PRODUCCION DE METABOLITOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOSTEMA 6. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS Producción de metabolitos primarios y secundarios Metabolitos primarios…son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas aminoácidos, vitaminas, nucleotidos, alcoholes, ácidos orgánicos 1) Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. 2) Se producen como productos únicos 3) Son producidos por todos los microorganismos (son universales). 4) La producción no puede perderse fácilmente por mutación espontánea pigmentos 1) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados químicamente entre sí.Producción de metabolitos primarios y secundarios Metabolitos secundarios…. se producen cundo la velocidad de crecimiento es baja. 2) La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea 3) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos .. toxinas. alcaloides. no tienen pues una función esencial en el crecimiento antibióticos. latencia exponencial estacionaria Trofofase (metabolismo Primario) Idiofase (metabolismo secundario). Solo observado en algunos microorganismos muerte . 60% 1) Como aditivos de piensos y de alimentos 2) Potenciadores del sabor 2) Antioxidantes.Producción de metabolitos primarios: AMINOÁCIDOS Uso comercial de los aminoácidos …en la industria alimentaria ….. 3) Edulcorantes …en la industria química 25% 1) Manufactura de polímeros 2) Manufactura de pieles sintéticas 3) Fabricación de cosméticos 4) En la fabricación de herbicidas …en medicina . La glicina es convertida en serina. D. L-triptófano. . 1) Biotransformación directa. L-alanina. L que ha sido acetilada químicamente (met. L-metionina. ala. D. L-lisina) 2) Por conversión de un producto intermediario barato vía biosíntesis. Ej. Por producción microbiologica. L-tirosina). D.PRODUCCION DE AMINOACIDOS Extracción de aa de hidrolizados de proteínas. 3) Enzimas o células inmovilizadas producidas por microorganismos. L-glicina. L-leucina. D. gly). (L-cisteína. Por síntesis química. (L-glutámico. ejemplo: la amino acilasa específica de Aspegillus orizae para separar una mezcla de aa D. Regulación de la biosintesis de aminoácidos por retroalimentación (feedback) Glutamato ( Prolina ( ) Enzima activa Enzima inactiva Regulación de la biosíntesis de amino ácidos por represión Represor argR Inactivo Activo + arginina argC Promotor argB Genes estructurales argH ) . A A A () X A X X B B B C C A A C D A E G F P1 P1 P2 REGULACION POR ISOENZIMAS P1 P2 P2 REGULACION CONCERTADA REGULACIÓN ACUMULATIVA H P3 . ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION… 1) Alteración de la acumulación de productos finales Ornitina. Lisina. Valina Mutantes auxótrofos 2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación Lisina y Treonina.Metabolitos primarios… I. Isoleucina Mutantes resistentes análogos II.ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD… L-glutámico . Producción de metabolitos primarios I.ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION… 1) Alteración de la acumulación de productos finales se acumula un producto intermediario Enzima a A Enzima b B Enzima a A Enzima c C D E Enzima c Enzima d Enzima b B Enzima d C D E . ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION… 1) Alteración de la acumulación de productos finales Superproducción de L-ornitina por Corynebacterium glutamicum. Mutante auxótrofo para Arginina Glutámico N-Acetil-Glutamil-P N-Acetil Ornitina Citrulina Mutación N-Acetil Glutámico ARGININA Semiladehido N-Acetil Glutámico ORNITINA Arginosuccinato .Producción de metabolitos primarios I. Obtención de mutantes auxótrofos mutagénesis Etil metano sulfonato Medio mínimo +ARGININA MM+ ARGININA MM+ARGININA MM+ARGININA penicilina -ARGININA . ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION… 1) Alteración de la acumulación de productos finales se acumula otro producto final P1 A B P2 Superproducción .Producción de metabolitos primarios I. ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION… 1) Alteración de la acumulación de productos finales Ornitina. Lisina. Isoleucina Mutantes resistentes análogos . Valina Mutantes auxótrofos 2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación Lisina y Treonina.I. Producción de metabolitos primarios Biosíntesis de lisina en Escherichia coli ASPARTATO 3 aspartokinasa 1 2 ASPARTIL FOSFATO SEMIALDEHIDO ASPARTICO ACIDO DIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA TREONINA ACIDO DIAMINOPIMELICO METIONINA LISINA ISOLEUCINA . Producción de metabolitos primarios represión retroalimentación Biosíntesis de lisina en Escherichia coli ASPARTATO 3 aspartokinasa 1 2 ASPARTIL FOSFATO SEMIALDEHIDO ASPARTICO ACIDO DIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA TREONINA ACIDO DIAMINOPIMELICO METIONINA LISINA ISOLEUCINA . Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum represión retroalimentación ASPARTATO aspartokinasa Mutantes resistentes a AEC ASPARTIL FOSFATO SEMIALDEHIDO ASPARTICO ACIDO DIHIDRODIPICOLINICO Homoserina deshidrogenasa HOMOSERINA TREONINA ACIDO DIAMINOPIMELICO METIONINA LISINA ISOLEUCINA . Producción de metabolitos primarios Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum Características de los microorganismos superproductores de lisina: 1. Mutantes resistentes a AEC (s-β-aminoetil-L-cisteína). 3. Mutantes homoserina deshidrogensa hipersensible a la inhibición por treonina. NH2-(CH2)2-CH2-CH2-CHNH2-COOH Lisina NH2-(CH2)2-S-CH2-CHNH2-COOH S-aminoetil cisteina AEC .Mutantes con un bloqueo en la homoserina deshidrogenasa (auxotrofos de treonina. metionina e isoleucina) 2. retrocruzamiento con la cepa parental para mejorar su crecimiento .Mutantes regulatorios. Requerimiento nutricional de biotina . Deficiencia en la α–cetoglutarato deshidrogenasa 2. Incremento en la glutamato deshidrogenasa 3.Metabolitos primarios… II. Brevibacterium.ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD… L-glutámico Uso: potenciador del sabor Microorganismo: Corynebacterium glutamicum. Microbacterium y Artrobacter Características de los microorganismos superproductores de glutamato: 1. glutamato . ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD… L-glutámico NADPH2 COOH CH2 NADP CO2 COOH NADP HC-COOH HC-OH COOH isocitrato CH2 NH3 NADPH2 COOH CH2 CH2 CH2 Isocitrato Deshidrogenasa C=O Glutamato Deshidrogenasa (descarboxilación oxidativa) COOH (aminación reductiva) α-cetoglutarato HC-NH2 COOH glutamato .Metabolitos primarios… II. Succinato Succinil CoA α-cetoglutarato deshidrogenasa Isocitrato α-cetoglutarato NH4 Glutamato CO2 .Glucosa Metabolitos primarios… L-glutámico CO2 Pirúvico CO2 CO2 Enzima málica Acetil CoA Piruvato carboxilasa Citrato CICLO TCA Oxalacetato Malato sintasa Malato Acetil CoA Aconitato Glioxilato Fumarato Isocitrato liasa Isocitratp deshidrogenasa Descarbox. Biosíntesis de ácidos grasos Metabolitos primarios… L-glutámico Concentración de Biotina: 1-5 μg/ml: excreción de glutamato 15 μg/ml: (no hay excreción de glutamato) Acetil-CoA carboxilasa . D -------------Glutamato kinasa No glutámico pirrolina-S enzimatica semialdehido carboxilato deshidrogenasa reductasa Prolina .C ---------.B -------------------.Producción de metabolitos primarios Biosíntesis de prolina en Serratia marcensens L-Glutámico (1) (2) (3) ----------. 4-dehidroprolina Acido 4-tiazolidin carboxilico S Para superproducir prolina 1) Se aislaron mutantes resistentes a 3. se insertaron en un plásmido multicopia y se reintrodujeron en Serratia marcensens en cepas defectivas en la degradación de prolina .4-dehidroprolina. 2) Se inactivó el gen que codifica la enzima la prolina oxidasa.prolina 3. 3) Serratia marcensens se cultivo en medio con alta concentración de sales 4) los genes que participan en la biosíntesis de prolina se clonaron a partir de la cepa superproductora. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDO CON ENZIMAS… L-Aspártico Aspartasa L-Aspártico 1mM Acido fumárico + NH3 Keq =20mM Aspartasa L-Aspártico 2M ácido fumárico + 2M NH3 .