Métodos de laboratorio

Universidad Autónoma de Coahuilade Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación monosacáridos por el método de Antrona 1 Tomás López Altunar Laboratorio de Microbiología. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, México. Fundamento La antrona forma un compuesto verde en medio ácido fuerte (ácido sulfúrico) con ciertos carbohidratos y sacáridos, en especial con azúcares y almidones. La reacción de la antrona en medio sulfúrico produce un derivado del furano que tiene su máximo de absorción en 620 nm. Reactivo antrona El reactivo se prepara de la siguiente manera:     Añadir 340 mL de agua destilada Agregar 660 mL de H2SO4 concentrado Añadir 10 g de tiourea Posteriormente agregar 0.5 g de antrona (cristalizado de etanol) Nota: el reactivo es estable por 2 semanas almacenado a 4 °C y la curva estándar se realiza con glucosa. Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5. Agregar 0.25 mL de muestra a analizar Añadir 1.25 mL reactivo antrona Someter a baño maría y dejar ebullir por 15 min Dejar enfriar por 20-30 min en oscuridad Medir a absorbancia a 575 nm. Solución de Glucosa: Disuelva 100 mg de glucosa seca y de buena calidad en un litro de agua destilada. La solución es estable por una semana si es guardada en un frasco ámbar y en refrigeración. Esta solución tiene una concentración de 100 mg/L de glucosa Referencia 1 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Kunerth W.H y Youngs. (1984). Modification of the Anthrone, Carbazole and Orcinol Reactions for Quantitation of monosaccharides. Cereal chemistry. 61:4:344-349. Determinación de azucares totales por el método de fenol-sulfúrico 2 Tomás López Altunar Laboratorio de Microbiología. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, México. Fundamento El método propuesto por Dubois et al., 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y temperaturas altas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa con el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismo y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensación de los compuestos fenólicos y con heterociclos con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con el fenol MATERIALES Y METODOS             Muestra hidrolizada (pulpa de café) Matraz de aforación Papel filtro Fenol 5 % Autoclave Glucosa 500 ppm Agua destilada Vortex Micropipetas Tubos de ensayo 3*100 ml H2SO4 concentrado Espectrofotómetro 2 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR AZUCARES TOTALES (DUBOIS, 1956) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 250 µl de muestra hidrolizada Añadir 250 µl de fenol al 5 % Agitar en vortex y dejar en baño de agua con hielo por 5 min Añadir 1 mL (1000 µl) de ác. Sulfúrico H 2SO4 concentrado Agitar en vortex cuidadosamente y ebullir por 5 min Enfriar a temperatura ambiente por 5 min Leer en espectrofotómetro a una absorbancia de 480 nm Nota: la curva de calibración se realiza con glucosa Referencias Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. y Smith F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28:3:350-356. 3 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación de azúcares reductores por el método de Somogyi-Nelson 3 Adriana Carolina Flores Gallegos Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, México. Fundamento El método se basa en la capacidad que tienen los azúcares reductores (como la glucosa y la fructosa) de reducir ciertos iones metálicos, como el cobre, en un medio alcalino y caliente. En el proceso, la muestra que contiene el azúcar reductor se calienta con la solución alcalina de tartrato de cobre (reactivo de Somogyi), y como resultado de la reacción se forma óxido cuproso. Éste reacciona con el arseno-molibdato (reactivo de Nelson) dando un compuesto de color azul (azul de molibdeno) (Figura 1). Cu2O Arseno-Molibdato Azul de molibdeno Figura 1. Reacción de azúcares reductores con los reactivos de Somogyi y Nelson La intensidad del color azul obtenido es proporcional a la cantidad de azúcar reductor presente en la muestra de acuerdo a la ley de Lambert y Beer. Reactivos Reactivo de Somogyi - Reactivo A Compuesto Carbonato de sodio anhidro Cantidad (g/L) 25 4 DIA-UADEC El reactivo es estable hasta por 1 año Reactivo de Nelson 25 g Molidato de amonio ((NH )6Mo O ) en 450 4 7 24 ml 21 ml de ácido sulfúrico (H SO ) concentrado 2 4 3 g Arsenato de sodio (Na HAsO 7 H O) en 25 ml 2 4 2 Mezclar e incubar a 37 ºC por 24 o 48 h Almacenar en un frasco ámbar o en un frasco cubierto con aluminio. El reactivo es estable por 6 meses. lo cual podría causar reoxidación del óxido cuproso. con el fin de evitar la cristalización del sulfato de sodio. Reactivo B Compuesto Cantidad (100 mL) Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O) Ácido sulfúrico (H2SO4) 15 1-2 gotas El reactivo de Somogyi está compuesto por 25 partes de reactivo A y 1 parte de reactivo B(la mezcla se realiza en el momento). 5 DIA-UADEC . El reactivo se debe filtrar y almacenar a no menos de 20ºC.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento (Na2CO3) Sal de Rochelle (KaNaC4H4O6) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Sulfato de sodio 25 20 anhidro 200 (Na2SO4) En la mezcla de reacción se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada de oxígeno atmosférico en la solución. Curva 2. 1 parte reactivo B) Agregar 1 ml reactivo Nelson Baño en ebullición por 20 min Completar a 5 ml Leer a 500 nm Notas: o o El blanco consiste en agua destilada. Desarrollo del compuesto cromogénico a 37º C. 24 horas. 12 horas. Curva 4. Curva 1. Procedimiento: 1 ml de la muestra Enfriar en baño de hielo 20 min Agregar 1 ml reactivo Somogyi (25 partes reactivo A. La curva de calibración debe realizarse con un estándar del azúcar reductor presente en la muestra (por ejemplo. tiempo 0. 48 horas. glucosa) en una concentración de 1 mg/ml (1000 ppm) 6 DIA-UADEC . Curva 3.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Figura 2. 0. o Si la DO es mayor a 1. los mejores resultados se obtienen si no se excede una concentración de 1 mg/ml. Curva estándar glucosa o Solución madre de glucosa(μL) Agua 0 100 200 300 400 500 1000 900 800 700 600 500 destilada (μL) Concentra ción (ppm ) 0 100 200 300 400 500 El método es muy preciso para 0. todas las sustancias con propiedades oxidativas o reductoras pueden causar interferencia. galactosa y maltosa.01 mg de glucosa. Nelson. Se ha reportado que el ácido cítrico causa interferencia en la determinación de azúcares reductores. N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. o El método no es apropiado para la determinación de una mezcla compleja de azúcares reductores. M (1926) Notes onsugardetermination.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Cuadro 1. Referencias bibliográficas: Somogyi.Journal of Biological Chemistry. Journal of Biological Chemistry. o El color es muy estable o En el ensayo de Somogyi-Nelson. 7 DIA-UADEC . las muestras deben ser diluídas ya que la linealidad de la absorbancia vs concenración de puede ver afectada. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación analítica de azúcares de acuerdo a sus propiedades químicas 4 Diana Beatriz Muñiz Márquez Laboratorio de Microbiología. Coahuila. Universidad Autónoma de Coahuila. Método volumétrico de Lane y Eynon En este método el carbohidrato reductor se encuentra en solución y con el se reduce un volumen medido y constante de licor cupro-alcalino (reactivo de Fehling-Soxhlet). Fundamento El método a continuación descrito fundamenta su principio químico en la capacidad reductora de los grupos aldehído y/o cetónicos libres de los carbohidratos. Departamento de Investigación en Alimentos. disacáridos reductores y polisacáridos previamente hidrolizados. con la consiguiente oxidación de los azúcares en el grupo carbonilo y en la función alcohol primario. dicha reacción se manifiesta en la precipitación de cobre como óxido cuproso. Facultad de Ciencias Químicas. Tal método es aplicable a monosacáridos. ante una solución cupro-alcalina.Soxhlet B (F-SB) Agua destilada Azul de metileno 1% Subacetato o acetato de plomo 30% Material y equipo     Bureta Matraces erlenmeyer de 250 mL Pipetas de 5 y 10 mL Embudo 8 DIA-UADEC . Determinación de azúcares reductores Reactivos (ver anexo de preparación de reactivos)      Solución Fehling. Saltillo. México.Soxhlet A (F-SA) Solución Fehling. 25280. en presencia de indicador azul de metileno. Para muestras líquidas. b Recolectar el filtrado y titular cuanto antes. néctares. Se finaliza la titulación hasta que desaparece totalmente el color azul de la solución y las burbujas son transparentes. d Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar). 2. dependiendo de la concentración del carbohidrato en análisis o bien trabajar directamente con la muestra. como el caso de los refrescos. deberá realizarse el siguiente proceso: a Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo. no se debe guardar por más de una hora. disolver 2 g en un volumen conocido de agua destilada y aforar a 100 ó 250 mL.Llevar la solución problema a una bureta y proceder como sigue: a En un matraz erlenmeyer agregar 5 mL de sln Fehling. jarabes. Preparar por triplicado. concentrados de frutas.9 Parrilla Procedimiento 1.Soxhlet A + 5 mL de sln Fehling. 9 DIA-UADEC . chocolates. NOTA: Cuando la muestra sea colorida.Soxhlet B + 40 mL de agua destilada. c Empezar la titulación con la solución problema y una vez que presente un ligero cambio de coloración la solución del matraz.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas   Departamento Papel filtro whatman no. Cuanto más oscura sea la muestra mayor cantidad de clarificante necesitará (por ejemplo solución con chocolate 4 o 5 gotas). para evitar una evaporación considerable.Si la muestra es sólida. agregar una gota de azul de metileno 1%. La cantidad de gotas es en proporción a la intensidad del color o de material suspendido en la muestra... Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con precipitado. alimentos en polvo o si tiene material suspendido. b Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullición. NOTA: La solución del matraz deberá permanecer en constante ebullición durante toda la titulación sin exceder de 3 minutos. hacer una dilución 1:1. Parrilla Procedimiento A Hidrólisis por reflujo 1. Pipetas de 5 y 10 mL. disolver 2 g en 50 mL de agua destilada..Si la muestra es sólida. de aforo x 100 mL gastados * g de muestra T F-S: título de la solución Fehling. azúcares hidrolizables. Reactivos (ver anexo de preparación de reactivos)       HCl concentrado NaOH 4% Solución F-S A Solución F-S B Agua destilada Azul de metileno 1% (solución acuosa) Material y equipo       Refrigerante Matraz balón fondo plano Bureta Matraces erlenmeyer de 250 ml. hacer una dilución 1:1 (completando 50 mL). dependiendo de la concentración del carbohidrato en análisis. 10 DIA-UADEC . Para muestras líquidas.Soxhlet Determinación de azúcares no reductores Este método es aplicable a sacarosa.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas e Departamento Calcular: % AZÚCARES REDUCTORES = T F-S * Vol. almidón y dextrinas. 2. 6. alimentos en polvo o si tiene material suspendido.Aforar a 200 mL con agua destilada. La cantidad de gotas es en proporción a la intensidad del color o de material suspendido en la muestra. Si la muestra es sólida. continuar el calentamiento por 3 horas más. Introducir el matraz con la muestra acidificada en una estufa a 45°C durante 24 hrs.. 4. como el caso de los refrescos. chocolates. 5. d Recolectar el filtrado y titular cuanto antes. deberá realizarse el siguiente proceso: c Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo... B) Hidrólisis por calor 1. no se debe guardar por más de una hora. Comprobar la hidrólisis de los polisacáridos adicionando una gota de lugol. 11 DIA-UADEC .Pasar la muestra a un matraz balón fondo plano y acidificarla con 1mL de HCl concentrado.Enfriar el hidrolizado y neutralizar con 1mL aproximadamente de NaOH 4%. disolver 2 g en 50 mL de agua destilada. Si éste adquiere una coloración morada sobre la muestra. néctares.Pasar la muestra a un matraz balón fondo plano y acidificarla con 1mL de HCl concentrado. dependiendo de la concentración del carbohidrato en análisis. si no es así. indica que la hidrólisis se ha completado. jarabes. NOTA: Cuando la muestra sea colorida.Llevar la solución problema a una bureta y proceder como sigue: a En un matraz Erlenmeyer agregar 5mL de solución F-S A + 5 mL de solución FS B + 40 mL de agua destilada. hacer una dilución 1:1 (completando 50 mL)... 4.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 2. Para muestras líquidas.Conectar el matraz al refrigerante e hidrolizar por 30 minutos (precalentar la parrilla y mantener alta la temperatura durante los 30 minutos que dura la hidrólisis). Preparar por triplicado. 3. concentrados de frutas.. Cuanto más oscura sea la muestra mayor cantidad de clarificante necesitará (por ejemplo solución con chocolate 4 o 5 gotas). 3. Balanza Matraces aforados de 500 mL Procedimiento 12 DIA-UADEC . preparar para 100 mL) Material y equipo      Bureta Matraces Erlenmeyer de 250 mL.01g/mL. Pipetas de 5 y 10 mL.Soxhlet AZÚCARES TOTALES % AZÚCARES TOTALES = % AZÚCARES + % AZÚCARES NO REDUCTORES REDUCTORES Anexo: preparación de reactivos Reactivos Fehling Sohxlet       Sulfato de cobre pentahidratado Tartrato de sodio y potasio Hidróxido de sodio Agua destilada Azul de metileno 1% (solución acuosa) Solución de dextrosa anhidra (0. Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con precipitado. e Calcular: % AZÚCARES NO REDUCTORES = T F-S * Vol. Se finaliza la titulación hasta que desaparece totalmente el color azul de la solución y las burbujas son transparentes. c Empezar la titulación con la solución problema y una vez que presente un ligero cambio de coloración la solución del matraz. agregar una gota de azul de metileno.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento b Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullición. NOTA: La solución del matraz deberá permanecer en constante ebullición durante toda la titulación sin exceder de 3 minutos. para evitar una evaporación considerable. d Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar). de aforo x 100 mL gastados * g de muestra T F-S : título de la solución Fehling. tomar en cuenta lo siguiente:    6) Volumen de las soluciones A y B Concentración de la solución patrón en g/mL. 3) Añadir a una bureta la solución de dextrosa anhidra 1%. Se finaliza la titulación hasta que desaparece totalmente el color azul de la solución y las burbujas son transparentes. C: concentración del patrón en g/mL (0. 2) Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullición. NOTA: La solución del matraz deberá permanecer en constante ebullición durante toda la titulación sin exceder de 3 minutos. 2) Solución B. 13 DIA-UADEC . Pesar exactamente 34. 5) Para obtener el título del reactivo F-S. Estandarización de la solución F-S 1) Medir 5 mL de solución A y 5 mL de solución B (utilizar pipeta limpia y seca para medir cada reactivo). V: volumen gastado del patrón. para evitar una evaporación considerable. Mezclar y aforar a 500 mL. Aforar a 500mL. Volumen de la solución patrón empleada en la titulación Cálculos: T=VxC T: título expresado en dextrosa para 10 mL de reactivo F-S (5 mL de A+ 5 mL de B).01g/mL). Pesar exactamente 173 g de tartrato de sodio y potasio y 50 g de hidróxido de sodio. Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con precipitado. Disolver en 200 mL de agua destilada y calentar si es necesario. agregar una gota de azul de metileno 1%. Disolver por separado cada reactivo.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 1) Solución A.689 g de sulfato de cobre pentahidratado. mezclarlos en matraz Erlenmeyer de 250 mL y diluir con 40 mL de agua destilada. 4) Empezar la titulación con la solución de dextrosa y una vez que presente un ligero cambio de coloración la solución del matraz. 14 DIA-UADEC . Solución patrón de dextrosa 1% Pesar 1 g de dextrosa anhidra y aforar a 100 mL con agua destilada. Referencia bibliográfica Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. Solución de subacetato de plomo (o acetato básico de plomo) 30%. concentración y fecha).063 g de maltosa anhidra 0.1 g. pp 1016. Method AOAC 923. vaciar a un frasco con gotero y etiquetar (nombre.09. Si se usa dextrosa monohidratada pesar 1. (1990).0475 g de sacarosa anhidra Hidróxido de sodio 4% Disolver 4 g de NaOH (lentejas) y aforar a 100 mL.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento NOTA: El T F-S expresado para 10 mL del reactivo tiene las siguientes equivalencias:     0.050 g de dextrosa anhidra 0. Vaciar a un recipiente y etiquetar (nombre. concentración y fecha). Azul de metileno 1% Disolver 1 mL de reactivo azul de metileno en 100 mL de agua destilada (en matraz aforado). mezclar.075 g de lactosa anhidra 0. Disolver 75 g de una u otra sal y aforar a 250 mL con agua destilada. 25280. Introducción La glucosamina (C6H13NO5) es un amino azúcar que se encuentra principalmente en el exoesqueleto de crustáceos y artrópodos. Fundamento Para determinar el contenido de glucosamina. su cuantificación nos permite tener una estimación del crecimiento de microorganismos en un cultivo. Reactivo de Erlich. se requiere una hidrólisis para liberarla de la pared celular. 15 DIA-UADEC . ya que las soluciones deben ser frescas para evitar error en la cuantificación.6 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 60 mL de sol. Solución de acetilacetona. Saltillo. por ende. siendo el monosacárido más abundante y. México. Disolver 1 mL de acetilacetona en 50 mL de Na2CO3 0.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación de glucosamina (Método indirecto para determinar biomasa fúngica) 5 José Juan Buenrostro Figueroa Laboratorio de Microbiología. Procedimiento Para esta técnica es necesario preparar las siguientes soluciones: A. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas.5 N. Universidad Autónoma de Coahuila. Coahuila. B. formando parte de la pared celular de hongos y muchos organismos. posteriormente se combina con la acetilacetona formando un compuesto pirrólico. que al reaccionar con el p- dimetilaminobenzaldehído (PDBA) forma un compuesto de color rojo a una absorbancia de 530 nm. HCl-EtOH (1:1). Disolver 1. Nota: Calcular la cantidad de solución a emplear de acuerdo al número de muestras. mediante el cual se libera la glucosamina. y posteriormente la reacción con la solución A y B para su cuantificación. Figura 1.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento En el siguiente diagrama de flujo se describe primeramente el pretratamiento de la muestra. Diagrama de flujo para la cuantificación de glucosamina. 16 DIA-UADEC . 1948. The Determination of Hexosamines According to Elson and Morgan. Cálculos Para hacer los cálculos correspondientes.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Nota: Se requiere determinar la glucosamina asociada al hongo.mL-1 con glucosamina como estándar. Por otra parte. Acta Chemica Scandinavica 2. el valor obtenido (mg/g de glucosamina) se divide entre el valor de glucosamina asociada al hongo. G. se realiza una curva patrón de 0 a 200 µg. 17 DIA-UADEC . para obtener el contenido de biomasa (mg/g de muestra). por lo cual se requiere biomasa seca del mismo (100 mg) a los cuales se les somete al mismo procedimiento descrito arriba. 467-473. se sustituye y en la ecuación de la recta por las absorbancias obtenidas de las muestras. Bibliografía Blix. Se agregan 100 mL de ácido fosfórico 85 % (p/v). El colorante azul de Comassie G-250 existe en dos diferentes formas: rojo y azul.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación de proteína soluble 6 Luis Víctor Rodríguez Durán Laboratorio de Microbiología. aproximadamente). Preparación del reactivo Se disuelven 100 mg del colorante Azul de Comassie G-250 en 50 mL de etanol al 95 %. Departamento de Investigación en Alimentos. Ensayo estándar 18 DIA-UADEC . esto hace de la técnica un procedimiento rápido y no requiere de un control estricto del tiempo de reacción. México. La unión del pigmento a la proteína es un proceso rápido (alrededor de 2 minutos) y el complejo proteína-pigmento permanece disperso en la solución durante un tiempo relativamente largo (1 hora. El complejo proteína-pigmento tiene un alto coeficiente de extinción lo cual resulta en una alta sensibilidad para la medición de proteína. Universidad Autónoma de Coahuila. Este reactivo es estable por al menos un mes a temperatura ambiente. El reactivo debe protegerse de la luz y filtrarse antes de su uso. que se basa en la formación de una coloración característica al acomplejarse las proteínas solubles con el colorante azul de Comassie. La forma roja se convierte en azul mediante la unión del pigmento a las proteínas. Ensayo: Se han descrito dos diferentes ensayos basados en el uso de este reactivo. Coahuila. Facultad de Ciencias Químicas. Fundamento Esta es una técnica espectrofotométrica. La solución se diluye en agua destilada y se afora a 1 L. Saltillo. cada uno con diferente sensibilidad. Simultáneamente se prepara un tubo blanco con 0. Se agrega 1 mL del reactivo de Bradford. Se mide la absorbancia a 595 nm del tubo muestra entre 2 minutos y 1 hora después de realizada la reacción contra el tubo blanco. Referencia: Bradford. Analytical Biochemistry 72(1-2): 248-254.100 mL de muestra con una concentración de 10 a 100 ppm de proteína. 19 DIA-UADEC . Agitar y reposar a temperatura ambiente. (1976). M. Micro-ensayo      En un tubo de ensaye se colocan 0. Se mide la absorbancia a 595 nm del tubo muestra entre 2 minutos y 1 hora después de realizada la reacción contra el tubo blanco. Cálculos Para calcular la concentración de proteína en la muestra. y detergentes comerciales.100 mL de muestra con una concentración de 100 a 1000 ppm de proteína. Interferencias Los únicos componentes que se ha encontrado que producen una interferencia excesiva durante la reacción son algunos detergentes en altas concentraciones como: dodecil sulfato de sodio. se realizó una curva patrón utilizando Albúmina Sérica Bovina (BSA) como estándar (Tablas 1 y 2). Se agregan 5 mL del reactivo de Bradford. Tritón X-100.100 mL de agua (o el buffer apropiado) y 5 mL de reactivo de Bradford. Agitar y reposar a temperatura ambiente. Simultáneamente se prepara un tubo blanco con 0. Las interferencias debidas a pequeñas cantidades de detergente pueden ser eliminadas usando los controles adecuados. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas      Departamento En un tubo de ensaye se colocan 0.100 mL de agua (o el buffer apropiado) y 1 mL de reactivo de Bradford. M. la solución fue diluida con 5 ml de agua destilada y su absorbancia fue leída a 790 nm. Referencia Belmares. los cuales se reducen al oxidar a los fenoles debido a la transferencia de electrones a pH básico. Universidad Autónoma de Coahuila. N. 20 DIA-UADEC . C. Fundamento El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de un método espectrofotométrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Departamento de Investigación en Alimentos. J. Rodríguez. 312318... 4. Saltillo. R. dando lugar a la formación de compuestos cromógenos como oxido de molibdeno y de tungsteno de coloración azul-verde. Electronic Journal of Enviromental.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Cuantificación de polifenoles hidrolizables por el método de FolinCiocalteu 7 Jorge Enrique Wong Paz Laboratorio de Microbiología.. Finalmente. C. Y. Agricultural and Food Chemistry. con un nuevo periodo de reposo de 5 minutos. La concentración producida es proporcional a la concentración de polifenoles presentes en la muestra. Este método se basa en la presencia de los ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico en el reactivo. Contreras. Posteriormente 800 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu se agregan y mezclan. R. Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid plants. México. 8. Garza. Facultad de Ciencias Químicas. Después de este tiempo. y Aguilar.01 M) fueron agregados y mezclados. Metodología     Se colocan 800 µL de la muestra en un tubo de ensaye. 2009. 800 µL de carbonato de sodio (0. dejándolos reaccionar por 5 min. Coahuila. . Food Technology and Biotechnology. Belmares. R.. 46 (2) 213–217. Gutiérrez. N. A. J. y Aguilar.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Ventura.. 2008. 21 DIA-UADEC . C. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote Bush (Larrea tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallec and Ellagic Acid Production.. R. G. Rodríguez. Aguilera. Esta reacción es catalizada por un ácido que depolimeriza los taninos condensados produciendo antocianidinas rojas. por ejemplo las cinidinas y delfidinas tienen una longitud de onda máxima en 545 y 557 nanómetros respectivamente.5 mL de muestra 3 mL HCl-Butanol 0. El numer de grupos fenolicos en los anillos afecta la longitud de onda. La porción de HCl-Butanol de 6:1 fue propuesta por Hagerman. Dalzell y Kerven. Universidad Autónoma de Coahuila. 1994). 1998). 1994. Material y reactivos     0. Hagerman y Butler. 1992). Notas importantes Al usar este método deben de considerarse las siguientes limitaciones marcadas por Waterman y Mole (1994): La cantidad de agua presente en la reacción puede ser critica para la formación y por tanto para la cuantificación de proantocianidinas (Waterman y Mole. La fácil ruptura de los enlaces interflaventes por el ácido es ampliamente varable. Fundamento Esta técnica permite analizar el contenido de proantocianidinas en equivalentes de catequina un polifenol del tipo flavan 3-ol. 1994. Coahuila. 1998. México. Facultad de Ciencias Químicas.1 mL reactivo férrico Tubos con tapa 22 DIA-UADEC . Otroo factor es la temperatura y el tiempo de reacción (Scalbert. Saltillo.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Cuantificación de taninos condensados por la técnica HCl-Butanol 8 María Isabel Reyes Arreozola Laboratorio de Microbiología. 1998). Departamento de Investigación en Alimentos. La cantidad de agua recomendada es 6 % (Waterman y Mole. Cuando la porción del reactivo es 4:1 o 6:1 sel desarrollo del color se ve incrementado (Dalzell y Kerven. 0 g/L) 23 DIA-UADEC . 20 mL HCl concentrado Aforar a 100 mL H2O Adicionar 2 g de sulfato férrico de amonio Conservar en frasco ámbar 4 °C HCl-Butanol (10 %) Se agregan 10 mL de HCl al 37 % y se afora a 100 mL con terbutanol. 10 mL HCl al 37 % Aforar a 100 mL terbutanol Catequina (1.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas    Departamento Baño metabólico Agua Espectrofotómetro Preparación de reactivos: Reactivo férrico Se agregan 20 mL de HCl concentrado. aforar a 100 mL con agua destilada posteriormente se adicionan 2 g de reactivo sulfato férrico de amonio y se almacena en un frasco ámbar en refrigeración (4 °C) hasta su empleo. Una vez transcurrido el tiempo.75 1 Agua destilada (mL) 1 0. se dejaron enfriar y se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro UV/visible a 460 nm.0 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA Swain.5 0.0 0. and Hillis E.1 mL reactivo férrico Enfriar a temperatura ambiente Calentar tubos por 1 h (baño metabólico 100 °C) Curva patrón de catequina 1g/L Catequina (mL) 0. 1959.5 mL de la muestra o el estándar. 0. M. La cantidad de catequina en las muestras fue calculada por medio de la ecuación resultante de las lecturas de la curva patrón. Biodegradacion de Taninos en Extractos de Gobernadora (Larrea tridentata Cov.1 mL de reactivo férrico. Los tubos se taparon. T. The quantitative analysis af phenolic constituents. (2006). Todos los tubos fueron calentados por 1 hora en un baño metabólico a 100 °C.50 0. Cuantificación de taninos condensados por HCl butanol En tubos de ensaye (16 x 150) se colocaron 0. Food Agric.0 0. Sci.) y Hojasén (Fluorencia 24 DIA-UADEC .. The phenolic constituentes of Prunus domestica.25 0. para evitar la evaporación del butanol. Ventura-Sobrevilla J.50 0. sobre este se agregaron 3 mL de HCl/Butano (1:9) y 0. J.25 0. dentro de los tapones se colocaron empaques.25 0. Tesis licenciatura.75 0.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Diluir 25 mg de catequina en agua y aforar a 25 mL posteriormente se almacena en un frasco ámbar en refrigeración (4 °C) hasta su uso.75 1.5 mL de muestra 3 mL HCl terbutanol (1:9) Leer espectrofotómetro 460 nm Cerrar tubos 0. 10:63-68.0 g/L 0. la solución fue diluida con 125 µL de agua destilada y su absorbancia es leída a 790 nm en un lector de microplacas (Epoch). Facultad de Ciencias Químicas. Saltillo. Posteriormente 20 µL del reactivo de Folin-Ciocalteu se agregan y  mezclan.01 M) fueron agregados y mezclados. 25 DIA-UADEC . Departamento de Investigación en Alimentos. Coahuila. Este método se basa en la presencia de los ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico en el reactivo. Cuantificación de polifenoles hidrolizables por el método de FolinCiocalteu en microplaca 9 Jorge Enrique Wong Paz Laboratorio de Microbiología. 25280. México. dejándolos reaccionar por 5 min. Finalmente.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento cernua D. Después de este tiempo. Fundamento El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de un método espectrofotométrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Universidad Autónoma de Coahuila.) mediante Fermentación en Estado sólido usando Aspergillus niger PSH. C. Metodología  Se colocan 20 µL de la muestra (concentración conocida) en un  pozo de la microplaca. con un nuevo periodo de reacción  de 5 minutos. Tesis Químico Farmacéutico Biólogo. dando lugar a la formación de compuestos cromógenos como oxido de molibdeno y de tungsteno de coloración azul-verde. Universidad Autónoma de Coahuila. los cuales se reducen al oxidar a los fenoles debido a la transferencia de electrones a pH básico. La concentración producida es proporcional a la concentración de polifenoles presentes en la muestra. 20 µL de carbonato de sodio (0. y Aguilar. Referencia Belmares. 4. J. N. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote Bush (Larrea tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallic and Ellagic Acid Production. Agricultural and Food Chemistry. donde el blanco es sólo agua milli Q y en el control se  colocan 20 µL de agua milli Q en lugar de la muestra.. Las cantidades empleadas en microplaca para esta técnica reducen 40 veces las cantidades empleadas en la técnica original. J. Electronic Journal of Enviromental.. Notas:  En cada corrida se debe leer la absorbancia de un blanco y un control. R. Belmares. A. N. y Aguilar. 2008. 46 (2) 213– 217. Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid plants. 2009. C. Y. Aguilera. 312-318. Contreras. 26 DIA-UADEC . R. R.. 8. C. Ventura.. Gutiérrez.. Rodríguez. Garza. La absorbancia real de la muestra se obtiene restándole la  absorbancia del control. C... Rodríguez. G.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas  Departamento La concentración de la muestra se obtiene en equivalentes de ácido gálico por gramo de material por correlación lineal de acuerdo a una curva estándar de ácido gálico de 0-250 ppm realizada con los mismos pasos antes descritos. Food Technology and Biotechnology. R. El mecanismo de reacción se debe a una substitución aromática electrofílica por NaNO2. Universidad Autónoma de Coahuila.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación espectrofotométrica de ácido elágico 10 Leonardo Sepúlveda Torre Laboratorio de Microbiología. El cual. México. Coahuila. Saltillo. se basa en la formación de una quinona oxima producto de la nitrosilación del ácido elágico. 25280. Departamento de Investigación en Alimentos. Fundamento Esta técnica se basa en la cuantificación de ácido elágico utilizando un método espectrofotométrico. Facultad de Ciencias Químicas. 27 DIA-UADEC . Tiene un límite de detección de 1 μg de ácido elágico. y la adición de con la solución de piridina para formar al electrófilo in situ (Figura 1). Se    pueden medir 250 μL en caso de que la muestra sea líquida. La hidrólisis de los elagitaninos produce ácido hexahidroxidifénico (HHDP). 40. Dos productos posibles pueden ser formados. (A) una simple sustitución del producto. Se pasa la muestra a tubos Eppendorf limpios. Se añade 1 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 2 N. Éstos forman quinona oxima (C). (B) nitrosil dienona. Se pasan por filtros Whatman No. Ensayo  Se pesan 10 mg en caso de que la muestra sea sólida. Los carbonos que no están sustituidos en el ácido elágico. Una vez filtrada la muestra. donde ocurre una lactonización espontánea para formar al ácido elágico. cuando se ioniza se forma (D) producto de A o B. se colocan 9 mL de piridina en una relación 1:10.   Esto con la finalidad de hidrolizar la muestra. Se coloca en una estufa a 70 °C por un período de 30 horas. La formación del ácido elágico de un elagitanino y reacción de ácido elágico con el electrófilo NO+.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Figura 1. son susceptibles al ataque electrofílico. En esta sección es conveniente contar con todas 28 DIA-UADEC . Se colocan en baño de hielo por 5 minutos. Se lee en el espectrofotómetro a 538 nm. Curva propuesta Concentrac Solución madre ión (μL) 0 0 20 40 40 80 60 120 80 160 100 200 Volumen final = 1000 μL Piridina (μL) 1000 960 920 880 840 800 Observaciones Se debe de tener mucho cuidado con el manejo de la piridina ya que es un potente cancerígeno y solución tóxica.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento las medidas de seguridad personal debido a la toxicidad del        reactivo.1 mL de nitrato de sodio (NaNO2) al 1 %. En este paso es importante colocar en una cubeta de cuarzo debido a la   solución corrosiva. Se colocan nuevamente 1. Absf – Absorbancia final. Se debe de trabajar toda la técnica con una máscara antigases. Se toma la lectura a 538 nm. 29 DIA-UADEC .1 mL de ácido clorhídrico (HCl) concentrado.Absi AE – Ácido elágico. Se pasa 1 mL a un tubo de ensaye. Se dejan incubar nuevamente a 30 °C por 36 minutos. Absi – Absorbancia inicial. Se deja incubar a 30 °C por 5 minutos. Se añade 0.1 mL de piridina. La formula es: AE = Absf . Se añade 0. La diferencia entre la absorbancia inicial y la absorbancia a los 36 minutos es proporcional a la concentración de ácido elágico. De debe de contar con una aeración adecuada. Departamento de Investigación en Alimentos. Coahuila. C. Saltillo. Para llevar a cabo ésta determinación. se pesan 30 mg de material vegetal seco y molido y se colocaron en tubos de ensaye con tapón de rosca y empaque para evitar la evaporación de los solventes utilizados en ésta técnica. Cuantificación de ácido elágico por 11 metanólisis Juan Alberto Ascacio Valdés Laboratorio de Microbiología. (1990).Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Es una técnica poco sensible. T. Universidad Autónoma de Coahuila. estos tubos no son sometidos a previa hidrólisis. Referencia bibliográfica Wilson. México. se debe de considerar con una cantidad considerable de ácido elágico en tu muestra para que funcione correctamente. 38. Quantitative determination of ellagic acid. Facultad de Ciencias Químicas. J. 25280. Es importante que se maneje un control. 1678-1683. and Hagerman. 30 DIA-UADEC . E. A. Agric Food Chem. La curva de calibración se empieza a realizar a partir del punto número 7. 6mm.75 mL de etanol.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Se adicionaron 1. la adición de éste reactivo se llevó a cabo en un congelador a –20 °C.45 m para obtener así una dilución 1:2 de cada muestra en los viales que después fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). luego las muestras se destapan y se colocan de nuevo en la estufa de calentamiento bajo las mismas condiciones.5 mL de ácido sulfúrico metanólico (éste reactivo se prepara adicionando 0. 30 °C de temperatura con las siguientes condiciones para las fases móviles (% A = metanol. % C = ácido acético 3 %): 31 DIA-UADEC . Luego de que los solventes fueron evaporados a cada tubo se le adicionaron 1.8 mL de capacidad y a cada vial se les agrega 0. se toman 0.190 mL ácido sulfúrico concentrado por cada ml de metanol que se requiera). 250 mm x 4. para evaporar los solventes que se utilizaron para realizar la hidrólisis de las muestras. el cual también se filtra por membranas de 0.5 ml de capacidad y se someten a centrifugación a 6000 rpm por 30 minutos.45 m y se colocaron en viales de vidrio de 1. esto para eliminar los compuestos hidrosolubles presentes en las muestras.5 mL de etanol. % B = acetonitrilo. los sobrenadantes son descartados y a los precipitados se les adicionaron 1. volumen de inyección de 10 L. y un aparato para HPLC de la marca Varian con las siguientes condiciones de operación: Una columna Varian Persuit c18 5 m.75 mL de cada muestra. Después de éste protocolo de extracción de ácido elágico. después los tubos cerrados herméticamente se colocaron en una estufa de calentamiento por 30 horas a una temperatura de 80 °C. Después de la centrifugación de las muestras.5 mL de agua y se pasan a tubos Eppendorf de 1. luego las muestras se someten a vibración sónica por 20 minutos. Para la cuantificación de ácido elágico se empleó un espectrofotómetro Cary Bio 50 de la marca Varian. se filtran por membranas de 0. con un flujo de 1 mL/min. 0 1. Para la cuantificación de ácido gálico mediante HPLC es necesario realizar primeramente una curva de calibración. Universidad Autónoma de Coahuila. Cuantificación de ácido Cromatografía líquida resolución (HPLC) 12 gálico de por alta Mónica Lizeth Chávez González Laboratorio de Fermentaciones.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Condiciones para el análisis por HPLC... Rodríguez-Herrera. Aguilar. Preparación de la curva de calibración.N.0 J. México. C.0 1. Para lo cual se 32 DIA-UADEC .0 1. R. A.0 1.. J. Facultad de Ciencias Químicas.0 1. (2010). Martínez-Hernández. Saltillo. 64: 528 – 532.0 1. 1. Euphorbia antisyphilitica residues as a new source of ellagic acid. Chemical Papers.L. Departamento de Investigación en Alimentos. Coahuila. Tiempo (min) Inicial 10 20 25 26 31 40 Referencia Ascacio-Valdés.. %A %B %C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 30 60 30 0 100 100 80 70 40 70 100 Aguilera-Carbó. 25280. Flujo (1 mL/mi n). C= ácido acético 3%).45 µm. Las condiciones de uso del equipo son: • Columna Optisil ODS 5 μm 250 mm x 4. A partir de ésta solución se realizarán diluciones. tantas como las que el operador considere necesarias para posteriormente interpolar sus resultados. en los cuáles el tiempo de retención del ácido gálico estará dado alrededor de 33 DIA-UADEC . B= Una vez analizadas las muestras. Las muestras se depositarán en los viales especiales para el equipo Condiciones de operación de HPLC: Los viales que contienen tanto la curva de calibración como las muestras a analizar serán colocadas de manera ordenada en el carrusel del equipo. Se verificará que la numeración de la lista en el programa del equipo corresponda con la del carrusel. serán microfiltradas por membrana de 0. • Volumen de inyección de 10 μL. • Temperatura ambiente.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento empleará un estándar de ácido gálico. Preparación de las muestras Como cualquier otra muestra HPLC.45 µm. Lo anterior con la finalidad de evitar la obstrucción de la columna y/o conexiones dentro del equipo. La solución estándar será preparada con una concentración de 500 ppm. • Flujo de 1 mL/min. Una vez preparada las diluciones.6 mm. se obtendrán cromatogramas. (A= metanol. • Fases móviles a régimen de gradientes acetonitrilo. deberá ser que será introducida en el equipo de previamente filtrada (de ser necesario) y posteriormente microfiltrada empleando una membrana de 0. tanto de la curva de calibración como la de las muestras.6 min. Facultad de 34 DIA-UADEC . ácido tánico. fructosa y etanol por HPLC Miguel Ángel Medina Morales Laboratorio de Microbiología. del (2011). Referencia Chávez-González. Departamento de Investigación en Alimentos.L. de la Universidad Autónoma de Coahuila. Se tomarán y medirán las áreas bajo los picos a este tiempo de retención. biodegradación M. 13 Cuantificación de glucosa. La cuantificación del ácido gálico se llevará a cabo interpolando las áreas de las muestras con las de la concentración conocida en una hoja de Excel.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento los 5. Contribución Tesis de al estudio maestría. ). El tiempo de análisis de cada muestra es de 30 minutos. Las muestras a analizar deben de estar disueltas en la fase móvil para evitar interferencias al momento de obtener los cromatogramas correspondientes. Aprovechamiento biotecnológico del mango (Mangifera indica L. Referencia Buenrostro-Figueroa. Facultad de 35 DIA-UADEC . Universidad Autónoma de Coahuila. Para cada uno de los analitos debe de prepararse una curva de calibración para ser integrada después con las lecturas y realizar la cuantificación.6 mL/min de flujo Las muestras deben de ser colocadas en viales para HPLC previamente filtradas por membranas de 0. Departamento de Investigación en Alimentos. Una de las alternativas para la detección y cuantificación de etanol es el uso de HPLC (High Performance Liquid Chromatography). 94 páginas.2 µm. México. Materiales  HPLC o o o o o Detector con arreglo de diodos Detector de índice de refracción (IR) Columna Metacarb 67H Organic acids 300 x 6. Coahuila. 25280. Tesis de Maestría.04 N (Fase móvil) 0. Saltillo.45 o 0. 14 Determinación de actividad tanasa por el método de rodanina metanólica Luis Víctor Rodríguez Durán Laboratorio de Microbiología. La temperatura de la columna debe de ser de 40 °C y 35 °C en el IR. Universidad Autónoma de Coahuila.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Ciencias Químicas.5 mm H2SO4 0. cetotiazolidina. muestra y control. se colocaron 0. Ensayo Las soluciones se pre-incubaron a 30 ° C durante 5 .Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Ciencias Químicas. Saltillo. México. el ácido gálico y la rodanina deben protegerse de la luz. los tres tubos se incubaron 5 36 DIA-UADEC .01M en buffer de citratos 50 mM a pH 5.25 mL del extracto enzimático. Coahuila. Reacción catalizada por la tanasa y posterior reacción del ácido gálico con la rodanina Reactivos Para la cuantificación de la actividad tanasa se requieren 5 soluciones:      Buffer de citratos 50 mM a pH 5.0. utilizando como sustrato para la tanasa un éster del ácido gálico (metil-galato).0) *El metil-galato.667% p/v en metanol KOH 0. Se etiquetaron tres tubos de ensaye como blanco. Figura 1. Universidad Autónoma de Coahuila.10 minutos. 1).01M en buffer de citratos (50 mM pH 5.25 mL de buffer de citratos y al tubo muestra se le agregaron 0. La medición del ácido gálico se basa en la formación de un cromóforo entre dicho ácido y la 2-tio-4.5 N Ácido gálico 100 ppm en buffer de citratos (50 mM pH 5.25 mL de metil-galato 0. Al tubo blanco se le añadieron 0.0) Rodanina 0.0 Metil-galato 0. Fundamento El método consiste en la medición del ácido gálico liberado durante la reacción enzimática. también conocida como rodanina (Fig.   L  L   5mL   0. se adicionaron 0.G.25mL    1gA.    1106 molA. Después se agregaron 4 mL de agua destilada.    170.  1molA.G.667 % p/v). se incubó a 30 °C por 5 min. se agregaron 0. En la figura 2 se muestra un esquema de esta técnica.G. Se leyó la absorbancia a 520 nm en un espectrofotómetro. se agitó el contenido de los tubos y se incubaron durante 10 minutos a 30 °C.2 mL de hidróxido de potasio (0. Se agrega el extracto enzimático al tubo control.G. Y se calculó con la ecuación 2: UI  mgA.G.    1molA. Departamento Después de la incubación.     1   5 min   37 DIA-UADEC .    1000mgA.3 mL de rodanina metanólica (0.G.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas minutos a 30 °C.G.12 gA.G. La unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de ácido gálico por min.5 N) y se incubó otros 5 min. Cálculos Para cuantificar el ácido gálico liberado se restó la absorbancia del tubo muestra a la absorbancia del tubo control (ecuación 1) y se calculó la concentración a partir de una curva estándar de 0 a 100 ppm de A. en buffer de citratos. R. a continuación se mencionan las principales:    El volumen se puede reducir para ahorrar reactivos y/o muestra o para ajustar el volumen final de la reacción a la capacidad de una microplaca.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Figura 2. Referencia Sharma. se puede usar KOH de una concentración hasta 5 N. Esquema del ensayo enzimático propuesto por Sharma et al. *Cualquier modificación realizada a la técnica. S. ej. K. A spectrophotometric method for assay of tannase using rhodanine. T. (2000) Variantes Esta técnica ha sido modificada en múltiples ocasiones. K. proveniente de sistemas bifásicos acuosos). Cuando la muestra se encuentra en un buffer de muy alta capacidad amortiguadora (p. Analytical Biochemistry 279(1): 85-89. & Dawra. (2000). debe reportarse como método modificado y especificar dicha modificación. La temperatura. el pH y el tiempo de incubación pueden ajustarse de acuerdo a las características de la tanasa que se utiliza. incluyendo las antes mencionadas.. Bhat. 38 DIA-UADEC . Coahuila.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación de actividad elagitanasa 15 Reynaldo De La Cruz Quiroz Laboratorio de Microbiología.05 M) + 50 µl de extracto enzimático.  La reacción se detiene a los 10 min usando 1050 µl Etanol absoluto y se deja actuando por 10 min.  Sonicar las muestras por 15 min y filtrar con la ayuda de una pirinola con un filtro millipore de 0. Departamento de Investigación en Alimentos. CS: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citrato pH 5 (0. Materiales Reactivos Micropipetas de 100 µl a 1000 µl y de 10 µl a 50 µl. Saltillo. Puntillas de 1 ml y de 100 µl Tubos de ensaye o tubos eppendorff Gradilla Solución madre del estándar de ácido elágico Etanol absoluto Buffer de citratos pH 5 Solución de elagitaninos 1 mg/ml Procedimiento Se usaron dos controles. México.  Se deja reaccionar durante 10 min a una temperatura de 60º C en un termobaño. Universidad Autónoma de Coahuila. Mezcla reacción: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citratos + 50 µl de extracto enzimático. CE: 1 ml de buffer de citratos pH 5 (0. Facultad de Ciencias Químicas.  Se colocan los viales en el equipo HPLC para ser inyectadas las muestras y cuantificar el ácido elágico (fase móvil de ácido acético al 3 %). Preparación de solución madre del estándar del ácido elágico (AE) 5 mg de ácido elágico + 10 ml de etanol = Solución de AE a 500 ppm 39 DIA-UADEC . La mezcla de reacción contenía elagitaninos (1 mg/mL) + extracto enzimático. uno de sustrato (CS) y el otro de enzima (CE).45 µm en viales de vidrio.05 M) + 50 µl de buffer de citratos. 25280. para realizar una curva de calibración. Determinación de las condiciones de reacción de la enzima elagitanasa obtenida por Aspergillus niger GH1 en cultivo en medio sólido. 100 y 0 ppm de AE.C. 40 DIA-UADEC . Referencia Míreles-Ramírez. 200. Universidad Autónoma de Coahuila. 2008.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento A partir de la solución madre preparar soluciones a 400. Tesis de licenciatura. 300. M. México.8 Baño maría a 50 °C Reactivos para determinación de azúcares reductores (Somogyi-Nelson) Procedimiento Blanco de sustrato (BS): En un tubo de ensaye colocar 200 µL de buffer mas 50 µL de extracto enzimático Blanco de enzima (BE): En un tubo de ensaye colocar 200 µL de sustrato más 50 µL de buffer. Facultad de Ciencias Químicas. exo-glucanasa y β-glucosidasa. Saltillo.1 M a pH 4. las cuales son: actividad endoglucanasa. Coahuila.4 localizados en las regiones internas de la molécula de celulosa. Metodología Material Tubos de ensaye (13 x 100) Carboximetil celulosa a 500 ppm (Sustrato) Buffer de ACCNa 0. contribuyendo a la disminución del grado de polimerización. Mezcla de reacción (MR): 41 DIA-UADEC . Para realizar la detección de la acción responsable de la depolimerización de la celulosa es necesario determinar tres actividades enzimáticas.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación 16 de actividad endoglucanasa Miguel Ángel Medina Morales Laboratorio de Microbiología. Determinación de actividad endoglucanasa En este caso se detecta la actividad de las enzimas responsables de la hidrólisis de los enlaces β-1. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Departamento de Investigación en Alimentos. Measurement of cellulase activities. Cada una de las determinaciones debe realizarse por triplicado o de acuerdo a las muestras que se tengan. Pure & Appl.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento En un tubo de ensaye colocar 200 µL de sustrato más 50 µL de extracto enzimático. 59: 257 – 268. A cada tubo se le miden azúcares reductores. Los tubos pueden ser incubados simultáneamente. Cada tubo se coloca en baño maría durante 10 minutos y se detiene la reacción mediante ebullición en baño maría durante 5 minutos.K. T. (1987). 42 DIA-UADEC . Referencia Ghose. Chem. Coahuila. Facultad de Ciencias Químicas.4 localizados en las regiones externas de la molécula de celulosa. Se adicionan 50 µL de extracto enzimático. Departamento de Investigación en Alimentos. 43 DIA-UADEC . En este caso se detecta la actividad de las enzimas responsables de la hidrólisis de los enlaces β-1. 25280. México. Saltillo. contribuyendo a la disminución del grado de polimerización. Procedimiento Blanco de sustrato (BS): En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan 50 µL de extracto enzimático Blanco de enzima (BE): En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel filtro Mezcla de reacción (MR): En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel filtro.1 M a pH 4.8 Baño maría a 50 °C Reactivos para determinación de azúcares reductores (Somogyi-Nelson).Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación 17 de actividad exoglucanasa Miguel Ángel Medina Morales Laboratorio de Microbiología. Universidad Autónoma de Coahuila. Metodología Material Tubos de ensaye (13 x 100) Tiras de papel filtro Whatman #1 de 1 cm x 6 cm (Sustrato) Buffer de ACCNa 0. Measurement of cellulase activities. Referencia Ghose. T. Cada una de las determinaciones debe realizarse por triplicado o de acuerdo a las muestras que se tengan. A cada tubo se le miden azúcares reductores.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Cada tubo se coloca en baño maría durante 1 h y se detiene la reacción mediante ebullición en baño maría durante 5 minutos. 59: 257 – 268. Pure & Appl.K. Chem. 44 DIA-UADEC . (1987). Los tubos pueden ser incubados simultáneamente. 45 DIA-UADEC . Cada una de las determinaciones debe realizarse por triplicado o de acuerdo a las muestras que se tengan.4 localizados en la celobiosa liberada por efecto de la acción de la exoglucanasa. Metodología Material Tubos de ensaye (13 x 100) p-NPG 9 mM (Sustrato) Na2CO3 0. Departamento de Investigación en Alimentos. Procedimiento Mezcla de reacción (MR):    En un tubo se colocan 800 µL de buffer Se agregan 100 µL de sustrato A la mezcla se adicionan 100 µL de extracto enzimático Cada tubo se coloca en baño maría durante 10 minutos y se detiene la reacción agregando 100 µL de Na2CO3 0. La hidrólisis de la celobiosa libera glucosa como producto para finalizar la hidrólisis de la celulosa. Universidad Autónoma de Coahuila. A cada tubo se le miden azúcares reductores.2 M a pH 4.1 M.1 M Buffer de AAANa 0. Facultad de Ciencias Químicas. Saltillo. Coahuila. México.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Determinación 18 Departamento de actividad β- glucosidasa Miguel Ángel Medina Morales Laboratorio de Microbiología. 25280. En este caso se detecta la actividad de las enzimas responsables de la hidrólisis de los enlaces β-1.6 Baño maría a 50 °C Reactivos para determinación de azúcares reductores (Somogyi-Nelson). Los tubos pueden ser incubados simultáneamente. Food biotechnology. 46 DIA-UADEC . D y Shetty. (2002).Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Referencia Vattem. Solid-state production of phenolic antioxidants from cranberry pomace by Rhizopus oligosporus. K. 16: 189 – 210. La actividad xilanasa es la responsable de la degradación de los xilanos contenidos en la molécula de hemicelulosa Metodología Material Tubos de ensaye (13 x 100) Xilanos a 500 ppm (Sustrato) Buffer de ACCNa 0. Saltillo. Facultad de Ciencias Químicas.8 Baño maría a 50 °C Reactivos para determinación de azúcares reductores (Somogyi-Nelson) Procedimiento Blanco de sustrato (BS): En un tubo de ensaye colocar 200 µL de buffer mas 50 µL de extracto enzimático Blanco de enzima (BE): En un tubo de ensaye colocar 200 µL de sustrato más 50 µL de buffer. Departamento de Investigación en Alimentos. México. Cada tubo se coloca en baño maría durante 10 minutos y se detiene la reacción mediante ebullición en baño maría durante 5 minutos.05 M a pH 4. 25280.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Determinación de actividad xilanasa 19 Miguel Ángel Medina Morales Laboratorio de Microbiología. Coahuila. Universidad Autónoma de Coahuila. 47 DIA-UADEC . Mezcla de reacción (MR): En un tubo de ensaye colocar 200 µL de sustrato más 50 µL de extracto enzimático. Los tubos pueden ser incubados simultáneamente.. (1987). T. Part 1: Xilanasas.K. Referencia Ghose. Cada una de las determinaciones debe realizarse por triplicado o de acuerdo a las muestras que se tengan. 48 DIA-UADEC . Pure & Appl. Chem.S. Bisaria. V. 59: 1739 – 1752. Measurement of hemicellulase activities.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento A cada tubo se le miden azúcares reductores. Fundamento El radical 2.02. Coahuila. México. Universidad Autónoma de Coahuila. El cambio de coloración es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de la sustancia colocada como muestra. Saltillo. cuando encuentra un H + con el cual complementar su estructura pierde la coloración.   Ambas soluciones son en agua.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas 20 Departamento Técnica para medir reducción de ABTS Norma Paola Meléndez Rentería Laboratorio de Biología Molecular. Para muestras de alimentos y fenoles diluir con etanol. La longitud de onda para determinar absorbancia es de 734 nm. Dejarlos reposar en oscuridad por 12 h a temperatura ambiente. Técnica:  Preparar una solución de ABTS 7 mM y mezclar con una solución de K2S2O8 hasta que este ultimo tenga una concentración de 2.2-azino bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) (ABTS) posee coloración azul. Facultad de Ciencias Químicas. Para la formación del radical ABTS es necesaria la presencia de persulfato de potasio. Departamento de Investigación en Alimentos. hasta obtener  una absorbancia de 0.7 ± 0. Utilizar etanol como blanco de lectura y ABTS-etanol como absorbancia  control. 49 DIA-UADEC .45 mM. Para reportar resultados y graficar los datos. Dejar reaccionar 1 min y leer la absorbancia. 50 DIA-UADEC . Proteggente A. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Pellegrini N. Recomendaciones: El radical en etanol es estable 2 días a temperatura ambiente y en oscuridad.. Free radical biology & medicine.. RiceEvans C.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento  Añadir a la cubeta de reacción 1 mL de solución etanólica de ABTS y 10  µL de muestra. 26: 1231-1237.. Pannala A.. Yang M. pueden emplearse las relaciones de abs Vs concentración (curva de calibración) expresados como equivalentes del estándar o bien el porcentaje de reducción del radical que se calcula con la siguiente fórmula: reducci ó n de ABTS= ( AC −A m ) AC ∗100 Donde AC es la absorbancia control (ABTS-etanol) y A m es la absorbancia de la muestra. (1999). Referencia: Re R.. Departamento de Investigación en Alimentos. Cuantificar el cambio de absorbancia de manera cinética. Fundamento El radical 2. utilizando el número de Avogadro para su cálculo. expresar los resultados como equivalentes de DPPH/ g de material. Técnica:  Preparar el radical a una concentración de 60 µM. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final. Añadir a la cubeta de reacción 2900 µL de solución metanólica de DPPH y 100 µL de muestra. Emplear como blanco de lectura solo metanol y como absorbancia  control la de la solución DPPH-metanol. Si las muestras son extractos de plantas.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas 21 Departamento Técnica para medir reducción de DPPH Norma Paola Meléndez Rentería Laboratorio de Biología Molecular. México. donde  la reacción de neutralización del radical sea paulatina. cuando encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloración. Basándose en la concentración de la solución del radical y la cantidad de solución que reaccionó con la muestra. Facultad de Ciencias Químicas. en solución  metanólica. Definir el tiempo en el cual el valor de la absorbancia permanece  constante. Saltillo.2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloración morada. Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical. Si es necesario deben hacerse diluciones de la muestra. Universidad Autónoma de Coahuila. mediante un  barrido en el rango visible. 51 DIA-UADEC . Coahuila. El cambio de coloración es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de la sustancia colocada como muestra. 52 DIA-UADEC . La longitud de onda de absorción del DPPH varía entre 515 y 520 nm. pero esto influye en la  sensibilidad de la técnica. Technol. The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. debe ser 1:1. Songklanakarin J. pero siempre debe tener absorbancia menor a 1. (2004). Debe  tener 1 cm de ancho. Referencia Molyneux P. pueden emplearse también las relaciones de Abs Vs concentración (curva de calibración) o bien el porcentaje de reducción del radical que se calcula con la siguiente fórmula: reducci ó n de DPPH = ( A C − Am ) AC ∗100 Donde AC es la absorbancia control (DPPH-metanol) y A m es la absorbancia de la muestra. para cumplir la Ley de Lambert-Beer.  por eso debe determinarse la mejor para el equipo en el cual se trabaje. pero hay reacciones que ocurren en tiempo más corto (5 min) o incluso algunas que tardan más (horas). La relación de las cantidades de muestra y radical en solución. siempre y cuando este último no reaccione con los solventes empleados para disolver el radical. Se pueden modificar estos valores. 26 (2): 211-219. Recomendaciones:  Los solventes empleados para la disolución del DPPH pueden ser  metanol o etanol. El tiempo general de la reacción a punto final suele ser de 30 min. La concentración a la cual se prepara la solución del radical puede variar  de 50 a 100 µM. Sci. La cubeta de reacción puede ser plástico.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas  Departamento Para graficar los datos. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas 22 Departamento Técnica para medir reducción de DPPH en microplaca Norma Paola Meléndez Rentería Laboratorio de Biología Molecular. donde la reacción de neutralización del radical sea paulatina. Emplear como blanco de lectura solo metanol y como absorbancia   control la de la solución DPPH-metanol. Tapar con un papel aluminio para evitar el contacto  directo con la luz mientras se llenan los pocillos con DPPH y muestras. El nombre del programa en el Epoch es DPPH cinética. Saltillo. México. Técnica:  Preparar el radical a una concentración de 60 µM. Cuantificar el cambio de absorbancia de manera cinética. en solución  metanólica. Colocar en la microplaca las muestras del blanco. Se puede usar el procedimiento espectro  DPPH del software Gen 5.2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloración morada. Colocar en la microplaca 193 µL de solución DPPH-metanol y 7 µL de la muestra a analizar. cuando encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloración. Departamento de Investigación en Alimentos. mediante un barrido en el rango visible. El cambio de coloración es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de la sustancia colocada como muestra. 53 DIA-UADEC . Si es necesario deben hacerse diluciones de la muestra. Universidad Autónoma de Coahuila. Facultad de Ciencias Químicas. Fundamento El radical 2. Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical. Coahuila. debe ser 1:1. expresar los resultados como equivalentes de DPPH/ g de material. El tiempo general de la reacción a punto final suele ser de 30 min. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final. pero siempre debe tener absorbancia menor a 1. Se pueden modificar estos valores. utilizando el número de Avogadro para su cálculo. La longitud de onda de absorción del DPPH varía entre 515 y 520 nm. Si se incuba fuera del equipo la reacción debe taparse la placa con papel aluminio para evitar al máximo el contacto con la luz. Recomendaciones:  Los solventes empleados para la disolución del DPPH pueden ser  metanol o etanol. 54 DIA-UADEC . pero hay reacciones que ocurren en tiempo más corto (5 min) o incluso  algunas que tardan más (horas).Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento  Definir el tiempo en el cual el valor de la absorbancia permanece  constante. Basándose en la concentración de la solución del radical  y la cantidad de solución que reaccionó con la muestra. por eso debe determinarse la mejor para el equipo en el cual se trabaje. pero esto influye en la  sensibilidad de la técnica. Para graficar los datos. Si las muestras son extractos de plantas. pueden emplearse también las relaciones de Abs Vs concentración (curva de calibración) o bien el porcentaje de reducción del radical que se calcula con la siguiente fórmula: reducci ó n de DPPH = ( A C − Am ) AC ∗100 Donde AC es la absorbancia control (DPPH-metanol) y A m es la absorbancia de la muestra. La concentración a la cual se prepara la solución del radical puede variar  de 50 a 100 µM. La relación de las cantidades de muestra y radical en solución.  Para el Epoch la longitud de onda puede ser de 514-518 nm. Modificar el tiempo de lectura del programa DPPH punto final del  software Gen 5. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Referencia: Departamento Molyneux P. Songklanakarin J. (2004). Sci. The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Technol. 26 (2): 211-219. 55 DIA-UADEC . etc. Para las mediciones voltamperométricas se utiliza un potenciostato. Saltillo. Fundamento Esta técnica consiste en la evaluación del potencial rédox de los compuestos antioxidantes mediante la aplicación de un barrido de potencial.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas 23 Departamento Evaluación electroquímica actividad anti-radicalaria de la Dulce Abril Flores Maltos Laboratorio de Microbiología.La voltamperometría cíclica (VC) y voltamperometría diferencial de pulsos (VDP) se realiza en un potenciostato/galvanostato.). Coahuila. mientras que la evaluación electroquímica del poder antioxidante se evalúa por VDP en un intervalo de potencial de -50 a 900 mV. platino. Procedimiento Las soluciones deben analizarse inmediatamente después de la preparación. Referencia 56 DIA-UADEC . Facultad de Ciencias Químicas. la celda electroquímica debe constar de tres electrodos: electrodo de trabajo (carbón vítreo. para la caracterización electroquímica del electrodo se utiliza la voltametría cíclica. México. oro. Al mismo tiempo se mide la corriente eléctrica generada entre el electrodo de trabajo y el contra-electrodo. Departamento de Investigación en Alimentos. desde el cual se controla el barrido de potencial entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo. siendo posible cuantificar la respuesta dada en valores de corriente. Universidad Autónoma de Coahuila. debida al movimiento de cargas eléctricas en la interfase electrodo-solución. Antes de los ensayos se realiza un barrido de rutina usando voltamperometría cíclica para la reacción de Fe 3+/Fe2+ para la caracterización del electrodo de trabajo. contraelectrodo y un electrodo plata-cloruro plata (Ag/AgCl) como referencia a los potenciales. El potenciostato conectado a una computadora se controló con el programa del equipo y se utilizaron diferentes protocolos de medición. para evitar la cristalización del azúcar. Tesis de Maestría. ya que el agua es un “llenador barato”. cereales preparados . endulzantes. Saltillo. 24 Secado de muestras y determinación de materia seca total Romeo Rojas Molina Laboratorio de Tecnología de Alimentos. Universidad Autónoma de Coahuila. Departamento de Investigación en Alimentos. productos 57 DIA-UADEC . apariencia y gusto de los productos. influye en las estructura.  La determinación de humedad se utiliza como factor de calidad de: jaleas y ates. 25280. En alimentos. Universidad Autónoma de Coahuila. así:  El contenido de humedad es un factor de calidad en la conservación de algunos productos. Coahuila.A. Facultad de Ciencias Químicas. La determinación de humedad puede ser el análisis más importante llevado a cabo en un producto alimentario pero es posible que sea el análisis del que se obtienen resultados poco exactos y precisos.  Se utiliza una reducción de humedad por conveniencia en el empaque y/o embarque de: leches concentradas. huevo en polvo. leches deshidratadas.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Flores-Maltos.convencionales (4-8%). (2010). químico o microbiológico) y permite determinar adulteraciones. papas deshidratadas y especias. Este valor analítico es de gran importancia económica para un fabricante de alimentos. determina su susceptibilidad al deterioro (físico. ya que afecta la estabilidad de: frutas y vegetales deshidratados. jarabes azucarados. Introducción La humedad es una de las determinaciones más importantes y ampliamente usadas en el control y procesamiento de muestras. México. Desarrollo de un microelectrodo para la evaluación del poder antioxidante total del extracto de damiana. D. inflados (78%). en las carnes procesadas por lo común se especifica el porcentaje de agua añadida.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento deshidratados (éstos son muy difíciles de empacar si poseen un alto contenido de humedad. así.  El contenido de humedad se especifica a menudo en estándares de identidad. Obviamente. La forma de preparar la muestra para este análisis quizá sea la fuente de error potencial más grande. Se debe minimizar cualquier probabilidad de calentamiento de la muestra mientras se muele. El contenido de humedad de los alimentos varía enormemente y es un constituyente principal en la mayoría de los productos alimenticios. el queso cheddar debe tener <39% de humedad. cualquier exposición de la muestra a la atmósfera abierta debe ser tan breve como sea posible. con base en el peso seco). así que se deben tomar precauciones para minimizar las pérdidas o ganancias de agua inadvertidas que ocurren durante estos pasos. líquidas. jugos de frutas concentradas. para harinas enriquecidas el contenido de humedad deberá ser <15%.  Todos los cálculos de valor nutricional requieren del conocimiento previo del contenido de humedad. El método es aplicable en muestras sólidas. Fundamento y alcance La materia seca que permanece en el alimento posterior a la remoción del agua se conoce como sólidos totales. pastosas no susceptibles a degradación al ser sometidos a temperaturas superiores 58 DIA-UADEC . Los datos sobre contenido de humedad se utilizan para expresar los resultados de otras determinaciones analíticas en una base uniforme (por ejemplo. de la muestra desecada hasta peso constante en estufa. Es por eso que este método se basa en la determinación gravimétrica de la pérdida de masa. Sacar un crisol de porcelana de la estufa. 3. Este método es inadecuado para muestras ricas en sustancias volátiles distintas al agua.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento a 100 °C. 5. 6. Pesar. Pesar en balanza analítica. 2. 7. 6. CALCULOS 59 DIA-UADEC . Secado de muestras 1. 1989) 1. Sacar muestra y enfriar por 15-20 min en desecador. Colocar el crisol en un desecador para que se enfríe por un tiempo de 15-20 min. Cortar la muestra en trozos de 1 cm aproximadamente. Poner la muestra en el crisol y meterla a la estufa por 24 h (arriba de 100 °C). pesar 2 g de muestra seca sobre un papel limpio. 5. 4. 13.21. Por separado. Cálculos MSP= Peso de muestra seca x 100 Peso de muestra humeda 100− MSP= Humedad Determinación de materia seca total (Método indirecto por secado en estufa. CAA. 3. Pesar la charola con la muestra cortada. 4. Pesar nuevamente la charola con muestra seca. 2. Sacar la muestra de la estufa y enfriar a temperatura ambiente por 3 min. Registrar el peso. utilizando unas pinzas. Registrar el peso húmedo y colocar la charola dentro de la estufa a una temperatura de 55-60 °C por 24 h. poner a peso constante e identificarlo con el número que se encuentra en este. Coahuila. Introducción La determinación de cenizas es también conocida como el análisis de residuos inorgánicos que quedan después de la ignición u oxidación completa de la materia orgánica de un alimento. Official Methods of Analysis. Saltillo. A.A. Fundamento y alcance 60 DIA-UADEC . NCh 841 of 78. existen tres tipos de análisis de cenizas: cenizas en seco para la mayoría de las muestras de alimentos.C. 25280. Departamento de Investigación en Alimentos. Para esto. Referencia Instituto Nacional de Normalización. Universidad Autónoma de Coahuila.O. Facultad de Ciencias Químicas. Es esencial el conocimiento básico de las características de varios métodos para analizar cenizas así como el equipo para llevarlo a cabo para garantizar resultados confiables. México. 15 th Edition 1990 25 Determinación de cenizas Romeo Rojas Molina Laboratorio de Tecnología de Alimentos. cenizas húmedas (por oxidación) para muestras con alto contenido de grasa (carnes y productos cárnicos) como método de preparación de la muestra para análisis elemental y análisis simple de cenizas de plasma en seco a baja temperatura para la preparación de muestras cuando se llevan a cabo análisis de volátiles elementales.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas MST = Departamento Peso crisol con muestra seca−Peso de crisol solo x 100 g de muestra H =100− MST NOTA: Realizar la determinación por triplicado y la diferencia no debe ser superior al 5 % del promedio. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento La técnica que se describirá a continuación es la de cenizas en seco. 2. Materiales. La ceniza remanente es el residuo inorgánico y la medición de la ceniza total es útil en el análisis de alimentos. pesar (anotar el peso exacto) y colocar 1 ó 2 g de muestra seca dentro del crisol. a baja temperatura para evitar salpicaduras hasta que deje de sacar humo. Sacar de la mufla y enfriar 15-20 min en desecador. Poner a peso constante (100 °C/24 h) un crisol o cápsula de porcelana por cada muestra que se va a analizar. Cálculos C= Peso del crisol con cenizas−Peso del crisol solo x 100 g de muestra 61 DIA-UADEC . 4. 6. reactivos y/o equipos        Muestra seca Crisoles Balanza analítica Parrilla de calentamiento Mufla Desecador Pinzas Procedimiento 1. Pesar en la balanza que se utilizó inicialmente (anotar peso exacto). Pre-incinerar en un mechero o parrilla eléctrica. Pasar a la mufla a 600 °C por 2-3 h. la cual consiste en quemar la muestra al aire y posteriormente en una mufla para eliminar todo el material orgánico. 5. 3. Enfriar el crisol por 15-20 min en desecador. ya que se pueden determinar diversos minerales contenidos en la muestra. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento NOTAS  No poner cinta a los crisoles para identificarlos. FUNDAMENTO La muestra seca se extrae con algún disolvente (hexano. 1977.A. 1980. 2.C.O. Ranganna. Manual of Analysis of Fruits and Vegetable Products. refrigerante. Saltillo. 4. 5. Universidad Autónoma de Coahuila. Official Methods of Analysis. 6. Referencia Instituto Nacional de Normalización. S. NCh 841 of 78. Extractor soxleth (sifón. Washington. del que se elimina el disolvente). D. Association of Official Analytical Chemists. México. Una forma rápida de poner a peso constante los crisoles es meterlos por 15 min a la mufla a una temperatura de 550-600 °C y enfriar en desecador por 15-20 min (no cerrar completamente el desecador ya que el calor de los crisoles puede provocar que la tapa se proyecte y se rompa). McGraw-Hill. 15 th Edition 1990 AOAC. A. éter etílico.C. 25280. éter de petróleo) posteriormente se determina el extracto seco por diferencia de peso. 3. Facultad de Ciencias Químicas. 26 Determinación de lípidos (Método de Soxhlet ) Ismael Menera López Departamento de Investigación en Alimentos. manta de calentamiento) Cartucho poroso de celulosa o papel filtro Parilla eléctrica. MATERIAL Y EQUIPO 1. Official Methods of Analysis. o manta de calentamiento Regulador de voltaje Estufa de secado a 100 – 103°C Balanza analítica 62 DIA-UADEC . Usar el número  impreso en el crisol por el fabricante. Coahuila. acoplar el refrigerante del depósito soxleth. International. m= Peso de la muestra (g). Washington. boca esmerilada de la estufa que este a peso constante.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 7. éter de petróleo o hexano) hasta la mitad del matraz. Disolvente METODOLOGÍA Colocar de 2 – 5 g en papel filtro de muestra o en un cartucho de celulosa de poro mediano. adicionar el disolvente (éter etílico. AOAC. Association of Official Analytical Chemists. m2 = Matraz con extracto etéreo (g). D.C. sacar. el cual se coloca en el anterior del sifón de un aparato de extracción Soxleth. 63 DIA-UADEC . transcurrido el tiempo. m1 = Matraz a peso constante (g). Official Methods of Analysis. enfriar y pesar. al finalizar la extracción colocar a peso constante nuevamente el matraz bola fondo plano en la estufa a 100 – 103°C por 24 horas. Sacar un matraz redondo plano. Extraer por un periodo de 4-5 horas. Cálculos: %G = m2 – m1 m x 100 Donde: %G = Porcentaje de extracto etéreo. 15th Edition. enfriar por 30 minutos y pesar.1990. Referencias AOAC. La pared celular de células vegetales. lignina y hemicelulosa. Aunque este material pueda digerirse parcialmente por la microflora intestinal raramente la digestión es total. Departamento de Investigación en Alimentos. Introducción La fibra cruda es el residuo orgánico combustible e insoluble que queda después de que la muestra se ha tratado con una solución acida y otra alcalina diluida hirviendo. 64 DIA-UADEC . Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. contiene la mayor parte del material resistente a las enzimas del tracto gastrointestinal de los mamíferos. México.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas 27 Departamento Determinación de fibra cruda Emilio Ochoa Reyes Laboratorio de Tecnología de Alimentos. que consiste principalmente del contenido de celulosa. Facultad de Ciencias Químicas. Saltillo. Coahuila. este tratamiento proporciona la fibra cruda. y se hace reaccionar con ácidos y álcalis en caliente. Metodología 1. La fibra está compuesta de fibra insoluble (celulosa. 65 DIA-UADEC . 4. Aunque este material pueda digerirse parcialmente por la microflora intestinal. Pesar 2 g de muestra sin grasa.225 N. Conectar al aparato de reflujo por un periodo de 30 min contados a partir de cuando empiece a hervir. Fundamento y alcance Para determinar la cantidad de fibra cruda el material debe estar desengrasado. La pared celular de las células vegetales. al hervir bajar la temperatura. 6.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento La fibra también proporciona propiedades físicas a los alimentos. Pasar la fibra (residuo que quedo en la tela de lino) al vaso Berzelius con 100 mL de solución de hidróxido de sodio 0. Transcurrido el tiempo secar y filtrar a través de tela de lino y lavar con 3 porciones de 100 mL de agua destilada caliente y hacer prueba de papel tornasol para verificar presencia de ácido. 2. raramente la digestión es total. hemicelulosa. Poner la muestra en un vaso Berzelius Agregar 100 mL de solución de ácido sulfúrico 0. y generalmente baja la densidad calórica de los alimentos. y generalmente baja la densidad calórica de los alimentos. para que se mantenga en ebullición suave. 5. la diferencia de pesos entre los residuos seco y calcinado corresponde a la fibra cruda.313 N y conectar al aparato de reflujo por 30 min. el residuo se seca y se calcina. La fibra también le da las propiedades físicas a los alimentos. lignina y almidon resistente) y fibra soluble (inulina. 3. pectinas y mucilagos). contiene la mayor parte del material resistente a las enzimas del tracto gastrointestinal de los mamíferos. Escurrir el exceso de agua presionando la tela de lino. Saltillo. Facultad de Ciencias Químicas. Laboratorio de Tecnología de Alimentos2. Sacar la tela del lino del embudo.Calcular.Poner a peso constante en la estufa a 100-103 °C por 12 h. A.A.Pre-incinerar la muestra en parrilla y meter en la mufla a 550-600 °C por 2-3 h. Coahuila. Introducción En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. Transcurrido el tiempo sacar y filtrar a través de lino y lavar con 3 porciones de agua destilada caliente y hacer prueba de papel tornasol para verificar si hay presencia de reacción alcalina. México. 8. 10. enfriar (a peso constante en desecador) y pesar. Departamento de Investigación en Alimentos.Sacar. 25280. NCh 841 of 78.C. previamente identificado. 15 th Edition 1990 28 Determinación de nitrógeno por el método Kjeldahl Miguel Ángel Medina Morales1 y Romeo Rojas Molina2 Laboratorio de Microbiología1. 12. El nitrógeno orgánico total es convertido en sulfato de La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido bórico.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 7. Universidad Autónoma de Coahuila. 9. Cálculos %FC= peso crisolcon fibra seca− pe so crisol fibra cenizas x 100 g de muestra Referencia Instituto Nacional de Normalización. 11. Los aniones del borato 66 DIA-UADEC . enfriar (a peso constante en desecador) y pesar 14. 13.Sacar de la estufa. amonio. Official Methods of Analysis. extender y retirar la fibra con una espátula y depositarla en un crisol de porcelana.O. C -NH2 + mH2SO4 proteína catalizadores calor CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) borato) 2NH 3 + Na2SO4+ NH 4 + H2BO3- (ión 67 DIA-UADEC . También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiado selenio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente. Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una descomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C. la digestión incompleta de la muestra. Reacciones llevadas a cabo en el método de Kjeldahl DIGESTIÓN (1) n . la pérdida de nitrógeno durante la digestión. El resultado del análisis representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no protéicos. Fuentes de error Constituyen fuentes de error en este método son: la inclusión de nitrógeno no protéico como parte de la proteína.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento así formado se titulan con HCl estandarizado. lo cual se convierte en el nitrógeno de la muestra. las condiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores. frasco gotero de 25 ml. embudo de cristal chico o mediano. Ácido clorhídrico 0. pinzas (nueces). Mezcla catalizadora para la digestión: 2. matraz de Erlenmeyer de 10 ml. piseta grande con agua destilada. par de guantes de asbesto. REACTIVOS        Verde de bromocresol al 0. cuerpos de ebullición.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento TITULACIÓN El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl estandarizado: H2BO3. Ácido sulfúrico concentrado. Hidróxido de sodio al 30%.5 g de dióxido de selenio + 100 g de sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre 68 DIA-UADEC .+ H+ (4) H3BO3 MATERIAL                 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 matraz de digestión Kjeldahl con capacidad de 125 ml. frasco lámbar con capacidad de 1 litro.01N (solución valorada). pinzas largas. matraz volumétrico de 100 ml. mechero de Bunsen. microbureta. EQUIPO  Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).  1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo). Rojo de metilo al 0. Ácido bórico al 2%. pipeta de 10 ml.1% diluido en alcohol al 95%.1% diluido en alcohol al 95%. soporte universal pipeta de 5 ml. 6.Disuelva 150g de perlas de hidróxido de sodio en 350 ml.1% y el rojo de metilo al 0. MÉTODO ELABORACION DE REACTIVOS 1.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento pentahidratado (proporcionada por la coordinación de laboratorios).Prepare por separado los indicadores verde de bromocresol al 0. Se conserva indefinidamente.Prepare un litro y valórela con una solución de NaOH de la misma normalidad....Disuelva 10 g de ácido bórico (en cristales) en 500 ml.. Mezcle 10 ml.Ácido Clorhídrico 0.. Almacene la solución en un frasco ámbar con tapón de vidrio. de verde de bromocresol con 2 ml.01N. transfiera la solución a un frasco Después de que se enfríe tapado.. 100g de sulfato de potasio (K 2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 . de agua destilada hirviendo. 3. 5H2O).Mezcle 2.5g de dióxido de selenio (SeO2). de la solución de rojo de metilo en un frasco gotero... 4.Ácido Bórico al 2%. 69 DIA-UADEC . de agua destilada. 2..Hidróxido de Sodio al 30%.. 5.Catalizadores para la Digestión..H2SO4 concentrado.Mezcla Indicadora.1% diluidos en alcohol al 95%. 0 g de mezcla catalizadora. 3. 2..5 ml.Enfríe el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al solidificarse la muestra.Si es posible ajuste la velocidad de destilación a aproximadamente 5 ml. por minuto 8.Añada 2.- Añada 7 ml.Añada la muestra a la cámara de ebullición por medio de un embudo (para recuperar las perlas de ebullición) y enjuague el matraz con aproximadamente 5ml... a la muestra digerida. de H2O cuidadosamente.. 7. 9. La digestión terminará cuando el color de la muestra sea azúl-verde claro. El proceso tomará aproximadamente 90 minutos. 5. de H2SO4.. poco a poco.15g de harina de trigo en un matraz de microKjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las parédes o al cuello del matraz.Encienda la unidad destiladora.Pese exactamente 0. Destilación 6.. 70 DIA-UADEC . 4. Mezcle y permítale enfriarse.Abra la llave del agua para tener H 2O circulando por el refrigerante todo el tiempo..Someta a digestión la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una campana de extracción.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento PROCEDIMIENTO Digestión 1. de H2O destilada. con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestión. rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. dos perlas de ebullición y aproximadamente 1.. 14.. Sólo se abre cuando se enjuaga el destilador.Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador. del destilado (4-5 minutos). Si queda todavía un poco de agua en el fondo permita que hierva para que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. Cada vez que se añada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora para el enjuague deje que ésta hierva primero. NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posición horizontal) durante el procesamiento de la muestra. 13.- Añada aproximadamente 10 ml. El destilado estará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor..- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando la cámara de ebullición varias veces con agua destilada. Esta operación se repite al menos unas 4 veces. 11.Colecte aproximadamente 20 ml.Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de ácido bórico y 2 gotas de indicador bajo la salida de destilación. La mezcla digerida se Si no cambia de color añada más NaOH.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 10. 12. Luego abra la llave de la parte que permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. tornará oscura (azúl-gris o café oscuro). El matraz estará listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la unidad destiladora. Una vez vacía la parte en donde se procesa la muestra asegúrese de que esté bien vacía. 71 DIA-UADEC .. de la solución de NaOH a la cámara de ebullición LENTAMENTE. Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Titulación 15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de la titulación. Compárese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH 3 o a un equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg está dado por miliequivalentes del ácido X 14 (el peso equivalente del N). Recuperación del amoníaco Una posible fuente de variación en este método es la pérdida del gas amoníaco o una falla en atrapar el amoníaco en el ácido bórico. Esto puede ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una técnica para buscar la recuperación del amoníaco consiste en destilar cantidades conocidas de amoníaco líquido y titularlo con HCl. Se obtendrá otra vez el color púrpura en el ácido bórico. Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solución de sulfato de amonio. Añada 5, 10 ó 15 ml (mediante una pipeta) de solución de sulfato de amonio a la cámara de ebullición de la unidad destiladora. Enjuáguela después con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de ácido bórico + indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado. Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl empleados y calcule el peso del nitrógeno en el (NH4)2SO4. Cálculos Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra % N = NHCl x Volumen de ácido corregido x 14 g N x 100 g de muestra mol 72 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento en donde: NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml. Volumen del ácido corregido = (ml. del ácido estandarizado para la muestra) - (ml. de ácido estandarizado para el blanco). 14 = Peso atómico del nitrógeno. Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de proteína cruda. El porcentaje de N en proteína para el harina de trigo es de 18% y su factor de conversión es de 5.70. Referencia A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Methods of Analysis. Washington, D.C. Official 73 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Extracción de ADN (método de CTAB) 29 Mariana Delgado García Laboratorio de Biología Molecular. Departamento de Investigación en Alimentos. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, México. La extracción de ADN por la técnica de CTAB fue propuesta por Doyle y Doyle (1987). Este método es apropiado para le extracción y purificación del ADN de plantas, productos alimenticios, cepas fúngicas, y es utilizado para la eliminación de polisacáridos y componentes polifenólicos, que afectan la pureza del ADN, por lo tanto la calidad de este. La técnica consta de tres pasos. El primero consta de una lisis de la pared celular. La muestra se trata con un buffer que contiene EDTA, Tris/HCl y CTAB, de esta manera se eliminan los lípidos y las proteínas de la pared celular. El CTAB tiene la función de capturar los lípidos y así, liberar el ADN. El EDTA es un componente quelante, que con otros metales se enlaza al Mg el cual es un cofactor de las ADNasas, por lo que al unirse el Mg con el EDTA se reduce la actividad de estas enzimas. El Tris/HCl da a la solución un pH adecuado para el ADN no se dañe. La extracción total de ADN, se realiza utilizando una solución de cloroformoalcohol isoamílico el cual facilita la eliminación de polisacáridos, proteínas, etc. Extracción: En este paso, los polisacáridos, compuestos fenólicos, proteínas y otros lisados celulares son disueltos en una solución acuosa, separados del CTAB y complejos ácidos nucleicos. La eliminación de polisacáridos así como de compuestos fenólicos es particularmente importante, por su capacidad de inhibir un gran número de reacciones enzimáticas. Normalmente la fase acuosa se forma en la parte superior, sin embargo, si la fase acuosa es densa, por la concentración de sal (0.5M), se forma en la parte inferior. En suma, los ácidos 74 DIA-UADEC Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento nucleicos en la fase orgánica tienden a partirse si el pH de la solución acuosa no ha sido adecuadamente equilibrado de un valor de pH de 7.8-8.0, de ser necesaria la extracción con cloroformo se realiza dos o tres veces para así remover completamente las impurezas de la capa acuosa. La última etapa que es la precipitación, se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada. Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual. Protocolo: 1. Pesar 0.1g de material a extraer y se envuelve en papel aluminio etiquetado previamente. 2. Colocar las muestra dentro del termo de nitrógeno líquido por 10 +/- 2 minutos. 3. Inmediatamente después macerar la muestra a polvo fino con un mortero esterilizado y congelado previamente. NOTA: A partir de este momento se requiere utilizar guantes de látex y bata de manga larga. 4. Transferir el tejido macerado a un tubo de 1.5ml previamente esterilizado y etiquetado. Agregar 1ml de buffer de extracción CTAB más 20µl de albúmina sérica bovina al 20%. 5. Mezclar con un paso en vortex ligero. Sumergir el tubo en baño maría a 55ºC por 20 minutos. 6. Centrifugar en la ultracentrífuga a 12,000rpm por 5 minutos. Obtener con micropipeta (cuidando utilizar puntillas estériles), el líquido 75 DIA-UADEC 5ml la fase acuosa (fase superior de la solución). Centrifugar en la ultracentrífuga por 10 minutos a 12. Centrifugar a 12.5ml previamente esterilizado y etiquetado. Doyle J. 7. 12. Seguir el paso 8 y continuar con el siguiente paso. NOTA: A partir de esta etapa las muestras deben permanecer refrigeradas Referencia. Mezclar por inversiones suaves durante 1-2 minutos. Transferir a otro tubo estéril de 1. Agregar 50µl de acetato de amonio 7. Agregar el mismo volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) al tubo con el sobrenadante.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.000rpm por 5 minutos y descartar el sobrenadante. Colocar en un congelador por 60 minutos. Mezclar por inversiones suaves. Doyle J. NOTA: de manera opcional se puede obtener el líquido sobrenadante y volver a mezclarse con un volumen equivalente de cloroformo: alcohol isoamílico 24:1 para volverse a lavar. Colocar el tubo destapado en posición invertida hasta que el olor a etanol desaparezca. 8. 9. Resuspender el ADN con 80µl de NaOH 8mM. 11. 10.5M más 800µl de etanol frío al 96%.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo de 1. Refrigerar las muestras.J.000rpm. Lavar la pastilla adherida al tubo (que es el ADN) dos veces con etanol al 70% (v/v) mezclado cada vez por inversión suave. Phytochem Bull 19:11-15 76 DIA-UADEC . 13. Universidad Autónoma de Coahuila. Facultad de Ciencias Químicas. Coahuila.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Ensayo in vitro de actividad antifúngica 30 Miguel Ángel De León Zapata Laboratorio de Fermentaciones. Saltillo. porcentaje de inhibición y el impacto del proceso biotecnológico de fermentación fúngica de plantas para la obtención de extractos vegetales con actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos. El presente ensayo es para determinar el porcentaje de crecimiento. México. Para la conservación fúngica se utiliza un sistema 77 DIA-UADEC . los cuales se activan en agar papa dextrosa y se incuban a una temperatura de 30 º C durante cinco días. 25280. Departamento de Investigación en Alimentos. METODOLOGIA En el presente ensayo se evalúan hongos fitopatógenos. Posteriormente se llevan a incubación a una temperatura de 30º C durante 48 horas realizando observaciones periódicas cada 24 horas. Se mide el diámetro en milímetros de la zona del crecimiento del hongo en cuatro direcciones tomando como resultado el valor promedio de estas mediciones. las cuales contienen el agar PDA sólido.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento crioprotector a base de una solución leche:glicerol (9:1). Se humedecen por completo círculos de papel filtro Whatman de 2 cm de diámetro en el extracto sin fermentar y el fermentado a las diferentes concentraciones y se colocan en cada una de las cajas previamente identificadas. se definió una constante de la 78 DIA-UADEC . en éste caso se evalúa el extracto liofilizado sin fermentar y el fermentado a las diferentes concentraciones que se deseen evaluar. Este ensayo se realiza por triplicado. Para este ensayo se utilizan cajas petri. evaluado en sus respectivas concentraciones se muestra en las ecuaciones 2 y 3. Se colocan 200 μL de la solución crioprotectora con el hongo sobre el agar y se extiende uniformemente con una varilla de vidrio estéril. la determinación del porcentaje de crecimiento y el porcentaje de inhibición del hongo por el extracto vegetal liofilizado obtenido con material vegetal fermentado. Growth ( )= Diameter of fungal growth ∗100 Diameter of ne gatvie control Inhibition ( )=100− of Growth (2) (3) Para medir el impacto del proceso biotecnológico de fermentación fúngica del extracto vegetal liofilizado. P AF= AF EF AF ENF (4) Donde PAF = Potenciación de la actividad antifúngica por la aplicación del proceso de fermentación. a partir del cual se interpreta la concentración en la que se obtiene el mayor efecto potencial de la actividad inhibitoria en el crecimiento de hongos fitopatógenos. se determina al considerar que el efecto de inhibición en el crecimiento fúngico es similar con ambos o más extractos. EJEMPLO DE GRÁFICA: 79 DIA-UADEC . por lo que se procede a dividir el % de inhibición de ambos extractos. AFEF = Inhibición del extracto fermentado (%) y AFENF = Inhibición del extracto sin fermentar (%). Tomando el valor 1 como el valor central. dando un valor cercano a 1 o inclusive 1. El cálculo de PAF (potenciación de la actividad antifúngica por la aplicación del proceso de fermentación). lo que nos indica una perspectiva muy general del efecto de potenciación de la actividad antifúngica durante el proceso de fermentación del extracto. que se calculó según la ecuación 4.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento potenciación de la capacidad antifúngica contra hongos fitopatógenos. 8 1.4 1. Universidad Autónoma de Coahuila 31 Conteo de esporas usando cámara de 80 DIA-UADEC .2 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Concentracion (ppm ) Eje Y: Concentración de extractos en ppm Eje X: PAF (potenciación de la actividad antifúngica por la aplicación del proceso de fermentación) Referencia Formulación y aplicación de una cubierta comestible a base de cera de candelilla con la adición de un extracto acuoso de Fluorensia cernua. Tesis de Maestría.8 0.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento 1.6 0.6 1.4 0.2 1 PAF 0. 01% estéril al matraz con el inoculo propagado Agitación en parrilla por 15 minutos. Para estandarizar procesos biológicos frecuentemente es necesario conocer los parámetros a manipular.          Se prepara una solución de Tween 80 al 0. Se obtiene el promedio de esporas contadas en los 13 cuadros y se aplica la siguiente fórmula para obtener la cantidad de esporas/mL: (Promedio cel/cuadro) (25) (1 x 104) (20) = número de esporas/mL   Posteriormente se determina la cantidad de esporas necesarias para la fermentación. Una de las alternativas para inocular se describe de la siguiente manera. Se procede a realizar el cálculo del inóculo deseado usando el promedio de las esporas mediante una regla de tres simple.Universidad Autónoma de Coahuila de Investigación en Alimentos Facultad de Ciencias Químicas Departamento Neubauer Juan Alberto Ascacio Valdés Laboratorio de Microbiología. Universidad Autónoma de Coahuila. Parte del control del proceso radica en definir la cantidad de células microbianas (bacterias o esporas fúngicas). Se cambia el objetivo a 40x y se enfoca el cuadro central y se cuentan las esporas que se encuentres enmarcadas en 13 de los 25 cuadros que tiene el cuadro principal (se recomienda un conteo de 13 cuadros en forma de “z”). Facultad de Ciencias Químicas. Se coloca la camarilla de Neubauer en el microscopio con el objetivo 10x y se enfoca el campo visual de manera que se observen 5 cuadros con 25 cuadros cada uno. Coahuila. empleando una mosca magnética Se toma una alícuota de esta mezcla y se prepara una dilución de solución de esporas en agua destilada (dilución 1:20) A partir de esta dilución se toma una alícuota con micropipeta y se llena la camarilla de Neubauer (aproximadamente 20 µL). Departamento de Investigación en Alimentos.01% (a 100 mL de agua destilada se le agrega una gota de Tween 80 y se agita levemente) La solución de Tween 80 se esteriliza a 121 °C por 15 minutos Se agregan 30 mL de Tween 80 0. Saltillo. Uno de estos parámetros es la cantidad de células microbianas. México. 81 DIA-UADEC .