EXPERIMENTO 2METODOS CUANTITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS REQUISITOS Repasar las estructuras de los 20 L-α aminoácidos (AA), que forman las proteínas y las características de las proteínas. OBJETIVOS Identificar por métodos colorimetritos los 20 L-α aminoácidos (AA), que forman las proteínas, basados en las reacciones de los grupos R 1. FUNDAMENTOS Por la estructura peptídica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las proteínas pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinación cuantitativa y cualitativa de las proteínas. Por presentarse variaciones en la composición de los aminoácidos de las diferentes proteínas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reacción, íntimamente relacionado con la naturaleza de la proteína analizada. 1.1 1.1.1 Fundamentos químicos de las pruebas. Prueba de la ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno). Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo. La reacción se muestra en la figura 1 27 2 Prueba de Biuret Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas.3-dicetohidrindeno) CO C CO Ninhidrina CO H + NH2 2 H2O CO C OH OH (2-amino-1. La formación de un complejo de coordinación entre los cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas.3-dicetohidrindeno) CO C HN CO C OC OC (Ninhidrina-dicetohidrindeno) color violeta 1. 28 .Figura 1 Reacción de la prueba de la ninhidrina CO C CO OH R + H H C OOH Ninhidrina 2 H 2O Aminoácido N CH OH CO C CO N R CH C OOH CO C CO H N R C C OOH (BASE DE SCHIFF) R CO C CO N H2 H + C H H 2O O C O2 (2-amino-1.1. La positividad se manifiesta por la aparición de una coloración violeta. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula. 29 . triptófano). fenilalanina. se cree que ocurre cierta deshidratación de la molécula proteica.Figura 2 Reacción de la prueba de Biuret OH CO NH CO NH 2 OH 1.1. La positividad se manifiesta por la formación de un coágulo. se reconocen por la formación de una coloración negra o gris. como otros coloide son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio[NaCl. La figura siguiente muestra dicha reacción. 1. 1.1. (NH4)2SO4 y NaSO4 ].3 Prueba de coagulación: OH Cu NH2 HN K K 2H N NH2 CO OC OH Es una prueba para identificar: albúminas. 1. Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción.4 Prueba de Sulfato de amonio: Las proteínas. No se conoce exactamente el mecanismo de reacción.1.6 Prueba de los grupos SH: Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los contiene. seguida de agregación y precipitación. glutelinas y prolaminas. globulinas. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.5 Prueba xantoprotica: Es una reacción que reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico (tirosina.1. 7 (Negro) Prueba de Sakaguchi: Es una prueba para identificar arginina y se usa para identificar proteínas ya que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido.1. La reacción es la siguiente (figura 4) 30 R . El desarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina. La positividad se reconoce por la aparición de un anillo color violeta-rojizo.8 Prueba de Hopkins-Cole: Es para identificar el triptófano y las proteínas que lo contienen. que caracteriza la arginina. (Figura 4) Figura 4 Grupo guanidina NH H 2N C NH (Grupo guanidina) 1. Reacción de la prueba de los grupos SH CH2 CHNH2 COOH S CH2 CHNH2 COOH 2 NaOH CH2OH CHNH2 SNa2 + COOH (Serina (Lanteonina) O SNa2 + H3C H3C C O O O Pb SPb + 2 CH3COONa C (Acetato de plomo) 1.Figura 3.1. MATERIALES Y MÉTODOS 2. posiblemente se deba a la formación del complejo oxido de mercurio y fenol. dan positiva la reacción. fenol y timol. El mecanismo de la reacción es poco conocido. Cualquier compuesto fenólico no sustituido en la posición 3.1. como la tirosina. mechero y pinzas de madera 31 .1 Materiales Tubos de ensayo. 2.Figura 5 Reacción de la prueba de Hopkins-Cole O CH2 N (Triptófano) H2O H2SO4 O NH CH2 C H (alfa-iminoglioaxil-beta-indolpropíonico) 1.9 Prueba de Millón: CH NH2 COOH + C H COOH (Acido g O C H C COOH La reacción es debida a la presencia del grupo hidroxifenílico (-C6H4OH) en la molécula proteica.5. 2. 2. Deje enfriar y observe 2.2. Ninhidrina: (Hidrato de Sustancia problema tricetohidrindeno al 0. Observe si se forma un precipitado. 2. P. P. dependiendo directamente de la concentración de albúmina presente en la muestra. La reacción positiva se manifiesta por la formación de un precipitado.2. El color violeta indica la reacción positiva. Sustancia problema P. hasta la aparición de un color violeta... 2.m. Biuret: NaOH al 10 % Mezclar e ir añadiendo gota a gota el sulfato cúprico al 0. Coagulación Ácido acético al 30 % (CH3COOH) Solución saturada de Cloruro de sodio (NaCl) Mezclar bien y calentar a la llama por 1 min.4.21. observar.p.2. En el caso de la albúmina o la globulina se presenta un enturbamiento mas o menos intenso que persiste al enfriamiento. también puede observarse pequeños grumos en las paredes del tubo. Centrifugar a 3000 r. agitando después de cada adición.2.5 ml 32 .3.2. Observe el tubo sobre un fondo oscuro. P.5.1 %) Reactivo ninhidrina Calentar hasta ebullición por 1 min. azul o amarillo. Xantoprotéica Sustancia problema Ácido nítrico concentrado (HNO3) Mezclar bien Calentar a la llama y observar 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml 4 gotas 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 0.2 Métodos Prueba Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Volumen 2. Sulfato de Sustancia problema amonio (NH4SO4) Solución de Sulfato de amonio al 50 % Mezclar bien Dejar en reposo durante 10 min. Sustancia problema P. por 10 min.5 % (CuSO4). 2. Dibuje los 20 L.Cole (Preparación: 10 mg de magnesio en 250 ml de ácido oxálico. proteínas. Grupos SH Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH) Acetato de Plomo Mezclar bien Calentar a la llama por 4 min.9.AA y clasifíquelos según la polaridad de sus grupos -R. 4. Sustancia problema Reactivo de Hopkins. 5. Diga cuáles son los fundamentos químicos de las pruebas estudiadas. 33 . 4 gotas 3.6. P. AUTO-EVALUACIÓN. se completa a 1litro con agua destilada) Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Sakaguchi 2 ml 5 gotas 8 gotas 10 gotas 1 ml 2. 6.2. diga cuales pruebas y porque serán positivas.2.2. 1.7. P. cuantitativo.α. 3.Prueba 2.2. (ALAVAL-GLY-GLU-LYS) Defina los siguientes términos: aminoácidos. Cuales son las aplicaciones prácticas de las pruebas. Hopkins-Cole 3 ml 1 ml 2 ml 2. Efectué un enlace peptídico.8. Mezclando continuamente y observar Sustancia problema Hidróxido de sodio al 40 % (NaOH) Naftol Hipoclorito de sodio al 2 % Mezcal bien y observar. diluir con 2 volúmenes de agua la solución resultante. Millón Sustancia problema Reactivo de Millón (Preparación: Hg y HNO3 En una proporción de 1:3. Volumen 1 ml 1 ml 1 ml 2. P. P. observar. se deja caer lentamente por las paredes del tubo. análisis cualitativo. Para el siguiente pentapéptido. Xantoprotéica (+) Violeta Proteínas y polipéptidos P. polipéptido o aminoácido (+) Rojo o amarillo fuerte Hidroxiprolina o prolina Prueba Biuret (-) Azul o amarillo aminoácidos P. Hopkins-Cole (+) Azul o violeta Triptófano (-) Incoloro Tirosina o Fenilalanina P. Coagulación (-) Incoloro Otros aminoácidos (+) Amarillo.3 Marcha analítica SUSTANCIA DESCONOCIDA Prueba Ninhidrina (-) incolora No es proteína ni aminoácido (+) Violeta o amarillo claro proteína. metionina . naranja o verde Tirosina. Millón (+) Precipita Globulinas (-) No Precipita Albúminas Grupo SH (+) Rojo Tirosina (-) Incoloro Fenilalanina (-) Incolora Otros aminoácidos (+) Rojo Arginina 34 P. cistina. fenilalanina o triptófano (-) No cuagula Histonas. Sakaguchi (-) Incoloro otros aminoácidos (+) Negro o gris Cisteína. Sulfato de amonio P. protaminas o polipéptidos (+) Cuagula Albúminas o glubulinas P.2. 34 9.32 9.99 N H COO - 10.60 6.21 5.36 9.83 9.02 1.60 5.13 5.00 2.89 35 . Ala (A) 89 Valina. Val (V) 117 Leucina. Ile (I) 131 Prolina. Phe F 165 Triptofano.96 2. Pro (P) 115 CH3 CH3 CH CH3 CH3 CH CH3 CH3 CH2 CH CH3 2.30 Metionina. Leu (L) 131 Isoleucina.74 CH2 1.83 9.98 CH2 2.4. Trp (W) 204 CH3 S CH2 CH2 2.69 pI 6.62 5. ANEXO ESTRUCTURA Y ALGUNAS PROPIEDADES DE LOS AMINOACIDOS 4.36 9.60 6.48 CH2 N H 2.39 5.28 9. Met (M) 149 Fenilalanina.1 Aminoácidos no polares: Grupo R pKa' pKa' pKa' Nombre + Abreviación R α-COOH α-NH3 PM Alanina. Ser (S) 105 Treonina..33 5.11 10.97 CH2 OH 2.78 8.15 5.68 CH3 CH2 OH 2.13 5.34 pKa' α-NH3+ 9.07 2. Gly (G) 75 Serina.63 10.60 pKa' R pI 5.20 HO CH2 9. Gln (Q) 146 H pKa' α-COOH 2.02 8. Thr (T) 119 Cisteina.4.21 9.80 5.65 36 . Cys (C) 121 Tirosina. Asn (N) 132 Glutamina.17 9.0 CH2 SH 1.43 5. Tyr (Y) 181 Asparagina.41 2.71 10.07 5.66 O NH2 O NH2 C CH 2 CH2 C CH2 2.2 Aminoácidos polares: Grupo R Nombre Abreviación PM Glicina. 22 - O C CH 2 Aminoácidos Básicos: Grupo R pKa' α-COOH 2.82 9.67 4.19 CH2 9.74 NH2 NH2 C NH CH2CH2CH2 2.00 7.4.7 O C CH2 O 2.17 6.3 Aminoácidos acídicos: Grupo R pKa' α-COOH 2. Arg (R) 174 Histidina.17 9.4 O - 2.18 pKa' pKa' R α-NH3+ 8. Asp (D) 133 Acido Glutámico.25 3.48 10.95 pI Nombre Abreviación PM Lisina.09 pKa' pKa' R α-NH3+ 9.53 9. Glu (E) 147 4.76 CH2 HN + 1.8 NH 37 .82 3.04 12. Lys (K) 146 Arginina. His (H) 155 NH3 + CH2CH2CH2CH2 + 10.86 pHI Nombre Abreviación PM Acido Aspártico. Xantoprotéica P. sin anexar hojas. Hopkins-Cole P. Sakaguchi P. 38 . para reportar la positividad o negatividad de la reacción. coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego.5. En la casilla “N0 Muestra”. Sulfato amonio P. Ninhidrina P. N0 Muestra P. Use los signos (+) o (-). Complete el siguiente cuadro con la información deseada. Coagulación P. Biuret P. Sobre la base de los resultados de sus pruebas. Millón Nombre de la muestra problema Composición de la sustancia identificada Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la práctica. Grupos SH P. Ud. puede identificar la muestra problema y escribir la composición mas resaltante en las casillas correspondientes. INFORME 2 (PRUEBAS CUALITATIVAS PARA AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS) Nombres N° del mesón N° del estudiante Desarrollo Informe Definitiva Apellidos Grupo de prácticas Fecha Calificaciones Entrada 1.
Report "metodos cualitativos para la identificación de proteínas"