Medios de Cultivo microalgal

Folleto de Algas©Escuela Superior Politécnica del Litoral, 1994 Impreso en Ecuador Henry G. Alvarez Arellano 29 CAPITULO IV MEDIOS DE CULTIVO (Tomado de «Phycologycal Methods», by Janet R. Stein) Objetivos Después de estudiar éste capitulo el estudiante deberá estar en condiciones de: 1.-Saber preparar un medio de cultivo elemental para casos emergentes. 2.-Conocer los pasos a seguir para una buena limpieza de vidriería. Cristalería. Limpieza. Agua salada. - Método general depreparación . Esterilización en autoclave. Soluciones stock. - Recomendaciones. 3.-Saber preparar un medio enriquecido. Preparar una solución stock de macro o de micronutrientes. - Micronutrientes inorgánicos. 4.-Conocer los medios más usados en el cultivo de algas de agua dulce y de agaua salada. Cianocobalamina (Vit. B12). Biotina (Vit. H). Tiamina (Vit. B1). 5.- Saber como almacenar agua salada «cruda» y cómo remover materia orgánica disuelta del agua. 6.-Usar el autoclave en el proceso de esterilización de vidrios y de soluciones. 7.-Preparar una solución stock de trabajo. 8.-Preparar extracto de suelo, esterilizarlo y saber preservarlo. - Micronutrientes orgánicos: - Preparación del extracto de suelo. - Medios marinos enriquecidos: Medio Walne. Medio «f/2» Guillard. Medio Erdschreiber. - Preservación de cepas: 9.-Entender la técnica de liofilización en la preservación de cepas. - Liofilización. Sinopsis del capitulo - Bibliografía. - Medios para algas de agua dulce. - Materiales: Químicos. Esterilización. Cristalería. Procedimiento de lavado. Agua. Suelo. - Método de preparación. - Medios de cultivo definidos: Beijerinck. Bold Basal. Chu Nº10. - Recomendaciones. - Medios para algas marinas. - Materiales: Químicos. Equipos. - Miscelanea de preguntas. Medios para algas de agua dulce Entre las principales consideraciones a seguir están: El ph del medio. Las concentraciones de nutrientes primarios. La fuente de nitrógeno. Los posibles factores orgánicos o de crecimiento para el enriquecimiento. La composición de micronutrientes. Los medios de naturaleza artificial, de composición química conocida, son a menudo empleados como aditivos para medios naturales de composición química desconocida como es el agua de un río o de un lago. Estamos entonces ante medios de crecimiento enriquecidos (agua fertilizada), en donde se aspira a cumplir con los requerimientos nutricionales de una especie o grupo de algas de quienes no se conoce exactamente sus requirimientos. mixed ): Las alícuotas de estos stocks son medidos y agregados a un volúmen dado de agua dulce. Cristalería: Tubos de ensayo : De diferentes volúmenes. Fiolas: De diferentes volúmenes. Agua destilada para la preparación de stock. 2 H2O (para 100 ml / l ) 1. ClH ) Químicos: Enjuagar 3 veces con agua destilada Deben ser de buena calidad y evitar reactivos degradados o contaminados. Se disuelve a 95 grados centígrados y endurece a 45. Todas estas soluciones deben prepararse con agua destilada. El agua dulce a ser enriquecida debe ser esterilizada o debidamente filtrada.2 g / l 0. Preparar como la gelatina. Las precipitaciones. Las soluciones stock deben guardarse en frío o en recipientes de vidrio bien sellados para evitar evaporaciones. Suelo: Método de preparación Un medio de crecimiento es generalmente preparado a partir de soluciones stock ( pre . petri . con tapa rosca o algodón o tapones de neopreno. Agua: El agua para el medio de crecimiento puede ser filtrada con membrana si la condición del cultivo así lo requiere. quedando así preparado el medio.61 g / l . En algunos casos los componentes son agregados directamente al volúmen dado de agua dulce. (Ver preparación del extracto más adelante en este capítulo). Las alícuotas de estas soluciones son medidas y agregadas a un volúmen dado de agua. es agregado al medio que fue preparado antes de ser autoclavado. Las soluciones stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo.1 g / l Stock II PO4 H 2 K ( para 40 ml / l ) 9. Platos petri con tapa: No mantienen esterilidad por largo tiempo.Ej. igualmente tapados con algodón o tapones de neopreno. Beijerinck ( pH 6. En caso de usarse su extracto.30 Medios de Cultivo Materiales Lavar con solución ácida ( ej. En algunos casos los componentes indicados son pesados y agregados directamente al volúment de agua. 20 lb/inch2 por 20 a 35 minutos después que ha alcanzado la presión indicada en el autoclave. para lo cual se recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio. especialmente nitratos y fosfatos.dish y fiolas o vertir el agar esterilizado en cada recipiente asepticamente en los vidrios. Que no haya recibido pesticidas. 7 H2O Cl2Ca . Los procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones. Se gelatiniza a temperatura estable y su estructura es fuerte. Autoclavado: A 121 grados centígrados. Desorden en la aplicación de los componentes o alícuotas pueden causar problemas. El agar es usado para solidificar medios de crecimiento. Si el pH es muy ácido no hay que autoclavar.5 g / l 0. Es importante la exactitud en el peso de los químicos a ser usados.07 g / l Stock III PO4 HK2 ( para 60 ml / l ) 11. Esta esterilización puede ser con el agar ya puesto en tubos.2 g / l 0. No fertilizado reciente. El agar es un polímero neutral de galactosa de baja viscosidad cuando está diluído en agua .8 ): Se compone de 3 soluciones stock de macronutrientes y una de micronutrientes. Lavado de vidrieria: Agua de llave más detergente. Medios de cultivo definidos Los medios generalmente son preparados a partir de soluciones stock previamente mezcladas. Soluciones stock de macronutrientes TIPO CANTIDAD Stock I NO3 NH 4 PO4 HK2 SO4 Mg . Los vidrios deben estar esterilizados debidamente.Usar del 1 al 2 % de concentración del agar. Que se asiente al ser mezclado con el agua. el suelo debe ser: Poca cantidad de arcilla ( barro ). Poco contenido de humus. Se suguiere entonces autoclavar ambos por separado. A continuaciòn se describen tres medios de cultivo para algas de agua dulce: 1. Enjuagar en agua de llave. Seguir la secuencia propuesta para la mezcla. fodoficea bacilarioficea. La solución final debe tener un pH 6.) Clase de algas cloroficea cloroficea.10 g / l ( NO3 )2 Ca PO4 HK2 SO4Mg. 4 H2O Mo O3 SO4 Cu. 5H2O (NO3)2 Co. 7 H2O Cl2Mn . Chun Nº 10 (pH 6.04 g / l 0. Na2 SO4Zn . Bold Basal Trazas SO4Zn. 6 H2O Medios de cultivo y clases de algas cultivadas 3. 4 H2 O Mo7O24 ( NH4)6.7. Enriquecidos (Indef. 4 H2O 31 Solución stock CANTIDAD NUTRIENTE CANTIDAD ( para 1 ml / l ) 1g/l 0.5.025 g / l 0.49 g / l 3.025 g / l 0. Ellas pueden ser autoclavados o filtradas con membrana y agregadas asepticamente al medio esterilizado. 7H2O PO4HK2 PO4H2K ClNa ( para 60 ml / l ) 10 g / 400 ml 8 g / 400 ml 3 g / 400 ml 3 g / 400 ml 7 g / 400 ml 1 g / 400 ml Soluciones stock de micronutrientes TIPO CANTIDAD Los medios enriquecidos tienen la ventaja de soportar el crecimiento de un gran número de especies de algas. cianoficea cloroficea.8 g / l 1.6 ) o solución Bristol: Se compone de 1 solución stock de macronutrientes y 4 de micronutrientes. Si estos medios son muy orgánicos corren el riesgo de contaminarse con bacterias más fácilmente que los inorgánicos. 98 g / l 1g/l Medios definidos Boro BO3H3 ( para 1 ml / l ) 11. crisoficea.02 g / l 0. El nitrógeno generalmente se lo introduce como nitrato y a veces como amoníaco.42 g / l 1.15 g / l 5g/l 2. Vitaminas como cianocobalamina.57 g / l 0.0): Evitar pesos repetitivos.Henry G. cianoficea. 7H2O CO3Na2 SiO3Na2 Cl3Fe 0.8 g / l Recomendaciones Los micronutrientes se disuelven uno por uno en 100 ml de agua tibia.2 g / l 0.crisoficea. Un medio definido puede transformarse en indefinido si se le hacen modificaciones. Beijerinck 2. Bold Basal ( pH 6. 5H2O EDTA . Chu Nº 10 8.5 .crisoficea. El hierro precipita en pH 7 2. Alvarez Arellano Solución stock de micronutrientes TIPO Micronutrientes BO3H3 SO4 Cu . Este es un medio natural complejo provisto de más de 50 elementos conocidos (componen- .44 g / l 0. ya que cuando las bacterias están presentes (cultivos clonales) pueden suplir vitaminas directamente al cultivo. luego el pH se ajusta a 5 con KOH granulado. 7 H2O SO4 H2 ( para 1 ml / l ) 4. cianoficea. Solución stock de macronutrientes TIPO CANTIDAD Stock I NO3Na Cl2Ca. Las vitaminas son importantes en los cultivos axénicos (libre de bacterias). Ellas son usadas en muy bajas concentraciones y almacenadas en solución stock a temperatura de congelamiento. A continuacion se indican las clases de algas que han sido cultivadas con éxito en los medios citados: EDTA Na2 EDTA Na2 KOH ( para 1 ml / l ) 50 g / l 31 g / l Hierro SO4Fe. biotina y tiamina son requeridas por muchas algas cuando crecen en cultivos axénicos. 2 H2O SO4 Mg. rodoficea Medios para microalgas marinas El agua de mar es de por sí un medio propicio para el crecimiento de algas. 7 H2O Cl2Mn .cloroficea. urea o amino ácidos.01 g / l 0.71 g / l 1.15 g / l 0. Un stock de urea se prepara con 54 g / l en agua destilada y 10 ml de esta solución se usa como fuente de nitrógeno para reemplazar al nitrato en el medio Bold Basal. pipetas para medir diferentes volúmenes.32 Medios de Cultivo tes) y un elevado número de compuestos orgànicos variables. Varios baldes de acero inoxidable de 13 a 15 l. Este medio marino generalmente es fortalecido cuando se le añaden nutrientes como el nitrógeno. el fósforo. a diferencia de los que se preparan con grado técnico y se usan mayormente en cultivos masivos. incluyendo pipetas. Haga un primer enjuague con agua de la llave y finalmente con agua destilada por varias ocasiones. pero cualquiera que éste sea. que no responden al lavado con detergente debe ser remojada en SO4H2 saturado con NO3Na o en NO3H caliente. el hierro y otros. Estos medios tienen elevado costo. Materiales Químicos: Los químicos empleados en la preparación de un medio pueden ser del grado reactivo o grado técnico. Un refrigerador . beakers de varias medidas. fiolas para usar en filtración La cristalería usada en los trabajos de rutina no deben emplearse en la preparación de medios y toda vidrieria nueva debe enjuagarse en ClH diluido para remover cualquier agente reaccionante. Un calentador eléctrico con agitador magnético para disolver compuestos. Una balanza analítica para pesar metales trazas y vitaminas. Equipos: Un autoclave para efectos de esterilización. Un medio sintético puede ser usado igual que uno enriquecido. Una balanza gramera para pesar valores mayores. espátulas. embudos de porcelana para filtración. Mínimas cantidades de materia orgánica pueden ser destruidas mediante cocción a 350 y 400 grados centígrados por 3 a 4 horas.congelador para almacenar reactivos. dependiendo de la calidad del cultivo que se va a realizar. soluciones stocks y vitaminas. Limpieza: El detergente remueve la materia orgánica del vidrio. Guillard f/2 en el cual un gran nùmero de especies algales crecen sin dificultad. Un incubador con control de luz y temepratura para preservación de cepas. Cristalería: La vidriería marca PYREX es de buena calidad. manipulación. botellas con tapa para reactivos. en un recipiente (balde) de acero inoxidable. de capacidad. Un pHmetro para estabilizar las soluciones y el medio final. Un lavador automático de pipetas. aunque poco se ha hecho al respecto para las microalgas bènticas. Los aparatos de filtración son en muchos casos convenientes para esterilizar estos medios debido a la rapidez y facilidad con que se lo hace. Los químicos de grado reactivo (QP) se usan en la preparación de medios para cultivo menores (Indoor Culture Application) o que demanden tal grado de pureza. Este es el caso del medio R. Un solo medio debe servir para la mayoría de las necesidades del cultivador. el medio deberá ser tan simple como sea posible en su composición y preparación. Déjela remojando toda la noche en una solución con detergente preparada con agua destilada. cilindros plásticos con tapa para lavado de pipetas. sin que éstos se precipiten. Los dedos sucios son buenos contaminantes. La preparación de soluciones stocks se hacen en agua . Se requieren aparatos para filtración al vacío (membrane filter). cilindros graduados con tapa y sin tapa. Invierta cada recipiente para que escurra y luego tápelo. Luego enjuague bien con agua destilada. El uso de estabilizadores (buffers) del pH no tóxicos y quelantes han facilitado la esterilizaciòn por calor de los medios marinos. Las dificultades encontradas en el desarrollo de los cultivos algales están a menudo relacionadas con los problemas de aislamiento. Muchos medios enriquecidos y sintéticos han sido desarrollados para el cultivo de algas microscópicas planctónicas y algunas especies bénticas han crecido exitosamente con estos medios. Primero enjuague la cristalería con agua de la llave inmediatamente después de usarla. Toda vidrieria. tubos de ensayo con tapa rosca. platos petri. mechero de gas y de alcohol. En el caso de las pipetas emplee el mismo procedimiento descrito y para escurrir use el porta pipetas. termómetros de -20 a 110 grados centígrados. embudos. fiolas de diferentes volúmenes. Un mejor entendimiento de los micronutrientes y de los factores de crecimiento han permitido mejorar este medio. La solución con la vidrieria caliéntela o hiervala por una hora. incubación y situación fisiológica del organismo. la materia orgánica disuelta debe ser primeramente absorvida. Otra forma de eliminar materia orgánica es por medio de radiación ultravioleta de alta energía.Una salinidad de 35 UPS es considerada normal para el agua salada. Este autoclavado puede causar precipitación en algunos medios.45 um es usada para eliminar todas las partículas menores incluso las bacterias. Alvarez Arellano 33 doblemente destilada. Agua cruda (no esterilizada. Este precipitado corresponde a casi todo el fosfato presente en el medio. por un tiempo que varía de 10 minutos para un volumen de 100 ml. fiolas. Cuando el recipiente es nuevo. Déjelo enfriar y luego mida el pH de la solución ajustándolo cuando sea necesario. ni filtrada con membrana) no debe almacenarse por mucho tiempo. El agua salada a emplearse en la preparación de medios debe ser de mar afuera. Cuando se trata de mínimas cantidades. el agua es mezclada con 2 g de carbón activado nuevo y pulverizado. o vidrio. Agua Salada especialmente las unicelulares. que además la esteriliza. matraces. Agregue los nutrientes apropiados de las soluciones stock. no así en otros. De no ser así la correcta esterilización no se dará. Para hacer bioensayos con vitaminas. éste debe ser « curado « con ácido clorhídrico varios días y luego enjuagarlo bien con agua de la llave. vitaminas y demás nutrientes son primeramente diluidos para formar las soluciones que servirán para enriquecer un medio de cultivo. donde la válvula de escape debe permanecer abierta hasta que se vea salir una columna de vapor en forma persistente. agitarlo por una hora y luego filtrarlo con membrana milipor.algodón o papel KRAFT no encerado-. Agregue asépticamente las vitaminas tomándolas de una solución previamente preparada y esterilizada después que el medio fue autoclavado y enfriado. Algunos metales traza. Si hay que rebajarla use agua destilada y si hay que subirla coloque el agua en un evaporador.2 a 8.5 empleando ClH 1N o NaOH según se requiera. los metales traza y el silicato previamente esterilizados. 20 minutos para 2 lts y 35 minutos para 5 lts.. Use una probeta para enrasar el volumen final. Ciertos plásticos que se usan en la esterilización pueden desprender tóxicos al medio. Hacer estas aplicaciones con criterio de asepsia para evitar contaminación cuando se trate de cultivos menores. sea beaker. fiola o matráz. pasando el agua por una columna de carbón activado que además la estandariza. En algunos autoclaves este aire se elimina automáticamente. Todo el aire debe salir del autoclave antes de iniciar la esterilización. etc. Los recipientes (frascos.4 normalmente. Asegúrese de que la salinidad final esté correcta. a diferencia del papel filtro. El agua salada puede conservarse en recipiente plástico (polietileno). Disuelva la cantidad exacta del compuesto en 80-90% del volumen requerido en agua destilada. al punto de permitir 500 y hasta 1000 diluciones para la preparación de medios enriquecidos. El material esterilizado caliente dejarlo que se enfríe dentro del autoclave antes de sacarlo. Es decir que estas soluciones viene a ser las ¨soluciones stock de trabajo¨. La mayoría de las algas crecen bien a 30 UPS e incluso menos. un litro por ejemplo. Cuando se filtra con membrana la velocidad de paso del agua debe ser lenta. pero se lo evita aplicando el fosfato. o de áreas costeras consideradas libres de contaminantes. se deja subir la presión hasta 15 libras. En una hornilla eléctrica o calentador magnético agite suave y constantemente mientras se disuelve el compuesto. . Método general de preparación Coloque el 80 o 90% del volumen requerido en el recipiente. Ajuste el pH a 7. botella.Henry G. luego filtrada para mantenerla. agitando constantemente.) que contienen el medio a ser esterilizado deben taparse con materiales que permitan el paso del vapor caliente al interior. La esterilización se logra autoclavando el medio a 121 grados centígrados de temperatura. Esta forma de remover la materia orgánica es mejor usarla con altas cantidades de agua salada. Es mejor preparar un medio con agua nueva. Soluciones Stock : La mayoría de las sales y compuestos empleados en la preparación de soluciones stock son muy solubles en agua. Esterilización en autoclave: Las partículas mayores son removidas con papel filtro Whatman # 1. pero una filtración con membrana (milipor) de 0. El pH del agua de mar es de 8. momento en que se inicia la esterilización y se toma el tiempo. El agua debe ser almacenada en fresco y oscuro. Cerrando la válvula. 15 lb/pulgada cuadrada de presión (de vapor). La concentración de algunas soluciones es muy baja. como tapones de gasa . Complete el 100% del volumen requerido final con agua salada y distribuya el medio en los recipientes indicados para su esterilización en autoclave o filtración. El papel aluminio no es recomendable usar. Algunos medios emplean mayor número de vitaminas. La glicilglicina es soluble en agua y el polvo puede agregarse directamente al medio. por lo que las solucioens estériles se agregan asépticamente luego de que el medio se ha enfriado. luego se irán disolviendo uno a uno los metales restantes y agitando constantemente. Las concentraciones de éstos compuestos varían según la fórmula del medio que se trate. Este elemento es agreagado como solución de metasilicato de sodio (SiO 3Na2). B12): Es estable en forma de polvo y contiene un 12% de humedad. cobalto. El amoníaco como cloruro de amonio (ClNH4) en un máximo de 0. El cobalto. SO4Mg. Recomendaciones Algunas sales no se preparan como soluciones stock debido a su baja solubilidad. biotina y tiamina HCl. Si ha de formarse una solución stock el Fe. mientras que el tris puede usarse con los cultivos xénicos. El tris es fuertemente alcalino por lo que para evitar precipitaciones no hay que agregarlo directamente al medio. Completar el volúmen final con agua destilada. por lo que precipita o se polimeriza cuando se lo agrega al medio. por lo que no causa precipitados y el pH debe ajustarse con gotas de NaOH 1N. Sólo dos amortiguadores (buffers) son usados en medios marinos: el tris (hidroxilmetilaminometano) y la glicilglicina. Algunos organismos inhiben su crecimiento con el tris y no así con la glicilglicina. El silicio participa en el medio solamente cuando se trata de algas diatomeas. vitaminas. Es altamente acídico. manganeso. El nitrógeno es agregado como nitrato de sodio (NO3Na). En la preapración pueden usarse las ampollas que contienen 10 mg del compuesto. Micronutrientes inorgánicos Corresponden a los metales que intervienen en el enriquecimiento del agua de mar. etc) disuelva cada uno por separado en un volumen mínimo de agua destilada. Las soluciones stock se almacenan en botellas de vidrio o recipeintes plásticos y se refrigeran.5-8. El metasilicato de sodio se disuelve con facilidad en agua destilada tibia y es altamente alcalino. por lo que deben ser usadas inmediatamente después de su preparación. esto es una solución que contiene una parte de clorobenceno (v/v). Los elementos que mayormente participan son el zinc. siendo el Na2 EDTA el principal quelante y con el que se evitan precipitados durante la combinación de las sales. Algunos aminoácidos también se degradan cuando son autoclavados en el medio. esto es la cianocobalamina. manganeso. Pero las diatomeas crecen bien si el medio es preparado con solución stock de silicio con pH alcalino. El hierro puede ser diluido aparte junto con el EDTA y formar la solución Fe.5. para lo cual: Preparar una solución stock primaria de cianocobalamina disolviendo el contenido de una ampolla (inyección) en .2 dicloroetano y dos partes de n-butilcloruro (1clorobutano). cobre y el hierro. pero el molibdeno es preparado como MoO4Na2. Cianocobalamina (Vit. Es conveniente usar sales hidratadas para facilitar su dilución cuando se prepara la solución de metales traza. La glicilglicina es rápidamente metabolizada por los microorganismos y debe ser usada sólo con los cultivos axénicos. Estos metales son agregados en forma quelada. El fósforo es agregado generlamente como ortofosfato. una parte de 1. El problema se resuelve si la solución stock del silicio primero se la acidifica a pH 2 con ClH concentrado.1 mM/l debido a su toxicidad para algunas especies. Estas sales son el NaCl. molibdeno. para luego formar una solución stock de trabajo. Agitar fuertemente.34 Medios de Cultivo En la preparación de una “solución stock de trabajo” que contiene una mezcla de compuestos (sales. pero el hierro por no brindar esta condición es quelado con el EDTA. Los micronutrientes que se verán aquí sólo serán aquellos que se usan para enriquecer medios marinos y no para medios sintéticos por cuanto estos no siempre dan resultados satisfactorios en las producciones masivas. Ajuste el pH del medio con el ClH concentrado. La primera solución stock mencionada es estable en condición alcalina. Ninguno de ellos sirve como recurso de nitrógeno para el crecimiento algal. molibdeno y zinc se los puede preparar por separado como soluciones stock primarias y diluidas. cobre. Cantidades mínimas deben ser empleadas en ambos casos y de 1 a 5 mM es suficiente. disolver primeramente el Na2 EDTA y a continuación el hierro.EDTA para así emplearlo en la preparación del medio. Micronutrientes orgánicos Sólo tres vitaminas son realmente necesarias para el crecimiento de las algas marinas. Ambos amortiguan bien en pH 7. El silicio siempre se lo disuelve aparte y forma una solución stock.EDTA también puede ser agregado en un principio y no hay alteración. Disolver la cantidad requerida de tris en agua destilada aparte y use mínimos volúmenes para enriquecer medios marinos. Buena parte del nitrógeno se puede perder del medio (volatiliza) durante el autoclavado. luego combine estas soluciones y enrase al volumen final deseado. Si las soluciones preparadas van a ser autoclavadas pueden agregarse unas gotas de un preservante volátil. La úrea se descompone cuando se la calienta y debe ser agregada por filtración estéril. Los cloruros o sulfatos de estos elementos (sales) pueden usarse. ClK y SO4Na2. Otra forma de preparar la solución stock de metales traza es con el 80 o 90% del volumen de agua destilada requerida. Las soluciones preparadas con estos buffers se deterioran con el tiempo. Solución de metales traza: Na2EDTA Cl3Fe. Ajustar el pH a 4. 1 l.2H2O 4.7H2O Cl2Co. Medio Erdschreiber (1927). Debe contener la menor cantidad posible de arcilla. Puede autoclavarse en esta condición y guardar en congelamiento. Sirve para aislar y mantener.1 g. PO4H2Na. Los medios enriquecidos más sofisticados contienen además mezclas de metales traza y vitaminas. 10 mg. (El silicato es sólo para diatomeas). Sirve para aislar y mantener algas. 100 ml. Solución metales traza Agua destilada 35 1 ml.4. H) Agua destilada 10 mg. La condición ácida de la vitamina permite su autoclavado.01 mg. Preparación del extracto de suelo La muestra de tierra no debe contener aplicaciones de fungicidas ni insecticidas. 0. por lo que deben manejarse con extremo cuidado en el laboratorio..2H2O NO3Na 1.EDTA y otros metales traza junto . que son agregados al agua de mar.EDTA PO4H2Na.4H2O SO4Cu. El agua salada y los aditivos son esterilizados por separado y luego combinados asépticamente. Por cada litro de agua salada a ser enriquecida. Ella también puede ser filtrada con membrana milipor. Puede ser efectivo para algas bénticas.5 antes de autoclavarse.6 g.6H2O NH46Mo7O24.. El extracto obtenido y la tierra son altos contaminantes. fósforo y el extracto de suelo. Medio “f/2” Guillard (1968).15 mg. 33. 0. Es necesario acidificar ésta solución con ClH para obtener un líquido claro. 0. Solución de metales traza: Cl2Zn Cl2CO.36 mg.30 mg.4H2O BO3H3 Na2. Tiamina HCl (Vit.36 g.H2O 5 mg. SiO3Na2. Solución básica de nutrientes:(*) Cl3Fe.5 con ClH y diluir a un volumen determinado (1 litro).Sofisticado medio usado para un gran número de especies unicelulares. Medios marinos enriquecidos Los medios enriquecidos más sencillos sólo contienen fuentes de nitrógeno. *Agitar en cada aplicación. H) 0.HCl (B1) Biotina (vit.Sofisticado medio usado para un gran número de algas unicelulares.5 mg. Las tres vitaminas pueden combinarse para formar una sola solución stock de trabajo hasta para mil diluciones. 100 g. aunque ellas son frecuentemente autoclavadas con el medio.9 g. Agregar 1 ml.6H2O Cl2Mn. B1): La cantidad requerida puede diluirse en la solución de biotina y ajustar el pH a 5. Almacenar la solución a -20 grados centígrados.Este medio es sencillo y ha sido usado para algas unicelulares y macroalgas.3 g. 0. 0.5. Mezclar un volumen de tierra en dos volumenes de agua estilada y autoclavar de 40 a 60 minutos o hervir por más de 60 minutos agitando constantemente. 100 ml. Solución de vitaminas: Cianocobalamina (B12) Tiamina.. 0. Solución de vitaminas: Cianocobalamina (B12) Tiamina. Alvarez Arellano agua destilada.5H2O SO4Zn. Agregar las vitaminas al medio en forma aséptica.4H2O MoO4Na2. Esta solución debe ser acidificada a pH 4.18 mg.1 ml.9H2O 15 . 20 g.5 mg. Esta vitamina resiste los recongelamientos y los reautoclavados. sólo que la biotina deberá ser pesada de acuerdo al requerimiento. de ésta solución por cada litro de agua salada a enriquecer. Agregar 0. Medio Walne (1966).022 mg. La solución stock primaria se prepara como en el caso anterior. 3. HCl (B1) Biotina (Vit. Los nutrientes y el agua salada son autoclavados juntos después del ajuste del pH a 7.6H2O MnCl2.Henry G. Biotina (Vit. 2 g.5H2O Agua destilada 2. Solución básica de nutrientes: NaNO3 75 mg.006 mg. 45 g. 0. 200 mg. El Fe. 0.6H2O SO4Cu. 0.01 mg. por cada litro de agua salada. 2 g.1 mg. Dejar el caldo en reposo durante la noche y luego filtrar. Su acidificación la vuelve estable para el autoclavado. H): Es estable en forma de cristal y contiene un 4% de humedad. 2) La formación de los cristales de hielo someten a las células a un stress físico. Estabilidad genética de las especies preservadas por largo tiempo. En ésta condición es muy dificil obtener una liofilización. resultando en un producto seco y estructuralmente intacto.80 mg.36 Medios de Cultivo con las vitaminas pueden reemplazar al extracto de suelo. 5) El descongelamiento de una muestra y su retorno a la temperatura ambiente expone a las células a efectos que pueden resultar letales. Para las algas el primero y segundo son los métodos más requeridos y convenientes. solubilización de lipoproteinas y alteración de la permeabilidad de la membrana. 7. 4) La deshidratación genera un incremento de las concentraciones de sales en la célula. Su uso depende del producto final y de la configuración deseada. Se requieren equipos especiales para éste proceso y están disponibles para operar tanto a escala de laboratorio como industrial. como cambiar las concentraciones de electrolitos (moléculas) o por efectos de la temperatura alterar el grado de reacción enzimática. El principal propósito de ésta modalidad de preservación (congelado-seco) es mantener los cultivos algales en estado viable por largo tiempo. Los cultivos liofilizados no requieren refrigeración para su almacenaje. Una vez formados los eutéticos. Cuando se congelan. La técnica de congelado-seco (freeze-drying) implica remover el agua o algún otro solvente de un producto congelado a través de un proceso llamado sublimación.199. equipos y espacio físico requerido para mantener colecciones. toda la suspensión se va volviendo viscoza a medida que la temperatura baja. Entre los daños que pueden sufrir están: 1) Alteración de los procesos metabólicos debido a los efectos causados por el diferencial de temperatura sobre las múltiples reacciones enzimáticas. es por ésto que una bomba de vacío (vacuum pump) es necesaria en un sitema de congelado-seco para evacuar el ambiente que circunda el producto. La presión de vapor del producto asegura la sublimación del agua (moléculas de vapor) desde el producto congelado al condensador.Cualquiera de ellos pueden hacer perder viabilidad a las células. Debe crearse la condición que asegure el libre flujo de las moléculas de agua desde el producto. generando su deshidratación. que se dá cuando un líquido congelado (cristales de agua por ejemplo) pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por el estado líquido.75 mg. El hielo debe ser removido del producto congelado (colección de algas) vía sublimación. especialmente si el grado de congelamiento es demasiado rápido. Es importante que la temperatura en la cual el producto es congelado-seco esté balanceada entre la temperatura que mantiene la integridad del congelamiento del producto y la temperatura que maximiza la presión de vapor del producto.30 .19. Reducción de tiempo. Se conocen 3 métodos de congelado-seco: Preservación de Cepas 1) Secado múltiple (manifold drying). Este balance es clave para un secado óptimo. Toda la técnica implica 3 pasos a saber : Precongelado.90 . con la consiguiente desnaturalización de proteinas. La liofilización: 2) Secado en un solo (batch drying). La colección de algas es adecuadamente precongelada. pasan por bajas temperaturas y son liofilizadas. 50. Finalmente el producto se congela formando un sólido (hielo) de características de vidrio. El diferencial de la presión de vapor entre el producto y el condensador permite . como las moléculas de agua por ejemplo. Por cada litro de agua salada a ser enriquecida.00 ml. Solución básica de nutrientes: NO3Na PO4HNa2 Extracto de suelo 100. Los productos o materiales así procesados no necesitan refrigeración y pueden ser almacenados a temperatura ambiente. Este paso requiere de un alto control de la temperatura y la presión de vapor de dicho producto. comparado con las formas rutinarias de transferencia. Primer secado. Durante ésta fase se forman los eutéticos (solutos que se congelan a una temperatura menor que la del agua circundante). usado para colectar la humedad que sale del producto congelado. las células son expuestas a una secuencia de stress de tipo físico y químico. Otro aparato indispensable es el condensador (cold trap). 3) El aumento de los cristales de hielo intracelulares producen una difusión del agua fuera de las células. teniéndose las siguientes ventajas para su aplicación: 3) Secado en bulto (bulk drying). La bomba de vacío remueve todos los gases que no son condensables y el condensador «captura» todos los gases condensables. Guillard. 1971. Este proceso se conoce como «disorción isotérmica». la humedad de enlace está aún presente en el producto.008 0. 1991. 2) Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates.Henry G. Un secado contínuo se necesita bajo una temperatura más tibia de la anterior a fin de eliminar la humedad residual..097 0. (grados centígrados) 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80 Presión (mm de Hg) 4. Robert R. El segundo secado se hace a temperatura mayor que la del ambiente por ser compatible con la sensitividad del producto. Kevan L. 3) Tecnología de Cultivo de Microalgas. la temperatura del condensador debe ser mucho más baja que la del producto.Describa el método general de preparación de agua salada enriquecida.776 0. Una forma común de aplicar calor es usando el ambiente directamente a las cámaras de secado (manifold drying). 7..¿En qué concentración participa el cloruro de hierro en la fórmula Chu No. Las cámaras portan las fiolas. Eduardo Uribe T.579 1.. 8. 4) Rotifer and Microalgae Culture Systems.¿Cómo evita el problema de la precipitación del silicato antes de agregarlo al medio ? 9. Miscelánea de preguntas 1. 10 ? 6. Todo éste proceso toma medio tiempo del requerido para el proceso anterior. 3.0004 El tercer componente esencial en el congelado-seco es la fuente de calor que tiene que ser aplicada al producto para asegurar la salida del agua en forma de vapor desde el producto congelado. 1992.¿Cuáles son las características del suelo para obtener 37 un buen extracto ? 5.027 0.¿Cuál es la concentración del nitrato de sodio en el medio “f/2” Guillard ? 10. Culture Methods and Growth Measurements. 4. Se trata de la «humedad residual» que puede estar entre un 78%.Explique en forma breve los pasos a seguir en la esterilización con autoclave. Stein. Wendy Fulks.950 0. El vacío debe ser lo más bajo posible y la temperatura del condensador la más fría que se pueda lograr.286 0.. . Segundo secado.. Main.Si recuerda nombre el compuesto químico que forma el stock II en la solución de macronutrientes del medio Beijerinck...Explique ¿por qué se usa el agar en la solidificación de medios de crecimiento y cuál es su principal ventaja? 2. Janet R. sin embargo. 1973.En forma breve describa los pasos para una buen lavado de vidriería. Tabla VIII Relación de temperatura/presión de vapor Temp.¿Qué es la disorción isotérmica ? Bibliografia de consulta: 1) Handbook of Phycological Methods.. Completado el primer secado y una vez que todos los cristales de hielo han sido sublimados.0019 0.. Alvarez Arellano el movimiento de las moléculas fuera del producto.. tubos o ampollas que contienen el producto (algas) a ser liofilizado.