MANUALTOXICOLOGÍA

Laboratorio de ToxicologíaPROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 1 Laboratorio de Toxicología PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 2 Laboratorio de Toxicología Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 3 Laboratorio de Toxicología PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 4 . Laboratorio de Toxicología UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614) María Elena Bravo Gómez Jorge Cornejo Garrido Francisco Hernández Luis Juan Francisco Palacios Espinosa Araceli Pérez Vásquez Francisco Sánchez Bartez Perla Carolina Castañeda López Manuel Gutiérrez Aguilar Bernardo Lucas Florentino Carlos Pérez Muñoz Alejandra Quijano Mateos Facultad de Química. D. UNAM México.F. 2012 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 5 . P. ISBN: 978-607-02-3094-3 Tamaño: 1.75 MB Tipo de impresión: PDF Tiraje: 300 unidades “Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio. 04510. Distrito Federal. Impreso y hecho en México PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 6 . México. R.Laboratorio de Toxicología Primera edición: 2012 Fecha de edición: 15 de enero de 2012 D. C. sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales”. Delegación Coyoacán.  2012 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Ciudad Universitaria. Laboratorio de Toxicología ÍNDICE Prólogo Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química Reglamento Interno de Higiene y Seguridad para los Laboratorios del Departamento de Farmacia Reporte de Seguridad e Higiene Extracción y cuantificación de tóxicos no volátiles en una muestra problema Cuantificación de cianuro de hidrógeno. a partir de glucósidos cianogénicos Produccion de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo Determinación de malatión residual Determinación de la actividad antioxidante de la quercetina y el ácido nordihidroguayarético Evaluación de la actividad genotóxica de la ciclofosfamida utilizando la técnica de micronúcleos en médula ósea Efectos tóxicos de la administración de plomo en ratas Efecto del pH en la liberación de plomo por utensilios de barro vidriado Determinación de etanol en una muestra problema Identificación de alcaloides y barbitúricos en muestras problema 8 11 13 15 16 29 40 49 58 65 77 90 96 104 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 7 . como tóxico volátil. Con base en lo anterior. el grupo de profesores de Toxicología. En este nuevo mapa curricular. El diseño del actual contenido programático de la asignatura fue pensado para revisar los conocimientos básicos de Toxicología como: citotoxicidad. la asignatura teórico-experimental de Toxicología. lo cual permitió la adquisición de equipos. bioactivación tóxica. Farmacología. carcinogénesis y teratogénesis. se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseño. metales pesados y sustancias de abuso. que a partir del semestre 06-I se inició la implantación gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. De tal manera. evaluación y producción de medicamentos. producción de reactivos para diagnóstico.Laboratorio de Toxicología PRÓLOGO En noviembre de 2004. En consecuencia. se implementaron dos nuevas prácticas con el apoyo del proyecto PE202006 a través del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME). de acuerdo con la reforma a la enseñanza experimental (Hernández y Llano. el H. Consejo Técnico de la Facultad aprobó las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Química Farmacéutico Biológica (QFB). y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Académico del Área de las Ciencias Biológicas y de la Salud (CAABYS). materiales y reactivos para la enseñanza experimental de esta asignatura. el cual está constituido por diez prácticas que cubren las unidades temáticas del curso (Tabla 1) y que permiten integrar. Química Analítica. para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposición. toxocinética y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobióticos —fármacos. Siguiendo estos criterios. los autores presentamos este Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología. estrés oxidante. aplicar y relacionar los conocimientos teóricos adquiridos en la asignatura. y Química Orgánica. en forma colegiada. diagnóstico de laboratorio. quedó ubicada en el 6° semestre para la carrera de QFB. mutagénesis. 1994). con clave 1614. decidió realizar la actualización y modificación del curso práctico. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 8 . Asimismo. incluyendo algunos temas de interés actual en esta asignatura y rediseñando los existentes. así como su correspondiente aplicación en la resolución de problemas de esta área. A través del aprendizaje de esta asignatura. investigación biomédica y conservación del medio ambiente. los guiones propician la integración de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioquímica. El estudiante es enfrentado a los mismos a través de un problema bien definido. donde la adquisición del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenómenos que ocurren en el laboratorio. carcinogénesis y teratogénesis Toxicidad de metales pesados Toxicidad de metales pesados Toxicidad de sustancias de abuso Toxicidad de sustancias de abuso Tabla 1. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 9 . el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de éstos a través del trabajo experimental. Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseñanza Experimental.Laboratorio de Toxicología Curso laboratorio Guión experimental Extracción y cuantificación de tóxicos no volátiles en una muestra problema Cuantificación de cianuro de hidrógeno. Cada uno de los guiones está estructurado de la siguiente manera:  OBJETIVO ACADÉMICO Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases teóricas. que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADÉMICO a través del trabajo experimental. a partir de glucósidos cianogénicos Producción de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo Determinación de malatión residual Determinación de la actividad antioxidante de la quercetina y el ácido nordihidroguayarético Evaluación de la actividad genotóxica de la ciclofosfamida utilizando la técnica de micronúcleos en médula ósea Efectos tóxicos de plomo en ratas Efecto del pH en la liberación de plomo por utensilios de barro vidriado Determinación de etanol en una muestra problema Identificación de alcaloides y barbitúricos en muestras problema Curso teórico Unidad temática Introducción a la Toxicología La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica La biotransformación de xenobióticos y su importancia toxicológica El estrés oxidante Mutagénesis. encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicación y/o el potencial toxicológico. Relación entre las unidades temáticas del curso teórico y los guiones experimentales. como tóxico volátil. así como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y técnicas analíticas empleadas comúnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobióticos.  PROBLEMA Se plantea con la intención de enfrentar al estudiante con fenómenos relacionados con el área. Hernández Luna. promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el área de las ciencias biológicas y de la salud. los autores agradecemos el apoyo brindado a través del proyecto PAPIME No. reforzar el proceso cognoscitivo. resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y. Finalmente. PE202006 de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM.  APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS Este apéndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guión y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.Laboratorio de Toxicología  DESARROLLO EXPERIMENTAL Describe el procedimiento y técnicas utilizadas para el desarrollo y obtención de resultados que permitan resolver el PROBLEMA. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 10 . 5-7. M. para concientizar a los alumnos de la relevancia y carácter obligatorio de ambos. así como la manera en que deberán ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. pp. Año XXV. se contempló la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos. Los autores consideramos importante también incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia.  APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS En este apéndice se indican las cantidades necesarias para la preparación de lo s reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.  CUESTIONARIO Se incluye con la intención de dirigir al estudiante hacia la resolución del PROBLEMA. de esta forma. (1994) “Propuesta de Reforma de la Enseñanza Experimental” en Revista del IMIQ. y Llano Lomas. vol. 07. M.  APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesión de laboratorio se generan un número importante de residuos. Deberá exhibirse visiblemente en cada laboratorio de la Facultad de Química. Las tuberías de cada laboratorio deberán estar pintadas de acuerdo con la norma correspondiente. alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. será su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Este equipo será de uso obligatorio. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 11 . para efectos del presente Reglamento. nunca deberá estar una persona sola en los laboratorios. El responsable del área deberá verificar esto por lo menos una vez cada semana. el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. Las puertas de acceso y salidas de emergencias deberán estar siempre libres de obstáculos. lo dictaminará la Comisión Mixta de Higiene y Seguridad. ARTÍCULO 3. materiales. Asimismo. además deberán cerrar las puertas de cubículos y laboratorios. Los controles maestros de energía eléctrica y suministros de gas para cada laboratorio deberán estar señalados adecuadamente. estar lo más alejadas que sea posible de instalaciones o controles eléctricos y libres de todo obstáculo que impida su uso correcto. Los laboratorios deberán estar acondicionados. como mínimo. ARTÍCULO 9. etc. de manera tal que sean identificados fácilmente. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento. así como la obtención del dosímetro correspondiente. consumir alimentos o bebidas. si no se encuentra su profesor o alguien responsable que lo sustituya. no podrá trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios. En el caso del personal académico y administrativo. el uso de lentes de contacto y de zapatos abiertos (tipo huarache o sandalia). las zonas de seguridad. ARTÍCULO 8. serán denominados laboratorios. de dos y al menos una de ellas deberá ser parte del personal académico de la Facultad. así como cajones y archiveros. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo. el equipo de protección personal. ARTÍCULO 11. funcionar correctamente. En los laboratorios queda prohibido: fumar. ARTÍCULO 13. ARTÍCULO 10. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisadas por un responsable. siempre que se ausenten del laboratorio. ARTÍCULO 2. con lo siguiente: a) Un control maestro para energía eléctrica b) Un botiquín de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilación adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Señalamientos de Protección Civil i) Regadera j) Lavaojos ARTÍCULO 4.Laboratorio de Toxicología Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química ARTÍCULO 1. deberán ser manejados con el máximo cuidado. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos espacios de la Facultad de Química en donde se realice trabajo experimental. cosas de valor a la vista.. según el caso. Todas las sustancias. El alumno que no tenga protección no podrá permanecer en el laboratorio. atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los de seguridad. Las regaderas deberán contar con el drenaje correspondiente. accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. Al realizar actividades experimentales. las rutas de evacuación. ARTÍCULO 12. ARTÍCULO 5. Estos sitios. nombrado por los departamentos académicos en sus áreas correspondientes. ARTÍCULO 7. sea de docencia o de investigación. invariablemente. equipos. El responsable del área deberá verificar esto al menos una vez cada semana. El mínimo de personas deberá ser. Su observancia es obligatoria para el personal académico. ARTÍCULO 6. en el lugar de trabajo. Los usuarios deberán abstenerse de dejar. En caso de emergencias. Todas aquellas cuestiones que no estén específicamente señaladas en el presente Reglamento deberán ser resueltas por la Dirección de la Facultad. ARTÍCULO 18. Los lugares en que se almacenen reactivos. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 12 . ARTÍCULO 17. deberá identificarse plenamente el área respectiva. luces. Queda prohibido pipetear con la boca. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del área y a la Coordinación de Seguridad. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio. Queda prohibido que menores de edad permanezcan en el laboratorio sin la autorización por escrito del responsable del área. según sea el caso. tanques de gases y aire. estantes. Cuando se trabaje con sustancias tóxicas. estarán sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTÍCULO 23. la manera de controlar los eventuales accidentes. El responsable del área deberá verificar. Además. la información acerca del tipo de reacción o proceso en desarrollo. disolventes. deberá dejarse. En caso de requerir que algún equipo trabaje de manera continua. derrames o personas accidentadas. En cada laboratorio deberá existir un botiquín de primeros auxilios al alcance de todas las personas que en él trabajen. ARTÍCULO 20. Al finalizar las actividades en el laboratorio. deberán recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. ARTÍCULO 24. vacío. Los manuales de prácticas correspondientes deberán incluir la forma correcta de la disposición de los residuos. deberán recargarse cuando sea necesario. accesorios y muebles de oficina y laboratorio. deberán estar sujetos a la pared para prevenir accidentes. se deberá trabajar en área con sistema de extracción y equipo de protección personal (según el manual correspondiente). evaluarse al menos una vez cada mes y recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada área soliciten. con la opinión de la Coordinación de Seguridad. materiales. Prevención de Riesgos y Protección Civil. ARTÍCULO 28. en forma clara. Cualquier alteración en las condiciones de seguridad. tanques de gas y. al menos una vez cada semana. Al activarlo: Identifíquese: Nombre y Puesto. ARTÍCULO 21. El personal (académicos. agua. Ubicación: Dé el mayor número de referencias físicas posibles y las vías de acceso. con incendios. para reponer los faltantes. etc. ARTÍCULO 26. y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo. y la forma de localizar al responsable del equipo. dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). equipos. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. En cada laboratorio de la Facultad deberá existir. el contenido del botiquín. o en el cumplimiento del presente reglamento. libreros.Laboratorio de Toxicología ARTÍCULO 14. administrativos o estudiantes) que trabaje en los laboratorios debe informar al responsable del área o a su jefe inmediato. ARTÍCULO 16. Número de lesionados. Los extintores de incendios deberán ser de CO 2 y de polvo químico seco. medios de cultivo. Los sistemas de extracción de gases deberán mantenerse siempre sin obstáculos que impidan que cumplan con su función. de conformidad con los resultados de la revisión o por haber sido utilizados. tanto en el interior como en el exterior del laboratorio correspondiente. la información acerca de los teléfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTÍCULO 25. apagadas las bombas de vacío. las posibilidades fuentes de problema. archiveros. Los anaqueles. ARTÍCULO 27. si padece enfermedades que requieran atención especial y puedan generar incidentes dentro del área. Tipo de siniestro. circuitos eléctricos. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje. Para transferir líquidos con pipetas. ARTÍCULO 15. deberá ser reportado al responsable correspondiente. ARTÍCULO 19. visible y legible. en forma claramente visible y legible. según lo determine la Subcomisión Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad. el responsable del área deberá verificar que queden cerradas las llaves de gas. ARTÍCULO 22. ARTÍCULO 29. en general. deberá utilizarse la llenadora correspondiente. los anaqueles y áreas de almacenamiento deberán contar con la protección adecuada para prevenir accidentes. Consejo Técnico de la Facultad. las sanciones aplicables serán las que decida el H. además. materiales. alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentación que resulte aplicable. el equipo de protección personal que será usado en los laboratorios y anexos del laboratorio donde se lleven a cabo trabajos de experimentación será. según la gravedad de la falta cometida. Lentes de seguridad (durante el tiempo que dure el experimento). b) En los laboratorios de investigación. una vez aprobado por el Consejo Técnico. ARTÍCULO 5. para alumnos y profesores: 1. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisadas por un responsable. Guantes. de preferencia. conforme a las disposiciones de la Legislación Universitaria. 3. sea de docencia o de investigación. En el caso de que una de ellas sea alumno. Bata de algodón 100% y zapato cerrado. El presente Reglamento. en tanto no lo contravengan. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química de la UNAM. ARTÍCULO 2. Los laboratorios deberán estar acondicionados de acuerdo con lo establecido en el ARTÍCULO 3 del Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química de la UNAM. a) En los laboratorios de docencia. o de las señalizaciones instaladas para Protección Civil. de todo aquello mencionado en el Artículo 2 del presente Reglamento. estos sitios. Bata de algodón 100% y zapato cerrado. ARTÍCULO 3. deberán ser de vidrios endurecidos e inastillables. En general. En caso de lentes graduados deberán ser de vidrio endurecido e inastillables. ARTÍCULO 31. Es aplicable en todos aquellos lugares del Departamento de Farmacia de la Facultad de Química donde se realice trabajo experimental. Al realizar actividades experimentales. Si se trata de personal académico o administrativo. 2. cuando se encuentre en contacto con los reactivos. entrará en vigor el día siguiente de su publicación en la Gaceta de la Facultad de Química. etc. ARTÍCULO 6. deberá usarse el cabello recogido cuando se utilice mechero. Su observancia es obligatoria para el personal académico. instalaciones. serán denominados laboratorios. Cada área académica deberá tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad que será de observancia obligatoria y complementario al presente Reglamento. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 13 . nunca deberá estar una persona sola en los laboratorios. Se considerarán también como áreas de laboratorio aquellos anexos donde se lleven a cabo experimentos. 3. Consejo Técnico en su sesión del 15 de junio de 2006. ARTÍCULO 33. Guantes. en caso de que el experimento lo exija. En el caso de los alumnos. propias de los laboratorios. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos. Los residuos sólidos generados durante los trabajos experimentales deberán colocarse en los contenedores identificados para este fin y mantenerse alejados del área de trabajo. 2. Aprobado por el H. los responsables serán los técnicos académicos adscritos a los mismos o el profesor encargado del laboratorio. para efectos del presente Reglamento. de preferencia. ARTÍCULO 4. En caso de lentes graduados. Reglamento Interno de Higiene y Seguridad para los Laboratorios del Departamento de Farmacia ARTÍCULO 1. deberá haber siempre un profesor como segunda persona. Lentes de seguridad (durante el tiempo que estén en contacto con los reactivos). Para laboratoristas 1.Laboratorio de Toxicología ARTÍCULO 30. ARTÍCULO 32. el o los responsables de cada grupo serán cada uno de los profesores de dicho grupo. se levantarán las actas correspondientes y se dictarán las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. serán sancionadas conforme a la Legislación Universitaria. ARTÍCULO TRANSITORIO ÚNICO. ARTÍCULO 13. Consejo Técnico en su sesión del 5 de octubre de 2006. ARTÍCULO 9. Las sustancias tóxicas. al igual que el Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química de la UNAM. Aprobado por el H. deberá estar en un lugar visible en el laboratorio. deberán ser colocados en bolsas de plástico y enviados al Bioterio de la Facultad. ARTÍCULO 12. Cualquier muestra que se guarde en los refrigeradores deberá estar etiquetada con la siguiente información: a) Nombre completo del alumno. El responsable del área deberá hacer la solicitud de recarga o reemplazo a la brevedad posible. una vez aprobado por el Consejo Técnico. Artículo Transitorio Único El presente Reglamento. No deberán ser desechados directamente en la basura. generados durante las sesiones experimentales. el responsable del área. e) Profesor responsable de la asignatura o proyecto. Al finalizar las actividades en el laboratorio. ARTÍCULO 8. Asimismo. para que se cumpla con lo establecido en los Artículos 3 y 15 del Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química. Este Reglamento se dará a conocer a todos los alumnos al inicio del semestre lectivo y se recabarán sus firmas de enterados. volátiles o inflamables deberán ser utilizadas dentro de las campanas de extracción. entrará en vigor el día siguiente de su publicación en la Gaceta de la Facultad de Química. Los restos de desechos biológicos (animales de laboratorio). deberá verificar que se cumpla el Artículo 22 del Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Química. Los sistemas de extracción de gases y campanas deberán mantenerse siempre sin obstáculos que impidan el cumplimiento de su función. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 14 .Laboratorio de Toxicología ARTÍCULO 7. d) Nombre de la asignatura o proyecto de tesis. c) Tipo de muestra. ARTÍCULO 10. ARTÍCULO 11. No se admitirá a nadie que llegue extraoficialmente de visita. deberá ser removido de su lugar para evitar confusiones en caso de necesitarlo. Cuando un extintor esté vacío por haber sido utilizado. el profesor o el laboratorista (el último en salir del laboratorio). ARTÍCULO 14. b) Fecha y periodo que se mantendrá almacenada. Laboratorio de Toxicología REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE GRUPO: _____________ FECHA: ___________________ PRÁCTICA: ______________________________________________________________ INTEGRANTES: __________________________________________________________ UTILIZACIÓN DE REACTIVOS Reactivo Cantidad empleada Observaciones VIGILANCIA DE EQUIPO Equipo Hora de inicio Hora final Observaciones MEDIDAS DE SEGURIDAD Tratamiento de residuos Observaciones Firma del responsable: ________________________________________ PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 15 . Anillo metálico 1 4 2 2 2 1 2 2 . La muestra deberá trabajarla en medio ácido y medio básico.Pipeta Pasteur .Tubos de ensayo 13 x 100 .Ácido tartárico .Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 16 .Vórtex . Reactivos .Matraz Erlenmeyer de 250 mL .Ácido clorhídrico (HCl) .Pipeta graduada de 1 mL 1 2 2 1 1 2 2 1 .Pipeta graduada de 10 mL .Cafeína .Probeta de 25 mL .Nitrato férrico (Fe(NO3)3) .Matraz Erlenmeyer de 50 mL .Cloruro mercúrico (HgCl2) .Embudo de separación de 250 mL .Laboratorio de Toxicología EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE TÓXICOS NO VOLÁTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno emplee métodos de extracción ácida y básica para obtener eficientemente tóxicos no volátiles de naturaleza ácida y básica en una muestra problema.Matraz de bola de 50 mL .Matraz aforado de 25 mL .Rotaevaporador Material Material por equipo .Pipeta graduada de 5 mL . y concluya qué método de extracción es el más eficiente.Piseta con agua destilada .Hidróxido de sodio (NaOH) .Espátula .Balanza analítica .Salicilato de sodio .Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Equipo .Matraz aforado de 10 mL . PROBLEMA Establecer las condiciones más adecuadas para realizar una extracción mayor o igual al 90% de los tóxicos no volátiles ácidos y básicos (ácido acetilsalicílico [AAS] y cafeína) presentes en una muestra problema.Cloroformo (CHCl3) .Gradilla .Espectrofotómetro . Vaso de precipitado de 100 mL . la extracción en medio básico. separando las fases orgánicas y reuniéndolas en un matraz. La solución ácida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3.Gradilla .Laboratorio de Toxicología Material para la curva patrón . 2. La fase acuosa se guarda. Etiquetar la fase acuosa como fracción B. A) Proceso de extracción en medio ácido para tóxicos no volátiles 1. Tratar esta fracción como se indica en el inciso C.Matraz volumétrico de 25 mL . La cuantificación de ácido acetilsalicílico (AAS) y cafeína se determinará siguiendo los apéndices correspondientes. Esta fase se trata con 5 mL de una solución saturada de NaHCO3. Agregar ácido tartárico hasta un pH = 2. la cual deberá dividirse en dos porciones de 15 mL para realizar a una de ellas la extracción en medio ácido. Tratamiento de la fase orgánica. DESARROLLO EXPERIMENTAL El profesor proporcionará 30 mL de muestra problema. La fase orgánica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se reúnen las fases acuosas con la fracción A. 5.Matraz volumétrico de 10 mL . y a la otra. se separan las fases. 3.Pipeta graduada de 1 mL . PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 17 .Pipeta graduada de 10 mL 1 5 5 10 1 1 1 NOTA: El profesor proporcionará las celdas a los alumnos. etiquetándola como fracción A. 4.Tubos de ensayo . La fase orgánica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fracción E y se trata como se indica en el inciso D. 6. Etiquetar como fracción D y tratarlo como se indica en el inciso D. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.5 N.Laboratorio de Toxicología 5. C) Cuantificación de ácido acetilsalicílico Tratamiento de la muestra (fracciones B. Realizar la extracción con dos porciones de CHCl3 de 15 mL. La fase acuosa resultante. El disolvente orgánico resultante que se encuentra en el matraz de condensación debe ser desechado en el contenedor etiquetado como R1. B) Proceso de extracción en medio básico para tóxicos no volátiles 1. Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.1 N. Extraer la fase orgánica con 5 mL de NaOH 0. agitar. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10 con NaOH 2. C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apéndice II). Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases. 4. La fase orgánica resultante marcarla como R1.1. Concentrar la fase orgánica hasta sequedad en el rotaevaporador. Colocar 1 mL de las fracciones B. Tratamiento de la fracción A. 3. C y F) 1. 2. separando las fases.2. esperar 2 min. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 18 .1. La fase acuosa se etiqueta como fracción F y se trata según el inciso C. 6. etiquetarla como fracción C y trabajarla como se indica en el inciso C. 6. agitar la muestra en un vórtex durante 1 min. Determinar la absorbancia a 540 nm. realice las diluciones necesarias. ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color). preparar la curva patrón como se describe a continuación (realizar dos curvas patrón por grupo). interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrón. Llevar hasta 25 mL con agua destilada.Laboratorio de Toxicología 2. las fracciones B. Después de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados. Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo. 4. Alícuota de la solución patrón (mL) 0. esperar 2 min y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura. Curva patrón del AAS 1. C y F se reúnen y desechan en el contenedor etiquetado como R3. 2. Calcular la concentración de AAS presente en su muestra. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer. Solución patrón de salicilato de sodio (1000 µg/mL). A partir de la solución patrón de salicilato de sodio (1000 µg/mL).5 1 3 5 7 Aforo con agua destilada 10 10 10 10 10 Concentración (µg/mL) 50 100 300 500 700 En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recién preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para desarrollar color (apéndice II). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 19 . 3. Solución patrón de cafeína (100 µg/mL). Después de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados.1 N.1 N y aforar con la misma solución a 100 mL. Calcular la concentración de cafeína presente en su muestra. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer. 2. Transferirlo a un matraz volumétrico de 25 mL y aforar con NaOH 0. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 20 . realice las diluciones necesarias con NaOH 0. interpolando la lectura de absorbancia en la curva patrón. A partir de la solución patrón de cafeína (100 µg/mL) preparar la curva patrón como se describe a continuación.1 N). Determinar la absorbancia de la solución anterior a 275 nm utilizando NaOH 0. Alícuota de la solución patrón (mL) 1 2 3 4 5 Aforo con NaOH 0. Por grupo realizar dos curvas patrón. las fracciones D y E se reúnen y desechan en el contenedor etiquetado como R2.Laboratorio de Toxicología D) Cuantificación de cafeína Tratamiento de la muestra (fracciones D y E) 1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0. Disolver 10 mg de cafeína anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N.1 N 25 25 25 25 25 Concentración (µg/mL) 4 8 12 16 20 3. 4. Determinar la absorbancia de la curva patrón a una longitud de 275 nm. ajustando a cero con un blanco (NaOH 0. 2. Curva patrón 1.1 N como blanco.1N. 3. ¿qué puntos del proceso y propiedades fisicoquímicas considera que son críticos? 3. Curva patrón. Una vez desarrollado el guión para una eficiente extracción de un xenobiótico. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 21 . En el caso de emplear una muestra biológica indique cuál es el objetivo de adicionar ácido tartárico además de ajustar el pH. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresión lineal de cada curva. 2.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1. Abs* curva 1 Abs* curva 2 cafeína [μg/mL] 4 8 12 16 20 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlación lineal (r) Abs* curva 1 Abs* curva 2 Tabla 1. AAS [μg/mL] 50 100 300 500 700 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlación lineal (r) *Abs: Absorbancia. de acuerdo con los resultados grupales. indicando el procedimiento que siguió para realizarlo. 6. Complete las siguientes tablas y. Extracción en medio básico Concentración (µg/mL) Rendimiento (%) Rendimiento (%) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 22 . Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la concentración de AAS y/o cafeína en su muestra. Ácido acetilsalicílico Equipo Extracción en medio ácido Concentración (µg/mL) 1 2 3 Tabla 3. concluya cuál es el mejor método de extracción analizado para los xenobióticos. 5. Lecturas de muestras. ¿Es necesario considerar el factor de dilución para calcular la concentración inicial de los xenobióticos en su muestra? Justifique su respuesta.Laboratorio de Toxicología Equipo 1 2 3 Absorbancia de las fracciones B C F D E Tabla 2. 4. Resultados grupales AAS. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 23 . Resultados grupales cafeína. Extracción en medio básico Concentración (µg/mL) Rendimiento (%) Rendimiento (%) 7. analice a qué puede atribuirse el hecho.Laboratorio de Toxicología Cafeína Equipo Extracción en medio ácido Concentración (µg/mL) 1 2 3 Tabla 4. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90%. 1974... 15.). Vol. Academic Press Inc. y Al-Meshal. 952 y 953. biotransformation” en Casarett & Doull’s. C. M. “Aspirine” en Analytical Profiles of drug substances. 123-134. ____________“Salicylic acid. Toxicology: The basic science of poisons. “Analytic Toxicology” en Toxicology the basic science of poisons. “Screening Tests for Common Drugs” en Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. 2001. 3-15. London. pp. I. Hassan. (Ed. Pharmaceutical Press. pp. Academic Press Inc. London. London.. (Ed. 1991. 1974. ____________“Extraction Methods in Toxicology” en Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. L.). “Caffeine biotransformation” en Casarett & Doull’s Toxicology: The basic science of poisons. Clarke. Florey. “Caffeine” en Analytical Profiles of drug substances. (5ª ed. pp. pp. Pharmaceutical Press. K. K. McGraw Hill. London. 1071. E.) McGrawHill. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 24 . pp.C.A. 1. 1996. M. K. 1974. p. Vol. Pharmaceutical Press. Vol. Vol. 71-150.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Casarett. 1996. 669-677 y 721-727.C. Klaassen.. (9ª ed. pp. Florey. Mexico. 8. 203. Zubair.A. Goodman & Gilman.” Vol. p. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Vol. 1. pp. 2001. Florey. 1991.J. New York. London. ____________“Colour Tests” en Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. 1. I. McGraw Hill. New York.G.) McGraw-Hill. 16-30.D. 1-11. especificando qué especies químicas se encuentran en cada una de las fases. 2. Razón por la cual se determinan la cafeína y el AAS a diferentes longitudes de onda. Relación entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra disuelto. 12. 7. 11. Propósito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la partición con CHCl3 con la fracción A en el proceso de extracción en medio ácido. 14. 3. 13. ácido tartárico. 6. Reacción de hidrólisis del AAS. Sustancias que pueden precipitar proteínas. 18. Dibujo de la reacción de identificación y cuantificación del AAS.1N en el proceso de extracción ácida. 17. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones. El análisis de una muestra biológica de 20 mL para determinar la presencia de salicilatos y/o cafeína arrojó las siguientes lecturas de absorbancia: PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 25 . 4. 15. 10. ácido acético y de la cafeína. 19. 8. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer. 16. Valores de pKa del AAS. ácido salicílico. Fundamento de una extracción múltiple y selectiva. 9. 5.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Propósito de lavar la fase orgánica con dos porciones de agua destilada en la extracción en medio ácido. Efectos tóxicos del ácido acetilsalicílico (AAS) y de la cafeína. Forma de obtener el rendimiento de la extracción de una sustancia. Densidad de los disolventes a emplear. Estructura de la forma iónica y no iónica del AAS y de la cafeína. Solubilidad de una sustancia iónica en medio acuoso y disolvente orgánico. Esquema de los procesos de separación empleados tanto en medio ácido como en medio básico. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0. 996 0. Cafeína A= 540 nm 0.456 Volumen (mL) 15 7 Absorbancia a  = 275 nm fracción D = 0.0566 r =0.421 0.684 0.970 Concentración [µg/mL] 4 8 12 16 18 b = 9.999 Tabla 2.785 Volumen (mL) 6 Tabla 1.000 A = 275 nm Calcule la concentración de AAS y cafeína en la muestra inicial.484 0.Laboratorio de Toxicología Absorbancia a  = 540 nm fracción B = 0. Curva patrón. C y D. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 26 .060 0. Absorbancia y volumen final de las fracciones B. Para la realización de los cálculos considere el proceso de extracción en medio ácido descrito en el guión experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.409 x 10-3 r= 0.713 0.885 1.133 0.8 x 10-3 m = 1.613 fracción C = 0.184 0.2 x 10-3 m = 0. Las lecturas de absorbancia de las curvas patrón para AAS y cafeína son las que se muestran a continuación: AAS Concentración [µg/mL] 50 100 300 500 700 b = 5. Laboratorio de Toxicología APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivo para desarrollar color: Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N.5 N Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL. en 10 mL de agua destilada..1 N Disolver 0. Solución de hidróxido de sodio 0. Solución de hidróxido de sodio 2. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades adicionales para el blanco y curva patrón). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 27 . Solución saturada de bicarbonato de sodio. Solución de ácido tartárico al 10% Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada. Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.A. hasta que no se pueda disolver en frío. Solución de ácido clorhídrico 1 M Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar hasta su total disolución. R3: Solución acuosa con HgCl2 y Fe(NO3)3. ácido acetilsalicílico y ácido salicílico.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: Cloroformo (restos de ácido acetilsalicílico y cafeína). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 28 . tartrato de sodio y restos de cafeína ionizada. R2: Solución acuosa básica de NaOH (pH = 10). A PARTIR DE GLUCÓSIDOS CIANOGÉNICOS OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrógeno liberado a partir de glucósidos cianogénicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y animales. .Laboratorio de Toxicología CUANTIFICACIÓN DE CIANURO DE HIDRÓGENO.Termómetro . y concluya cuál de estas muestras presentan riesgo de toxicidad para el humano.Cloroformo (CHCl3) . Reactivos .Espectrofotómetro . y relacione la concentración con su potencial toxicológico. con base en la cantidad de HCN que está presente en el consumo de 100 g de muestra.Carbonato de sodio (Na2CO3) * Ver apéndice II.Ácido pícrico Equipo .Ácido clorhídrico * (HCl) .Reactivo de Guignard * . PROBLEMA Que el alumno cuantifique la concentración de cianuro de hidrógeno presente en una serie de 2 muestras de semillas o plantas.Estufa PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 29 . COMO TÓXICO VOLÁTIL.Cianuro de potasio * (KCN) . 6 6 1 6 6 Material de estudio Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de durazno. almendra de capulín. almendra de ciruela pasa.Mortero con pistilo .Navaja (traer por equipo) . almendra de cereza.Tijeras . semillas de manzana roja.Vaso de precipitado de 100 mL 3 Material para la curva . semillas de lima.Pipeta graduada de 1 mL .Tubos de ensaye 20 x 150 con tapón de hule .Tiras de papel filtro cualitativo (filtración rápida) de 2 x 10 cm .Tubos de ensaye 20 x 150 con tapón de hule .Matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapón de hule .Pinzas .Matraces volumétricos de 25 mL .Cajas Petri .Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) NOTA: El profesor proporcionará las celdas para las lecturas.Probeta de 50 mL 3 1 1 3 1 1 . PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 30 .Pipeta graduada de 1 mL .Matraces Erlenmeyer de 250 mL con tapón de hule .Pipeta volumétrica de 25 mL .Embudo de cola corta .Hielo (proporcionado por laboratorista) 3 1 3 1 1 1 .Laboratorio de Toxicología Material por equipo . Adicionar al matraz del inciso anterior 1 mL de solución de HCl 0. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la Figura 1. colocándolas para su secado sobre una caja de Petri. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50 y 55oC. Preparación de la tira reactiva 1.5 N y el agua destilada deben estar en baño de hielo antes de realizar la parte experimental. Preparación de las muestras NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra deberán tener todos los reactivos necesarios dentro del matraz. NOTA: La solución patrón de cianuro de potasio. cuidando que estén humedecidas. una de las cuales será proporcionada por el profesor. 3. A cada una de las muestras se le realizará el siguiente procedimiento: 1. colocar el matraz en baño de hielo. así como lista la tira reactiva. 2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas. 2. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 31 . 3. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumétrica y agregarlos a un matraz Erlenmeyer de 250 mL.Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL Cada equipo trabajará con 2 muestras problema de plantas o semillas según la lista mencionada. el ácido clorhídrico 0.5N y dos gotas de CHCl3. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapón después de concluir este procedimiento. El equipo que prepare curva patrón de HCN deberá preparar 6 tiras adicionales. dejándolas aproximadamente 10 min. tanto para su muestra como para la curva patrón. 4. 6. 7. Preparación de la muestra en el matraz y colocación de la tira reactiva. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo con el siguiente cuadro y colocarla en el mortero. cortarla con la ayuda de las pinzas de disección y navaja. Semilla o almendra Manzana Durazno Perón Capulín y cereza Mamey Peso en mg 250 200 150 30 200 Tabla 1. Pesos recomendados para la determinación de cianuro en semilla o almendra. TAPÓN DE HULE PAPEL FILTRO (TIRA ACTIVA) MUESTRA Figura 1.Laboratorio de Toxicología 5. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 32 . Introducir simultáneamente en la estufa a 40ºC los matraces con las muestras problema y con los correspondientes de la curva estándar de HCN durante 1 hr. y macerarla lo más rápido posible. Colocar rápidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y tapar de inmediato. Laboratorio de Toxicología Preparación de la curva patrón de ácido cianhídrico La curva patrón de HCN se prepara colocando en matraces volumétricos de 25 mL los volúmenes de la solución patrón de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo con agua destilada: Alícuota de la solución patrón de KCN (mL) 0. como se indica en la Figura 1. Posteriormente.2 1.1 0. Finalmente. debidamente etiquetados. Preparar 6 matraces Erlenmeyer de 250 mL agregando 1 mL de la solución de HCl 0. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrón. Introducir simultáneamente en la estufa a 40ºC los matraces con las muestras problema y con los correspondientes de la curva estándar de HCN durante 1 h.0 0. Curva patrón de HCN.4 0.6 2 Tabla 2. 2. 3.2 0.8 1. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 33 .5 Concentración de HCN (µg/mL) Blanco 0. colocar con cuidado la tira reactiva en el interior del matraz. 1. y taparlos inmediatamente con su tapón después de concluir este procedimiento. cuidando de no mojarla con el contenido.5 N y dos gotas de CHCl3. pasarlas de inmediato a los matraces Erlenmeyer.4 0.3 0. colocar los matraces en baño de hielo. y sujetarla en la boca del matraz con un tapón. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrón en el espectrofotómetro a 520 nm. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 34 . la mezcla se coloca en un contenedor etiquetado como R2. los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Después de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados.Laboratorio de Toxicología Tratamiento de las muestras problema. Decantar el contenido del matraz y colocar el residuo líquido en un contenedor etiquetado como R1. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra problema. El material vegetal se deja secar en la campana sobre papel periódico para ser desechado posteriormente. 4. 3. utilizando como blanco el primer punto de la curva. Filtrar la solución con papel filtro para eliminar residuos de la tira de papel. curva patrón y blanco 1. curva estándar o blanco). 2. adicionar al tubo 20 mL de agua destilada. Transcurrido el tiempo de incubación. tapar el tubo y agitar vigorosamente. Absorbancias de la curva patrón. indicando el procedimiento realizado para esta determinación.8 1.2 1. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentración de HCN en mg/100g de muestra.6 2 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlación lineal (r) Absorbancia Tabla 1. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 35 . 2. HCN [μg/mL] 0. Reporte.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1.4 0. los valores de absorbancia obtenidos e indique los valores de la regresión lineal. en la siguiente tabla. Tabla 2. Proponga un método para extraer tóxicos volátiles a partir de una muestra. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 36 . bajo < 10 mg/100g de muestra . Indique cuáles muestras representan un riesgo potencial en caso de su consumo.Laboratorio de Toxicología 3. 4. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla: Material vegetal Concentración de HCN (µg/mL) mg HCN/100 g de muestra Riesgo de toxicidad* Equipo 1 2 3 * alto ≥ 10 mg/100g de muestra. 5. ¿Cómo podría eliminar la presencia de glucósidos cianogénicos de sus muestras? 6. Resultados grupales. R. (1969). Montgomery.A. Inherent Plant Toxins” en International Food Safety Handbook: Science. (Ed. 290-308. 519-526. London.. Younes. Acribia. Toxicología de los alimentos. “Cyanogenic glucosides and their function” en Phytochemical ecology.. R. Zaragoza. E. 711-719. pp.) Academic Press.E. (1970). 1972. Eyjolfsson. (2000). National Academy of Sciences. B.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Conn. S. “A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated seeds” en Nutrition Reports International 29. 11-36. pp. I. International Regulation.. y Truhaht.. L. New York. 143-160. Fabre. Tratado de toxicología.. E. Marcel Dekker. J. M. 1999. Lucas. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 37 . 15-19. “Cyanogenic glucosides” en Journal of Agricultural and Food Chemistry 17. S. pp. 74-108. D. Harborne.B. __________________“Cyanogenic glucosides” en Toxicants ocurring naturally in foods. Inc.C. (2000).D. Ed. Fishbein. pp. Sotelo. y Pimenta-Pinotti. Liener. “Plant cyanogenic glycosides” en Toxicon 38. 104-123. 311-332. J. Francisco. “Cyanogens” en Toxic constituent of plant foodstuff. 487-492. and Control. Washington. 1980. pp. H. 1978. R. Speijers.A.. R. 1973. I. Vetter.). (2ª ed). 368380. “Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides” en Fortschritte der Chemie Organischer Naturstoffe 28. I. (Eds. Miller.E.H. Academic Press. G.J. pp. Vol. 1976.P. Paraninfo. pp. y Egmoad. M. “Natural Toxins III. Linder. A. (1984).. Madrid. New York. “Cyanogenic Glycosides in Plants” en Brazilian Archives of Biology and Technology 43. Causa por la cual es necesario colocar en baño de hielo las soluciones de cianuro de potasio y el HCl 0. 5. Propósito de calentar la muestra a 40C en la estufa. Enseguida agregar 12. Argumento por el cual la tira reactiva no debe tocar la solución en que se encuentra la muestra. Finalidad de agregar HCl y CHCl3 a la muestra y a la curva patrón. 6. Hidrólisis enzimática de un glucósido cianogénico. 3.5 g de ácido pícrico en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y disolver con 200 mL de agua destilada. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 38 .5N empleadas en la preparación de la curva patrón. 4. Reacción de Guignard para la detección de HCN. APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivo de Guignard Colocar 2. 10. Importancia que tiene que. Razón por la que se da una reacción positiva sin que la tira reactiva esté en contacto con la muestra. Importancia toxicológica de los glucósidos cianogénicos.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. 8. la trituración de la muestra se realice rápidamente y sea colocada en baño de hielo. Estructura de un glucósido cianogénico. NOTA: Manejar con cuidado el ácido pícrico. ya que esta sustancia es cancerígena y se absorbe fácilmente por la piel. durante la práctica. 7. Llevar la solución a un volumen de 500 mL con agua destilada. 9.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar cuidadosamente para disolverlo. NOTA: A pesar de que la concentración utilizada de KCN en este guión es de aproximadamente 0. disolver y aforar con agua destilada. no deberá descuidar las medidas de seguridad para su trabajo. Solución ácido clorhídrico 0.46g/100mL) y vaciar a un matraz volumétrico de 1000 mL que contiene aproximadamente 500 mL de agua destilada. restos de isopurpurina.24 mg/mL y esta concentración está por debajo de la DL50 en ratones.5 N (HCl) Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 39 .05 mg de KCN. Transferir la pesada cuidadosamente a un matraz aforado de 50 mL. KCl. R2: Solución de ácido pícrico. KCN.5 N).Laboratorio de Toxicología Solución patrón de cianuro de potasio (KCN) Se pesan exactamente 12. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: Solución acuosa de HCl (0. Na2CO3. aforar enseguida con agua destilada. Cianuro de potasio* (KCN) .Solución amortiguadora de fosfatos* .Éter dietílico Equipo .Laboratorio de Toxicología PRODUCCIÓN DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno observe la formación de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la administración de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.Ferricianuro de potasio* (K3[Fe(CN)6]) .Balanza para pesar animales PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 40 . Reactivos .Hidróxido de amonio (NH4OH) *Ver apéndice II.Nitrito de sodio* (NaNO2) .Ácido acético glacial (CH3COOH) . la reducción en el porcentaje de MHb debida a la administración de azul de metileno. .Centrífugas . PROBLEMA Determinar cuantitativamente.Solución salina isotónica (SSI) .Nuevo azul de metileno* .Heparina 1000 UI o EDTA al 10% . en ratas tratadas con NaNO2.Espectrofotómetros UV-Vis . Rejilla . colocarla en la tabla de disección y extraer de cada una.Tijeras de disección .Jeringa de 3 mL (traer por equipo) . Envolver los restos de los animales de experimentación en una PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 41 . Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biológicoinfecciosos (RPBI). administrar por la misma vía. Dejar transcurrir 30 min después de la administración.1 mL de solución de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye con 0.Tubos de ensaye 13x100 .. 4.Pipeta graduada de 5 mL . DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. 1 mL de sangre. 1 mL/Kg de SSI. II y III. por vía i. 15 minutos después. Preparar 3 jeringas con 0.p. Administrar a la rata III. 8. 50 mg/Kg de la solución de nitrito de sodio.Pipeta graduada de 0.. 3. Pesar a cada uno de los animales e identificarlos como I. Colocar la muestra sanguínea en el tubo correspondiente. por vía i. Quitar la aguja de la jeringa para evitar hemolizar la muestra sanguínea. para evitar la coagulación de las muestras.Jeringa de insulina (traer por equipo) .Tabla de disección .) una dosis de 2 mg/Kg de la solución de azul de metileno y.1 mL 3 1 1 1 2 1 .Tubos de ensaye 16 x 150 3 1 1 1 1 3 Animales de experimentación 3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).Pinzas de disección .3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo con el número de rata correspondiente. 50 mg/Kg de la solución de nitrito de sodio.Pipeta graduada de 1 mL . 7.Caja de contención . Administrar a la rata II. por vía intraperitoneal (i. por punción cardiaca. 5. 9. 6. Anestesiar a cada rata con éter.p. 2.Laboratorio de Toxicología Material .p. Mezclar los tubos perfectamente por inversión. Administrar a la rata I. e) Separar el sobrenadante.1 mL de la solución de K3[Fe(CN)6] al 20% en solución acuosa. g) Pasar la solución a un tubo limpio. f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A1). Conservar el resto de la muestra hasta el final de la determinación y después desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO). b) Agregar 0. h) Agregar una gota de la solución neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco. d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.9 mL de solución amortiguadora de fosfatos pH 6. y mezclar. desechar el contenido de la celda y el resto de la solución del inciso n en el contenedor etiquetado como R1. 10. Desechar el sobrante de la solución proveniente del inciso k en el contenedor etiquetado como R1. contra un blanco de solución amortiguadora de fosfatos. o) Mezclar. l) Transferir 2 mL de la solución del tubo del inciso k. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra como se indica a continuación: a) Colocar 4. k) Agregar una gota de NH4OH concentrado al tubo del inciso i. contra su respectivo blanco (lectura A3). Recuperar la solución en el mismo tubo.6 en un tubo de ensaye. n) Después de 2 minutos agregar una gota de la solución neutralizada de KCN a cada tubo (blanco y problema). m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada. esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm. a otro tubo y agregar 8 mL de la solución amortiguadora y 0. una vez obtenidos los cálculos. i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 42 .1 mL de sangre. j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A2). c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.1 mL de la solución de K3[Fe(CN)6] al 20% en solución acuosa.Laboratorio de Toxicología hoja de papel periódico y colocarlos en la caja de contención para su posterior incineración. Después de haber realizado la lectura y. 8 mL de solución amortiguadora y 0. A2) 23.4 Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 . Cálculos: Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4 Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 43 . 11.Laboratorio de Toxicología NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguíneas deberá ser inactivado con NaClO previamente a su lavado. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 44 . Equipo 1 2 3 Prom SD %CV SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2 %MHbt %MHbt %MHbt Tabla 3. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas: Equipo A1 1 2 3 SSI A2 A3 A1 NaNO2 A2 A3 Azul de metileno + NaNO2 A1 A2 A3 Tabla 1.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1. Determinaciones de Hb y MHb totales. SSI Eq 1 2 3 Prom SD %CV NaNO2 MHbt (g/100mL) Hbt MHbt Hbt (g/100 mL) (g/100mL) (g/100 mL) Azul de metileno + NaNO2 Hbt MHbt (g/100 mL) (g/100mL) Tabla 2. Lecturas espectrofotométricas. Comparación del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos. ¿Qué efecto observó en el %MHbt en la rata II? ¿A qué lo atribuye? 5.Laboratorio de Toxicología 2. 3. ¿Por qué es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales? PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 45 . ¿Observó algún cambio en la cantidad de Hbt en función de los xenobióticos administrados? ¿Por qué? 7. Graficar los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento. ¿Qué efecto observó en el %MHbt en la rata III? ¿A qué lo atribuye? 6. Graficar los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento. 4. O. pp.H. Ed.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Dreisbach.B. Gran Bretaña. J. 1988.M. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 46 . y Robertson. 2001. “Inorganic and other Analisis” en Analitical Methods in toxicology. Watkins. Casarett & Doull.. “Investigation of hemolitic anaemias” en Medical Laboratory Hematology. C. Stahr. R.G. Editorial El Manual Moderno (6ª ed. USA. pp. Ed.). Ed.. Hall. 1984. 394 y 395. R. México. 5-7. Klassen. pp. McGraw-Hill Interamericana (5ª ed. 327-333. Malia.. “Tratamiento de los envenenamientos” en Manual de toxicología clínica. inc. 1991.F. 68-70. pp. W.D. Manual de Toxicología. prevención diagnóstico y tratamiento.). Butterworths. John Wiley and sons. D.. R. México. H. A2 y A3.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. K3[Fe(CN)6] y KCN. ingestión e inhalación. 4. Efectos tóxicos de una intoxicación con azul de metileno. NH4OH en el paso “k” de su técnica.44 g de fosfato monopotásico anhidro (KH2PO4) en 1000 mL de agua destilada. 5. Especies que se determinan en A1.6. Realizar una primera solución amortiguadora de fosfatos. 6. Fundamento de los métodos analíticos para determinar hemoglobina total y metahemoglobina en sangre. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicación por nitritos. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 47 . (KCN) Mezclar una parte de una solución de cianuro al 10% y otra parte de ácido acético glacial al 12% (v/v). 3. disolviendo 3. 2.6. Efectos tóxicos de una intoxicación por nitritos.8 g de fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) y 5.6. Mezclar una parte de la solución anterior con tres partes de agua destilada y ajustar el pH a 6. Solución de cianuro de potasio neutralizada. APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución amortiguadora de fosfatos pH = 6. Propósito de agregar la solución amortiguadora de fosfatos pH 6. NOTA: Tanto el cianuro de hidrógeno como los cianuros sólidos o en disolución son tóxicos por absorción por la piel. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 48 . aforar a 10 mL. pesando 1 g de NaNO2 y disolviéndolos en 10 mL de solución salina isotónica. consultar con el laboratorista o el profesor) Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada. Solución Salina Isotónica (SSI) Preparar 50 mL de esta solución o comprar una presentación comercial. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: Solución amortiguadora de fosfatos pH 6.Laboratorio de Toxicología Solución de ferricianuro de potasio al 20%. pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo en 10 mL de SSI. Solución de nuevo azul de metileno en SSI (4 mg/mL) Preparar 10 mL de esta solución. NH4OH. EDTA al 10%. KCN. (Preparar sólo en caso de no haber heparina. K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre. (K3[Fe(CN)6]) Preparar 10 mL de esta solución. Solución de nitrito de sodio (NaNO2) en SSI (100 mg/mL) Preparar 10 mL de esta solución.6. Vasos de precipitado de 100 mL . Material Material vegetal Traer por equipo 50 g de cáscara de limón.Pipeta volumétrica de 10 mL .Pipeta graduada de 1 mL .Propipeta .Frasco de vidrio de boca ancha con tapa (traer por equipo) . o bien 50 g de hojas externas de col o coliflor. PROBLEMA Cuantificar malatión residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un porcentaje de recuperación mayor o igual al 75% en la muestra control. calabaza o chayote.Pipeta graduada de 10 mL . Relacionar la cantidad de insecticida presente en ambas muestras con el riesgo toxicológico de su consumo.Pipeta graduada de 5 mL .Embudo de separación de 125 mL 1 2 2 1 2 2 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 49 . Material por equipo .Soporte universal c on anillos de fierro .Tubo de ensaye de 16 x 150 .Laboratorio de Toxicología DETERMINACIÓN DE MALATIÓN RESIDUAL OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobiótico empleando sus propiedades ácido-base y reacciones de degradación.Probeta graduada de 25 mL .Embudo de filtración rápida 2 1 3 2 2 2 . identificar como R1 y colocar en la campana. tapar y agitar vigorosamente durante 5 minutos. los responsables de seguridad e higiene deberán colocar R1 en una bolsa de plástico y cerrarla. Adicionar 15 mL de solución ácida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el embudo por 1 minuto. 3. midiendo con pipeta volumétrica.Malatión al 50% .Embudo de filtración rápida Reactivos . Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. 5.Pipeta graduada de 5 mL .Tetracloruro de carbono (CCl4) . Colocar 25 g del material de estudio (únicamente la cáscara o superficie del vegetal) en un frasco de vidrio de boca ancha y añadir 30 mL de CCl 4. Adicionar a cada tubo 0. Pasar esta mezcla a un embudo de separación y agitar suavemente.Etanol (EtOH) . PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 50 .5% y 5 mL de etanol. Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocándolo sobre un papel periódico.Vasos de precipitado de 100 mL 1 3 .2 mL de solución de CS2 al 0. 4.Laboratorio de Toxicología Material para la curva .Cloruro férrico* (FeCl3) .Sulfato de sodio* (Na2SO4) .Disulfuro de carbono (CS2) DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado. 2.Sulfato cúprico* (CuSO4) . 3 3 3 .Fenolftaleína* .Hidróxido de sodio* (NaOH) . Medir el volumen exacto con una probeta.Acetona * Ver apéndice II.Embudo de separación de 125 mL .Tubo de ensaye de 16 x 150 . Al finalizar la sesión. 7. Colectar la fase orgánica en un vaso de precipitado y filtrarla. Agitar nuevamente por 5 minutos. Añadir 5 mL de etanol. transfiriéndola nuevamente al embudo de separación enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la fase acuosa como R2. Leer la fase orgánica en el espectrofotómetro a 416 nm. agitar y añadir 0.Laboratorio de Toxicología 6. etiquetándola como R5. 10. recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgánica etiquetándola como R3. dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solución de Na2SO4 al 9%. Colectar la fase orgánica y desechar la fase acuosa etiquetándola como R4.2 mL de NaOH 6N. Añadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 51 . 12. desechar la fase orgánica. 8. Neutralizar gota a gota con HCl 6N con agitación continua hasta la desaparición del color azul violeta. 9. Agregar 0. Una vez que se obtengan los resultados finales. separar las fases.3 mL de solución de CuSO4 al 3. agitar y desechar la fase orgánica en el recipiente etiquetado como R3. Añadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenolftaleína al 1%.5% y agitar. ajustando previamente a 100% de transmitancia con CCl4.2 mL de solución de FeCl3. 11. Mezclar. 5 mL de solución patrón de malatión + 2.0 mL de solución patrón de malatión Tabla 1.2 mL de solución de CS2 al 0. Procedimiento para la curva patrón de malatión.5%. Concentración 8 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separación.Laboratorio de Toxicología Procedimiento para la curva patrón Preparar la curva patrón de la siguiente forma: Tubo 1 2 3 Reactivos 1 mL de solución patrón de malatión + 4 mL de etanol 2. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 52 . Adicionar 10 mL de CCl4 y 0. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como en la muestra a partir del inciso 5.5 mL de etanol 5. CremLyn.).A. Norris. White-Stevens. Pesticides in the Environment. Voil. Diagnóstico y Tratamiento. Klassen. 103.. O. 2. 570. Morifusa. Casarette & Doull.U. M. E. 615-618. 196-199. R. Dreishbad. Handbook of toxicology: Insecticides. pp.. 1987. New York.D.B. W. 1999. 95-104. 1959. “Colorimetric estimation of malation residues” en Journal of Agricultural and Food Chemistry. Negherban. B. 451-464. Marcel Dekker. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. 2001.R. C. pp. New York. Robertson. 119-121. 1978. Farmacología Básica y Clínica. Ed.. pp. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 53 . Prevención. 1954. Manual de Toxicología Clínica.V. Ed. El Manual Moderno (7ª ed. Pesticides and mode of action. McGraw-Hill Interamericana. 1979. London..). R. Saunders Comp. Chapman and Hall (6a ed. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. J. p. Cleveland. México. 1979. pp. Katzung. Manual de Toxicología.). E. 937.. El Manual Moderno (6ª ed. Ed.O.W. 455-463. W.A. Part I and II. México. W. John Wiley & Sons. A.. P.B. Watkins. CRC Press.H. Averall. 62-77.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Adrien.. pp. 1971. México. pp. C. Inc. 624-634. 3. Explique por qué se determinan las lecturas en transmitancia. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: Equipo 1 --- Material vegetal Malatión (µg/mL) Rendimiento Malatión en la muestra (ppm) Riesgo tóxico* 2 --- 3 --* Alto ≥ 8 ppm.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1. concluya si existe un riesgo toxicológico por el consumo del material vegetal analizado. bajo < 8 ppm Tabla 2. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 54 . Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Malatión (µg/mL) %Transmitancia Absorbancia 8 20 40 Muestra 1 Muestra 2 Pendiente (m) Ordenada al origen (b) Coeficiente de correlación lineal (r) Tabla 1. Resultados. 4. Indique el procedimiento que siguió para realizar los cálculos de concentración de malatión en sus muestras. 5. De acuerdo con los resultados obtenidos. 2. Resultados grupales. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 55 . Límites permitidos de acuerdo con la NOM vigente para el malatión. Propósito de adicionar los siguientes reactivos: CCl4. 3. Ventajas que presentan los pesticidas organofosforados con relación a los organoclorados. 9. solución Na2SO4 al 9%. HCl. 8. En caso de encontrar una baja concentración en alguna de las muestras. 5. Estructura del compuesto de coordinación que se forma durante la práctica con los productos de la reacción anterior y el catión Cu2+. C) cumplimiento de las normas de aplicación del pesticida en cuestión. Enzimas involucradas en la destoxificación del malatión en insectos y en mamíferos. Relación matemática entre absorbancia y transmitancia. 6. EtOH. Dibuje la reacción que se lleva a cabo con el malatión en medio básico y presencia de etanol. 10. CS2. comente cómo influiría cada uno de estos factores en el resultado del análisis: A) estabilidad del compuesto. 7. fenolftaleína. Mecanismo de potenciación del efecto tóxico del malatión en insectos. Mecanismo de toxicidad del malatión en el insecto. NaOH. 2. Comparación de los valores de DL50 para mamíferos y para insectos. FeCl3 y CuSO4. B) el desarrollo experimental realizado. Usos y propiedades biológicas del malatión. 4. APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. solución ácida Na2SO4 al 9%.Laboratorio de Toxicología 6. 5 mL de CS2 y aforar a 100 mL con CCl4. medir 48. pérdida de conocimiento y convulsiones. Ácido clorhídrico 6N (HCl) Para preparar 100 mL.1 mL de malatión al 50% y aforar con etanol a 100 mL.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución patrón de malatión 40 µg/mL Medir 0. De esta solución medir 8 mL y aforar a 100 mL con etanol. Disulfuro de carbono al 0. pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada. pesar 9 g de Na2SO4 y aforar a 100 mL con agua destilada. Sus efectos tóxicos incluyen irritación de membranas. vómito. Solución ácida de sulfato de sodio A 100 mL de solución de Na2SO4 al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado. medir 0. se absorbe por piel y vías respiratorias. coma y fallo respiratorio. Sus efectos agudos incluyen convulsiones. Nota: El CS2 es altamente tóxico. Hidróxido de sodio 6N (NaOH) Para preparar 100 mL. Nota: El malatión es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fácilmente por piel y vías respiratorias. se debe extremar cuidado con su contacto directo. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 56 .5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua destilada.5% (CS2) Para preparar 100 mL. náusea. Sulfato de sodio al 9% (Na2SO4) Para preparar 100 mL. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: Material vegetal con CCl4.5 g de CuSO4 y aforar a 100 mL con agua destilada. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 57 . H2O. pesar 3. aforar a 100 mL con agua destilada. pesar 5 g de FeCl3 y disolver en 1 mL de HCl 6N. R3: CCl4 y subproductos orgánicos de hidrólisis ácida. Sulfato cúprico al 3. Na2SO4. pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.Laboratorio de Toxicología Cloruro férrico al 5% (FeCl3) Para preparar 100 mL. R4: CuSO4. fenolftaleína. Fenolftaleína al 1% Para preparar 100 mL. R2: Solución ácida de Na2SO4 al 9% y EtOH. R5: CCl4 y compuesto de coordinación de cobre. FeCl3.5% (CuSO4) Para preparar 100 mL. Quercetina .Espátula de cromo níquel .Laboratorio de Toxicología DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL ÁCIDO NORDIHIDROGUAYARÉTICO OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias químicas.Balanza analítica .Micropipeta de 100-1000 µl .Carbonato de sodio (Na2CO3) .Ácido nordihidroguayarético (ANDG) Equipo .Tubos Eppendorf 1.Xantina oxidasa (XO) .Nitrato de cobre (Cu(NO3)2) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 58 .Gradilla .Celda 4 1 1 1 .Matraces de 250 mL 1 1 1 2 .Nave de pesado . PROBLEMA Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el ácido nordihidroguayarético mediante la reducción en la producción de anión superóxido.Bicarbonato de sodio (NaHCO3) .Micropipeta de 10-100 µl . Reactivos .5 mL . utilizando el sistema xantinaxantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio.Nitroazul de tetrazolio (NAT) .Espectrofotómetro Material por equipo .Potenciómetro .Xantina (Xan) .EDTA . 4. siguiendo el orden de adición indicado en la columna reactivo. Agitar e Incubar ** h. Cu(NO3)2 Control positivo (µL) 100 100 300 300 300 1h 200 Control negativo (µL) 100 100 600 300 1h 200 Antioxidante 0.[(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la quercetina y/o ANDG AC+= absorbancia del control positivo PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 59 . 2. ** Cerrar el tubo. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el 100% de formazán en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo con la siguiente fórmula. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+). se empieza a contar el tiempo.Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. % atrapamiento= 100 . NBT e. leer las diferentes muestras a 560 nm. XO* g. quercetina y ANDG. Solución amortiguadora d. Tabla 1. 5. Antioxidante f. Transcurrido el tiempo de incubación. Tubo Reactivo a. Todo el material de vidrio deberá ser enjuagado previamente con EDTA. EDTA c. empleando como blanco una solución amortiguadora de carbonatos pH 10. Preparar los tubos de acuerdo con la siguiente tabla. control negativo (C-). agitar la mezcla por inversión e incubar a 24-30°C. Xantina b.25 µM quercetina (µL) 100 100 200 300 100 300 1h 200 ANDG (µL) 100 100 200 300 100 300 1h 200 * Una vez adicionada. 3.2. Preparación de los tubos problema y control. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el profesor. 7. Resultados grupales. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Control positivo (C+) Absorbancia % Atrapamiento 0% Tabla 1. Resultados por equipo. ¿Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuiría a disminuir el estrés oxidante? Justifique su respuesta. 4. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 60 . Quercetina ANDG 2. Una vez obtenidos los resultados.Laboratorio de Toxicología 6. discutan a qué factores se podría atribuir dicho comportamiento. ¿Cuál de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2•-? 3. desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: Equipo 1 2 3 4 Promedio Desviación estándar % de Atrapamiento Quercetina ANDG Tabla 2. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad. CUESTIONARIO 1. 5. 87-97.. Johns. “A novel and potent biological antioxidant. T. Casarett and Doull’s Toxicología: la ciencia de los venenos. Hidetaka..Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Cadenas. Handbook of Antioxidants. Inc. E. Owena. Klassen. y Tuñón. 2002. México.D. C.. Martínez-Flórez. L. P..M. Wardman.. (2002). Tsutomu. New York. (6a ed. 271-278. 2001. “Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes” en Nutrición Hospitalaria. “Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress. kinobeon A. pitfalls.. González-Gallego. K. from cell culture off sunflower” en Life Sciences 74..J.L. (2003). Klaassen. “Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout” en Journal of Ethnopharmacology 64. P. et al. Marcel Dekker. S. XVII. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 61 .). (5ª ed. 149-160.D. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia básica de los tóxicos. Volume 1. 995-1022. J. Culebras. McGraw-Hill. 16-32. J. Interamericana. Mc Graw-Hill.. Susumu. 2001.). World Health Organization monographs on selected medicinal plants. (1999).. Ed. pp.. and prospects ” en Free Radical Biology & Medicine 43.. C. Packer. M. N. T. 1999.B. Watkins. Geneva. J. (2007). Reacción de Fenton. + 8. EDTA. Reacción catalizada por la XO. XO y Cu(NO3)2. 7. Propósito de la adición secuencial de: xantina. Definición del proceso de estrés oxidante. Concepto de antioxidante.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 2. solución amortiguadora de carbonatos pH 10. Especie química que absorbe a 560 nm. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 62 . 5. 6.2. nitroazul de tetrazolio. 4. 3. Noción de radical libre y especies reactivas. Completar los productos en el siguiente diagrama. 1 mM Pesar 33.2 mM (Cu(NO3)2) Pesar 4 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 100 mL con agua destilada. Guardar la solución en un frasco ámbar en el refrigerador.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Xantina 1.7 mg de xantina. Nitroazul de tetrazolio 0.2 Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1. Ajustar pH a 10.5 mM Pesar 22. pH 10.1 M Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 63 .01 g de Na2CO3. Solución amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solución amortiguadora de carbonatos.4 mg de quercetina y aforar a 250 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10. Xantina oxidasa La enzima se preparará durante la sesión de laboratorio de acuerdo con la indicación de los profesores. Nitrato de cobre 0.2 (solución stock). disolver con agua destilada. EDTA 0. agregar Na2CO3 0. disolverlos con agua destilada. Quercetina 0.2 y aforar a 250 mL.6 mg de EDTA.25 µM Pesar 1. aforar a 1 L. 25 µM Pesar 1. H2O2. ácido nordihidroguayarético. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: xantina.2 (solución stock). EDTA. nitroazul de tetrazolio.Laboratorio de Toxicología ANDG 0. xantina oxidasa.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2. formazán. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 64 . Cu(NO3)2. ácido úrico. quercetina. solución amortiguadora de carbonatos pH 10. o un ratón ICR control negativo no tratado. en eritrocitos policromáticos de médula ósea murina.Aceite de inmersión.Etanol (EtOH) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 65 .Pipeta Pasteur .8 . inducidos por ciclofosfamida.Bulbo para pipeta Pasteur .p.Microscopio óptico 2 2 4 2 . .Solución salina isotónica (SSI) .Pinzas de disección . Material por equipo .Colorante de Giemsa 2 % .Contador de células 6 4 1 Reactivos .Laboratorio de Toxicología EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD GENOTÓXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TÉCNICA DE MICRONÚCLEOS EN MÉDULA ÓSEA OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotóxica de un xenobiótico empleando la técnica de cuantificación de micronúcleos en médula ósea de ratón.Solución amortiguadora de fosfatos pH=6. Animales de experimentación Un ratón ICR por equipo.Tijeras de disección .Portaobjetos . PROBLEMA Identificar la presencia de micronúcleos. administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40 mg/Kg i. Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen más de 30 minutos entre los pasos 1 y 9. 3. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 66 . estirando las patas traseras del animal. 1. Dislocar la articulación del fémur con la cadera. Sacrificar al ratón por dislocación cervical. Diseccionar y extraer el fémur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por debajo de la rodilla. fijarlo a la mesa de trabajo. 2. 4. Una vez muerto el animal de experimentación. cortar cuidadosamente ambas epífisis y lavar el interior del fémur con 3 mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del número 21. Una vez limpio. Recolectar y reunir en un mismo tubo de 13 x 100. tomar la parte que queda debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulación de la rodilla y el fémur. Limpiar cuidadosamente cada fémur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido muscular. Envolver los restos del animal de experimentación en una hoja de papel periódico. la médula de cada fémur.Laboratorio de Toxicología 5. colocarlos en la caja de contención para incinerarlo posteriormente. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 67 . 7. Para facilitar la eliminación del tejido muscular. 6. extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur. 9. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas. 11. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 68 . Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una gota de la suspensión de médula ósea y un segundo portaobjetos justo atrás de la gota en ángulo de 45°. 10. Depositar el sobrenadante en una solución de hipoclorito de sodio. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente para formar una delgada capa de células. y resuspender el botón en una gota de SSI. Repetir esta operación durante 5 minutos. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la médula (tubo del inciso 6). Secar completamente los extendidos al aire. hasta cubrir la superficie y secar al aire.Laboratorio de Toxicología 8. Dejar reposar durante 10 minutos. Enjuagar la laminilla una vez más con agua destilada y secar al aire. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante de Giemsa 2% y cubrir con un cubreobjetos.8 durante 5 minutos. . Observar al microscopio con aceite de inmersión. y enjuagar la laminilla con agua destilada. 15. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 69 . 13.El número de eritrocitos policromáticos por cada 200 eritrocitos totales.El número de eritrocitos policromáticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos policromáticos. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos. Cubrir la laminilla con solución amortiguadora de fosfatos pH 6. 14. y registrar los siguientes datos: . 16.Laboratorio de Toxicología 12. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: EPCa/ ETb Laminilla 1 Laminilla 2 Laminilla 3 Laminilla 4 Sumatoria EPCMNc/ EPC /200 ET /1000 EPC *EPC: Eritrocitos policromáticos. Resultados por equipo. Con base en la experiencia adquirida. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 70 . Tabla 1. CUESTIONARIO 1. indique dos características que le permitan identificar un micronúcleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tinción. b ET: Eritrocitos totales.Laboratorio de Toxicología Eritrocito policromático micronucleado Eritrocito normocromático Eritrocito policromático Eritrocito normocromático micronucleado NOTA: Debido a que el conteo de los micronúcleos se debe realizar al ciego. 2. c EPCMN: Eritrocitos policromáticos micronucleados. el alumno no sabrá hasta el final de la práctica si el animal de experimentación proporcionado ha sido tratado o no con ciclofosfamida. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 71 .005 SD 0. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos. Resultados grupales. c EPCMN: Eritrocitos policromáticos micronucleados. ¿podría establecer si el daño genotóxico ocasionado por la ciclofosfamida fue clastogénico o aneuploidógeno? Explique su respuesta.Laboratorio de Toxicología 3.0006 0. b ET: Eritrocitos totales. Tabla 2.58 0.0006 *EPC: Eritrocitos policromáticos. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla: EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC Ciclofosfamida Promedio /200 ET /1000 EPC Datos teóricos de los individuos control Control (-) n=3 Promedio 116/200 ET 5/1000 EPC cociente 0. 4. 5. Realice una comparación estadística mediante (t-Student) entre los dos grupos y concluya si existen diferencias significativas como para considerar un daño genotóxico. Hummelenb.. I. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test. A. H. G. pharmacy and medical personnel occupationally exposed to cytostatic drugs — evaluation by the micronucleus assay” en Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 497. Conduct And Data Interpretation” en Mutation Research 455. Marcos. E. S. chromosome breakage. Sautter. Office of Prevention. (2003)... D. Proudlock.. EPA (US Environmental Protection Agency). apoptosis. G. (2001). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 72 . R.... Konopacka. 155-166. 147-156. (1997).. “The genotoxic risk of hospital... Cebulska-Wasilewska.5395. A. J. chromosome loss and non-disjunction” en Mutation Research 392. Nunziata. Elhajoujia.. B. Gröbmair. “Evaluation of frequency of micronuclei in exfoliated cells from bladder of mice treated with benzo(a)pyrene. “In vivo Rodent Micronucleus Assay: Protocol.. Pethran. 19-30. Statham. K. W. 669-672.. R. M.. Maisch. Kirsch-Voldersa.V. Pastor. Fruhmann. Cundaria. “A review of in vitro methods to assess the biological activity of tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke” en Toxicology in Vitro 17. “Evaluation of the rat bone marrow and peripheral blood micronucleus test using monocrotaline” en Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 392. Hessel. Creus. M.. A. Howard. 587-594. (1994). (2000). A.. August 1998. Gutiérrez. S. Health Effects Test Guidelines OPPTS 870. (2001).. M. “Micronuclei in peripheral blood lymphocytes and buccal epithelial cells of Polish farmers exposed to pesticides” en Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 495.J. 2-acetylaminofluorene and cyclophosphamide” en Cell Biology International 18. Hayashi. C.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Andreoli. Radon. Pesticides and Toxic Substances (7101) EPA 712-C-98-226. P. 243-249. “The in vitro micronucleos test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay. 101-109. Gigante. S. (1997).. A. Krishna. 3. 2.6 ± 0.33 18. administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. obteniendo los siguientes resultados: Grupo SSI Daunorrubicina Apigenina Micronúcleos/1000 células 0. Fundamento de la tinción de Giemsa.6 ± 0. Se determinó la actividad genotóxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre periférica de ratón.62 1.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. 5. Concepto de micronúcleo y proceso de formación.5 ± 0. Mecanismo de acción genotóxica de la ciclofosfamida. Los xenobióticos en estudio se administraron a 2. inmaduros y micronucleados con el colorante de Giemsa. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 73 . Promedio de número de micronúcleos por cada tratamiento. 9. Definición de eritropoyesis. Diferencia entre daño clastogénico y aneuploidógeno. mientras que el grupo control fue administrado con SSI. 7. y cómo se pueden diferenciar con la técnica de micronúcleos.80 Tabla 1.8. Usos clínicos de la ciclofosfamida. Propósito de adicionar EtOH y solución amortiguadora de fosfatos pH=6. 6. 8. Coloración que adquieren los eritrocitos maduros.5 mg/kg. 4. 2 t = 0 y1 – y2 Sp * 2 1 + 1 n1 + n2 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 74 . y concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de daño genotóxico. Sp = 2 (n1 .Laboratorio de Toxicología Realice una comparación estadística (t-Student) de los grupos tratados con especto al control.1)S12 + (n2 – 1)S22 n1 + n2 . 683 0.390 2.854 0.692 0.706 4.508 2.658 1.156 1.681 0.015 1.061 1.674 1.821 2.943 1.021 2.845 2.059 1.708 1.310 1.048 2.782 1.228 2.571 2.356 1.861 0.684 0.638 1.857 0.576 Tabla 2.282 6.467 2.703 0.093 2.341 1.179 2.721 1.920 0.20 0.865 0.851 0.323 1.000 0. t-Student.704 2.855 0.861 2.315 1.074 2.831 2.866 0.201 2.604 4.960 31.069 2.771 2.858 0.169 3.457 2.296 1.706 1.067 1.066 1.889 0.842 1.886 1.120 2.473 2.694 0.056 1.041 1.376 1.319 1.761 1.684 0.756 2.812 1.074 1.365 2.833 1.845 0.119 1.052 2.036 3.518 2.688 0.447 2.746 1.071 1.683 0.083 1.372 1.787 2.895 1.727 0.326 63.055 3.870 0.859 0.132 2.055 1.819 2.064 2.078 1.415 1.714 1.046 1.703 1.883 0.365 3.321 1.316 1.697 1.896 2.025 0.602 2.462 2.860 0.069 1.190 1.750 2.01 0.980 1.734 1.706 0.076 1.807 2.386 1.856 0.740 1.868 0.314 2.896 0.699 1.776 2.101 2.110 2.689 0.797 2.042 2.677 0.977 2.080 2.055 1.645 12.765 0.262 2.906 0. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 75 .816 0.711 1.160 2.725 1.058 1.858 0.862 0.854 0.856 0.684 0.345 1.764 2.358 2.718 2.397 1.863 0.753 1.617 2.583 2.353 2.328 1.108 1.079 1.289 1.690 0.250 3.476 1.796 1.687 0.086 2.624 2.685 0.485 2.337 1.965 4.106 3.060 1.499 3.500 2.695 0.058 1.848 0.920 2.325 1.691 0.045 2.741 0.303 1.050 1.528 2.686 0.314 1.060 2.701 1.318 1.350 1.679 0.333 1.779 2.660 2.821 6.855 0.182 2.012 2.947 2.707 3.941 0.005 1.686 0.061 0.539 2.978 0.440 1.330 1.363 1.492 2.685 0.306 2.423 2.100 1.729 1.860 1.876 0.143 2.998 2.15 0.Laboratorio de Toxicología Grados de libertad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120  0.063 1.355 3.250 1.683 0.541 3.145 2.064 1.841 4.718 0.873 0.479 2.567 2.697 0.657 9.963 1.093 1.383 1.032 3.303 3.763 2.311 1.057 1.313 1.25 0.650 2.000 1.921 2.056 2.700 0.717 1.688 0.684 1.134 1.879 0.681 2.131 2.925 5.552 2.878 2.747 3.671 1.10 0.711 0.088 1.771 1.898 2.533 1.05 0. 6.........Laboratorio de Toxicología APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución salina isotónica (SSI) Para preparar 100 mL..9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada...... PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 76 .............. se pesan 0....2....63 g Agua destilada (cuanto baste para un litro) Giemsa al 2% Tomar 2 mL de Giemsa comercial y diluir en 100 mL de agua destilada.. o bien.... Solución amortiguadora de fosfatos Na2 HPO4 . puede utilizarse la solución comercial....56 g KH2 PO4.... al relacionar los resultados encontrados macroscópicamente en el hígado y bazo.Caja de contención .Etanol (EtOH) . DESARROLLO EXPERIMENTAL El trabajo experimental se desarrollará por equipos en 4 sesiones de laboratorio.Traer marcadores de tinta permanente color rojo. negro y azul . hemoglobina total (Hbt) y hemoglobina libre (Hbl).Perforador (primera sesión) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 77 .Algodón Reactivos . PROBLEMA Identificar cuál de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor daño en las ratas. y Hbl.Laboratorio de Toxicología EFECTOS TÓXICOS DE LA ADMINISTRACIÓN DE PLOMO EN RATAS OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno visualice el daño macroscópico ocasionado en hígado y bazo de ratas administradas de forma sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por vía i.Éter etílico . con los encontrados microscópicamente en los eritrocitos y en la cuantificación del Hto.3 jeringas para INSULINA (traer por cada sesión) . Hbt.Balanza para animales .Solución salina isotónica (SSI) .Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) . Material por equipo . Animales de experimentación (por equipo para las cuatro sesiones) 3 ratas del mismo sexo y peso entre 180 y 300 g.Hipoclorito de sodio al 6% (NaClO) .p. Relacionar dicho daño con las alteraciones que se presentan en la morfología de los eritrocitos y en los valores del hematocrito (Hto). previa anestesia con éter. 2. de acuerdo con el siguiente código. un volumen de 0. A cada rata se le administrará. 2. 4. y SSI. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Unidades = Oreja derecha Decenas = Oreja izquierda 3. por vía intraperitoneal. A cada rata se le administrará un volumen de 0. Procedimiento para la Sesión II y III (segunda y tercera administración) 1. Cada equipo contará con 3 ratas.5 mL de la solución que le corresponda por vía intraperitoneal.Laboratorio de Toxicología Procedimiento Sesión I (primera administración) 1. Pesar e identificar mediante tinción en la cola y perforaciones en la oreja. Nota: El profesor indicará el color con el que se deberá marcar las colas de las ratas en cada equipo y qué numeración se asignará a cada una de las ratas. a cada una de las ratas. B. Pesar a cada una de las ratas.5 mL de la solución que le corresponda. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 78 . A cada equipo se le proporcionará 3 soluciones etiquetadas como solución A. Reactivo de Drabkin .5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.Microscopio de óptico(s) con objetivo de inmersión .Éter etílico . Anestesiar las ratas con éter etílico y.Micropipeta Reactivos .Pinza de disección .Nuevo azul de metileno .Espectrofotómetro .Centrífuga para microhematocrito .Tubos de ensayo de 13 x 100 .Etanol (EtOH) .Peróxido de hidrógeno al 1% (H2O2) Equipo . PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 79 .Vaso de precipitados de 250 mL .Pipeta graduada de 1 mL 1 15 1 2 5 2 2 4 1 DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Tijeras de disección . Preparar 3 jeringas con 0.Tubos capilares .Centrífuga . obtener un volumen de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.Pipetas volumétricas de 5 mL .Solución de heparina 1000 UI o EDTA al 10% .Bencidina al 1% -Solución salina isotónica (SSI) 1 1 1 1 5 8 16 2 1 1 .Algodón .Celdas de vidrio .Navaja para bisturí con porta bisturí .Jeringas de 5 mL .Gradilla . 3.Solución patrón de cianometahemoglobina (CNMHb) .Portaobjetos . 2.Caja de contención . mediante punción cardiaca.Cajas de Petri . Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el número de la rata que corresponda y agregar 0.Tubos de ensayo de 16 x 150 .Vasos de precipitados de 100 mL .1 mL de heparina o 0.Tabla de disección .Colorante de Wrigth .Laboratorio de Toxicología Procedimiento para la Sesión IV Material por equipo .Pipetas graduadas de 10 mL .1 mL de solución de heparina o EDTA al 10%. Determinar hemoglobina libre en plasma según la sección de técnicas experimentales. Envolver los restos de los animales de experimentación en una hoja de papel periódico y colocarlos en la caja de contención para su posterior incineración. Una vez realizadas las determinaciones anteriores.Laboratorio de Toxicología 4. 2. 9. Realizar esta operación por duplicado. Realizar la cuantificación de hemoglobina total de acuerdo con la sección de técnicas experimentales. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito de acuerdo con lo indicado en la sección de técnicas experimentales. centrifugar cada uno de los tubos con la sangre restante a 2500 rpm x 5 min y separar el plasma del paquete celular. Sacrificar la rata por dislocación cervical. El extremo vacío se cierra con calor. 11. Los animales que no fueron empleados deberán ser devueltos al bioterio. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguíneas con colorante nuevo azul de metileno (NAM) de acuerdo con la sección de técnicas experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor con hipoclorito de sodio. Técnicas experimentales Técnica de microhematocrito 1. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Colocar los órganos en cajas de Petri con SSI. 5. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100 correspondiente. Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la centrífuga para microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min. 10. 12. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 80 . Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversión del tubo. 3. 8. Observar y comparar los órganos con respecto a la rata control. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguíneas con colorante de Wright de acuerdo con la sección de técnicas experimentales. para evitar su deshidratación. 7. 6. Hacer una incisión en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hígado de cada rata. Hacer un frotis de cada muestra. Una vez obtenido los resultados. C. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relación con la altura total de la muestra (M1) y expresarla en %. B. de la siguiente forma: _ _ 2 Muestra de sangre 2 2 X % 1 1 1 A.Laboratorio de Toxicología 4. Mediante un movimiento uniforme deslizar el portaobjetos 2 sobre el 1. Para formar una monocapa uniforme de células. depositar los capilares en el contenedor para residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI). M 2 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 81 _ _ _ _ _ _ _ _ _ . M1 _________ 100 % M2_________ X% M M1 M2 _ _ _ _ 5. Poner una pequeña gota de sangre sobre el portaobjetos 1 y colocar el portaobjetos 2 en frente de la muestra. _ _ _ Tinción de Wright 1. Laboratorio de Toxicología 2. Transcurridos 5 minutos. Cubrir el portaobjetos por completo con el colorante de Wright. Colocar una gota de la mezcla anterior en un portaobjetos y hacer un frotis siguiendo la técnica descrita (la metodología de la tinción de Wright). Preparar 5 tubos de acuerdo con la siguiente tabla. Tabla 1. enjuagar con agua destilada y dejar secar. 2. 3. Agregar con una pipeta Pasteur 3 gotas de sangre y 3 de colorante a un tubo de 13 x 100 y mezclar. Repetir esta operación durante 5 minutos. Cuantificación de Hbt PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 82 . Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min. 4.02 ---5 ---- ---- ---- 0. 3. 5. agitando cuidadosamente después de la adición de cada reactivo y dejar reposar 10 min. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x. Colocar los tubos en el contenedor con hipoclorito de sodio y lavar.02 0. Dejar que los extendidos sequen al aire. Dejar secar al aire. Cuantificación de hemoglobina total 1. Tubo REACTIVO (mL) SOLUCIÓN DE REFERENCIA MUESTRA DRABKIN Blanco Referencia* A B SSI -------5 0. Observar los frotis al microscopio con el objetivo 100x. usando aceite de inmersión. usando aceite de inmersión. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.02 0. Tinción con nuevo azul de metileno 1. Depositar los residuos de la tinción en un frasco etiquetado como R1. 4.02 5 5 5 *Consultar la concentración de la solución de referencia en la etiqueta del frasco. 02 mL ----------1.02 mL 1. Calcular la concentración de Hbt en g/dL empleando la siguiente fórmula: Hbt = Aprob*(Cref.0 mL Tabla 2.) Donde: Cref.0 mL 0.0 mL Mantener los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos Ácido 10% *Preparar una solución estándar de hemoglobina con una concentración de 150 mg/L a partir de la solución estándar de hemoglobina total. = absorbancia de la solución de referencia 4. Cuantificación de Hbl.02 mL ----------1. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 83 .0 mL 1.0 mL 10.0 mL 1.0 mL 10. Cuantificación de hemoglobina libre en plasma 1. Marcar 6 tubos de 16 x 150 y trabajar según la siguiente tabla: A B SSI Solución Estándar* Blanco Bencidina 1% Plasma Estándar Agua destilada H2O2 1% 1.0 mL 10.0 mL -----0.0 mL 0.0 mL 10. colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.02 mL -----1.Laboratorio de Toxicología 2.0 mL 0.0 mL 1. = concentración de la solución de referencia (g/dL) Aprob = absorbancia del problema Aref./Aref.02 mL ----------1. Ajustar la absorbancia a cero con el blanco y leer a 540 nm. Una vez leídos. acético 10.0 mL ----------0. 3.0 mL 1. (+) para el menor y (-) para la ausencia de efecto. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 84 . leer a 515 nm. Una vez leídos. calcule según la sección de técnicas experimentales: Hto. siendo (++) para el de mayor efecto. 2. Con los datos de la tabla anterior.Laboratorio de Toxicología 2. Mezclar y dejar reposar 10 min a temperatura ambiente. calificar con cruces el efecto tóxico. bazo. M2 = altura del paquete globular. Hbl y reporte sus resultados en la siguiente tabla: Rata Órganos* Hígado Bazo Frotis* Wrigth NAM Hto % Hbt g/dL Hbl mg/L Efecto* Tóxico A B SSI *En los espacios para hígado. del problema mg de Hbl = ----------------------------Abs. del estándar * concentración del estándar (mg/L) 3. NAM y efecto tóxico. frotis Wrigth. Cálculos: Abs. Reporte sus resultados en la siguiente tabla: Hematocrito* (cm) Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl M1 M2 M1 M2 SSI A B *M1 = altura total de las muestras. colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3. Hbt. CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles fueron las diferencias en las alteraciones morfológicas en hígado y bazo para cada tratamiento? 4. 9. ¿Cuáles fueron las diferencias observadas en las células sanguíneas. ¿Qué relación observó entre las alteraciones morfológicas de las células sanguíneas y la proporción de reticulocitos? 6. los valores de Hbl y Hbt? 7.Laboratorio de Toxicología 3. ¿Qué relación observó entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas? Concluya qué solución provocó mayor efecto tóxico. ¿Qué relación observó entre la proporción de reticulocitos con los valores obtenidos de Hto? ¿Cómo afectó la dosis de la solución A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al control? 8. con respecto al control utilizando las tinciones de Wright y NAM? 5. ¿Qué relación observó entre las alteraciones morfológicas de las células sanguíneas y los valores de hematocrito encontrados en cada una de las ratas? ¿Qué relación observó entre la proporción de reticulocitos. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 85 . López-Carrillo. pp.). 1670-744. McGraw Hill. “Eliminación del plomo por curado casero” en Salud Pública.V. Casarett y Doull’s Toxicology. Isolation and Identification of Drugs. I y II. Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo. (6a ed.D.SSA1.J. Ríos. R. Philadelphia. 827-834. Clark. Ed.kdhe.. W.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Blanke. Decker. “Analysis of toxic substances” en Textbook of clinical chemistry. 2001. Pharmaceutical Press. 5106-5108. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 86 .ks. Ed. (1999). pp.009.E. 1986. L. The Basic Science of Poisons. México 41. Saunders. C.state. E.us Torres-Sánchez. New York..1993. C. Vol. London.. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM. www. L. 1972 Klaassen. Medidas terapéuticas que se toman en una intoxicación por plomo y que concentración plasmática del mismo debe de estar presente para que se aplique a los niños. 4. 6. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 87 . Para preparar 100 mL. Efectos que ocurren en los eritrocitos cuando la concentración de plomo rebasa el valor de 80µg/dL y qué es lo que provoca esta manifestación. 10. 14. 3. APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución salina isotónica (SSI) Puede utilizarse la solución comercial o preparar una solución de cloruro de sodio al 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua destilada.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. Características en una intoxicación crónica (30-50 µg/dL) por plomo en los niños. 8. 5. por la técnica del microhematocrito.9 %. en dosis de 40 mg/Kg en el diagnóstico por intoxicación por plomo. Papel que juega la sal Na2CaEDTA. 2. 9. se pesan 0. por el método de la cianometahemoglobina y el de la hemoglobina libre. Vida media del plomo en sangre y huesos. 12. Influencia de la edad del individuo en la absorción gastrointestinal del plomo. por el método de la bencidina. Influencia de la edad y el sexo en los niveles de plomo en sangre en los seres humanos. Efectos que producen la anemia que se manifiesta por la intoxicación por plomo. Fundamento de la determinación del hematocrito. 7. Papel que juegan los eritrocitos en la relación de concentración plasma/orina en la eliminación del mismo. Tejidos principales de distribución y depósito del plomo en el organismo. 11. Síntomas principales de intoxicación por plomo en el tracto gastrointestinal. 13. Fundamento de la tinción de Wrigth y del Nuevo Azul de Metileno. Manifestación principal en una intoxicación por plomo en el sistema nervioso central. Fundamento de la determinación de hemoglobina total. Laboratorio de Toxicología Reactivo de Drabkin. (preguntar al profesor si ya está preparado) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]) Cianuro de potasio (KCN) Saponina Agua destilada c.b.p. 1.0 g 0.20 g 0.05 g 0.1 g 1000 mL Nota: El reactivo de Drabkin y la solución estándar de CNMHb. Contienen derivados de CIANURO, los cuales son tóxicos, sin embargo las concentraciones de éstos están por debajo de la dosis letal referida a un litro de solución. Nuevo azul de metileno: (preguntar al profesor si ya está preparado) Nuevo azul de metileno Oxalato de potasio Cloruro de sodio Agua destilada c.b.p. Filtrar antes de usar. 0.5 g 1.40 g 0.80 g 100 mL Solución de bencidina al 1% Solubilizar 1 g de bencidina en 100 mL de ácido acético al 10%. Nota: La bencidina es un reactivo considerado como carcinogénico, por lo que se deben extremar precauciones en su manejo. Peróxido de hidrógeno al 1% Ácido acético al 10% Colorante de Wright (preguntar al profesor si ya está preparado) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 88 Laboratorio de Toxicología Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporación, guardar en un sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH. R2: Sangre de rata, NaHCO3, K3[Fe(CN)6], KCN, saponina. R3: Plasma de rata, bencidina, H2O2, ácido acético. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 89 Laboratorio de Toxicología EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIÓN DE METALES PESADOS POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cerámica a diferentes valores de pH. PROBLEMA Realizar un análisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas de barro vidriado y sugerir cuál de ellos presenta mejores resultados para reducir el contenido de plomo en estos recipientes. Discutir el riesgo de exposición al plomo liberado por recipientes de barro vidriado en los seres humanos. Materiales - Vasija de barro vidriado* - Tubos de ensayo 13x100 - Anillo metálico - Papel pH - Probeta de 100 mL 6 10 3 3 1 - Mechero - Rejilla de asbestos - Gradilla - Pipetas de 1 mL - Pinza para tubos 3 3 1 3 1 *Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos con una capacidad máxima aproximada de 250 mL. REACTIVOS - Agua destilada - Hidróxido de sodio 1 N (NaOH) - Yoduro de potasio (KI) - Ácido clorhídrico (HCl) - Ácido nítrico (HNO3) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 90 B y C y reunirlas con las vasijas curadas 1. Marcar las vasijas no curadas como A. pH 2 Solución NaOH. Vasija 2 . Colocar el volumen necesario en cada una según el diseño de la siguiente tabla. Calentar las vasijas a ebullición y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua disminuya considerablemente. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 91 . 5. 2 y 3 3. Vasija 3 . secar. el profesor indicará a los alumnos los tratamientos de curado a realizar a 3 de las 6 vasijas: Vasija 1 . Previo a la sesión. 2. Lavar y secar.Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Vinagre: Llenar ¾ partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante 1 hora. reponiendo el volumen perdido durante esta operación. 4. Lavar y secar. reponiendo el volumen perdido durante esta operación. A Solución HCL. reponer el volumen perdido con agua.Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100 mL de agua y hervir durante 1 hora. Agitar y raspar ligeramente las paredes de cada vasija con una espátula.Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija de barro y dejar reposar por un día antes de lavarla con jabón eliminando cualquier residuo que se haya formado. pH 10 Agua destilada X B C 1 X 2 X 3 X X X Tabla 1. Diseño experimental. 11. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento ácido (A. Colocar por separado 0.5 mL de solución de cada vasija en tubos de ensayos. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 92 . 1 mL de la solución de yoduro de potasio procurando que la solución caiga directamente en el contenido del tubo. Agregar a cada tubo. 10. 13. 1. dejar reposar en su gradilla y observar.Laboratorio de Toxicología 6. 8. vaciar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R1. y medir el pH. Una vez obtenidos los resultados. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y básico (B) en un contenedor etiquetado como R2. 2 y 3) en el contenedor etiquetado como R1. 9. 7. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO3 concentrado. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior. 12. Agitar por unos segundos. Emplee un control negativo con agua destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6 y 7. Una solución o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. 5. medio (++). 3. Resultados. 2 y 3. alto (+++). Reporte sus resultados en la siguiente tabla. Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo A HCl B NaOH C agua destilada 1 ajo 2 vinagre 3 cal Tabla 1. Utilice el control negativo como referencia. ¿A qué la atribuye? 4.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1. indicando la presencia de plomo con cruces: negativo (-). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 93 . Concluya qué método de curado fue más eficiente. ¿Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podrían ser una fuente de exposición a plomo? 6. Concluya qué método de extracción fue más eficiente. bajo (+). 2 y 3 con la vasija A e indique si hay alguna diferencia. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1. B y C. 2. ¿Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposición a plomo? Justifique su respuesta. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A. state. pp. 6th edition. Decker. Torres-Sánchez. 41:5106 – 5108 (1999). Saunders.V. López-Carrillo. R. L.J. Toxicology.. Philadelphia. pp.D. W.SSA1. Clark. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Blanke.009.kdhe. C.E. Klaassen. Public information office and Bureau of consumer health. “Eliminación del plomo por curado casero” en Salud Pública. 1986. 827-834. Los peligros del plomo. Casarett y Doull’s.. Vol. y Ríos. C.1993.ks. The basic science of poisons. E. México. I y II. Isolation and Identification of Drugs. 1670-1744. 1972. www. L. “Analysis of toxic substances” en Textbook of clinical chemistry. McGraw Hill 2001. PhD. Pharmaceutical Press.us PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 94 . London. Proceso de vidriado de utensilios de barro. Precauciones que se pueden aplicar en casa para reducir el riesgo de exposición a plomo por consumo de alimentos. Límite máximo permitido de plomo en utensilios de barro vidriado por la NOM vigente. Esta solución es sensible a la luz.5% (KI) Pesar 16. 3. disolver en aproximadamente 25 mL de agua mezclar y aforar. 4. APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución de HCl pH 2 y solución de NaOH pH 10 Calcular la cantidad adecuada para preparar la solución de pH = 2 con HCl y la solución de pH 10 con NaOH. KI R2: NaOH. tomando las precauciones necesarias y etiquetando el recipiente final. Reacciones que se llevan a cabo en las vasijas de barro vidriado A y B durante el proceso de extracción e identificación. 5. APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: HCl.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. PbI2. 2. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 95 . Cinco alimentos de naturaleza ácida y cinco de naturaleza alcalina. HNO3. PbI2 NOTA: El responsable de residuos reunirá el contenido de R1 y R2 al finalizar la sesión. Solución de yoduro de potasio 16.5 g de KI y colocarlos en un matraz aforado de 100 mL. Pipeta graduada de 5 mL .Etanol (EtOH) PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 96 .Papel filtro (2 x 5 cm) .Tubo de ensayo 16 x 150 .Pipeta Pasteur con globo 3 3 1 3 3 4 .Balanza analítica Material . PROBLEMA Cuantificar al menos el 80% de la concentración de etanol en mg/dL en dos muestras problema y mediante los resultados obtenidos indicar el grado de intoxicación de los sujetos de los cuales provienen las muestras analizadas.Celda de vidrio para espectrofotómetro 2 3 4 6 2 5 . Reactivos .Matraz volumétrico de 10 mL .Pipeta graduada de 1 mL . Equipo .Caja de Petri con centro de vidrio .Pipeta volumétrica de 2 mL .Pinzas para tubo de ensayo .Estufa .Carbonato de potasio* (K2CO3) .Espectrofotómetro .Pipeta volumétrica de 5 mL .Pipeta volumétrica de 1 mL .Dicromato de potasio* (K2Cr2O7) .Laboratorio de Toxicología DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno realice la determinación presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras problemas mediante un método indirecto.Ácido sulfúrico (H2SO4) * Ver Apéndice II. adicionarles 0. control negativo. 5. II. Al tubo control negativo agregarle 5 gotas de agua destilada. Al tubo control positivo agregarle 5 gotas de etanol. Rotular 4 tubos como control positivo. 2. 4. 3. Determinación presuntiva de etanol 1. I.Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL A cada alumno se le proporcionarán 2 muestras problema a las cuales se les realizará la determinación presuntiva y cuantitativa de etanol.5 mL de solución de K2Cr2O7 (Solución A). muestra 1 y muestra 2. A cada uno de los tubos. A los tubos muestra 1 y 2 agregarles 1 mL de cada una de las muestras problema respectivamente. Determinación cuantitativa de etanol Centro de vidrio Esquema 1. 7. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 97 . 6. Reunir el contenido de los 4 tubos y confinarlos en un recipiente etiquetado como R1. Cámara de Conway. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente y observar la coloración de los tubos. Esta solución se utilizará como referencia para realizar los cálculos pertinentes. 7.Laboratorio de Toxicología Cada una de las muestras se tratará de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1. como se muestra en el esquema 1. durante 45 minutos. transferir el contenido del recipiente B a un matraz volumétrico de 10 mL. 6. Finalmente. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 98 . Colocar 2 mL de la solución B de K2Cr2O7 en el recipiente B. 5. Colocar 1 mL de la muestra problema en el recipiente A y tapar inmediatamente con el recipiente C. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra. agitando suavemente. aforar a 10 mL con agua destilada (en ocasiones puede aparecer un precipitado que desaparece al aforar). Determinar la absorbancia de la solución B de dicromato de potasio diluida 1 a 10. utilizando como blanco agua destilada. a 450 nm. lavando perfectamente dicho recipiente y la parte externa del recipiente A con un volumen máximo de 5 mL de agua destilada para ambos recipientes. Muestra 1 2 Control negativo Control positivo Coloración Resultado (+/-) Tabla 1. 4. 3. 2. Colocar la cámara de Conway en una estufa a 40ºC. Confinar el contenido del recipiente B y la solución de referencia en el frasco etiquetado como R1. Resultados presuntivos. Una vez transcurrido el tiempo indicado. CUESTIONARIO 1. Adicionar 1 mL de solución saturada de K2CO3 en el recipiente B. 8. utilizando como blanco agua destilada. Determinar la absorbancia a 450 nm. Proponga una modificación a la técnica presuntiva que le permita emplearla como prueba cuantitativa. Con los valores obtenidos en sus muestras. ¿Considera que la intensidad de color en la prueba presuntiva es un indicador de la concentración de EtOH en sus muestras? 3. Tabla 2. 4. Considere todas las diluciones realizadas tanto de su muestra biológica como de la solución de referencia. relacione la sintomatología en la siguiente tabla y concluya si los valores se encuentran por encima del límite legal establecido. Resultados de la prueba cuantitativa. Calcular la concentración de etanol en la muestra en mg/dL. desglosando los cálculos realizados para cada una de las muestras tomando en cuenta la lectura de absorbancia de la solución de referencia. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 99 . Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. 5. Muestra 1 2 Solución de referencia Absorbancia Dilución* Concentración (mg/dL) *En caso de haberse realizado.Laboratorio de Toxicología 2. 6. hipoglucemia intensa. tiempo de reacción lento. y visión borrosa. tambaleo y lenguaje cercenado. 300 a 500 ≥ 500 Falta notoria de coordinación. estupor.Laboratorio de Toxicología Concentración (mg/dL) 50 a 150 Observaciones clínicas Falta de coordinación. ¿Cuál es la concentración máxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo? 7. sobre todo en niños. hipoglucemia y convulsiones. Observaciones clínicas según el grado de intoxicación. Tabla 3. excepto en individuos tolerantes. ¿Qué resultados esperaría si la concentración de EtOH en la muestra es mayor a la concentración máxima que puede determinar el protocolo? PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 100 . Coma y muerte. 150 a 300 Deterioro visual. . 9a ed. L.A. “Hipnóticos y sedantes: etanol” en Goodman & Gilman.S. Ed. C. Klassen. Ethyl alcohol. Hobbs. pp. The C. J.J. “Efectos de los solventes y vapores en Toxicología Clínica” en Casarett & Doull.. T.S. Methods in clinical chemistry. 739-744.F.J. 411419. 1987. I. U. 324-329..H. 1. T. Inc. y Kaplan. 145-154.A.A. 1996. la ciencia básica de los tóxicos.V. pp.1-E-10b. H. “Ethanol” en Methodology for Analitical Toxicology..Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Fister. W. Verdoorn.3 (1950) U. (5ª ed.F. 934-935. Manual de Toxicología. McGraw-Hill Interamericana.A. T. Sunshine.J. Alcohol por Schroeder.. Manual of standardized procedures for spectrophotometric chemistry. Rall...A.S. Standard scientific supply corporation.W. Mosby Company. CRC Press. E-10a. 2001. México D. México D. 1978.) McGraw-Hill Interamericana. Watkins.B. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 101 . A. Las bases farmacológícas de la terapéutica. pp. U.D. pp. Pesce. de esta solución se tomaron 5 mL y se diluyeron a 10 mL. Fundamento de la prueba presuntiva.72 mg de etanol/100 mL de sangre. 3. Propósito de adicionar solución saturada de K2CO3 e incubar. Balanceo de la siguiente ecuación:  Cr3+ + R-COO - CH3OH + K2Cr2O7 2. 8. Longitud máxima de absorción del K2Cr2O7 en el visible. Respuesta: 60. tipo de sustancias que pueden dar un resultado falso positivo.01 M de dicromato de potasio se colocaron en la celdilla B y se hicieron reaccionar con 1 mL de muestra problema (celdilla A). Especificidad de la prueba.205. dando una absorbancia de 0.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. La lectura de absorbancia para la última solución. Fundamento de la prueba cuantitativa. a 450 nm. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 102 . Calcular la concentración de etanol en sangre de la siguiente muestra problema: Solución de referencia: 2 mL de una solución 0. Muestra: 2 mL de la solución 0. 5. 6. Al término de 45 minutos de calentamiento. Límite máximo de EtOH en sangre legalmente establecido para conductores. 4.23. Color de las soluciones que contienen cromo (VI) y cromo (III). 9. 7.01 M de dicromato de potasio se diluyeron a 10 mL. el contenido de la celdilla B se diluyó a 10 mL y se leyó a 450 nm. fue de 0. Posteriormente filtrar.5 g de K2Cr2O7 y solubilizarlo en 20 mL de H2SO4 al 50 %. K2CO3 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 103 .7 g/mol Densidad del etanol: 0. destrucción de membranas mucosas y perforación del tabique nasal.5 g de K2Cr2O7 en 25 mL de agua destilada y agregar cuidadosamente 40 mL de H2SO4 concentrado. CH3COOH. NOTA: El contacto con altas concentraciones de dicromato de potasio puede resultar en ulceración de manos. agregar la cantidad necesaria de K2CO3 en el volumen de agua destilada a preparar hasta su saturación (se observa que ya no se disuelve). H2SO4. PM del etanol: 46 g/mol PM del K2Cr2O7: 294. K2Cr2O7. Solución B: Solución de dicromato de potasio (K2Cr2O7) Disolver 0. Cr(SO4)3.7893 a 20°C APÉNDICE III DISPOSICIÓN DE RESIDUOS R1: EtOH. aforar a 100 mL con H2SO4 al 50 %. dejar enfriar y diluir con agua destilada a 100 mL.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Solución A: Solución de dicromato de potasio (K2Cr2O7) Pesar 2. Solución saturada de carbonato de potasio (K2CO3) Con agitación. K2SO4. Acetato de cobalto tetrahidratado .Vaso de precipitados de 100 mL .Agitador de vidrio .Matraz de bola de 50 mL .Laboratorio de Toxicología IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES Y BARBITÚRICOS EN MUESTRAS PROBLEMA OBJETIVO ACADÉMICO Con base en los conocimientos adquiridos en los guiones anteriores.Yoduro se sodio (NaI) . Reactivos .Embudo de cola corta .Acetato de etilo .Embudo de separación de 250 mL .Escopolamina PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 104 .Tubos de ensayo .Pipeta Pasteur 2 2 3 2 3 4 3 .Pipeta graduada de 10 mL .Ácido acético glacial .Anillo metálico .Tubo capilar 1 1 2 1 4 2 2 .Vaso de precipitado de 250 mL .Metanol (MeOH) . que el alumno proponga un proceso de extracción e identificación para alcaloides y barbitúricos.Cromatofolios de aluminio .Matraz Erlenmeyer de 125 mL .Ácido barbitúrico Equipo .Isopropilamina .Probeta de 10 mL .Rotaevaporador .Hidróxido de amonio (NH4OH) . PROBLEMA Aislar e identificar escopolamina y/o ácido barbitúrico de una muestra problema.Lámpara de luz ultravioleta Material .Bomba de aspersión .Anillos de corcho .Carbonato de bismuto (Bi2(CO3)3) . Etiquetar cada uno de ellos con el nombre de la sustancia que espera que contenga. Placa cromatográfica. El alumno desarrollará el procedimiento que proponga para aislar la forma no ionizada de los compuestos antes mencionados. evaporar a sequedad en un rotaevaporador.5 mL (3 o 4 gotas) de metanol. El profesor proporcionará una muestra que contiene escopolamina y/o ácido barbitúrico. Una vez obtenida la forma no ionizada de las sustancias. En una de ellas (placa 1) del lado izquierdo tendrá aplicada previamente la referencia de escopolamina. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 105 . Una muestra del residuo reconstituido previamente será aplicada del lado derecho de cada una de las placas de acuerdo con el siguiente esquema. y en la otra (placa 2) la de ácido barbitúrico. Para el proceso de identificación. Dejar enfriar y reconstituir cada uno de los residuos con 0.Laboratorio de Toxicología DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Esquema 1. solicitar a los profesores dos placas para cromatografía en placa fina. 3. 2. y con yodo para el otro compuesto. b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reacción. revelar las cromatoplacas utilizando la solución etiquetada como solución reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide. Para la identificación de la escopolamina emplear como sistema de elución una mezcla CHCl3/MeOH (9:1) + 3 gotas de NH4OH. Visualizar la presencia de escopolamina y/o ácido barbitúrico con una lámpara de luz U. 6. y agregar 2 gotas de HCl 1N más 2 gotas de “solución stock del reactivo de Dragendorff”. Calcular el Rf para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y comparar el valor obtenido con el de la referencia proporcionada. Para la identificación del ácido barbitúrico emplear como sistema de elución una CHCl3/Acetona (9:1) + 3 gotas de ácido acético. y posteriormente.Laboratorio de Toxicología 4. 7. Con el residuo reconstituido excedente realizar el siguiente procedimiento de identificación. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 106 . b) Realizar un control positivo con las muestras de referencia y un control negativo (con agua) para esta reacción. Eluir hasta la línea “límite de elución” indicada en el Esquema 1. 5. 9. Saturar las cámaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las placas cromatográficas. 8. Barbitúricos a) Colocar tres gotas del residuo reconstituido correspondiente y agregar tres gotas del reactivo A y tres gotas del reactivo B (Dille-Koppanyi).V. Alcaloides a) Colocar 2 gotas del residuo reconstituido correspondiente. si los hubo.Laboratorio de Toxicología CUESTIONARIO 1. 3. 5. Referencia escopolamina Residuo reconstituido de escopolamina Referencia Residuo de ácido reconstituido barbitúrico de ácido barbitúrico Dille-Koppanyi Dragendorff Rf Tabla 1. Reporte el diagrama de separación que utilizó para esta práctica y justifique los cambios. 2. Explique su respuesta. con relación al diagrama diseñado en los conocimientos previos. Explique su respuesta. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificación. Indique si su muestra contenía escopolamina. 4. Resultados de las pruebas de identificación. ¿Cuáles son los puntos que considera críticos para la adecuada separación e identificación de la muestra? PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 107 . Marque con una cruz si la reacción fue positiva. Indique si su muestra contenía ácido barbitúrico. 32. Plantas Medicinales. 1972.. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 108 . pp.E. Pharmaceutical Press. Clark.25-42. Cochin.. Zaragoza. J. Isolation and Identification of Drugs . Blood and Tissues” en Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139.V. Editorial Interamericana. Bases Bioquímicas y Patológicas. “Analysis of Toxic substances” en Textbook of clinical chemistry. pp. “Alcaloides. Daly. 1984. Farmacología. London. Bruneton. R. J. Generalidades” en Farmacognosia. 775-792. Fitoquímica. “The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. A. México. 708-714. Bowman y Rand. Decker. España. Vol. 1670-1744.W. Acribia. 154-159.Laboratorio de Toxicología Referencias bibliográficas Benko. I y II. J. (1963). E. (2ª ed). Blanke. “Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue” en Journal of Forensic Sciences 30. W.J. Saunders. 1986. 2001. (1985). Ed. Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine. Philadelphia. 42. la solución anterior se guarda en un frasco ámbar (la cual es estable por 6 meses). PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 109 . 2. 5. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la solución. APÉNDICE II PREPARACIÓN DE REACTIVOS Reactivo de Dragendorff (solución patrón) Solubilizar 2. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.Laboratorio de Toxicología APÉNDICE I CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. justificando en cada etapa el uso de los reactivos sugeridos. Fundamento de la reacción de Dragendorff.6 g de Bi2(CO3)3 y 7. Indicar en el diagrama anterior la recolección y almacenamiento de los desechos generados. Bases de la reacción de Dille-Koppanyi.0 g de NaI en 25 mL de ácido acético glacial. Yodo y reactivo de Dragendorff como reveladores. Reactivo de Dragendorff (solución reveladora) Mezclar 10 mL de la solución patrón con 25 mL de ácido acético glacial y 60 mL de acetato de etilo. 7. Fundamento de la cromatografía en capa fina como herramienta de identificación de sustancias químicas utilizando luz UV. Diagrama de separación para aislar escopolamina y ácido barbitúrico presentes en una muestra problema. Mezclar 20 mL del filtrado (solución rojo-café) con 8 mL de acetato de etilo. 6. 4. calentar por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Propiedades ácido-base (pKa) de la escopolamina y el ácido barbitúrico. 3. Laboratorio de Toxicología Reactivo A (Dille-Koppanyi) Solubilizar 0. NOTA: El reactivo A y el reactivo B son estables por 2 días. PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 110 . Reactivo B (Dille-Koppanyi) Mezclar 5.2 mL de ácido acético glacial.1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de MeOH absoluto y agregar 0.0 mL de isopropilamina con 25 mL de MeOH absoluto. Laboratorio de Toxicología Manual de guiones experimentales para la enseñanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicología (clave 1614) Editado por la Facultad de Química Se utilizaron en la composición tipo Times New Roman puntaje 11 y 12 Tipo de impresión PDF El cuidado de la edición estuvo a cargo de Brenda Álvarez Carreño. Daniel José María Ramírez Olvera Publicación aprobada por el Comité Editorial de la Facultad de Química. Abril 2012 PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIÓN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEÑANZA 111 . La formación estuvo a cargo del departamento de Diseño y Medios Audiovisuales. Diseño de interiores y portada: LDG.