1UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Departamento de Ciências dos Alimentos Bacharelado em Química de Alimentos Disciplina de Seminários Métodos rápidos de análise microbiológica Júlia Coswig Goldbeck Pelotas, 2008. 2 Júlia Coswig Goldbeck Métodos rápidos de análise microbiológica Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Química de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial da disciplina de seminários. Orientadora: Josiane Chim Co-Orientadora: Carla Mendonça Pelotas, 2008. 3 Agradecimentos À colaboração de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andréia Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientação, confiança e oportunidade de crescimento pessoal e profissional. À Profa. Dra. Miriam Galvão e Dra. Caroline Borges, pela orientação e conhecimentos transmitidos. Às orientadoras da referente disciplina, Prof a. Dra. Carla Mendonça e Profa. Josiane Chim. Aos amigos, e ao apoio e compreensão do meu companheiro de todas as horas, Wilson Colvara. Ao órgão apoiador de minha graduação, CNPQ, pela concessão de bolsa Iniciação Científica. " ( Jonathan Swift ) .4 “ A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e pensar no que ninguém pensou. fez surgir os métodos rápidos de análise microbiológica. Trabalho acadêmico. 32f. Os métodos rápidos possuem várias vantagens. porém. Júlia C. Alguns desses métodos já são aprovados pela AOAC. Sob visão geral. Quase todos os métodos rápidos são projetados para identificar um único alvo. sendo que os resultados são obtidos em alguns minutos. Os testes são similares no formato e desempenho e possuem de 90 – 99% de exatidão quando comparados a métodos convencionais. Bacharelado em Química de Alimentos. . o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. enquanto que resultados negativos são considerados confirmatórios. Métodos rápidos de análise microbiológica. segundos ou em algumas horas. facilidade de leitura e interpretação dos resultados. Os métodos rápidos são divididos em métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade. Universidade Federal de Pelotas. simplificação de tarefas. bem como. os métodos são projetados especificamente para identificar um grupo ou espécie bacteriana. como diminuição de custos para a empresa. 2008. Resumo A necessidade de rapidez dos resultados de análise.5 GOLDBECK. resultados positivos devem ser apenas presuntivos. ........................ 23 ...........................6 Lista de tabelas Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos encontrados no mercado................................ .... Figura 6 – Riboprinter® System da DuPont Qualicon................................ usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada. 26 Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose............................................................................................7 Lista de figuras Figura 1 – Microscópio fluorogênico............................................................................................ usado para contagem de microrganismos e conseqüente formação de colônias...................... Figura 5 – Bax® System.......... 29 ..................................... sistema automatizado de PCR real 28 28 time...... 18 18 Figura 3 – Reação antígeno anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA................ Figura 2 – Placas PetrifilmTM prontas para uso... .......1.............................. 3................... 3............. 3.............................8 Sumário 1 Introdução......................................3.......................................................................................................................2.. 3........2.......... 3.......2 Métodos imunológicos.............1....................1 Métodos convencionais x métodos rápidos.......................................................... 3...................1............. 3.............2 Técnica de epifluorescência direta........1 Métodos bioquímicos............. 3....................................................2..................................................................................................................... 3........3 Métodos moleculares... 3..1....2 Métodos para avaliar a inocuidade...1.................................1.....2.........2.......................... 3.............2....2 Imunocaptura............................ 3........................2.1............... 3.................3 Bacteriófagos com DNA modificado....................1................................................................................ 2...3 Técnica fluorogênica.......................................... 3..................................................................................2.................2 Reação de Polimerase em cadeia (PCR)...........................1...........................................2.........2.....2.......1 Métodos de contagem direta............2........................2......................2...2..................1 Ensaios imunoenzimáticos................................1 Sondas genéticas...............3 Imunoimobilização........................4 Ribotipagem. 3.......................1.................... 4 Conclusões ...................................................................................... 3..................2 Impedância/condutância........................................... 2 Métodos rápidos................................ 3 Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos........................4 Sistemas prontos para uso.........................................2........1 Bioluminescência...................................................3................2..............2 Métodos de contagem indireta...1....1 Técnica de membrana filtrante.3.........3 Placas SIMPLATE TM.................................... 10 12 13 15 15 15 15 16 17 18 19 20 21 21 22 22 22 22 23 24 24 24 26 26 26 28 28 30 32 .. 3.... 3... 3....2......2......................................... 3.....................2................. Referências................................................. 3................................................................ 3..4 Coaglutinação..........1 Métodos para avaliar a qualidade..1..1..............................................5 ELISA......... 3...........................................3................... Com o surgimento de alimentos . Após o período no qual o ser humano tinha a sua alimentação baseada apenas nos abundantes recursos da natureza. na história da humanidade. o homem passou a plantar. Introdução É impossível determinar exatamente quando. criar animais e produzir o seu próprio alimento. o homem tomou conhecimento da existência de microrganismos e da sua importância para os alimentos.9 1. e em nível internacional. Entre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um produto. em relação aos métodos convencionais. é necessário que os critérios de avaliação sejam claramente estabelecidos. Logo. como São Paulo. de alguns métodos rápidos empregados na análise microbiológica de alimentos. têm legislação própria. da Organização das Nações Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e através da comissão do Codex Alimentarius. Portanto. foi conhecer as características. padrões microbiológicos para alimentos são definidos em nível federal. ou métodos rápidos. por um programa conjunto FAO/WHO. ao quais vêm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade. 1999). bem como as vantagens e desvantagens. alguns estados de federação. aqueles desenvolvidos há muitos anos e que ainda vêm sendo empregados como métodos oficiais. pelo Ministério da Saúde sob RDC n° 12 de 02 de janeiro de 2001.10 preparados. Atualmente. sem dúvida. os mais importantes são. aqueles que diferem as suas características microbiológicas. o objetivo do presente trabalho. A avaliação microbiológica do alimento fornece informações que permitem avaliá-lo quanto às condições em relação à saúde da população. Para que a análise microbiológica seja conduzida de forma que os resultados obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado. Os critérios de avaliação são estabelecidos pela legislação de cada país. estão sendo atendidos adequadamente (FRANCO & LANDGRAF. principalmente pela conservação inadequada (FRANCO. nacionais ou internacionais. Em nível estadual. a análise microbiológica de um alimento pode ser realizada através dos métodos “convencionais”. como também é para observar se os padrões e especificações microbiológicos. . a análise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos estão presentes é fundamental. No Brasil. 1996). Esses critérios são definidos de modo a permitir uma avaliação segura e válida. devem ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). começaram a ocorrer os problemas relacionados com doenças transmitidas pelos alimentos e com a rápida deterioração dos mesmos. não somente para conhecer as condições de higiene de determinado produto. 1998). geralmente. São utilizados. como conseqüência da necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados analíticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL.11 2. Sob visão geral. como técnicas de seleção e a fim de garantir a segurança dos consumidores. Métodos rápidos Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70. a maioria desses métodos consiste em um dispositivo descartável que contém 15 a 30 meios ou carcaças. projetados . as avaliações dos mesmos. e Listeria. mostram que o bom desempenho desses métodos está relacionado com o tipo de alimento. gran negativas e gran positivas. como também Campylobacter. Isto pode ser atribuído. porém. Os testes são similares no formato e no desempenho e possuem exatidão de 90 – 99% quando comparados a métodos convencionais (FUNG et al.1 Métodos convencionais X métodos rápidos Os métodos convencionais recebem essa denominação porque foram desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados como métodos oficiais na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos. 2. Listeria. Porém. o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar rapidamente um grande número de amostras contaminadas por um determinado patógeno (YUSTE. muitos dos chamados “novos métodos em microbiologia de alimentos” nada tem de “novos”. Public Health . 2007). contagem de bolores e leveduras. é aconselhável executar estudos comparativos para assegurar a eficiência da análise (FRAQUEZA. monocytogenes (HAJDENWURCEL. 2002). 2000) A maioria dos testes são projetados para identificar/quantificar as bactérias entéricas. Ainda são poucos os métodos validados oficialmente para alimentos. detecção de Salmonella spp. Esses métodos estão internacionalmente descritos aceitos em e publicações recomendados consideradas pela American de referência. por isso.. bactérias anaeróbias. Os métodos rápidos mais encontrados no mercado são os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli. vários métodos alternativos de contagem têm sido proposto nos últimos anos. Os resultados com a utilização dos métodos rápidos podem se dar em alguns minutos. são na verdade resultados da transposição de métodos há muito tempo utilizados em outras áreas da microbiologia.12 especificamente para identificar um grupo ou uma espécie bacteriana. segundos ou algumas horas e. Quase todos os métodos rápidos são projetados para detectar um único alvo. 1998). na maioria das vezes devido à composição química do alimento. tem se observado que a área de métodos rápidos desenvolve-se de forma espantosa. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de análises microbiológicas. Menor tempo de retenção do produto na indústria. Visando minimizar estes problemas.1997). ou então o meio de cultura pode ser adicionado após a transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em profundidade). tétrades. pode-se enumerar: Redução do tempo de análise. . O método convencional de contagem de microrganismos consiste basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto homogeneizado e de suas diluições em meios de cultura sólidos. 1999). além disso. pelo International Commission on Microbiological Specification for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA). levando em consideração que: os microrganismos estão arranjados em pares. aumentando a produtividade laboratorial. cadeias e cachos. em face do alto volume de alimentos à disposição do consumidor em curto espaço de tempo (SILVA. levando a um falso resultado positivo.13 Association (APHA). Apesar da aparente simplicidade dessa técnica.. conseqüentemente. As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e temperatura adequada para a determinação a ser feita. o número de colônias que aparece na placa não corresponde ao número de células individuais presentes. quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver erros. Tais métodos também podem oferecer economia de espaço e materiais. sensíveis e específicos. Como vantagens dos métodos rápidos. surgiram os métodos alternativos (métodos rápidos). bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias. sendo a leitura dos resultados bastante difícil. durante a qual os microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis. ela é bastante trabalhosa e sujeita a erros. além de ser cansativa e imprecisa. adequadamente selecionados em função do microrganismo a ser enumerado. que apresentam a conveniência de produzirem resultados mais rápidos. mesmo quando contadores automáticos são empregados (SILVEIRA et al. que podem ser enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos (FRANCO. pois pode variar de acordo com o analista. 1996). se comparados às técnicas convencionais. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis (semeadura em superfície). aceitabilidade pelos órgãos oficiais. Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos Os métodos rápidos podem ser divididos em dois grupos: métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA. sendo que os resultados negativos são considerados como definitivos. Porém. Os métodos que avaliam a qualidade do alimento estão mais relacionados aos . assistência técnica dos fabricantes e disponibilidade de espaço no laboratório. tempo de análise. 2006). os métodos rápidos aprovados pelos órgãos oficiais podem ser utilizados somente para controle. Simplificação das tarefas envolvidos na análise. segundo Feng (1995). Facilidade de leitura dos resultados. custo.14 Diminuição de custos. simplicidade de operação. Especificidade. Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os métodos convencionais. ao se escolher e implantar os métodos rápidos deve se levar em conta parâmetros como precisão. Contudo. 3. mas resultados positivos são considerados presuntivos e devem ser confirmados por métodos padrões. 6x10 -3 UFC por membrana.1.1 Técnica de membrana filtrante Utilizada há bastante tempo para enumeração de coliformes totais. o que elimina a necessidade de diluição. para melhorar a filtrabilidade.1 Métodos de contagem direta 3. fecais e Escherichia coli em água. aqueles não patogênicos. sendo também aprovados diversos tratamentos enzimáticos que podem ser utilizados em função do tipo de alimento. Em seguida as membranas são transferidas para a superfície de placas contendo ágar ou cartões absorventes saturados com meio de cultura. já os métodos que avaliam a inocuidade. Após o tempo de incubação adequado para cada microrganismo. Permite a contagem de 1 até 1. . quantificam/identificam microrganismos patogênicos. faz-se a enumeração das colônias que surgiram na superfície das membranas.45µm) para retenção dos microrganismos presentes nessa mistura. por vezes não detectáveis em outras técnicas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas quadriculadas e pelo uso de contadores automáticos.1. coliformes totais. seu uso em alimentos é mais recente. porém.15 microrganismos deteriorantes. O uso de membranas Isogrid é aprovado pela AOAC para enumeração de bactérias totais. As colônias são coradas para facilitar a visualização. A mistura alimento-diluente é filtrada através de membranas filtrantes de acetato de celulose ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0. 3.1 Métodos para avaliar a qualidade 3. Microrganismos presentes em pequeno número. podem ser “concentrados” pela filtração de volume maior da amostra. A técnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens: Remove os componentes do alimento que podem interferir no crescimento microbiano (sólidos em suspensão ou agentes antimicrobianos).1. Escherichi coli e Salmonella. Essa membrana é então corada com fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de fluorescência. 2007). 2007). Injúria de bactérias devido ao calor pode alterar a fluorescência.apresenta algumas desvantagens: Técnica muito cansativa. que retém os microrganismos. Os microrganismos viáveis e não viáveis são enumerados por microscopia.1. Y. frutos do mar e outros têm apresentado ótimos resultados (MACHADO. A epifluorescência direta tem boa sensibilidade. perfringens. as membranas podem ser também utilizadas para a pesquisa de Staphylococcus aureus.1. resultante da concentração das células na superfície da membrana filtrante. parahaemolyticus.3 Técnica fluorogênica Os testes baseados na adição de MUG (4-metil-umbeliferil-β-D-glicuronideo) a um caldo de cultura para detecção de Escherichia coli. A amostra devidamente homogeneizada tratada com enzimas e tensoativos. são exemplos desta técnica. P. Tem sido bastante usada em leite.1. Essa técnica. farinhas vegetais. V. fluorescente quando observado . 3. porém. em função da fase de crescimento microbiano. A enzima β-glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse microrganismo transforma o MUG em umbeliferona.1. C. enterocolítica. pois o DNA e RNA corados apresentam fluorescência de coloração diferente.16 Além da aprovação oficial. As células viáveis apresentam fluorescência laranjaavermelhado. aeruginosa. Sua aplicação em alimentos como leite. O corante permite a diferenciação das células viáveis. 3.. condimentos. sendo uma das técnicas que oferece resultados mais rapidamente. bactérias gran negativas e estreptococus fecais. carne. se necessário. é filtrada através de uma membrana de policarbonato.2 Técnica de epifluorescência direta Técnica rápida de contagem de microrganismos que não depende de seu cultivo e conseqüente formação de colônias. O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes laboratórios (MACHADO. enquanto células mortas têm fluorescência verde. 4 Sistemas prontos para uso Existem diferentes sistemas disponíveis comercialmente. permite o cálculo do número mais provável de E. Figura 1 – Microscópio fluorogênico. com gás e fluorescentes após 24 ou 48h.1. Placas de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou fluorogênicos. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno. . 2008. 1 representa ilustrativamente um microscópio fluorogênico.Dispensa a preparação de meio de cultura.Emprega microplacas estéreis e prontas para uso. incubação e técnica de leitura para E. . . Fonte: Google imagens (Epifluorescência direta). .Resultados confiáveis. 3. recobertos de nutrientes desidratados e géis hidrossolúveis a frio.Identificação direta e enumeração de Escherichia coli ou enterococos em 36 horas (em comparação com 3 ou 4 dias usando métodos tradicionais). nos quais os meios de cultura já vêm prontos para uso.17 sob luz ultravioleta de onda longa. usado para contagem de microrganismos. usado nesta técnica para enumerar as células viáveis não viáveis. 2007). Entre esses.Rapidez e facilidade de usar. . Este método oferece como vantagens: .Economia de tempo e material. destacam-se as Placas de Petrifilm-3M. são filmes de papel quadriculado revestido com polietileno. coli e Enterococcus. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO. As placas PetrifilmTM são produzidas e comercializadas pela 3M. .Detecção da atividade de uma enzima específica de cada bactéria por microplaca. com princípios distintos.1. A observação do número de tubos turvos. A Fig. .Padronização do preparo. muitas vezes já na própria placa de petri. . 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno e. As colônias apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo microrganismo passa de incolor para vermelho. A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumeração de: bactérias aeróbias totais. Entre as vantagens desse sistema. em contato com os componentes da placa provoca a hidratação dos nutrientes e a geleificação da mistura. 2002). do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais. A água de diluição contida na amostra. sendo a incubação pelo período de 3-5 dias a 25°C (SANT’ANA. isto é. AZEREDO. coliformes totais e fecais. As placas Petrifilm são prontas para uso. Após a geleificação (1 min) as placas são incubadas na temperatura e tempo adequados. A exposição das mesmas a temperaturas superiores a 25°C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu desempenho. Obtenção rápida dos resultados. enterobactérias. Execução fácil e rápida. E. voltar o filme para a posição inicial e aplicar um difusor plástico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa. Leveduras e bolores podem ser enumerados. através de leve pressão manual. A Fig. leveduras e bolores e ainda bactérias láticas. Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo. . com exceção daquelas usadas para contagem de fungos. Custo baixo. antes do uso necessitam estar em temperaturas ambientes. que dispensa a necessidade de preparo de meios de cultura. como é observado o resultado final. CONCEIÇÃO. As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8°C.18 que na face voltada para o filme inferior é revestido por géis hidrossolúveis a frio e um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC). fazendo-se em seguida a enumeração de colônias. necessário incubar por 48 horas. Os agentes gelificantes são solúveis em água e a frio. em alguns casos. tem-se: Ser um sistema pronto para uso. basta erguer o filme superior e inocular 1mL do produto a ser analisado. respectivamente. coli. inclusive microrganismos. 2008. menor é o tempo de retenção. . 3. Placas PetrifilmTM prontas para uso. através de medidas de alterações físicas ocorridas durante este processo.1. 3. mais recentemente. Estas técnicas exigem a construção de curvas-padrão. inicialmente obtido da cauda de vagalumes ou extraído de peixes e.2 Métodos de contagem indireta Além das técnicas diretas os analistas têm a seu dispor diversas técnicas alternativas indiretas.19 Figura 2. Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm). é possível detectar a presença de até uma célula viável na amostra em teste (FRANCO et al. Nestas técnicas os microrganismos presentes são quantificados através da dosagem de determinados produtos metabólicos. nas quais se faz a correlação entre os parâmetros medidos e o número de células viáveis presentes. Através destas técnicas. obtido por manipulação genética de microrganismos.1. 1992).2. ainda. Uma das formas mais simples de se medir a quantidade de ATP é através do sistema luciferina-luciferase. desta maneira quanto maior for o nível de contaminação de um produto. que produzem quando se multiplicam nos alimentos ou. teoricamente.. O princípio básico é quanto maior o número de microrganismos presentes mais intenso é o fenômeno medido.1 Bioluminescência Esta técnica está baseada no princípio de que a quantidade de Adenosina Trifosfato (ATP) presente em um sistema está relacionada ao numero de células metabolicamente ativas. ATP reage com a enzima luciferase. baseadas na medição da atividade metabólica dos microrganismos nos alimentos. qualquer pessoa pode usar. um fluorímetro ou em um espectrofotômetro de cintilação líquida. - Fácil utilização.AMP + PP E . - Resultados em minutos.1. Essas alterações ocorrem como conseqüência da mudança da composição química desse meio devido à atividade metabólica dos microrganismos presentes. Reações que ocorrem durante o ensaio de bioluminescência. em contato com o oxigênio. 3.LH2 . - Medição exata da quantidade de ATP. A luz emitida pode ser medida em luminômetro. formando um complexo que. Uma das grandes aplicações dessa técnica é o monitoramento da eficiência de procedimentos de limpeza e higienização em plantas processadoras de alimentos (FRANCO.2 Impedância/Condutância São baseadas na propriedade que os microrganismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. podendo ser expressa através da seguinte reação: Mg+2 E + LH2 + ATP E . Esta técnica é bastante conveniente no monitoramento de programas de APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle).2. - Sistema portátil.LH2 . com emissão simultânea de luz.LH2 . LANDGRAF. 1996). LH2 = luciferina . Apresenta como vantagens: - Fácil leitura. fácil transporte.AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz E = enzima luciferase. E . sofre uma descarboxilação.AMP = complexo luciferaseluciferina-AMP Equação 1.20 na presença de luciferina e íons Mg ++. com valores máximos e mínimos. - Capacidade de armazenamento de dados (memória). - Não necessita adição de soluções. Durante a . ácidos graxos. o acúmulo desses metabólitos finais resulta em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio (SILVEIRA.1. 2006). moléculas grandes (proteínas. As placas são incubadas a 35ºC por 24 horas. A contagem de bolores e leveduras e bactérias mesófilas são realizadas enumerando-se as câmaras que apresentam fluorescência sob luz UV. Existem no mercado diversos “kits”.1 Métodos Bioquímicos São baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos.2. 2003). expressando-se o NMP. bolores e leveduras em alimentos. Escherichia coli.2 Métodos para avaliar a inocuidade 3. .g -1 ou mL-1 de alimento analisado (SILVA. carboidratos) são transformadas em moléculas menores (aminoácidos.21 multiplicação microbiana.3 Placas SIMPLATE TM Técnica alternativa para a enumeração de bactérias totais. 3. os quais se encontram na forma desidratada ou liofilizada. às quais se adicionam alíquotas da amostra em análise e o meio de cultura Simplate. Coloração púrpura indica presença de coliformes totais e fluorescência sob luz UV presença de Escherichia coli. coliformes. onde os testes são executados com pequenos volumes de meio de cultura. RABIT (Don Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments). quimicamente mais ativas. lipídeos. As placas são plásticas e apresentam 84 ou 198 câmaras. Após a incubação faz-se a leitura dos resultados. ácidos orgânicos). na maioria miniaturizados. e são reidratados pela adição de pequeno volume da amostra a ser testada. 3.2. O número de microrganismos é determinado através de uma tabela. São exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMéurieux). GALLO. em função disso. Existe no mercado um grande número de sistemas comerciais baseados em técnicas imunoenzimáticas. 2006). vêm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de alimentos.22 normalmente através de uma combinação de números obtida de acordo com o resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema.2 Métodos Imunológicos Esses métodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e. O tipo não competitivo. também conhecido como tipo Sanduíche. A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro.2. que age em reações que resultam no desenvolvimento de cor. 2006). A reação é baseada na ligação não covalente e reversível do antígeno com o anticorpo específico. no qual um desses reagentes é marcado com uma enzima.2. fica adsorvido a superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno.2.1 Ensaios imunoenzimáticos Nesses ensaios um dos reagentes. Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos encontrados no mercado . 3. antígeno ou anticorpo. 2007). 3. os quais podem ser poli ou monoclonais. conforme a Tab. Dois tipos de ensaios imunoenzimáticos são mais comumente utilizados: competitivo e não competitivo. 1. a seguir. é o mais utilizado nos sistemas de triagem de microrganismos patogênicos em alimentos (SILVEIRA. partículas metálicas revestidas de policarbonato e outras). normalmente cromogênica. Cada combinação de números corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO. ou seja. São baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos. placas de microtitulação. Os principais métodos imunológicos são descritos abaixo (SILVEIRA. Listeria-Tek.3 Imunoimobilização Nessa técnica. coli e E. Após a ligação com o antígeno específico. aureus- FABRICANTE Organon Teknika Tecra Via Unique Salmonella. 3.4 Coaglutinação . 3.2.2. ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Listeria. S. obtémse um produto concentrado que pode. nessa técnica os anticorpos ficam ligados a partículas metálicas recobertas com policarbonato. Tecra Difcro Oxoid Neogen Biocontrol bioMéuriex aureus Fonte: MACHADO. 3. Unique Listeria ECOLI Listeria Rapid Test REVEAL Listeria. 1996). Salmonella e E.2 Imunocaptura Também chamada de imunoseparação magnética. ou mesmo substituir a etapa de préenriquecimento. coli Vip E. bactérias móveis cultivadas em meio semi-sólido têm sua mobilidade bloqueada pela adição de anticorpos flagelares específicos. Essa técnica. permitindo que o restante do material seja removido.2.2.2. EHEC-Teck Listeria-Via. as partículas metálicas são atraídas por um imã. então.23 SISTEMA Salmonella-Tek. Após a retirada do imã. Salmonella-Via. EHEC-Via. coli VIDAS Siatema Salmonella. E. 2007. quando aplicada diretamente em alimentos pode reduzir.2. sempre necessária quando se pretende investigar a presença de microrganismos patogênicos em alimentos por métodos convencionais (SILVA. Há formação de uma banda de precipitação visível na interface anticorpo-bactéria. hormônios. específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. e do PCR.fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunológica. que detecta os ácidos nucleicos virais. que detecta proteínas do vírus. Depois é realizada uma lavagem com uma proteína inespecífica para que esta ocupe os poços livres. é possível utilizar o teste para se detectar outras substâncias de interesse como. podendo chegar a apenas duas semanas. O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpoantígeno. os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos como um dos antígenos do HIV .24 Essa técnica é baseada na aglutinação de partículas de látex sensibilizadas com anticorpos antitoxinas. Utilizando-se de um método semelhante ao método de Imunoradioensaio. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário. estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro. pode-se transformar muitas outras substâncias em antígeno e obter um anticorpo do mesmo. Este é o teste de primeira linha no diagnóstico da infecção pelo HIV vírus da SIDA/AIDS. por exemplo.2. no entanto. 3.a proteína p24 . Assim. o teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata. sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças infecciosas uma vez que vários agentes patológicos induzem a produção de anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfócitos B do sistema imunológico humoral humano. Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidas as proteínas de interesse. Também são conhecidas como reações de aglutinação de látex ou aglutinação passiva reversa.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos no soro. Um resultado positivo num teste de ELISA é sempre confirmado por outros testes específicos como é o caso do Western blot. Em seguida o produto . A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. O teste ELISA também pode ser utilizado de diversas outras formas.2. 2000). A figura acima. pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse (SIMERSKY.1 Sondas genéticas . Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e. 3.3. Fonte: Google Imagens (ELISA). medindo-se a intensidade da cor da superfície. mostra como é possível estabelecer a concentração do analito em questão. 2008. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reação específica entre o antígeno e o anticorpo.3 Métodos Moleculares 3. uma vez que. A concentração é obtida através de uma curva de calibração (Absorbancia x concentração). assim. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima cromogênica. Reação antígeno e anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA. a enzima cromogênica liga-se á enzima conjugada. menor é a concentração do analito. Figura 3.2. A Fig.2.25 é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. sendo porém inversamente proporcional a quantidade do analito. os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações (FUNG. Depois de extraído o DNA. há desenvolvimento de cor e.3. portanto. para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos). Normalmente o material extraído é o DNA (ADN). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão). 2007).2. a presença do microrganismo investigado é detectada (MACHADO. que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato. adicionam-se sondas. deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado sem danificá-lo.2 Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) É uma técnica muito utilizada em microbiologia para amplificação do material genético de microrganismos. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizada com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Toda esta mistura é colocada no termociclador. para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer. quando há hibridização com a sonda. que são fragmentos de DNA ou RNA específicos para o patógeno alvo. a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC. por pouco tempo. 3. normalmente cromogênicas e.26 Nessa técnica é necessário submeter os microrganismos a um tratamento em que seu material genético é liberado e separado em duas fitas simples. Em primeiro lugar. Na segunda etapa. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é . Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC. marcadas com enzimas. Em seguida. 2002). em seguida um novo ciclo é iniciado. baseado em DNA para análises microbiológicas de Salmonella. a técnica acima citada. Fonte: Google Imagens (PCR). O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida (figura 4).27 exponencial 2ciclo. Bolores e Leveduras. E. 5 mostra. 2007). flora acompanhante e outras variáveis têm as suas influências reduzidas a praticamente zero (YUSTE. Listeria Monocytogenes. Figura 4.sakazakii.sp. Eletroforese em gel de agarose. FUNG. Listeria. 2008. Campylobacter jejuni/coli. como na técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR). como por exemplo o Bax Sisten o qual é um sistema automatizado de PCR real-time. Roda de uma a noventa e seis análises por vez. . o que aumenta a capacidade e a estabilidade do método de uma forma única. pois as variações do meio. ou seja não há a necessidade de realizar uma eletroforese. onde a leitura é feita diretamente na tela do aparelho. Atualmente existem outras técnicas mais rápidas que a PCR.Coli 0157:H7. Enterobacter. com resultados disponíveis em cerca de 3 horas e meia. Essa técnica avalia a característica genética da bactéria. A Fig. ilustrativamente. 2. Como exemplo pode-se citar o Riboprinter® System da DuPont Qualicon é a única tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada. 3.28 Figura 5. Riboprinter® System da DuPont Qualicon. 2008.3. que passa a sintetizar proteínas especiais. . quando a amostra é resfriada adequadamente.4 Ribotipagem É feita em um equipamento sofisticado.2. os bacteriófagos se ligam a Salmonella e o material genético é introduzido na bactéria. Figura 6. sistema automatizado de PCR real time Fonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem). além de criar um banco de dados digital.3. na análise e comparação de DNA-RNA oferecendo assim. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter® System da DuPont Qualicon. 3. 2008.3 Bacteriófagos com DNA modificado Esses bacteriófagos carregam informação genética para a síntese de proteínas especiais. quando esse microrganismo está presente na amostra. Esse princípio é utilizado em um teste para Salmonella e. facilmente observada a olho nu (MACHADO. no qual bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de espécie. responsáveis pela formação de cristais de gelo. A formação dos cristais de gelo provoca alteração na coloração do meio. Virtualmente qualquer bactéria pode ser identificada por esse método. ou seja. O processo se baseia na ribotipagem. totalmente automatizado. Bax® System. A Fig. um alto poder discriminatório pela diferenciação em nível genético. Fonte: Google imagens (Ribotipagem). 2007). usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada. identificando a fonte e causa da contaminação de uma maneira direta e indubitável. já são encontrados no mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos. 1996). Logo. essas técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”. observou-se que o controle e segurança da qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados á indústria alimentar. 4. pois fornece um perfil genético de cada uma das bactérias implicadas. os .29 Com este equipamento é possível realizar a rastreabilidade completa do microrganismo em questão. hoje. devido à necessidade de rapidez de resultados. Conclusões A partir do estudo realizado. permitindo que as bactérias com o ribogrupo coincidente sejam identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al. porém. p. pois estas vêm crescendo. não só aos microbiologistas. Diário oficial da República do Brasil. possuem algumas desvantagens. placas petrifilm e placas simplate.30 mais usados na área da pesquisa são PCR. mas a todos da área de alimentos. substituindo. . estarem interados com essas novas técnicas. o ELISA. Regulamento técnico sobre padões microbiológicos para alimentos. em parte. n° 7. de 02 de janeiro de 2001. 2001. além de minimizar os custos de uma empresa. Os métodos rápidos possuem muitas vantagens. sendo de rápida e fácil leitura. Referências BRASIL. Brasil. No entanto. os métodos convencionais aplicados na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos. os resultados positivos ainda não são considerados confirmatórios. 46-53. como boa exatidão. Resulução RDC n° 12. como o elevados custo de algumas técnicas e mesmo aqueles já aprovados pela AOAC. torna-se imprescindível. Atlas de microbiologia de alimentos. D.ed.1. D. PELCZAR JR. 2.1. 2002. J. et al. Métodos de análise microbiológica de alimentos. 66 p. v. São Paulo: Fonte Comunicação e Editora. FRANCO. D. Rapid methods for detecting food borne pothogenes. M. 3. C.45-66. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology. 26. n. . G. v. Visão geral sobre novos métodos em microbiologia de alimentos.. 2-32. R. 1997. 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Report "Metodos Rapidos de Analise Microbiologica"