhas infectadas deve ser coletado por raspagem profunda das áreas quebradiças, distróficas e descoloradas da lâmina ungueal e/ou dos depósitos subungueais. Os espécimens de cabelo devem ser coletados por arrancamento com pinça, já que o foco infeccioso se encontra no bulbo piloso, técnica da escova de cabelo, técnica do quadro de cabelo ou lampada de Wood. 1.8. Tecidos: biópsias de sítios suspeitos devem ser transportadas em gaze estéril umedecida em salina ou em frasco estéril contendo salina. Os espécimens de biópsia devem apresentar uma área de tecido são e lesado. O material não deve estar congelado, desidratado ou formolisado. 1.9. Sangue: coleta de sangue venoso feita por punção com seringa e agulha estéreis. Frasco de hemocultura bifásico (agar BHI-caldo BHI) ventilados devem ser empregados para cultura. Fungos patogênicos mais comuns e principais sítios anatômicos Sangue LCR Trato Genitourinário Trato Respiratório Pele e Anexos C. immitis H. capsulatum S. schenckii Candida spp. C. neoformans P. brasiliensis B. dermatitidis C. immitis H. capsulatum Aspergillus spp. Candida spp. C. neoformans S. schenckii B. dermatitidis C. immitis H. capsulatum Candida spp. C. neoformans B. dermatitidis C. immitis H. capsulatum P. brasiliensis S. schenckii Aspergillus spp. Candida spp. C. neoformans Zigomicetes B. dermatitidis C. immitis Dermatófitos H. capsulatum P. brasiliensis S. schenckii Aspergillus spp. Candida spp. C. neoformans Zigomicetes 25 Critérios de recusa de amostras clínicas para cultivo micológico Critério para recusa Sem identificação no recipiente que contém o material clínico ou discrepância de informação sobre o paciente na requisição do exame e na etiqueta de identificação do material clínico Esfregaço de escarro corados pelo Gram com 15 células epiteliais por campo microscópico Ação Devolver a quem enviou para esclarecimentos Quando se suspeita de uma infecção de trato respiratório baixo, a presença de grande quantidade de células epiteliais em amostras de escarro indica contaminação com secreções orais; isto não é necessariamente um critério de recusa já que se pode recuperar fungos patogênicos particularmente se são empregados meios seletivos; cada caso deve ser analisado individualmente Pedir uma nova amostra se a condição clínica justifica; se uma nova amostra é viável, mas não é possível obtêla por e técnicas não invasivas, pode ser necessário a coleta por biópsias Notificar que as amostras de 14 horas são inaceitáveis e pedir o envia de amostras matinas com no máximo 1 horas de colhidas Pedir o reenvio de amostras em frascos apropriados Swab seco ou material insuficiente Amostras de urina ou escarros de 14 horas Material adequado remetido em recipiente inapropriado; falta de esterilidade, presença de vasamentos, não refrigeração 1. PROCESSAMENTO DO ESPÉCIMEN CLÍNICO 1.1. Pré-tratamento a. Secreções Respiratórias: lise com agentes mucolíticos (N-acetil-l-cisteína, pancreatina 0,5%, fluimicil). É um procedimento opcional, pode melhorar a recuperação dos microganismos patogênicos, mas fungos contaminates também são benificiados. b. Fluidos Corporais (líquido céfalo-raquidiano, líquido sinovial): filtração (filtro de 0,11µm) ou centrifugação (1500 a 1500g). É necessário para uma ótima recuperação, dev ser procedida em espécimens com volume maior que 1-1ml. c. Urina: centrifugação(1500 a 1500g). É necessária para uma ótima recuperação, especialmente quando se tratar de agentes de micoses profundas. 26 d. Tecido: trituração com gral e pistilo ou cortes em pequenos fragmentos (zigomicetos) com bisturi ou tesoura estéreis. É necessário para melhorar a recuperação dos fungos agentes de micoses profundas. e. Unhas: macaração prolongada (pernoites) com hidróxido de potássio. É necessário para uma ótima recuperação de dermatófitos e outros agentes (hifomicetos e leveduras). 1.1. Exame microscópico direto dos espécimens clínicos a. Azul de Alciano Uso: detecção de Cryptococcus neoformans Tempo requerido: 1 minutos Vantagem: quando positivo em LCR é diagnóstico Desvantagem: não é comumente empregado, como a tinta da china não detecta todos os casos b. Álcool-ácido resistência Uso: detecção de Mycobacteria e Nocardia spp. Tempo requerido: 11 minutos Vantagem: cora Nocardia spp e Blastomyces dermatitidis Desvantagem: espécimens de tecido são difíceis de interpretar poe causa da forte coloração de fundo c. Branco de Calcoflúor Uso: detecção específica de fungos Tempo requerido: 1 minuto Vantagem: pode ser misturado ao KOH; detecta fungos rapidamente como resutado de fluorescência brillhante (reação específica com a quitina da parede fúngica) Desvantagem: requer microscópio de fluorescência; prominente fundo fluorescente’porém o fungo apresenta uma fluorescencia mais intensa; secreções vaginais são difíceis de interpretar d. Giemsa Uso: exame de medula óssea ou esfregaço de sangue periférico Tempo requerido: 15 minutos 27 Vantagem: detecção de Histoplasma capsulatum intracelular Desvantagem: detecção usualmente limitada ao Histoplasma capsulatum e. Gram Uso: detecção de bactérias Tempo requerido: 3 minutos Vantagem: empregado no exame bacterioscópico do espécimen clínico; permite a identificação da maioria dos fungos Desvantagem: alguns fungos se coram bem, outros, por exemplo o Cryptococcus neoformans, coram-se fracamente e exibem apenas um aspecto pontilhado. Alumas Nocardia isoladas falham em corar ou coram fracamente. Artefatos mimetizam as leveduras f. Tinta da China Uso: detecção de Cryptococcus neoformans Tempo requerido: 1 minuto Vantagem: quando positivo no LCR é diagnóstico de meningite Desvantagem: negativo em muitos casos de meningite, não confiável g. Hidróxido de Potássio Uso: detecção clarear o espécimen para tornar o fungo mais visível Tempo requerido: 5 minutos, se o clareamento não é completo, um tempo maior é necessário (10 minutos) Vantagem: rápida detecção de elementos fúngicos Desvantagem: requer experiência, já que os artefatos podem confundir o analista. O clareamento de alguns espécimens pode ser demorado (unha) h. Azul de Metileno Uso: detecçãodetecção do fungo em escamas de pele Tempo requerido: 1 minutos Vantagem: usualmente adicionado ao KOH, fornece contraste para a detecção dos elementos fúngicos Desvantagem: o contraste das células pode ser difícil 28 l. Gromori Metanamina Silver (impregnação pela prata) Uso: detecção detecção de fungos em cortes histológicos Tempo requerido: 1 hora Vantagem: cora especificvamente os elementos fúngicos Desvantagem: método de coloração fúngica que não está usualmente disponível no laboratório de micologia clínica m. Papanicolaou Uso: exame de secreção vaginal para a presença de células malígnas Tempo requerido: 30 minutos Vantagem: citotécnico pode identificar elementos fúngicos Desvantagem: requer coloração especializada e analista familiarizado com essa coloração n. Ácido periódico de Schiff (PAS) Uso: detecção específica de fungos Tempo requerido: 10 minutos, 5 minutos adicionais se coloração com contraste for empregada Vantagem: cora elementos fúngicos bastante bem, hifas e leveduras podem ser prontamente distingüidos Desvantagem: Nocardia spp. não se coram bem, Blastomyces dermatitidis aparece pleomorfisado, artefatos PAS positivos podem aparecer com células de levedura o. Wright Uso: exame de medula óssea ou esfregaço de sangue periférico Tempo requerido: 7 minutos Vantagem: detecta Histoplasma capsulatum Desvantagem: detecção limitada ao Histoplasma capsulatum 29 Característica dos elementos fúngicos vistos em exame direto dos espécimens clínicos Morfologia em Tecido Leveduras Organismos Tamaho (µm) 1-5 Aspectos Característicos Histoplasma capsulatum pequenas, ovaladas a arredondadas; gemulantes; frequentemente encontradas em cachos dentro de histiócitos; detecção difícil quando em pequenas quantidades, normalmente intracelulares pequenas, ovais a arredondadas ou em forma de charuto; gemulação simples ou múltipla; raramente vistas em espécimens clínicos as células variam de tamanho, usualmente são esféricas, mas podem ter a forma de uma “bola de football americano”; gêmulas são normalmente simples; cápsulas podem ser ou não evidentes; raramente pseudohifas são formadas as células são comumente grandes e esféricas, com paredes duplas e refratárias; gemulação normalmente simples, gêmulas podem manter-se ligadas à célula mãe, a ligação entre célula mãe e célula filha é estreita as células são normalmente grandes e envolvidas por pequenas leveduras periféricas (leme de navio, chapéu de Mickey); pequenas células podem estar presentes e lembrar as de H. capsulatum as esférulas variam muito no tamnho, algumas contêm endosporos, outras estão vazias; duas esférulas juntas podem lembrar células de B. dermatitidis gemulantes; endosporos podem lembrar as células de H. capsulatum, mas não mostram evidências de gemulação; as eférulas podem produzir múltiplos tubos germinativos, se a preparação direta for mantida em câma úmida por mais de 14h.; hifas podem ser encontradas em lesões cavitárias grandes com paredes espessas e contendo endosporos; maduros esporângios são maiores do que as esférulas de C. immitis Sporothrix schenckii 1-6 Cryptococcus neoformans 1-15 Blsatomyces dermatitidis 8-15 Paracoccidioides brasiliensis 5-60 Esférulas Coccidioides immitis 10-100 Esporângios Rhinosporidium seeberi 6-300 30 Continuação Morfologia em Tecido Leveduras, pseudohifas ou hifas vedadeiras Organismos Tamaho (µm) Levedura: 34 Pseudohifa: 5-10 Aspectos Característicos Candida spp. as células usualmente exibem simples gemulação; pseudohifas quando presentes apresentam constricções nos pntos de constricções e matêm-se unidas com “cordão de salsichas”; hifas verdadeiras quando presentes têm paredes paralelas e são septadas hifálicos curtos e encurvados estão presentes com cachos de células de leveduras esféricas hifas são grandes, em forma de fita, freqüentemente encurvadas, ocasionalmente septadas e com ramificações em ângulo reto; pequenas hifas podem ser confundidas com as do Aspergillus spp., particularmente A. flavus Leveduras e hifas Malassezia furfur Levedura: 3- elementos 8 Hifa: 1,5-4 Hifas septadas largas Zygomycetes 10-30 Hifas septadas hialinas Dermatófitos: Pele e unhas 3-15 hifas hialinas septadas são comumente vistas; cadeias de artrosporos podem estar presentes artrosporos na periferia do fio de cabelo, produzindo uma bainha que indica infecção ectotrix; artropsoros formados pela fragmentação de hifas dentro do fio de cabelo são indicativos de infecção endotrix; filamentos hialinos longos ou canais dentro dos pêlos são indicativos de favus as hifas são septadas e exibem ramificação dicotômica com ângulo de 45o; grandes hifas atípicas podem lembrar as de zigomicetos hifas e artrosporos retangulares estão presentes; formas irrregulares podem ser observadas hifas e artrosporos retangulares a ovalados estão presentes; blastosporos podem ser difíceis de ser em observados Pêlos 3-5 Aspergillus spp. 3-11 Geotricchum spp. 4-11 Trichospporon spp. 1-4/8 31 Continuação Morfologia em Tecido Organismos Tamaho (µm) Aspectos Característicos Penicillium spp. Scopulariopsis spp. Paecilomyces spp. Fusarium spp. Pseuallescheria boydii Hifas septadas demáceas Alternaria spp. Bipolaris spp. Cladosporium spp. Curvularisa spp. Drechslera spp. Exophiala spp. Phialophora spp. Wangiella dermatitidis 1-6 hifas são septadas e impossíveis de distingüir das outras dos demais fungos hialinos, p.ex. Aspergillus spp. hifas demáceas polimórficas são vistas; células gemulantes com septos simples e cadeias de células arredondadas e entumescidas podem estar presentes; ocasionalmente agragados podem ser encontrados em infecção por Phialophora e Exophiala Corpúsculos Muriformes Cladosporium carrionii Fonsecaea compacta Fonsecaea pedrosoi Phialophora verrucosa Rhinocladiella aquaspersa 5-10 células de paredes marrom e espessas, arredondadas e pleomórficas asseptadas, unissetadas e septadas em dois planos; comumente as células contêm duas divisões que formam 4 células; ocasionalmente hifas septadas ramificadas podem ser encontradas além dos corpúsculos muriformes grânulos brancos, macios sem matriz cementada Grânulos Acremonium falciforme Acremonium kiliensi Acremonium recifei Curvularia geniculata Curvularia lunata Aspergillus nidulans 100-300 500-1000 grânulos negros, duros com matriz cementada na periferia grânulos negros, macios, sem matriz cementada grânulos negros, macios, vacuolados, sem matriz cementada, formados a partir de hifas escuras e células entumescidas 65-160 Exophiala jeanselmei 100-300 Fusarium moniliforme Fusarium solani Leptosphaeria senegalensis Leptosphaeria tompkinsii 100-500 300-600 400-600 500-1000 grânulos brancos e macios, sem matriz cementada grânulos negfros, duros, com matriz cementada; periferia composta de células poligonais; centro formado por rede de hifas 32 Continuação Morfologia em Tecido Organismos Tamaho (µm) 50-500 Aspectos Característicos Madurella grisea grânulos negros e macios, sem matriz cementada; periferia composta de células poligonais entumescidas; centro formado por rede de hifas grânulos negros a marrons-escuros, duros que podem ser de dois tipos: marrom ferrugem, compacto e preenchido com matriz cementada marrom escuro e preenchido com numerosas vesículas (614µm), matriz cementada na periferia e área central de hifas claras grânulos brancos com matriz cementada presente na periferia grânulos brancos, macios, compostos de hifas e células entumescidas na periferia dentro de uma matriz cementada grânulos negros, macios, compostos de células poligonais entumescidas na periferia; centro formado por rede de hifas; sem matriz cementada Madurella mycetomatis 100900 Neotestudina rosatii 300-600 Pseudoallescheria boydii 100-300 Pyrenochaeta romeroi 300-600 3. CULTURA 3.1. Meios de cultura a. Isolamento primário • • • • • Agar de Sabouraud 1% (SDA): recuperação primária de fungos sapróbios e patogênicos (não aconselhável) Agar infusão de cérebro-coração (BHIA): recuperação primária de fungos sapróbios e patogênicos Agar infusão de cérebro-coração com cloranfenicol e cicloheximida: recuperação primária de fungos sapróbios e patogênicos, excluindo-se os dermatófitos Agar de Sabouraud e Agar BHI (SABHI): recuperação primária de fungos sapróbios e patogêncios Agar mycosel: principal meio de recuperação primária de dermatofitos 33 • Frasco de hemocultura bifásico (agar BHI e caldo BHI): recuperação primária de fungos do sangue Meios de cultivo para recuperação de fungos de amostras clínicas Sangue medula óssea • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro • agar mycosel • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida. • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida. • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro e gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida; • agar semente de niger. • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida. • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida. • agar de Sabouraud com infusão de cérebro-coração; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina e cloranfenicol; • agar infusão de cérebro-coração com ou sem sangue de carneiro, gentamicina, cloranfenicol e cicloheximida; • agar semente de niger. LCR Pele, pêlos e unhas Membranas mucosas Abscessos, úlceras e lesões subcutâneas Escarro e secreções pulmonares Estomatite Biópsia Urina 34 Antimicrobianos adicionados aos meios micológicos ANTIMICROBIANOS Antibacterianos Cloranfenicol Gentamincina Antifúngico Cicloheximida 500µg/ml 16µg/ml 5µg/ml CONCENTRAÇÃO NO MEIO b. Isolamento secundário • • • • • • Agar milho com tween 80: identificação de Candida albicans por produção de clamidosporos; identificação de outras leveduras por micromorfologia Agar base nitrogênio-leveduras (YNB): identificação de leveduras por determinação de assimilação de açúcares Agar base carbono-leveduras (YCB): identificação de espécies de Cryptococcus pela redução de nitratos Agar semente de niger: recuperação e identificação de Cryptococcus neoformans Agar ascosporos: detecção de ascosporos em leveduras ascosporogênicas Agar uréia: detecção de espécies de Cryptococcus neoformans; diferenciação de Trichophyton mentagrophytes e Trichophyton rubrum; detecção das espécies de Trichosporon • • • • Agar batata dextrosado: demontração da produção de pigmentos por Trichophyton rubrum Meio de arroz: identificação de Microsporum audoiunii Agares “tricofitons” 1-7: identificação dos membros do gênero Trichophyton Agar Czapeck: recuperação e identificação diferencial de espécies de Aspergillus e Penicillium 35 Meios aconselháveis para subcultura de fungos Grupo Zygomycetes Meios de cultivo agar milho agar de Sabouraud 1% agar milho agar de Sabouraud agar Czapec-Dox agar de Sabouraud agar milho agar infusão de cérebro-coração Fungos hialinos Aspergillus spp. Dermatófitos Fungos demáceos Fungos dimórficos Comparação: Placas x Tubos Característica Área superficial Placa grande (aproximadamente 7500mm para 100mm de placa) Suprimento de oxigênio Taxa de desidratação do meio Segurança no manuseio Possibilidade disseninação de fungos Detecção de culturas mistas fácil difícil de pobre grande boa pequena bom rápida 1 Tubo pequena (aproximadamente 1500mm1 por tubo de 15x115mm) pobre lenta Taxa de Crescimento Grupo Crescimento rápido Crescimento intermediário Crescimento lento Taxa de crescimento (dias) <5 6-10 >11 Fungos sapróbios, oportunistas e leveduras oportunistas, subcutâneos e dermetófitos sistêmicos e subcutâneos 36 Distinção entre fungos contaminantes e patogênicos São os sintomas da infecção consistentes com os sintomas de uma infecção fúngica ? Os elemtos fúngicos foram visualizados no tecido ou em outro material obtido da lesão ? Houve crescimento fúngico a partir da cultura do material clínico ? Houve mais de uma cultura positiva para a mesma espécie fúngica ? O fungo isolado é capaz de causar os sintomas observados na infecção sob investigação ? 3.1. Inoculação nos meios de cultura a. Equipamentos • • • • Alça em “L” (dobrada em ângulo reto): fungos filamentosos Alça em “gota” (bacteriológica): fungos leveduriformes Alça de Drigalski: espalhamento sobre o meio de cultura Alça de Hockey: espalhamento sobre o meio de cultura b. Técnicas de inoculação • • Esgotamento sobre a superfície do meio: fungos leveduriformes Perfuração do meio: fungos filamentosas 3.4. Tempo de incubação • • • Uma semana para fungos sapróbios e oportunistas Duas semanas para os dermatófitos Quatro semanas até 11 semanas para os fungos patogêncios (dimórficos) 3.5. Temperatura de incubação • • Temperatura ambiente ou 30o C para isolamento primário Trinta e sete graus para obtenção do dimorfismo 4. PROCEDIMENTOS GERAIS 4.1. Escarro e secreções respiratórias: selecione as partes mais purulentas, sanguinolentas, caseosas e necróticas. Se a amostra é muito viscosa, deve-se 37 homogeneizar pela adição de NALC; NAOH e outros agentes de digestão química, usados para o processamento de espécimens suspeitos de tuberculose, não devem ser empregados. Prepare uma montagem úmida da amostra para realização de exame direto e inocule 0,5ml no meio de cultura empregado; como as secreções são freqüentemente contaminada com bactérias, meios contendo antibióticos devem ser empregados; uma cobinação de meios seletivos, tal como BHIA com cloranfenicol e cicloheximida, e não seletivos, tal como SABHI, devem ser utilizada. 4.1. LCR: as amostras podem ser centrifugadas a 1500-100g por 10 minutos e o sedimento inoculado sobre a superfície do meio de cultura não seletivo (SABHI); havendo pouca quantidade disponível, inocule no meio 3-4 gotas de espécimen clínico; montagens com tinta da china (nigrosina) devem ser preparadas quando o C. neoformans for suspeito; para preparar a montagem microscópica tanto uma gota do sedimento centrifugado quanto uma alíquota do material in natura devem ser misturadas a uma gota de tinta china sobre a lâmina; uma lamínula é aplicada e a preparação microscópica e examinada para a presença de leveduras gemulantes com cápsulas. 4.3. Urina: entorno de 10 ml de urina deve ser centrifugado e 0,5 ml de sedimento deve ser inoculado tanto em agar não seletivo (SABHI) quanto em meios seletivos (BHIA com cloranfenicol e cicloheximida); montagens diretas podem ser preparadas e examinadas microscopicamente para a presença de leveduras e hifas. 4.4. Pele, pêlos e unhas: escamas de pele, fragmentos de unha e fios de cabelos arrancados podem ser examinados em preparações microscópicas com KOH; o propósito do KOH é clarear ou macerar as estruturas proteináceas e escleróticas que podem dificultar a visualização dos elementos fúngicos (a maceração pode ser acelerada pelo rápido aquecimento da lâmina sobre a chama do bico de Bunsen); uma lamínula é aplicada e os espécimens são examinados para a presença de hifas estreitas e regulares que caracteristicamente se quebram em artrosporos; a visualização da hifa é melhorada pela adição de calcoflúor ao KOH (microscópio de fluorescência); em pêlos o arranjo dos esporos na superfície do pêlo (ectotrix) e intrapilarmente (endotrix) podem ser vistos; fragmentos de hifas podem ser também encontrados dentro dos pêlos; escamas de pele, fragmentos de unha e pêlo devem ser colacados diretamente sobre a superfície e dentro do agar mycosel com uma alça em “L”; as áreas inoculadas devem ser 38 examinadas em intervalos freqüentes para o desenvolvimento de colônias; as culturas devem ser mantidas por pelo menos 30 dias antes de descartar como negativas. 4.5. Tecido: o processamento dos espécimens de tecido pode ser feito a partir da trituração com gral e pistilo (não recomendável) ou a partir de cortes com tesoura ou bisturi estéreis; os fragmentos (1mm3) devem ser inoculados diretamente sobre o meio de cultura e abaixo de sua superfície; homogeneizados de tecido, medula óssea ou centrifugados de espécimens clínicos (5-10 ml) devem ser depositados sobre meios não seletivos (SABHI), já que esses espécimens são normalmente estéreis e meios com antimicrobianos não são necessários. 4.6. Sangue: frascos de hemocultura bifásicos (agar BHI e caldo BHI. 5. IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS 5.1. Fungos filamentosos a. Exame Macroscópico: A morfologia colonial deve ser interpretada com cautela, pois fatores como tipo de meio de cultura, temperatura de incubação e tempo de incubação interferem no aspecto macroscópico das culturas fúngicas. As características a serem investigadas são: • • • Textura: algodonosa; velutina; granular; pulverulenta ou glabrosa Topografia: rugosa; umbeliforme; umbilicada ou verrucosa Coloração: negra; cinza; branca; marrom; amarela; creme; laranja; verde; violeta ou vermelha b. Exame microscópico A observação da micromorfologia reprodutiva dos fungos filamentosos é a base do diagnóstico micológico. • Exame microscópico direto: um fragmento de cultura é retirado da colônia em tubo ou placa e montado sobre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado (lactofenol de Aman ou lactofenol com azul de algodão) e observado em microscópio óptico com objetivas de 10x e 40x e luz de baixa intensidade. O exame microscópico 39 direto é de preparação fácil e rápida e normalmente é suficiente para a identificação de muitos fungos isolados no laboratório. A principal desvantagem do método é a desorganização das estruturas morfológicas durante a preparação da montagem microscópica. • Microcultivo em lâmina: o cultivo de fungos em meios sólidos (agar de Sabouraud) ou líquidos (caldo de Sabouraud) depositados diretamente sobre lâminas e/ou lamínulas preservam as estruturas morfológicas, já que não se manipula diretamente os elementos fúngicos. A principal desvantagem do método é a demora no diagnóstico, pois há a necessidade de se esperar o crescimento da microcultura. A observação microscópica é feita como no exame direto. • Corantes: lactofenol com azul de algodão: fungos hialinos; lactofenol de Aman: fungos demáceos Métodos complementares para a identificação de fungos filamentosos Teste ou Procedimento Dimorfismo Aplicação Permite diferenciar os fungos dimórfico pela obtenção de sua fase leveduriforme ou de esférulas quando cultivados à tempratura de 37o C Fungos Blatomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Sporothrix schenckii Exoantígeno Permite a identificação específica de Blastomyces dermatitidis vários fungos por imunodifusão Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Permite diferenciar os fungos pela Fungos oportunistas: rápido velocidade des crescimento que Dermatófitos: intermediário apresentem Fungos sistêmicos: intermediário a lento Permite diferenciar as espécies patogênicas que apresentam habilidade de crescimento em temperaturas elevadas Absidia corymbifera: 45-50o C Aspergillus fumigatus: 48-50o C Cladosporium batianum: 41-43o C Cladosporium trichoides: 37-41o C Cunnighamella bertholletie: 41o C Cunnighamella elegans: 40o C Rhizomucor pusillus: 50-55o C Rhizopus microsporus: 45o C Rhizopus oryzae: 45o C Taxa de Crescimento Termo-tolerância 40 Continuação Teste ou Procedimento Resistência à Cicloheximida Aplicação Fungos Permite diferenciar as espécies Epidermophyton floccosum patogênicas a partir da capacidade de Microsporum spp. crescimento em agar mycosel a 30o C Trichophyton spp. Blatomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Sporothrix schenckii Permite diferenciar alguns fungos da Basidiobolus ranarun classe dos Zygomycetes pela produção Conidiobolus coronatus de esporos que são lançados violentamente e aderem na parede do tubo ou placa Permite diferenciar o Trichophyton mentagrophytes e o Trichophyton rubrum quando cultivados em fios de cabelo esterilizados por autoclavação em tubo ou placa T. mentagrophytes: perfurações cônicas no fio de cabelo, observadas em microscópio óptico T. rubrum: não produz perfurações no pêlo Demonstração de Balistosporos Perfuração do Fio de Cabelo Urease Permite diferenciar o Trichophyton T. mentagrophytes: urease positivo mentagrophytes e o Trichophyton T. rubrum: urease negativo rubrum quando cultivados em agar uréia de Christensen Permite diferenciar nutricionalmente T. tonsurans e T. violaceum: tiamina alguns membros do gênero Trichophyton T. equinum: ácido nicotínico quando cultivados em uma série de M. megninii: histidina meios com ou sem nutrientes agregados Permite diferenciar o Microsporum canis M. canis: crescimento e o Microsporum audouinii quando M. audouinii: sem crescimento cultivados em meios de arroz a 30o C Permite diferenciar o Trichophyton T. rubrum: pigmento cor de vinho rubrum do Trichophyton mentagrophytes M. persicolor: pigmento cor de rosa quando cultivados em agar batata T. mentagrophytes: sem pigmentos dextrosado ou agar milho com 1% de glicose e o Microsporum persicolor do Trichophyton mentagrophytes quando cultivados em agar peptona 1% Permite diferenciar a Wangiella spp. das Wangiella dermatitidis: negativo outras espécies de fungos dematiáceos Exophiala jeanselmei: positivo Permite diferenciar alguns patógenos Fonsecaea spp.: negativo dematiáceos de sapróbios quando Cladosporium spp.: positivo cultivados em caldo contendo gelatina a 11% Permite diferenciar alguns fungos Exophiala werneckii: positivo dematiáceos quando cultivados na Exophiala jeanselmei: negativo presença de 15% de NaCl Agares “Tricofitons” 1-7 Crescimento em Arroz Produção de Pigmentos Assimilação de Nitrato Proteólise Tolerância ao Cloreto de Sódio 41 5.1. Identificação dos fungos leveduriformes a. Exame Macroscópico É menos distintivo para as espécies de levedura. Também aqui a morfologia colonial deve ser interpretada com cautela, pois os mesmos fatores (tipo de meio de cultura, temperatura de incubação e tempo de incubação) que interferem no aspecto macroscópico das culturas filamentosas influenciam as características macromorfológicas das colônias levedudriformes. Normalmente, essas colônias têm uma aparência mucóide ou pastosa e uma topografia lisa ou rugosa. Como nas colônias filamentosas, diversas cores podem ser descritas, todavia, as colônias de coloração esbranquiçadas são as mais frequentemente encontradas. b. Exame Microscópico Por terem poucas estruturas micromorfológicas que permitam a identificação das espécies, o exame microscópico deve ser acompanhado de estudo do pefil biquímico. Empregando-se microscópico óptico, objetivas de 10x e 40x e luz de baixa intensidade, a observação microscópica pode ser procedida em preparações diretas e/ou em microcultivos corados com azul de algodão. Células de levedura, blastosporos, pseudohifas, clamidosporos, artrosporos e hifas vedadeiras são as estruturas visualizadas. Métodos de identificação de fungos leveduriformes Teste ou Procedimento Morfologia em Agar Milho Aplicação Permite a diferenciação micromorfológica de algumas leveduras a partir da produção em agar milho com tween 80 de blastosporos, pseudohifas, blastosporos, clamidosporos, hifas verdadeiras e/ou artrosporos Fungos C. albicans: pseudohifas, blastosporos e clamidosporos Candida spp.: pseudohifas e blastosporos Trichosporon spp.: hifas e artrosporos Geotrichum spp.: hifas e artrosporos Cryptococcus spp.: blastosporos Candida glabrata: blastosporos Saccharomyces spp.: blatosporos Hansenula spp.: blastosporos Tubo Germinativo Permite diferenciar a Candida albicans pela produção de tubo germinativo em 0,5ml de soro sanguíneo ou clara de ovo a 37o C por 1-3 horas C. albicans: tubo germinativo positivo 42 Continuação Teste ou Procedimento Tinta da China Aplicação Permite a diferenciação de leveduras patogênicas pela detecção de cápsulas em coloração de contraste com tinta da china de Permite a identificação definitiva das espécies de levedura a partir do de padrões de assimilação de açúcares obtidos em meios sólidos (YNB) Permite a diferenciação de espécies de levedura a partir de padrões de fermentação de açúcares obtidos em meios líquidos Permite a diferenciação de espécies de Cryptococcus pela redução do nitrato de potássio obtida em meios sólidos (YCB) ou pelo teste rápido da nitratoredutase Permite a diferenciação de espécies de leveduras patogênicas a partir da produção de urease verificada em agar uréia de Christensen, teste rápido da urease ou teste rápido urease -seletivo Permite a diferenciação de espécies patogênicas de levedura a partir da síntese de fenol-oxidase verificada pela produção de colônias negras ou marrons em agar semente de niger Permite diferenciar espécies de levedura pela produção de ascosporos em meio ascosporoindutor Fungos Cryptococcus neoformans: tinta da china positiva Assimilação Carbohidratos Tabela de valores: crescimento (+), sem crescimento (-) Fermentação Carbohidratos de Tabela de valores: produção de gás (+), sem produção de gás (-) Assimilação de Nitrato C. albidus e C. terreus: positivos Hidrólise da Uréia Cryptococcus positivo neoformans: Trichoporon spp.: positivo Detecção da Fenol-oxidase Cryptococcus positivo neoformans: Formação de Ascosporos Saccharomyces e ascosporo positivo Hansenula: 43 Continuação Teste ou Procedimento Crescimento a 37o C Aplicação Permite a diferenciação de espécies patogênicas de levedura pela demonstração de termotolerância em agar de Sabouraud a 37o C Fungos Candida albicans: positivo Cryptococcus positivo Saccharomyces positivo neoformans: Trichospporon beigelii: positivo cerevisiae: Geotrichum candidum: negativo Formação de Película Permite a diferenciação de espécies de levedura pela habilidade de formação de película superficial em caldo de Sabouraud Candida tropicalis: positivo Candida krusei: positivo Trichoporon spp.: positivo Geotrichum candidum: positivo 44 Fungos Leveduriformes (Cultura Pura) Tubo Germinativo + Tinta da China + Candida albicans Agar Milho (Micromorfologia) Blastosporos Pseudohifas, Blastosporos e Clamidosporos Pseudohifas e Blastosporos Hifas e Artrosporos Urease + Assimilação de Inositol + Assimilação de Nitrato + Rhodotorula (ausência de balistosporos) Candida albicans Ascosporos Assimilação de Carbohidratos + Candida spp. Assimilação de Carbohidratos Urease Geotrichum (ausência de blastosporos) Trichosporon (presença de blastosporos) + Assimilação de Carbohidratos Agar Semente de Niger + Assimilação de Carbohidratos Candida spp. Saccharomyces e Hansenula Candida glabrata Outros Padrões de Assimilação Assimilação de Carbohidratos Cryptococcus spp. (identificação final) Cryptococcus neoformans Cryptococcus spp. (identificação final) 5.3. Diagnóstico histopatológico Colorações úteis para o diagnóstico histopatológico das micoses Coloração Hematoxilina & Eosina Cor do Fungo Rosa a rosa azulado Vantagens Mostra a resposta tecidual; cora alguns fungos; não mascara a coloração natural fúngica; revela o fenômeno de SplendoreHoppli Limitações Muitos fungos são pobremente corados ou não se coram Gormori-Grocott Marron escuro sobre um fundo verde claro Os fungos são mais prontamente detectados Mascara a coloração fúngica natural e pode encobrir detalhes internos dos fungos; a resposta tecidual pode ser detectada Colorações Especiais para Fungos Ácido Schiff Periódico de Rosa avermelhado sobre um fundo verde Os fungos são mais prontamente detectados Mascara a coloração fúngica natural e pode encobrir detalhes internos dos fungos; a resposta tecidual pode ser estudada; muitos elementos teciduais também se coram Gridley Vermelho púrpura sobre um fundo amarelo Os fungos são mais prontamente detectados; detalhes morfológicos dos fungos visíveis são Mascara a coloração fúngica natural; fungos não viáveis no momento da fixação tecidual podem não ser corados Mucicarmin de Mayer Cápsula de Cryptococcus Permite a diferenciação do C. neoformans das outras leveduras Não é específica para C. neoformans e algumas células podem não se corar; o Rhinosporidium seeberi e o Blastomyces dermatitidis podem ser corados neoformans vermelha sobre um fundo púrpura 46 5.4. Diagnóstico imunológico Testes imunológicos para a detecção de micoses sistêmicas Fixação de Complemento Contraimunoeletroforese Ensaio imunoenzimático Anticorpo Fluorescente Teste de Ssensibilidade Aglutinação em Látex Micoses Sistêmicas Aspergilose Blastomicose Candidíase Coccidioidomicose Criptococose Histoplasmose Paracoccidioidomicose Esporotricose X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Precipitação em Tubo 47 Aglutinação em Tubo Prova do Ácido Nucléico Radioimunoensaio Imunodifusão Exoantígeno Cutânea (DNA) ASPERGILOSE a. SINONÍMIA: sem referência b. DEFINIÇÃO: a aspergilose é um espectro de doenças causadas por membros do genêro Aspergillus. A manifestação clínica e a severidade da doença dependem do estado fisiológico do paciente e da espécie de Aspergillus envolvida. Hospedeiros com resistência diminuída por doença debilitante, quimioterapia, perda da microbiota normal e imunocomprometimento pelo uso de antimicrobiano e esteróides podem predispor o paciente à colonização e/ou à doença invasiva. Aspergillus spp. são frequentemente patógenos secundários oportunísticos em pacientes com bronquiectasia, carcinomas, outras micoses e tuberculose. c. FORMAS CLÍNICAS: colonização; infecção; alergias e toxicoses. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: o prognóstico depende do tipo e da severidade da doença e também do status fisiológico do paciente. A aspergilose alégica se torna tipicamente crônica. Contudo, a colonização pode se manter crônica ou mesmo se tornar invasiva. A aspergilose alérgica tem sido tratada com sucesso com a predinisona, com cromoglicato de sódio e inalação de nistatina. O uso prolongado de esteróides nos caso de aspergilose crônica deve ser visto com cautela. Os aspergilomas podem ser tratados por ressecção cirúrgica e anfotericina B. A aspergilose infecção pode ser tratada com anfotericina B, porém os Aspergillus não são muito sensíveis nem a este antifúngico e nem à 5-fluorocitosina. Formas sistêmicas e meningíticas são geralmente fatais, mesmo depois de instituída a terapia. e. PATOLOGIA: a reação tecidual na aspergilose é representada por uma inflamação supurativa aguda com áreas de necrose isquêmica. O fungo prolifera como hifas septada com diâmetro 1,5 a 4,5 µm. As hifas podem apresentar caracteristicamente ramificações dicotômicas (aproximadamente 45o) com uma aparência geral de “exército em marcha”. As hifas podem se ramificar irregularmente e ter um aspecto similar a hifas encontradas nos zigomicetos. Cabeças aspergilares e micélio (aspergilomas) podem ser produzidas em cavidades pulmonares. Invasão de vasos sangüíneos, trombose, enfartamentos e disseminação são extremamente comuns. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: os materiais clínicos, tais como fluídos, escarro ou tecidos, são montados em KOH a 10%. Hifas septadas, hialinas, ramificadas e longas, medindo aproximadamente 3.0µm de diâmetro são observadas nas aspergiloses. A demonstração das hifas nos espécimens clínicos e a recuperação repetida da mesma espécie de Aspergillus em cultura é um forte indício de aspergilose. Deve sempre ser lembrado que um número de outros fungos pode ser morfologicamente idêntico ao Aspergillus no tecido. Em ocasiões raras, o micélio pode dar origem a corpos de frutificação (cabeçAqs aspergilares) e conídios na fase parasitária. Isolamento: o material clínico deve ser inoculado em SDA com cloranfenicol e incubados a 30o C. Os Aspergillus são sensíveis à cicloheximida, dessa forma, eles não irão crescer em meio que contenham este antifúngico. O descarte de culturas negativas deve ocorrer só depois de 4 semanas. g. MICOLOGIA: Aspergillus flavus; A. fumigatus; A. glaucus; A. nidulans; A. niger e A. terreus. h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais 49 BLASTOMICOSE NORTE AMERICANA a. SINONÍMIA: Doença de Chicago, Doença de Gilchrist.. b. DEFINIÇÃO: a blastomicose norte americana pode ser uma infecção benigna e autolimitada ou ainda uma micose crônica granulomatosa e supurativa, na qual a infecção primária é iniciada nos pulmões com freqüente disseminação para outros orgãos do corpo, especialmente pele e ossos. A doença é mais prevalente em homens de 40 a 60 anos de idade e em crianças. A blastomicose pode coexistir com carcinoma broncogênico, histoplasmose, doença pulmonar severa e tuberculose. c. FORMAS CLÍNICAS: crônica óssea; primária pulmonar e sistêmica. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a terapia é necessária. A anfotericina B é a droga de escolha. e. PATOLOGIA: a resposta do tecido é uma combinação de inflamação granulomatosa e supurativa aguda. Estas podem variar proporcionalmente de pessoa a pessoa e de um sítio anatômico para o outro no mesmo indivíduo. Os pulmões geralmente apresentam um processo inflamatório granulomatoso disseminado com pequenas áreas abscedadas. Os fungos são geralmente demosntrados nos bordos ou margens dos abscessos. O envolvimento cutâneo mostra uma hiperplasia pseudoepiteliomatosa com microabscessos focais nas papilas dérmicas. As células de levedura são globosas a ovóides com aproximadamente 8 a 15µm de diâmetro. Um simples blastosporos está unido à célula mãe por uma base de inserção larga. Na maioria das vezes, é visto predominantemente celulas simples sem a presença de blastosporos. A parede celular da levedura é espessa e duplamente refratária. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: o material clínicos, tais como fluídos prostáticos, escarros ou tecidos, são examinadso ao KOH a 10%. O fungo usualmente ocorre como uma levedura globosa de paredes espessas e refringentes que mede de 8 a 15µm de diâmetro, contudo, algumas leveduras podem apresentar um diâmetro de até 30µm. O fungo pode apresentar também células de levedura que têm menos do que 8µm. Cada blastosporo está ligado à célula mãe por uma base larga. Pelo seu tamanho, o Blastomyces dermatitidis, sob certas circunstâncias, pode ser confundido com o Coccidioides immitis ou Cryptococcus neoformans. Isolamento: inocular o material clínico em SDA com cloranfenicol, em agar 50 infusão de cérebro coração com cloranfenicol (BHIA), em agar extrato de levedura-fosfato e em um meio com cicloheximida e incubar a 30o C. As culturas devem ser mantidas por pelo menos 4 semanas antes de serem despresadas como negativas. O Blastomyces dermatitidis cresce melhor em agar extrato de levedura. Confirmação Laboratorial: a conversão da forma filamentosa à leveduriforme é necessária para assegurar que o fungo suspeito é o Blastomyces dermatitidis e não outro fungo similar, tal como o Chrysosporium ou o Sepedonium. A conversão do fungo pode ser prontamente acompanhada no agar de Kelley ou em agar sangue suplementado com vitaminas. Incubar os tubos inoculados a 37o C. A forma de levedura irá crescer dentro de alguns dias. g. MICOLOGIA: Blastomyces dermatitidis; Ajellomyces dermatitidis (forma sexuada). h. HABITAT NATURAL: America do Norte 51 BLASTOMICOSE QUELOIDIANA a. SINONÍMIA: Lobomicose, Doença de Jorge lobo. b. DEFINIÇÃO: a lobomicose é uma infecção cutânea crônica que se manifesta como quelóides, lesões verrucosas a nodulares, placas crostosas e tumores. O fungo cresce como células globosas que se conectam umas com as outras por uma base de inserção estreita. As células podem formar ainda cadeias ramificadas. As lesões desenvolvidas são bem definidas, macias, indolores e móveis, já que estas se encontram livres nos tecidos mais profundos. Lesões antigas tornam-se verrucosas e ulceradas com lesões satélites resultantes de autoinfecção. c. FORMA CLÍNICA: cutânea. d. Prognóstico e Tratamento: as lesões são tratadas por excisão cirúrgica, pois reincidências comumente ocorrem. Esta excisão deve ser ampla, o que pode resultar em novas cicatrizes. e. PATOLOGIA: os nódulos são formados por granulomas histiocitários subepidermais que se encontram sob a pele e o tecido subcutâneo. Tecido fibroso está disperso por entre um grande número de celulas gigantes e histiócitos. As células gigantes têm de 40 a 80µm de diâmetro. Nas lesões antigas, infiltrados piogênicos, paraceratose e acantose estão presentes. Hiperplasia pseudoepiteliomatosa e abscessos intraepidérmicos estão ausentes. O fungo ocorre como cadeias de células globosas de 7 a 14 µm de diâmetro. Cada célula está conectada à células adjacentes por uma base de inserção estreita. Algumas destas células ocorrem dentro de células gigantes e magrófagos, mas a maioria está entre elas. f. LABORATÓRIO: Exame direto: o material clínico, tecidos cutâneo e subcutâneo, é montado em KOH a 10% e examinado para a presença de cadeias de células globosas em forma de “limão” ou “ampulheta”. Isolamento: o fungo não tem sido cultivado. g. MICOLOGIA: Paracoccidioides loboi (ou Loboa loboi ). h. HABITAT NATURAL: desconhecido. 52 CANDIDÍASE a. SINONÍMIA: Candidose, Monilíase. b. DEFINIÇÃO: cadidíase é uma infecção micótica primária ou secundária causada por diversos fungos do gênero Candida. As manifestações clínicas podem ser agudas, subagudas, crônicas ou episódicas. A doença apresenta certa dificuldade de diagnóstico devido ao fato dos membros do gênero Candida serem também comumente recuperados de indivíduos saudáveis. c. FORMAS CLÍNICAS: alérgica; cutânea; mucocutânea e sistêmica. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: o prognóstico depende quase que inteiramente do tipo e da severidade dos fatores predisponentes e da subsequente forma clínica da candidíase. A nistatina é efetiva no controle do “thrush”, da doença cutânea, periníquea, doença esofagiana crônica, vaginites e infecções gastrointestinais. A anfotericina B pode ser usada topicamente e é a droga de escolha no tratamento da candidíase disseminada ou sistêmica e candidíase mucocutânea crônica. Aproximadamente 60% dos isolados de C. albicans recuperados de pacientes previamente não tratados são sensíveis à 5-fluorocitosina. A droga tem sido útil no tratamento da doença sistêmica. O teste de susceptibilidade e monitoramento dos níveis séricos da 5-fluorocitosina são obrigatórios quando este agente antifúngico é empregado. e. PATOLOGIA: a reação tecidual é inicialmente uma inflamação supurativa aguda seguida por uma reação inflamtória granulomatosa. A formação de abscessos é bastante comum. Blastosporos e pseudohifas são ambos vistos em secções teciduais. Essas formas são melhor visualizadas por colorações especiais, tais como PAS (periodic acid-Schiff) e GMS (Gomori menthenamine silver). Os blastosporos são ovóides e usualmente de 3 a 4µm de diâmetro. Algumas espécies de Candida podem produzir, sob certas condições, hifas verdadeiras. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: células de levedura gemulantes, de forma ovóide e com 3 a 7µm de diâmetro; pseudohifas; hifas verdadeiras são usualmente visualizadas nos espécimens clínicos montados em KOH a 10%. Pode ser extremamente difícil diferenciar a Candida sp. de fungos como Aspergillus, Trichosporon e Geotrichum porque eles são todos capazes de produzir hifas verdadeiras morfologicamente muito semelhantes. Tubos 53 germinativos e clamidosporos são observados em C. albicans. Isolamento: incubar o material clínico em SDA com cloranfenicol. Muitas espécies de candida (C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis) são sensíveis à cicloheximida. Meios com cicloheximida devem ser usados com cautela. Incubar a 30o C. O crescimento está presente em 1 a 5 dias. Fluido espinhal e sangue devem ser processados por filtração. Identificação: baseada na produção de tubo germinnativo, pseudohifas, hifas verdadeiras, clamidosporos, zimograma e auxanograma de carbohidratos, auxanograma dos compostos nitorgenados. g. MICOLOGIA: Candida albicans; C. krusei; C. guilhermondii; C. parapsilosis; C. pseudotropicalis; C. stellatoidea e C. tropicalis. h. HABITAT NATURAL: homem, animais, solo e vegetais 54 COCCIDIOIDOMICOSE a. SINONÍMIA: Febre do Vale de São Joaquim, Granulomatose Coccidióidica b. DEFINIÇÃO: a coccidiodomicose é uma infecção respiratória que apresenta resolução rápida. A micose pode se tornar aguda, crônica, severa ou fatal. A doença pode levar a uma condição pulmonar crônica ou disseminar para meninges, ossos, articulações ou tecido cutâneo e subcutâneo. A resposta tecidual inicial na doença disseminada é a supuração, contudo, a doença progressiva e crônica é caracterizada por uma reação granulomatosa com algumas áreas apresentando resposta celular mista. Acredita-se que o restabelecimento resulte em imunidade a reinfecção. Aproximadamente 60% dos pacientes com infecção primária são assintomáticos, 40% têm uma doença pulmonar moderada a aguda e entorno de 0,5% desenvolvem doença extremamente grave. Mais ou menos 15% dos pacientes com doença disseminada têm meningite. c. FORMAS CLÍNICAS: primária: pulmonar e disseminada. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a coccidioidomicose primária é tratada com repouso e restrição da atividade. Esteróides podem ser usados para controlar reações alérgicas. A doença secundária não tratada tem um prognóstico grave. A droga de escolha é a anfotericina B. A meningite usualmente requer adminstração intratecal e intravenosa de anfotericina B. A 5-fluorocitosina tem pouco valor no tratamento das coccidioidomicose. Alguns pacientes tratados com miconazole apresentam uma alta taxa de recorrência. e. PATOLOGIA: a reação tecidual é uma inflamação granulomatosa e supurativa aguda. A supuração aguda está usualmente presente entorno dos artrosporos e depois da ruptura das esférulas. Inflamação granulomatosa normalmente ocorre ao redor da esférula em cutânea; secundária: pulmonar e desenvolvimento. Hifas podem estar presentes na cavidade pulmonar e em lesões meningianas sem formar artrosporos, o que pode levar a confusões com hifas de Aspergillus. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: espécimens clínicos, tais como flúidos, escarro e tecidos, são examinados em KOH a 10%. Esférulas com paredes espessas (entorno de 1µm) de 30 a 60µm de diâmetro e endosporos de 1 a 5µm de diâmetro são característicos de Coccidioides immitis. Os endosporos são liberados quando a parede da esférula é rompida. Confusões 55 podem ser feitas com o Blastomyces dermatitidis se os endosporos não estão em grande quantidade dentro das esférulas. Isolamento: inocular o material clínico em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol e incubar a 30o C. As culturas devem ser mantidas por 4 semanas antes de serem descartadas como negativas. O fungo cresce muito rápido e prontamente produz artrosporos em forma de “barri” de 1,5 a 4µm e 3 a 6µm com uma célula dijuntora (sem contúdo citoplasmático) entre cada artrosporo. O C. immitis é um fungo perigoso e deve ser manipulado todo o tempo em cabine de segurança biológica classe II ou III. Confirmação Laboratorial: a confirmação laboratorial com C. immitis é necessária porque outros fungos, tais como os membros da família Gymnoascaceae, podem desenvolver anamorfos semelhantes ao C. immitis. Procedimentos laboratoriais incluem meios especiais para a conversão e também técnica de exoantígenos. Estudos com modelos animais podem ser necessários, em alguns casos. g. MICOLOGIA: Coccidioides immitis. h. HABITAT NATURAL: Solos alcalinos da américa do norte e latina. 56 CRIPTOCOCOSE a. SINONÍMIA: Blastomicose Européia, Torulose. b. DEFINIÇÃO: a criptococcose é uma doença crônica, subaguda a aguda pulmomar, sistêmica ou meningítica. A infecção primária ocorre nos pulmões após a inalação dos elementos fúngicos em suspensão no ar. A infecção pode manter-se localizada nos pulmõesz ou disseminara outros orgãos. Na disseminação, o fungo normalmente mostra predileção pelo sistema nervoso central. A infecção pulmonar primária não tem sintomas caracteríticos e, na maioria das vezes, é assintomática. A doença encefálica é a forma mais freqüentemente diagnosticada. c. FORMAS CLÍNICAS: encefálica; cutânea e mucocutânea; óssea; pulmonar e viceral. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: as lesões pulmonares localizadas em pacientes não imunocomprometidos têm um bom prognóstico, regredindo normalmente sem tratamento. A disseminação hematogênica para o SNC têm um mau prognóstico, a menos que seja tratada imediatamente. Infecções sistêmicas são usualmente fatais, especialmente em pacientes debilitados. Contudo, lesões primárias cutâneas ou mucocutâneas regridem espontaneamente. A doença crônica é caracterizada, na maioria dos vezes, por intervalos alternados de remissão ou exarcerbação, mas só eventualmente é fatal. A anfotericina B é a droga de escolha. Lesões pulmonares crônicas e lesões ósseas podem ser tratadas por excisão cirúrgica. Muitas amostras rapidamente desenvolvem resistência à 5-fluorocitosina durante a quimioterapia, por isso, testes de susceptibilidade são requeridos correntemente no tratamento das meningites. e. PATOLOGIA: a reação tecidual é inicialmente uma degeneração mucóide com áreas de inflamação, assumindo uma aparência gelatinosa. Grande número de células arredondadas são encontradas na matriz mucóide. Com o progresso das lesões, reação granulomatosa pode ocorrer. Os organismos decrescem numericamente e são normalmente encontrados em células gigantes e histiócitos. Com a resolução, os granulomas antigos apresentam células de levedura mortas com a cápsula desintegrada. Eles podem ser difíceis de serem vistos nas preparações corados pela H & E. As leveduras são redondas, tipicamente encapsuladas e com 5 a 15µm de diâmetro. Os blastosporos estão ligados por uma base estreita. As cápsulas se coram de rosa pela técnica de mucicarmin. 57 f. LABORATÓRIO: Exame Direto: células de leveduras globosas são facilmente visualizadas na maioria dos materiais clínicos (Líquido cérebro-epinhal e tecidos) montado em KOH a 10% ou em tinta da china (coloração de fundo). A cápsula pode estar ou não presente. Isolamento: inocular aspirados e tecidos (processado em homogeneizador) em SDA com cloranfenicol e incubar a 30o C. O C. neoformans é sensível à cicloheximida. O crescimento está presente em 1 a 5 dias. O líquido céfalo-raquidiano pode ser processado pela técnica da filtração ou centrifugação. Identificação: baseada na presença de cápsula, prova da urease, assimilação de acúcares e nitratos, crescimento a 37o C e patogenicidade para animais. g. MICOLOGIA: Cryptococcus neoformans (forma assexuada); Filobasidiella neoformans (forma sexuada). h. HABITAT NATURAL: fezes de pombos, solo e vegetais (eucalipto). 58 CROMOMICOSE a. SINONÍMIA: Cromoblastomicose, Dermatite Verrucosa Cromomicótica ou Cromoparasitária, Blastomicose Negra. b. DEFINIÇÃO: a cromomicose é uma infecção localizada crônica da pele e tecido subcutâneo que se segue a uma implantação traumática do agente. As lesões são verrucosas, ulceradas e crostosas, podendo ainda ser planas ou elevadas. Lesões satélites podem se desenvolver depois de auto-inoculações e por espalhamento linfático à áreas adjacentes. A micose usualmente se mantém localizada com extensa formação de quelóides. Depois de muitos anos as lesões podem lembrar a cabeça de uma “couve-flor”. Alguns agentes etiológicos dessa doença (Fonsecaea pedrosoi e Phialophora verrucosa) podem disseminar para o cérebro. Elefantíase e estase linfática podem também ocorrer como resultado de infecções bacterianas. c. FORMA CLÍNICAS: dermatite verrucosa; síndrome cerebral; cistos simples e múltiplos e lesões locais ou assintomáticas. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a infecção usualmente mantém-se localizada, mas disseminações hamatogênicas para o cérebro podem ocorrer com grave prognóstico. Estágios precoces de cromomicose são tratados com excisão cirúrgica, eletrodessecação ou criocirurgia. A anfotericina B e a 5-fluorocitosina usadas em combinação é a terapia de escolha. e. PATOLOGIA: as lesões de pele mostram uma hiperplasia pseudoepiteliomatosa hiperquerática e microabscessos queratinolíticos na epiderme. Hifas demáceas e corpos escleróticos ou muriformes são encontrados nas áreas de inflamação dérmica no extrato córneo. Os corpos escleróticos são redondos, de parede espessa, coloração acastanhada, asseptados, unisseptados e septados em dois planos e com 5 a 11µm diâmetro. Os abscessos cerebrais são bem demarcados pela espessa parede. Hifas demáceas irregulares estão dentro desses abscessos. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: em materiais clínicos como crostas superfíciais, montados em KOH a 10%, podem ser visualiszadas hifas ramificadas, septadas e escuras, com 1 a 5µm de diâmetro ao exame microscópio. Pús e tecido granulomatoso obtidos por 59 curetagem ou biópsia de tecido subcutâneo e pele contêm corpúsculos muriformes que são arredondados, demáceos, de parede espessa e com 5 a 11µm de diâmetro. Isolamento: inocular os espécimens clínicos em SDA com cloranfenicol e em meio contendo cicloheximida e cloranfenicol. Incubar a 30o C e descartar como negativas somente depois de 4 semanas. g. MICOLOGIA: (principais fungos): Cladosporium carreonii; Fonsecaea pedrosoi; Fonsecaea compacta e Phialophora verrucosa e Rhinocladiella aquaspersa. h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais. 60 DERMATOFITOSE a. SINONÍMIA: Tinha (Tinea) ou Ringworm. b. DEFINIÇÃO: O grupo de alterações cutâneas designadas como dermatofitose, ou mais correntemente como tinha, é considerado, de forma genérica, como um conjunto de lesões provocadas na pele, nos pêlos e nas unhas, independentemente do tipo clínico e da respectiva localização, por um grupo de fungos denominados de dermatófitos. c. FORMAS CLÍNICAS: tinea capitis; tinea barbae; tinea corporis; tinea manuum; tinea pedis; tinea cruris; tinea unguium; tinea favosa; tinea dos animais e favo dos animais. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: A doença tem um bom prognóstico. As lesões de pele podem ser tratadas com medicação tópica ou sitêmica. Quando pêlos e unhas são infectados, o tratamento sistêmico é preferível. Os derivados imidazólicos e triazólicos, a terbinafina e a griseofulvina são as drogas de eleição. A infecção normalmente está restrita à pele e seus anexos. Algumas formas regridem espontâneamente. e. PATOLOGIA: As alterações cutâneas apresentam-se de uma forma geral como pápulas, vesículas, deformações, destruição de pêlos e unhas, e descamação superficial. As lesões pápulo-vesiculosas tendem a se agrupar e adquirir aspectos figurados anulares ou policíclicos que constituem a impigem (lesões arredondadas de bordos elevados e eritematosos). Em regra, as lesões acantonam-se em áreas limitadas da superfície cutânea, mas eventualmente adquirem distribuição regional ou dispersa, e em casos mais raros, generalizam-se. Em determinadas circunstâncias, surgem na evolução das lesões, fenômenos inflamatórios mais ou menos intensos, particularmente nas áreas pilosas, com aparecimento de tumefação, nódulos e supuração que clinicamente são chamados de Kerion. A detecção de fluorescência nos pêlos parasitados pode ser feita utilizando-se uma fonte de radiação ultra-violeta (lampada de Wood). f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pele, pêlos e unhas, são montados em KOH a 10%. Hifas septadas e grande número de artrosporos estão presentes. O parasitismo dos pêlos pode apresentar um padrão ectotrix, endotrix ou endo-ectotrix de acordo com a localização extra ou intrapilar das estruturas fúngicas. Isolamento: Os espécimens são inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol 61 (mycosel) e incubados a 30o C. Colônias são observadas nos meios de culturas depois de 5 a 10 dias de incubação, mas são frequentes períodos mais prolongados. As culturas negativas devem ser descartadas somente após 4 semanas. Identificação: baseada em características morfológicas, prova da urease, provas nutricionais e perfuração do pêlo. g. MICOLOGIA: Microsporum spp.; Trichophyton spp. e Epidermophyton floccosum. h. HABITAT NATURAL: geofílicos, zoofílicos e antropofílicos. 62 ESPOROTRICOSE a. SINONÍMIA: sem referência b. DEFINIÇÃO: a esporotricose é uma infecção crônica caracterizada por lesões nodulares cutâneas ou subcutâneas com comprometimento de linfonodos adjacentes que supuram, ulceram e drenam. O espalhamento secundário para as articulações, ossos e músculos podem ocorrer. A micose pode, ocasionalmente, envolver o sistema nervoso central, pulmões, sistema genito-urinário ou todos os orgãos. Em caso de doença pulmonar, o fungo ganha entrada pela inalação de elementos fúngicos em suspensão no ar ou via traumatismo da pele. c. FORMAS CLÍNICAS: cutânea; disseminada; linfocutânea (linfangite nodular ascendente) e pulmonar. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a esporotricose linfocutânea, cutânea e mucocutânea são infecções crônicas. Disseminações são raras. O prognóstico da doença disseminada é grave e cura espontâneas são desconhecidas. Iodeto de potássio oral é usado em muitos casos. O tratamento deve ser feito por pelo menos 4 semanas para que ocorra a cura clínica. A anfotericina B é usada para o tratamento da doença linfocutânea reincidente, para a esporotricose pulmonar e para a doença disseminada. Outra droga com variado grau de sucesso terapêutico é a 5-fluorocitosina. Antibióticos são usados quando infecção bacteriana secundária está presente. e. PATOLOGIA: o padrão de infecção é caracteristicamente bem circunscrito e granulomatoso com área central de supuração aguda. Na pele esse modelo é similar ao que é visto na blastomicose e na coccidioidomicose. A demonstração do microrganismo é muito difícil no tecido, por não ser muito numeroso. O fungo é leveduriforme, globoso a ovóide, com 3 a 5µm de diâmetro e com múltiplos blastosporos. As leveduras não são encapsuladas. Corpos asteróides podem estar presentes e consistir de uma célula basófila, globosa a ovóide, de 3 a 5µm de diâmetro, com um raio eosinofílico de 10µm de diâmetro. Os corpos asteróides parecem ser mais comuns nas lesões secundárias do que nas primárias. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: de execução difícil. A técnica de anticorpos fluorescentes pode ser útil. A digestão pela diastase antes da coloração pela H & E ou PAS pode ajudar. Isolamento: inocular aspirados, material de curetagem ou “swabs” de lesões abertas em SDA 63 com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol. Incubar o meio a 30o C. O crescimento ocorre usualmente em três dias. Confirmação Laboratorial: a conversão da forma filamentosa em leveduriforme é necessária, já que outros fungos são morfologicamente semelhantes. O fungo deve ser transferido para o agar infusão de cérebro coração e incubados a 37o C em ambiente com 5 a 10% de CO1. g. MICOLOGIA: Sporothrix schenckii. h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais. 64 FEOHIFOMICOSE a. SINONÍMIA: Cisto Feohifomicótico, Feosporotricose, Cisto Micótico Subcutâneo. b. DEFINIÇÃO: a feohifomicose consiste de um grupo de infecções fúngicas caracterizadas pela presença de micélio septado demácea nos tecidos. As hifas podem ser curtas ou longas, tortuosas, entumescentes ou regularmente formadas, ou ainda, podem apresentar uma combinação de todas essas formas. Os fungos demáceos causadores da feohifomicose pertencem à classe dos Hyphomycetes, Coelomycetes, Ascomycetes, Blastomycetes e Deuteromycetes. c. FORMAS CLÍNICAS: cutânea; córnea; subcutânea e disseminada. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a maioria dos casos de feohifomicose pode ser controlada por excisão cirúrgica e quimioterapia. A anfotericina B e a 5-fluorocitisina são drogas de escolha. O miconazol pode ser útil em alguns casos. A invasão do cérebro tem um grave prognóstico. e. PATOLOGIA: a histopatologia varia bastante, indo desde reações teciduais associadas a abscessos até ativas invasões teciduais pela hifa. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pús e tecidos, são montados em KOH a 10% para exame. A natureza demácea do elemento hifálico é a chave para o diagnóstico da feohifomicose. A hifa pode ser variável ou regular em sua forma. Isolamento: os espécimens são inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol e incubados a 30o C. Todavia, muitos dos seus agentes etiológicos são sensíveis à cicloheximida. As culturas são descartadas como negativas em 4 semanas. O fungo isolado deve ser compatível com a doença clínica e a morfologia no tecido (demáceo). g. MICOLOGIA: (principais fungos): Cladosorium bantianum; Curvularia sp.; Drechslera sp. e Exophiala jeanselmei. h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais. 65 HIALOHIFOMICOSE a. SINONÍMIA: sem referência. b. DEFINIÇÃO: a hialohifomicose consiste de um grupo de infecções fúngicas caracterizadas pela presença de micélio septado hialino nos tecidos. Os fungos hialinos causadores da hialohifomicose pertencem à classe dos Hyphomycetes, Coelomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes e Deuteromycetes. Nos tecidos parasitados esses fungos apresentam morfologia semelhante, provocando o mesmo tipo de reação tecidual. c. FORMAS CLÍNICAS: cutânea; onicomicose; ocular; osteoarticular; meningítica; cerebral; pulmonar; cardíaca e septicêmica. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a doença em imunocomprometidos pode apresentar um prognóstico grave. Para o tratamento, pode-se usar a anfotericina B associada ou não à 5fluorocitosina. Derivados imidazólicos e triazólicos podem ser empregados. Interveções cirúrgicas podem ser procedidas nas formas localizadas. O uso de colírio de pimaricina pode ser empregado nos casos de ceratite. e. PATOLOGIA: a reação tecidual é bastante variada. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pús e tecidos, são montados em KOH a 10% para exame. A natureza hialina do elemento hifálico é um aspecto importamte para o diagnóstico. A hifa pode apresentar uma forma variável ou regular. Isolamento: os espécimens são inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol e incubados a 30o C. Todavia, muitos dos seus agentes etiológicos são sensíveis à cicloheximida. As culturas são descartadas como negativas em 4 semanas. O fungo isolado deve ser compatível com a doença clínica e a morfologia no tecido (hialino). g. MICOLOGIA: Acremonium spp.; Beauveria spp.; Fusarium spp.; Paecilomyces spp.; Penicillium spp.; Pseudoallescheria boydii e Scopulariopsis spp. h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais. 66 HISTOPLASMOSE AMERICANA a. SINONÍMIA: Histoplasmose Norte Americana b. DEFINIÇÃO: Aproximadamente 95% dos casos de histoplasmose são inaparentes, subclínicos e benignos. Cinco porcento têm uma doença pulmonar progressiva crônica ou uma doença sistêmica aguda fulminante. Todos os estágios dessa doença podem mimetizar a tuberculose. A histoplasmose pode coexistir com a actinomicose, outra micoses, sarcoidiose ou tuberculose. c. FORMAS CLÍNICAS: disseminada e pulmonar. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a doença disseminada, crônica cavitária, mucocutânea ou sistêmica requer terapia. A anfotericina B é a droga de eleição. A recuperação é rápida e essencialmente sem recaídas, se o tratamento adequado é instituido e o paciente não apresenta doença debilitante associada. e. PATOLOGIA: o quadro histopatológico na histoplasmose disseminada aguda é diferente daquele visto na doença mais crônica e nos nódulos pulmonares solitários. Na primeira entidade, o Histoplasma capsulatum está localizado nos histiócitos e nas células reticuloendoteliais. As células aumentam, mas sem evidências de inflamação. As leveduras gemulantes intracelulares são aproximadamente de 3µm de diâmetro e similares às da Leishmania spp., mas sem apresentarem os cinetoplastos. Em adição, as Leismania não se coram pelas técnicas especiais de coloração utilizadas para os fungos (PAS, GMS). Lesões antigas apresentam granulomas bem desenvolvidos e têm uma área central caseosa semelhante à tuberculose. Os nódulos pulmonares solitários são bem organizados e frequentemente têm um bordo de calcificação arredondado detectável ao raio-X de tórax. Os fungos no interior dos nódulos estão normalmente mortos. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: a detecção do fungo no material clínico, tal como medula óssea, escarro e tecidos, é usualmente difícil. O material corado pela técnica do PAS, Giemsa, ou GMS são superiores às preparações com KOH. Isolamento: inocular o material em SDA com cloranfenicol, em agar extrato de levedura-fosfato com cloranfenicol, em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol, em Sabhi com cloranfenicol e em agar sangue com cloranfenicol. Incubar as culturas a 30o C e não descartar com menos de 11 semanas. 67 Confirmação Laboratorial: a conversão das formas filamentosas em leveduriformes é necessária para assegurar que o fungo não é uma espécie de Chrysosporium ou Sepedonium. Transferir o fungo para um tubo teste contendo agar infusão de cérebro coração com vitaminas e incubar a 37o C. Técnicas de exoantígenos podem ser empregadas. g. MICOLOGIA: Histoplasma capsulatum; Ajellomyces capsulatus (forma sexuada). h. HABITAT NATURAL: solo com altos teores de nitrogênio (cavernas habitadas por morcegos e deltas de rios). 68 HISTOPLASMOSE AFRICANA a. SIMONÍMIA: Histoplasmose de Grandes Formas. b. DEFINIÇÃO: a histoplasmose africana é uma infecção micótica que envolve primariamente a pele, pulmão, figado, rins, linfonodos, tecido subcutâneo e ossos. Os ossos são os sítios mais frequentemente invadidos. O agente etiológico cresce como uma grande levedura dentro das células gigantes e também como células pequenas semelhantes àquelas vistas na histoplasmose clássica. Os aspectos clínicos primários da histoplasmose africana são representados por lesões nodulares, cutâneas ulceradas e osteolíticas que podem se disseminar ou se manter localizadas. c. FORMAS CLÍNICAS: disseminada e localizada. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: lesões isoladas podem ter cura espontânea ou requerer intervenção cirúrgica. A doença disseminada tem um prognóstico grave, especialmente se o pulmão e o baço estão envolvidos. A anfotericina B é a droga preferida. e. PATOLOGIA: pequena reação celular ao fungo é notada, com excessão do grande número de células gigantes (com até 80µm) e macrófagos. Neutrófilos estão usualmente presentes, especialmente durante a necrose. O fungo apresenta paredes grossas, são globosos a ovóides, têm de 7 a 15µm de diâmetro e podem formar pseudohifas rudimentares com 3 a 5 células. Grandes agregados de leveduras podem ser prontamente visualizados dentro das células gigantes e no espaço extracelular, juntamete com necrose do tecido do hospedeiro. Diferentemente do Blastomyces dermatitidis, os blastosoporos não estão unidos à célula mãe por uma base de inserção larga. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: espécimens clínicos, tais como tecidos, são examinados em KOH a 10%. Grandes células de levedura são prontamente observadas. Frequentemente o Blastomyces dermatitidis é confundido com o agente a histoplasmose africana, já que ambas ocorrem na África. Isolamento: inocular o material em SDA com cloranfenicol, em agar extrato de levedura-fosfato com cloranfenicol, em meio contendo cicloheximida e Sabhi com sangue e cloranfenicol. Incubar as culturas a 30o C e descartar como negativas depois de 11 semanas. Confirmação Laboratorial: a conversão da forma filamentosa à leveduriforme é requerida para assegurar que o fungo recuperado não é do gênero Chrysosporium ou 69 Sepedonium. Os agentes etiológicos da histoplamose clássica e da histoplasmose africana são morfologicamente idênticos a 30o C. A conversão das fases é feita em agar infusão de cérebro coração com vitamina, incubado a 37o C. g. MICOLOGIA: Histoplasma capsulatum var. duboisii (ou Histoplasma duboisii) e Ajellomyces capsulatus (forma sexuada) h. HABITAT NATURAL: solo 70 MICETOMA a. SINONÍMIA: Pé de Madura, Maduromicetoma, Maduromicose. b. DEFINIÇÃO: o micetoma é uma síndrome clínica caracterizada por tumefação, fistulação e granulação. Os micetomas são infecções localizadas que envolvem o tecido cutâneo e subcutâneo, fácias e ossos. As lesões consistem de abscessos, granulomas e fítulas (tratos sinuosos drenantes). Após a implantação do agente etiológico, a lesão primária torna-se localmente invasiva, indolente e tumefeita ou surge como um inchaço subcutâneo, indolor e pequeno que se torna flegmoso. A ruptura da lesão resulta em trato sinuoso, inchaço e deformação da parte do corpo afetada. Grânulos estão presentes no pús e no tecido entorno deste trato sinuoso. c. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: os micetomas causados por fungos (eumicetomas) são normalmente resistentes à quimioterapia. Drogas antimicóticas têm sido usadas em conjunto com cirurgias, com variado grau de sucesso. A amputação é geralmente a ação final. d. PATOLOGIA: as úlceras e tratos sinuosos abertos são envolvidos por bordas planas ou elevadas. Os abscessos são preenchidos com material piogênico e grânulos que freqüentemente são cobertos por um exudato. A parede do abscesso é formada por reação granulomatosa, inflamação crônica e tecido de granulação. e. LABORATÓRIO: Exame Direto: pús, exudato ou tecidos devem ser observados macroscopicamente para a presença de grânulos. Os grânulos são montados em salina estéril, comprimidos entre lâmina e lamínula e visualizados ao microscópio óptico. Os micetomas produzidos pelos actinomicetos (actinomicetomas) têm grânulos compostos por filamentos de 0,5 a 1,0µm de diâmetro e elementos bacilares e coccóides. Aqueles produzidos por fungos são formados por hifas de 1 a 5µm de diâmetro com células dilatadas intercalarmente. Isolamento: os espécimens contendo fungos são inoculados em SDA com cloranfenicol e incubados a 30o C. Os grânulos devem ser lavados em água destilada estéril ou salina estéril, ou ainda em solução antibiótica, antes da inoculação no meio. Alguns fungos são sensíveis à cicloheximida, por isso, meios contendo esse antifúngico devem ser empregados sempre em associação com meios livres de antimicrobianos. 71 f. MICOLOGIA: (principais fungos): Fungo Coloração dos Grânulos Acremonium falciforme Acremonium recifei Aspergillus nidulans Exophiala jeanselmi Leptosphaeria senegalensis Madurela grisea Madurela mycetomatis Neotestudina rosatii Petriellidium boydii Pyrenochaeta remoroi branco branco branco preto preto preto preto branco branco preto g. HABITAT NATURAL: solo e vegetais 72 PARACOCCIDIOIDOMICOSE a. SINONÍMIA: Blastomicose Sul Americana, Blastomicose Brasileira. b. DEFINIÇÃO: a paracoccidioidomicose é uma doença granulomatosa crônica que se origina como uma infecção pulmonar. A disseminação resulta em granuloma ulcerativo na cavidade nasal e bucal (estomatite ulcerada muriforme), e ainda, ocasionalmente, na mucosa gastrointestinal. Nódulos linfáticos são comumente envolvidos. A paracoccidioidomicose é frequentemente encontrada em associação com outras doenças, tal como chagas, infecções helmínticas, má nutrição, esquistossomose ou tuberculose. A infecção produz basicamente lesões na orofaringe, gengivas e, menos frequentemente, no trato digestivo e mucosa anoretal. c. FORMAS CLÍNICAS: disseminada; mucocutânea linfática e pulmonar. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: o prognóstico é similar ao de outras micoses sistêmicas. A anfotericina B é a droga de escolha. As sulfonamidas podem ser usadas no tratamento e controle de várias formas moderadas da doença. e. PATOLOGIA: áreas de inflamação granulomatosa apresentando regiões caseosas centrais e associadas a abscessos piogênicos estão usualmente presentes. Muitas células gigantes contendo o organismo compõem o granuloma. O fungo ocorre como uma levedura gemulante de paredes duplas e refringentes, medindo de 11 a 14µm de diâmetro. A célula central é circundada por numerosos blastosporos de variados tamanhos, ligados à célula mãe por base de inserção estreita. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: escarro, material de biópsia (base e margem externa das úlceras), crosta e pus (linfonodos supurativos) contêm as células de levedura. O material é montado em KOH a 10% para o exame. O fungo é caracterizado por múltiplas gemulações de pequenas células globosas (1 a 10µm de diâmetro) observadas entorno de uma célula madura globosa (30µm de diâmetro) de paredes espessas e refringentes, formando figuras denominadas de “roda de leme” ou “chapéu de mickey”. Isolamento: inocular o material clínico em BHIA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida. Incubar as células a 30o C e não descartar o material com menos de 4 semanas. As colônias podem necessitar de 10 ou mais dias para alcançarem 1cm de diâmetro. Confirmação Laboratorial: a 73 conversão da fase filamentosa à fase leveduriforme é necessária, já que o Paracoccidioides brasiliensis é geralmente estéril na forma filamentosa. Além disso, os conídios quando formados são muito semelhante àqueles encontrados no gênero Chrysosporium e Sepedonium. Inocular o fungo em Agar infusão de cérebro coração suplementado com sangue e vitaminas e incubar a 37o C. g. MICOLOGIA: Paracoccidioides brasiliensis h. HABITAT NATURAL: solo e vegetais 74 PITIRÍASE VERSICOLOR a. SINONÍMIA: Tinea Versicolor, Dermatite furfurácea. b. DEFINIÇÃO: a pitiríase versicolor é uma dermatomicose muito difundida em todas as partes do mundo. A doença é caracterizada pelo aparecimento de pequenas manchas bem delimitadas, de coloração variável, localizadas principalmente no pescoço, ombros, tronco e abdômen. A superfície das lesões podem se apresentar lisas ou pulverulentas. As manchas são de coloração amarelada ou parda, e raspando-as com a unha, nota-se ligeira descamação que constitui o chamado sinal de unhada ou sinal de Besnier. c. FORMAS CLÍNICAS: folicular; generalizada; inguinal; da face; do couro cabeludo; das mãos; circinada; pápulo-acromiante e pseudopapulosa. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: A pitiríase versicolor é assintomática, causando apenas incômodos estéticos. Os derivados imidazólicos e triazólicos são os de preferência de uso. e. LABORATÓRIO: Exame Direto: o material clínico, tal como as escamas epidérmicas, é montado em KOH a 10% para exame. A microscopia revela células de leveduras arredondadas com um aspecto de “botijão de gás” dispostas como cachos e formas filamentosas. As células apresentam brotamento polar e a célula mãe se separa da célula filha por um colarete ou pescoço bem nítido. Apenas com o exame direto é possivel fechar o diagnóstico. Isolamento: inocular as escamas epidérmicas em (SDA) acrescido de óleo de oliva (1%), bile bovina (3%), cloranfenicol (5mg%) e incubar a 37o C. f. PATOLOGIA: A principal característica clínica da doença são as manchas associadas à descamação furfurácea superficial. Lesões acromiantes, hipopigmentadas ou Sabouraud dextrose agar cicloheximida (50mg%) e hiperpigmentadas irão produzir manchas brancas, amareladas, cor de café com leite ou castanho escuro. O mecanismo patogênico dessa discromia continua por esclarecer, mas não parece que seja apenas devido ao efeito de “filtro solar” desempenhado pela descamação. Modificações do fenômeno de queratinização e dificuldades no transporte dos grânulos de melanina são observados. É possível que exista também uma ação sobre o próprio melanócito. Essas alterações são decorrentes da ação dos metabólitos do fungo sobre a fisiologia da pele. 75 Os achados histopatológicos revelam penetração folicular, hipergranulose sinais de dermite crônicas, hiperqueratose com vacuolização e acantose. Nas com lesões hipopigmentadas registram-se incontinência de melanina. Por vezes há inflamação perifolicular, outra vezes, há inflamação perivascular. g. MICOLOGIA: Malassezia furfur (Pityrosporum orbiculare) e Pityrosporum ovale. h. HABITAT NATURAL: microbiota da pele humana e couro cabeludo. 76 RINOSPORIDIOSE a. SINONÍMIA: sem referência b. DEFINIÇÃO: a rinosporidiose é uma infecção micótica das membranas mucosas caracterizada pelo desenvolvimento de pólipos. Os sintomas variam de acordo com o estágio de desenvolvimento do tumor e do sítio anatômico. Os pólipos são geralmente rosa ou púrpura e friáveis. c. FORMAS CLÍNICAS: cutânea; disseminada (rara); nasal e ocular. d. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: os pólipos são crônicos, mas indolores. A remoção cirúrgica e instilação local de anfotericina B são as formas de tratamento mais usadas. e. PATOLOGIA: grande número de cistos bem definidos estão logo abaixo do epitélio hiperplásico. O estroma é denso com infiltração crônica e microabscessos purulentos ocasionais. As esférulas alcançam um tamanho de 300µm de diâmetro e contêm grande número de endosporos que variam de 7 a 10µm de diâmetro na maturidade. A liberação dos endoporos produz uma reação inflamatória polimorfonuclear, formação de abscessos e algum tecido necrótico. Tecidos de granulação são normalmente proeminentes. f. LABORATÓRIO: Exame Direto: tecido macerado, excisado ou descarga nasal são montado em KOH a 10% para exame. Esférulas e grande número de endosporos estão presentes. Isolamento: o organismo não tem sido cultivado. g. MICOLOGIA: Rhinosporidium seeberi h. HABITAT NATURAL: águas paradas. 77 ZIGOMICOSE 1. Entomoftoromicose 1.1. Entomoftoromicose causada por Conidiobolus sp. (conidiobolomicose) a. DEFINIÇÃO: a infecção é um processo inflamatório crônico ou granulomatoso, restrita à mucosa nasal e caracterizada por pólipos ou massas subcutâneas limitadas e palpáveis. Os sintomas incluem inchaço nasal, começando nos ossos turbinados inferiores e que podem se estender por toda a região da orofaringe. As infecções são tipicamente bilaterais, mas podem ser unilaterais. As massas podem ser desfigurantes, palpáveis e ancoradas. A epiderme pode tornar-se acantonada (acantótica) e eritematosa. As pálpebras podem apresentar-se inchadas. O raio-x mostra antro opaco, obliteração dos espaços aéreos nasais e engrossamento da mucosa. Cerca de 80% dos casos ocorrem em homens. b. FORMAS CLÍNICAS: mucosa nasal, subcutânea c. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: a doença é relativamente benigna, algumas vezes cura espontaneamente. Iodeto de potássio e/ou anfotericina B são drogas de escolha. d. PATOLOGIA: as hifas são regularmente septadas com 4 a 10µm de diâmetro. Uma bainha eosinofílica com um arranjo digitiforme semelhante àquela encontrada na esporotricose, coccidioidomicose, blastomicose, paracoccidioidomicose e mais raramente na candidíase é observada. Invasão vascular está ausente. A reação celular pode ser aguda e/ou crônica. As reações inflamatórias crônica são granulomatosas com infiltrados contendo células gigantes do tipo corpo estranho e hifas fagocitadas. A reação aguda consiste de eosinófilo, linfócitos e células plasmáticas. Os eosinófilos podem originar abscessos eosinofílicos. e. LABORATÓRIO: Exame Direto: vesículas macias e/ou raspados de mucosas infectadas são montados em KOH a 10% e examinados para a presença de hifas septadas, largas e com paredes duplamente refratarias. Isolamento: incubar o material clínico em SDA com cloranfenicol e não usar meio contendo cicloheximida, já que o fungo é sensível a este antimicrobiano. Incubando a 30o C, o crescimento esta presente em 48 horas. f. MICOLOGIA: Conidiobolus coronatus 78 g. HABITAT NATURAL: solo 1.1. Entomoftoromicose causada por Basidiobolus sp. (basidiobolomicose) a. DEFINIÇÃO: A micose é uma doença inflamatória crônica ou granulomatosa, geralmente restrita ao tórax, costas, membros e nádegas. Ela é caracterizada por uma grande quantidade de massas subcutâneas não ulceradas, endurecidas e palpáveis. A doença ocorre principalmente em crianças com predominância de meninos. A micose começa como um nódulo subcutâneo. O inchaço é firme, bem circunscrito, sem dor e com algum prurído. A massa é palpável e unida a parte superficial da pele, mas não a fáscia. A pele é atrófica e descolorada ou hiperpigmentada. A massa aumenta de tamanho e pode envolver todo o braço, ombros, face, pescoço, pernas e nádegas. Comprometimento de orgãos internos têm sido relatado ocasionalmente. Leucositose de até 19.000 e eosinofilia de até 30% podem estar presentes. b. FORMAS CLÍNICAS: subcutânea c. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: O prognóstico é geralmente bom e a deformação corporal usualmente resolve. Iodeto de potássio e/ou anfotericina B são drogas de eleição. d. PATOLOGIA: Os processos patológicos são semelhantes aos observados na zigomicose por Conidiobolus coronatus. Todavia, os elementos hifálicos têm de 10 a 40µm de diâmetro e as hifas estão esparsamente dispostas no granuloma. e. LABORATÓRIO: Exame Direto: o exame de biópsia em KOH a 10% deve revelar hifas refringentes, septadas e largas. Isolamento: deve-se proceder como indicado para o isolamento do Conidiobolus coronatus. f. MICOLOGIA: Basidiobolus ranarum. g. HABITAT NATURAL: solo e fezes animais. 1. Mucormicose a. DEFINIÇÃO: As micoses causadas por membros da ordem Mucorales são geralmente agudas e desenvolvem-se rapidamente em paciente debilitado. A doença envolve áreas crâniorino-facial, pulmões, trato gastrointestinal, pele e menos comumente outros sistemas. A 79 doença esta associada com o diabetes descompensado em acidose (alteração na migração e fagocitose), má nutrição, pacientes gravemente queimados e outras doenças tais como leucemia e linfoma, ou terapia imunossupressora com o uso de citotoxinas e corticóides. Os fungos mostram uma predileção pelos vasos (artérias). A invasão resulta em embolias e necrose do tecido adjacente. Reações piogênicas supurativas podem ocorrer. As infecções são tipicamente agudas e fulminantes. A doença rinocerebral em pacientes com acidose usualmente leva à morte em poucos dias. b. FORMA CLÍNICAS: orbito-rino-cerebral; cutânea. c. PROGNÓSTICO E TRATAMENTO: o prognóstico é grave, especialmente quando áreas rino-cerebrais são envolvidas em pacientes com diabetes descompensado. A maioria dos caso de doença gástrica e pélvica são diagnosticados em autópsia. Muitos casos ocorrem em pacientes com leucemia ou linfoma. Esses são usualmente fatais. O controle da diabetes, o desbridamento cirúrgico dos tecidos envolvidos e o emprego da anfotericina B são recomendados. d. PATOLOGIA: a reação tecidual é normalmente leve. Inflamação supurativa aguda com áreas focais de inflamação granulomatosa predomina. As hifas variam de 6 a 50µm de diâmetro, são esparsamente septadas ou não septadas e irregularmente ramificadas. O organismo invade caracteristicamente a parede dos vasos sangüíneos adjacentes, produzindo trombose e infartamento, mas raramente disseminam através das vasos. e. LABORATÓRIO: Exame Direto: é crítico um diagnóstico rápido. Os elementos fúngicos são normalmente pouco numerosos nas supurações. Raspados dos ossos turbinados, material aspirado dos tratos sinuosos, escarro na doença pulmonar e material de bióspia montados em KOH a 10% contêm hifas de parede espessas refratárias com 6 a 15µm de diâmetro. Células entumescidas com mais ou menos 50µm e hifas distorcidas podem estar presentes. Isolamento: inocular o material clínico em SDA com cloranfenicol e incubar a 30o C. Meios contendo cicloheximida não são empregados porque esses fungos são sensíveis a este antimicrobiano. Fatias de pão esterilizado em tubos de ensaio podem ser úteis para a recuperação de zigomicetes quando outros meios falharem. Um tubo com pão esterilizado não inoculado deve ser usado como controle. toráxica; pélvica-abdominal e gástrica e 80 f. MICOLOGIA: Absidia corymbifera; Rhizomucor pusillus; Rhizopus oryzae; Rhizopus arrhizus; Cunninghamella bertholetiae; Syncephalastrum racemosum. g. HABITAT NATURAL: solo e vegetais. 81 BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA CLÍNICA Profa. Cintia de Moraes Borba, FIOCRUZ DEFINIÇÃO: É o conjunto de normas e procedimentos considerados seguros e adequados à manutenção da saúde em atividades de risco de aquisição de doenças profissionais (Hoefel & Schneider, 1997). LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS: COMO TRABALHAR COM SEGURANÇA? Em um Laboratório de Análises Clínicas muita atenção deve ser dada ao manuseio de material biológico, como excreções, secreções, enfim qualquer tipo de matéria orgânica úmida proveniente do corpo humano, até mesmo escamas secas de pele, pois estes podem conter agentes potencialmente infectantes. Nunca se deve assumir que as pessoas que trabalham em laboratório tenham conhecimento adequado sobre as práticas de segurança, individual ou coletiva, sendo portanto necessário treinamento constante. Mimica, 1997 descreve que a infecção adquirida a partir de materiais no laboratório pode não somente comprometer os funcionários do mesmo, mas também seus familiares, estudantes e outras pessoas que visitam suas dependências, e, às vezes, até mesmo de pessoas de laboratórios ou locais vizinhos. Assinala ainda que não é conhecida a real incidência de infecção adquirida no laboratório clínico. Nos Estados Unidos a incidência anual estimada é de 1,4 a 3,5 infecções adquiridas no laboratório em cada 1000 funcionários por ano. Como neste capítulo trataremos especificamente de fungos, toda a atenção será voltada a estes microorganismos. No caso de um acidente envolvendo fungos vivos, as seguintes normas gerais de segurança deverão ser cumpridas (McGinnis, 1980): a) Prenda a respiração e deixe a sala imediatamente, fechando a porta; b) Avise todas as pessoas do laboratório e não permita a entrada na área contaminad c) Descontamine o local do acidente (veja “O que se deve fazer em caso de acidentes”). 82 Collins, 1983 descreve que a exposição aos microorganismos, inclusive os fungos, pode ocorrer por: 1. Inalação de partículas fúngicas - pelo ar; após derramamento ou quebra de vidrarias; após remoção de buchas de algodão ou tampa de rosca; 1. Ingestão - por pipetagem com a boca; pela falta de lavagem das mãos após manuseio de culturas e/ou animais infectados; 3. Inoculação direta como resultado de acidentes com - agulhas; quebra de vidrarias; contato com a pele e subsequente entrada no organismo através de cortes e arranhões. NORMAS GERAIS PARA O TRABALHO NO LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS: 1- Todos os acidentes devem ser comunicados à Chefia; 1- Não fumar; 3- Não comer, nem beber; 4- Não aplicar cosméticos no laboratório; 5- Não usar lentes de contato. Em caso de necessidade, proteger os olhos com óculos de segurança; 6- Utilizar roupa de proteção de mangas compridas e de comprimento abaixo dos joelhos. Retirá-la caso saia do laboratório; 7- Lavar as mãos freqüentemente; 8- Usar luvas quando se manipular espécimens patogênicos, sangue, líquidos biológicos e animais infectados; 9- Não pipetar com a boca; 10- Evitar a formação de aerossóis durante os procedimentos técnicos; 11- Utilizar tubos com meio inclinado, sempre que possível, ao invés de placa de Petri para fungos patogênicos. Nunca usar placas para semear Coccidioides immitis, ou quando se suspeita deste (Larone, 1987); 11- Esterilizar materiais contaminados ou potencialmente infecciosos antes de serem lava- dos ou descartados. Esta esterilização pode ser química ou física; 13- Desinfetar regularmente as bancadas, os pisos, os equipamentos e outros materiais onde são manipulados materiais biologicamente perigosos, com hipoclorito de sódio a 5% diluído a razão de 1:10, recentemente preparado, para obter uma concentração final de 5g/litro de cloro livre, ou fenol a 5%. Sempre é bom lembrar que ambos são tóxicos e irritantes para a pele, os olhos e o sistema respiratório (Costa, 1996). Existem outros desinfetantes eficazes para fungos. Maiores detalhes, consulte Romão, 1996; 83 14- Fungos perigosos, tais como, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum entre outros, devem ser manipulados em cabines de segurança biológica Classe II ou III. Segundo McGinnis, 1980 acidentes envolvendo espécimens clínicos e fungos podem ocorrer dentro ou fora da cabine de segurança. Um acidente fora da cabine de segurança é mais difícil de administrar. O QUE SE DEVE FAZER EM CASO DE ACIDENTES: 1. Acidentes fora da cabine de segurança com espécimens clínicos e culturas de fungos que não são potencialmente perigosos: 1.1. Feche a ventilação da área e espere aproximadamente por 1h antes de entrar até que os aerossóis possam ser depositados; 1.1. Vista um jaleco de mangas compridas, máscara, e luvas de borracha; cubra o material clínico ou a cultura quebrada com hipoclorito de sódio a 5% diluído a razão de 1:50 para obter uma concentração final de 1g/litro de cloro livre, ou fenol (ácido fênico) a 5%; 1.3. Mantenha a área molhada com o desinfetante por aproximadamente 1h antes de limpá-la; 1.4. Todos os equipamentos contaminados ou potencialmente contaminados devem ser desinfetados; 1.5. Após a desinfecção do local do acidente, autoclave e descarte todos os resíduos. Se as mãos entrarem em contato com o material contaminado, lave-as com sabão e água, ou álcool isopropílico a 70%, ou ambos. 1. Acidentes fora da cabine de segurança envolvendo fungos perigosos: 1.1. Feche a ventilação da área e espere, aproximadamente, por 1h antes de entrar na sala; 1.1. Vista um macacão ajustado nos pulsos, respirador e cubra os sapatos. Coloque na área do acidente fenol a 5%, ou hipoclorito de sódio a 5%, diluído a 1:10. Espalhe o desinfetante ao redor do sítio do acidente, mas não diretamente sobre o derramado para não produzir aerossóis; 1.3. Coloque papel toalha embebido com desinfetante sobre o derramado por 1h. A descontaminação com formaldeído se faz necessária, quando se tratar de agentes do grupo de risco 3; 1.4. Autoclave todos os materiais contaminados durante o acidente; 1.5. Limpe os equipamentos e acessórios do laboratório com desinfetante. 84 3. Acidentes ocorrendo em uma centrífuga: 3.1. Prenda a respiração e desligue a centrífuga imediatamente e deixe a sala fechando a porta; 3.1. Comunique ao pessoal do laboratório e feche a ventilação da área; 3.3. Espere aproximadamente por 1h; 3.4. Vista roupa protetora, entre na sala e desinfete a centrífuga com hipoclorito de sódio a 5% diluído a 1:10 ou fenol a 5%; 3.5. Limpe os equipamentos e desinfete a sala; 3.6. Autoclave o material contaminado. 4. Acidentes dentro da cabine de segurança com fungos perigosos: 4.1. Deixe a cabine; 4.1. Vista luvas, esfregue todas as paredes, superfícies de trabalho e equipamentos com hipoclorito de sódio a 5%, diluído a 1:10 ou fenol a 5%, deixando o desinfetante em contato com as superfícies da cabine por 10 a 15 min.; 4.3. Autoclave as luvas e esponjas. 5. Acidentes ocasionando a contaminação do laboratorista: Passe no local material absorvente embebido em povidine e procure atendimento médico, no caso de contato com fungos. Porém, se o trabalhador tiver contato acidental, certo ou duvidoso com materiais biológicos humanos deverá ser submetido pelo menos à sorologia para AIDS, hepatite B e hepatite C, nos tempos zero (data do acidente), três e seis meses após o acidente. Os riscos de contaminação laboratorial variam de acordo com o tipo de agente manipulado. O Center for Disease Control (CDC) em 1988 elaborou normas de segurança a serem seguidas nos laboratórios. Nestas normas foram estabelecidos quatro níveis de biossegurança (NB-1, NB-1, NB-3, NB-4) de acordo com as classes de risco dos microorganismos. As classes são: a) Classe de risco 1- (baixo risco individual e baixo risco para a comunidade) - organismo que não causa doença ao homem ou animal; b) Classe de risco 1- (risco individual moderado e risco limitado para a comunidade) patógeno que causa doença ao homem ou aos animais, mas que não consiste em sério risco a quem o manipula em condições de contenção, à comunidade, aos seres vivos e ao meio ambiente. As exposições laboratoriais podem causar infecção, mas a existência de medidas eficazes de tratamento e prevenção limitam o risco, sendo o risco de disseminação bastante limitado; 85 c) Classe de risco 3- (elevado risco individual e risco limitado para a comunidade) - patógeno que geralmente causa doença grave ao homem ou aos animais e pode representar sério risco a quem o manipula. É um risco se disseminado na comunidade, mas usualmente existem medidas de tratamento e de prevenção; d) Classe de risco 4- (elevado risco individual e elevado risco para a comunidade) patógeno que representa grande ameaça para o ser humano e para os animais. Grande risco de contaminação para quem o manipula e com grande poder de transmissibilidade de um indivíduo a outro. Os fungos conhecidos se enquadram nas classes de risco 1, 1 e 3. Não existem fungos classe de risco 4. Os níveis de biossegurança (NB) de um experimento serão determinados segundo o organismo de maior classe de risco envolvido no experimento. Laboratório NB-1: é adequado ao trabalho que envolva agentes de menor grau de risco. Normas de biossegurança a serem seguidas: • treinamento específico do pessoal; • proibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos; • proibido guardar alimentos nas áreas de trabalho; • uso de pipetadores: é proibido pipetar com a boca; • uso obrigatório de roupas de proteção; • acesso restrito ao laboratório; • descontaminação das superfícies de trabalho e dos resíduos antes do descarte; • descontaminação dos resíduos, produzidos durante os trabalhos, antes do descarte; • retirada de materiais contaminados em recipientes rígidos e à prova de vazamentos; • superfícies resistentes a água, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, e ao calor moderado; • espaço suficiente entre as bancadas, cabines e equipamentos para permitir fácil acesso à limpeza; • controle rotineiro de insetos e roedores; • existência obrigatórioa de pia para lavar as mãos; • lavar as mãos antes de deixar o laboratório; 86 Laboratório NB-2: é adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado. Deve-se seguir as indicações para NB-1 e as normas específicas para NB-1 descritas abaixo: • • • • • • • • • • além de treinamento específico, deve haver supervisão competente einformação específica do risco; acesso limitado durante procedimentos operacionais; procedimentos que podem originar aerossóis infecciosos devem ser efetuados em contenção (cabines de segurança biológica); usar roupas apropriadas (jalecos, gorros, máscaras, etc.); a roupa protetora deve ser retirada antes de sair do laboratório e deixada na área de trabalho; laboratório sinalizado com: agente de risco, possibilidades de contato, aviso dos requisitos necessários para a entrada na área de trabalho, pesquisador responsável e endereço; proibida a entrada de animais não correlacionados ao trabalho; obrigatório o uso de luvas; descontaminação obrigatória do lixo antes do descarte; evitar o uso de objetos perfuro/cortantes; nunca separar agulha/seringa, bisturi/suporte; alocá-los em recipiente apropriado para descontaminação antes do descarte; • • cuidados especiais obrigatórios para evitar a formação de aerossóis; derramamento e acidentes devem ser imediatamente comunicados para manutenção de registro. Providências adequadas devem ser tomadas (descontaminação, atendimento médico, vigilância); • • • quando apropriado, amostras de soro referência do pessoal de laboratório devem ser mantidas e amostras adicionais colhidas periodicamente; manual de biossegurança específico deve existir e estar disponível; equipamentos de contenção devem ser usados (cabines de segurança biológica classe I ou II) sempre que houver o risco de produção de aerossóis (centrifugação, trituração, homogeneização, agitação vigorosa, ruptura por sonicação, abertura de recipientes contendo material sob pressão diferente da ambiental, inoculação intranasal em animais e em cultura de tecidos infectados); • normas específicas para a manipulação de volumes grandes (maiores de 10 litros) existem e devem ser seguidas; 87 • autoclave deve estar disponível para a descontaminação no interior ou próximo do laboratório. Laboratório NB-3: é aplicável aos locais onde são desenvolvidos trabalhos com agentes infecciosos classe de risco 3. Seguir as indicações para NB-1 e as normas específicas para NB-3 descritas abaixo: O laboratório deverá ter instalações específicas para o trabalho com agentes de NB-3. Para alguns casos, quando não existirem condições específicas para NB-3, particularmente em instalações laboratoriais sem área de acesso específica, ambientes selados ou fluxo de ar unidirecional, as atividades de rotina e operações repetitivas podem ser realizadas em laboratório com instalações NB-1, acrescidas das práticas recomendadas para NB-3 e o uso de equipamentos de contenção para NB-3. Cabe ao pesquisador principal a decisão de implantar essas modificações, comunicando-as a CIBio e CTNBio; • menores de 18 anos não poderão entrar no laboratório; • devem ser usadas toalhas absorventes com uma face de plástico voltada para baixo, recobrindo as superfícies de trabalho; • roupas de proteção de uso limitado ao laboratório devem ser usadas e descontaminadas antes de lavadas ou descartadas; • devem ser usadas máscaras faciais ou respiradores nas salas de manipulação de animais; • animais de laboratório em NB-3 devem ser mantidos em sistemas de confinamento parcial (sistemas de caixas com filtros e paredes rígidas ou sistemas de contenção de caixas equipados com radiação ultravioleta e refletores); • os sistemas convencioanais de caixas só poderão ser usadas quando todo o pessoal utilizar dispositivos e roupas protetoras; • todo o pessoal deve tomar banho ao deixar as áreas de trabalho; • as linhas de vácuo devem estar protegidas com filtro de ar com elevada eficiência (filtros HEPA-high efficiency particulated air) e coletores com líquido desinfetante; • cabines de segurança biológica (classes I, II, III) ou outra combinação apropriada de dispositivos de proteção pessoal e contenção física devem ser usadas para a manipulação de culturas e de material clínico ou ambiental, operações de desafio de animais, cultivo de tecido ou fluidos infectados de animais ou ovos embrionados, necrópsia de animais infectados; • o laboratório deverá estar separado de áreas de acesso comum. Deve ter sistema de dupla porta a partir de áreas contíguas; 88 • o laboratório com superfícies lisas e resistentes deve ser selado e sem reentrâncias; • próximo a saída deve existir uma pia com torneira de sistema automático de acionamento ou pedais; • as janelas do laboratório devem ser fechadas ou lacradas; • as portas devem possuir fechamento automático; • deve existir autoclave para descontaminação de resíduos, localizada no interior do laboratório ou em áreas contíguas, preferencialmente com sistema de dupla porta; • o laboratório deve ter um sistema de ar independente, com ventilação unidirecional, onde o ar penetre pela área de entrada. Não deve existir exaustão do ar para outras áreas do prédio. O ar exaurido não pode ser circulado e deve ser filtrado por filtro HEPA antes de eliminado ao exterior do laboratório. Deve haver verificação constante do fluxo de ar no laboratório; • o ar de saída das cabines de segurança biológica após passar por filtros HEPA deve ser eliminado para o exterior do edifício por sistema de exaustão; • o ar de saída das cabines pode recircular no interior do laboratório se a cabine for testada e certificada anualmente. Laboratório NB-4: é aplicável aos locais onde são desenvolvidos trabalhos com agentes infecciosos classe de risco 4. Seguir as indicações para NB-3 e as normas específicas para NB-4 descritas abaixo: • nenhum material deverá ser removido do laboratório de contenção máxima, a menos que tenha sido autoclavado ou descontaminado, exceção para materiais que tenham que sair viáveis; • material a serem usados no laboratório devem ser descontaminados em autoclave de dupla porta, câmara de fumigação, ou sistema de ante-câmara pressurizada; • material viável a ser removido de cabines classe III ou do laboratório deve ser acondicionado em recipeinte inquebrável e selado. Este, por sua vez, deve ser colocado dentro de um segundo recipiente que será desinfetado ou fumigado; • equipamentos que não resistam a temperaturas elevadas devem ser descontaminados por gases ou vapor em câmara específica; • somente os trabalhadores do laboratório podem ter permissão para entrar; • as portas devem ser hermeticamente fechadas e a entrada deve ser controlada; • deve-se avisar a todos aqueles que entrarem no laboratório do potencial risco e as medidas de segurança; 89 • deve haver um registro de entrada e saída de pessoal, com data, horário e assinaturas; • protocolos definidos para situações de emergência devem ser elaborados; • a entrada e a saída de pessoal do laboratório deve ocorrer após uso de chuveiro e troca de roupa. A roupa protetora utilizada para o trabalho deve ser descontaminada antes do descarte; • deve se organizar um sistema de notificação de acidentes e vigilância médica; • todos os procedimentos laboratoriais devem ocorrer em cabine de segurança classe III, ou classes I ou II usadas em associação com roupas de proteção pessoal com pressão positiva, ventiladas por sistema de suporte de vida; • o laboratório de contenção máxima deve estar localizado em prédio separado; • as paredes, tetos e pisos do laboratório devem ser construídos com sistema de vedação interna, para aumentar a eficiência da fumigação e evitar o acesso de animais e insetos; • as superfícies internas do laboratório devem ser resistentes a líquidos e produtos químicos; • sistema de drenagem do solo deve conter depósito com desinfetante químico eficaz, conectado a um sistema coletor de descontaminação. O sistema de esgoto e ventilação deve estar acoplado a filtros HEPA; • sistema de luz, dutos de ar e linhas utilitárias devem estar posicionados verticalmente para evitar acúmulo de poeira; • os líquidos liberados de chuveiros ou de sanitários devem ser descontaminados quimicamente ou pelo calor; • deve haver sistema de ar com pressão diferencial e fluxo direcional para assegurar o diferencial de pressão não permitindo a saída do agente de risco. Deve estar acoplado ao sistema manômetros com alarmes. COMO TRABALHAR COM AGENTES FÚNGICOS PATOGÊNICOS? COCCIDIOIDES IMMITIS (NB 3) . Fungo dimórfico . Fase micelial: hifas que se quebram em artroconídios . No tecido: esférula repleta de endosporos A coccidioidomicose é uma infecção respiratória benigna que pode se resolver espontaneamente ou progredir para uma doença sistêmica severa. Riscos laboratoriais: inalação de artroconídios e esférulas. A inoculação subcutânea da forma de esférula pode resultar na formação de granulomas locais que regridem espontaneamente. 90 Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 nas instalações laboratoriais e no trabalho com espécimens clínicos; identificação de isolados; processamento de tecidos animais e no manuseio de dejetos de animais, pois a urina pode conter o fungo. Nível de biossegurança 3 no trabalho com a fase filamentosa esporulada ou processamento de solo com suspeita de conter artroconídios. PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS (NB 1) . Fungo dimórfico. Fase micelial: hifas e clamidoconídios . Fase leveduriforme: elementos esféricos uni e/ou multibrotantes As manifestações clínicas resultam da inalação de elementos infectantes do fungo, com envolvimento dos pulmões, áreas mucocutâneas e outros órgãos. Riscos laboratoriais: com a fase filamentosa o perigo está em se inalar elementos infectantes. Com a fase leveduriforme o risco está na inoculação acidental do fungo. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 ao se trabalhar com espécimens clínicos, animais, culturas filamentosas e leveduriformes em meios ricos. nível de biossegurança 3 para a manipulação de culturas filamentosas em meios pobres e solo. BLASTOMYCES DERMATITIDIS (NB 1) . Fungo dimórfico . Fase micelial: hifas com conídios esféricos a ovais . Fase leveduriforme: células esféricas com unibrotamentos A blastomicose é uma doença crônica supurativa e granulomatosa. As manifestações clínicas podem ser: forma pulmonar, formas disseminada e cutânea. Riscos laboratoriais: inoculação de formas de levedura presentes em tecidos de animais e em espécimens clínicos. Outro perigo é a manipulação de culturas filamentosas. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 para o trabalho com animais, materiais clínicos e culturas leveduriformes. Nível de biossegurança 3 para o trabalho com culturas filamentosas, solo e outros materiais contendo conídios. HISTOPLASMA CAPSULATUM (NB 3) . Fungo dimórfico . Fase micelial: hifas com conídios de dois tipos, microconídios e macroconídios (tuberculados) . Fase leveduriforme: elementos ovalados com brotamento unipolar 91 . Nicho ecológico: solo e restos orgânicos contaminados com fezes de galinha, morcego e pássaros. A histoplasmose pode ser uma micose pulmonar aguda, subaguda, crônica ou sistêmica. Riscos laboratoriais: manuseio de culturas na fase filamentosa, processamento de solo contaminado e de material biológico. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 no manuseio de espécimens clínicos e no trabalho com tecidos animais. nível de biossegurança 3 na manipulação de culturas filamentosas identificadas como H. capsulatum e processamento de solo contendo conídios. CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS (NB 1) . Levedura patogênica . Aspecto parasitário: elementos esféricos com um só brotamento . Aspecto em cultivo: lêvedo unibrotante encapsulado A criptococose é uma micose que pode ser pulmonar ou disseminada. A partícula infecciosa, acredita-se ser propágulos de leveduras desidratadas e/ou basidiosporos que são inalados. Nos casos de exposição laboratorial o nível de patogenicidade para adultos imunocompetentes normais é baixo. Riscos laboratoriais: inoculação acidental de culturas e outros materiais contaminados, mordidas de camundongos infectados experimentalmente, manipulação de materiais ambientais infectados (ex: fezes de pombo) e contato com material contaminado com urina de animais infectados. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 para o trabalho com materiais clínicos, com culturas e com animais infectados experimentalmente. Cabine de segurança biológica classe II deverá ser usada durante o manuseio de solo e outros materiais contendo células de leveduras ou quando se trabalha com o estado perfeito do agente (Filobasidiella neoformans). SPOROTHRIX SCHENCKII (NB 1) . Fungo dimórfico . Fase micelial: hifas delicadas e conídios formando pequenos “bouquets” . Fase leveduriforme: elementos com forma navicular e de charuto, além de corpos asteróides O fungo vive na natureza, usualmente associado a vegetais, e é inoculado acidentalmente na pele ou tecido subcutâneo determinando as lesões nodulares. Ocasionalmente o fungo pode ser inalado causando a forma sistêmica. 92 Riscos laboratoriais: respingos de materiais de culturas nos olhos, arranhão ou injeção de material infectado na pele ou mordidas de animais infectados experimentalmente, manipulação de culturas ou necrópsia de animais. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 no trabalho com culturas e animais. Luvas deverão ser usadas. DERMATÓFITOS - EPIDERMOPHYTON, MICROSPORUM E TRICHOPHYTON (NB 1) . Aspecto em cultivo: hifas delicadas com macro e microconídios . Aspecto parasitário: hifas hialinas que podem se desarticular formando os artroconídios. As dermatofitoses são lesões da pele, pêlos e/ou unhas. Os dermatófitos são saprófitas do solo, onde vivem sobre restos de queratina. Riscos laboratoriais: contato com animais infectados experimentalmente ou naturalmente. Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 durante todo o trabalho. Usar luvas ao manusear animais experimentais. FUNGOS EM GERAL Segundo o CDC vários fungos têm causado sérias infecções em hospedeiros imunocompetentes que inalaram ou se inocularam acidentalmente por via subcutânea de fontes ambientais. Os agentes são: Cladosporium trichoides, C. bantianum, Penicillium marneffei, Exophiala dermatitidis e outros. Além destes, existem os Aspergillus fumigatus, A. flavus e Candida albicans que podem causar sérios problemas em humanos. Atualmente uma série de fungos estão surgindo como patógenos oportunísticos (Torres-Rodriguez, 1996). Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 ao se trabalhar com fungos que estejam esporulando ou ao se inocular animais experimentais. 93 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARON, E. J.; PETERSEN, L. R. & FINEGOLD, S. M. BAILE & SCOTT’S DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY. 9ª ED. ST. LOUIS, MOSBY, 1994 FISHER, F. & COOK,N. B. FUNDAMENTALS OF DIAGNOSTIC MYCOLOGY. 1ª ED. PHILADELPHIA. SAUNDERS, 1998. KERN, M. E. & BLEVINS, a K. S. MEDICAL MYCOLOGY. A SELF- INSTRUCTIONAL TEXT. 1 ED. PHILADELPHIA. F. A. DAVIS COMPANY, 1997. KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, & WINN Jr., W. C. COLOR ATLAS AND TEXT BOOK OF DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY. 5a ED. PHILADELPHIA. LIPPINCOTT, 1997. KONEMAN, E. W. & ROBERTS, G. D. MICOLOGIA. PRACTICA DE LABORATORIO. 3a ED. BUENOS AIRES. PANAMERICANA, 1987. KWONG-CHUNG, K. J. & BENNETT, J. E. MEDICAL MYCOLOGY. PHILADELPHIA. LEA & FEBIGER, 1991. MCGINNIS, M. R. HANDBOOK OF MEDICAL MYCOLOGY. NEW YORK. ACADEMIC PRESS, 1980. RIPPON, J. W. MEDICAL MYCOLOGY. THE PATHOGENIC FUNGI AND THE PATHOGENIC ACTINOMYCETES. 3a ED. PHILADELPHIA. LEA & FEBIGER, 1988. ROSE, N. R.; DE MACARIO, E. C.; FAHLEY, J. L.; FRIEDMAN, H. & PENN, G. M. MANUAL OF CLINICAL LABORATORY IMMUNOLOGY. 4ª ED. 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DE MICOLOGIA 13(S1): 30-38, 1996. 97 ANEXO: MODELO DE LAUDO MICOLÓGICO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE FARMÁCIA LABORATÓRIO DE MICOLOGIA CLÍNICA 33.663.683/0012CGC: 33.663.683/0012-79 Laudo No.: RESULTADOS Paciente: XXXXX Sexo: XXXXX Idade: XX Protocolo de Origem: XXXX Data de Entrada: XX.XX.XXXX Data de Emissão: XX.XX.XXXX Solicitante: Laboratório XXXXXXX Material Escamas de pele da região das costas e axilas Exame Micológico Direto Presença de hifas hialinas e ramificadas e cadeias de artrosporos compatíveis com dermatófito Cultura de Fungos Cultura positiva para Microsporum canis ________________________ Prof. Paulo Murillo Neufeld Chefe do Laboratório de Micologia Clínica Faculdade de Farmácia – UFRJ Farmácia Laboratório de Micologia Clínica – Faculdade de Farmácia - UFRJ Prédio do CCS - bloco A - 2o. andar - sala 025 Janeiro21941Ilha do Fundão - Rio de Janeiro-RJ - 21941-590 2562Tel/Fax (021) 2562-6421 98