UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN CIENCIAS DE LA SALUD HUMANAMANUAL BÁSICO DE LABORATORIO DE INMUNOBIOLOGÍA BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA Coordinador de Edición y Revisión: Ladislao Palomar Morales Edición y Revisión: Fonseca Coronado Salvador, Martínez Sosa Ángel Germán, Palomar Morales Ladislao, Vega López Marco Antonio, Zendejas Buitrón Victor Manuel Enero 2013 INDICE Página Programa de la asignatura Calendario de prácticas Reglamento general para los laboratorios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Seguridad en el Laboratorio de inmunobiología Morfología de las células del sistema inmunitario Técnicas de separación y purificación de células del sistema inmunitario 3 6 7 8 14 18 26 33 40 45 47 56 63 69 73 79 Fagocitosis Purificación de inmunoglobulinas por Salting out y/o inmunoafinidad Cuantificación de proteínas Anatomía del sistema inmunitario Electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia Inmunoelectrotransferencia 10 Inmuno Ensayo Enzimático (ELISA) 11 Genotipificación de SNP´s mediante PCR en tiempo real 12 Citometría de flujo 13 Inmunización de animales 2 Programa de la Asignatura 3 4 5 . PROYECTO Y/O ACTIVIDAD Presentación y formación de equipos Seguridad en el Laboratorio de inmunología Morfología de las células del sistema inmunitario FECHA (SEMANAL) 01/02/13 08/02/13 15/02/13 22/02/13 01/03/13 08/03/13 15/03/13 22/03/13 05/04/13 12/04/13 19/04/13 26/04/13 03/05/13 10/05/13 17/05/13 24/05/13 FECHA (SEMANAL) 22/03/13 17/05/13 CUMPLIÓ SI NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SEM Técnicas de separación y purificación de células del sistema inmunitario Fagocitosis I Fagocitosis II Purificación de inmunoglobulinas por precipitación y/o inmunoafinidad Primer Examen parcial Cuantificación de proteínas Anatomía del sistema inmunitario Electroforesis en gel de poliacrilamida y transferencia Inmunoelectrotransferencia Inmuno ensayo enzimático (ELISA) Genotipificación de SNP´s mediante PCR en tiempo real FERIADO Citometría de flujo Segundo Examen parcial Entrega de calificaciones CUMPLIÓ SI NO Manejo e inmunización de ratones I Inmunización de ratones II Inmunización de ratones III Sacrificio y muestreo EXAMEN Primer Examen parcial Segundo Examen parcial OBSERVACIONES 8 15 6 .UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA Código: FPE-CB-DEX-01-02 Número de Revisión: 02 CALENDARIZACIÓN ASIGNATURA GRUPO(S) SEMANA (1638) INMUNOBIOLOGÍA. (1807) INMUNOLOGÍA ESPECIAL SEMESTRE 2013-II CARRERA BQD OBSERVACIONES 1601 y 1651. 1802 NÚMERO Y/O NOMBRE DE LA PRÁCTICA. la salud o los recursos naturales. compuestos. dejando como depósito la credencial vigente de la UNAM.UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS REGLAMENTO GENERAL PARA LOS LABORATORIOS 1) 2) 3) 4) 5) 6) CODIGO: DOC-CB-DEX-01-00 N de REVISIÓN: 01 o Este reglamento aplicará para personal académico. 3º de la Ley General del Equilibrio y Protección del Ambiente). de no hacerlo. 7) 8) 9) 10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario. se hará acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio. es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CBDEX-01-09) y lo entregue a la persona responsable. inflamables o biológico-infecciosas (Art. El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente uno de los profesores del grupo. j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura. tóxicas. b) Ingerir alimentos y/o bebidas. Queda prohibido en los laboratorios: a) Tirar basura fuera del cesto. reactivas. deberá programarse con el profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prácticas. Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin. sustancias. e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos. Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con manga larga. no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prácticas. La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos a partir de la hora señalada. alumnos y laboratoristas. 11) Para solicitar material y equipo. d) Recibir visitas. explosivas. Por seguridad. Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares. i) Mover el mobiliario de su lugar. h) Sentarse sobre las mesas de trabajo. 7 . g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental. 13) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el laboratorio. por sus características corrosivas. desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado físico representan un riesgo para el ambiente. El uso de las computadoras portátiles queda restringido a temáticas relacionadas con la asignatura. En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de trabajo. reproductores de sonido o cualquier medio electrónico de entretenimiento. entendiendo por residuo peligroso: elementos. c) Fumar. f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios. 12) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en las condiciones en que se recibió. PRÁCTICA 1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOBIOLOGÍA QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVO • Introducir las medidas de seguridad, químicas y biológicas, en el laboratorio de Inmunobiología para que el alumno las ponga en práctica y pueda minimizar los riesgos de trabajo. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO Es fundamental que el alumno conozca las medidas mínimas de seguridad, química y biológica, que deben seguirse en un laboratorio donde se manejan reactivos químicos y muestras biológicas, por esto se plantea en el programa de la asignatura como primera práctica del curso. INTRODUCCIÓN Existe un riesgo evidente de contaminación al que esta expuesto el personal de salud (profesionales, estudiantes, investigadores, etc., personal de limpieza), al tratar con pacientes infectados o potencialmente infectados, en especial cuando el personal de salud, está en contacto con sangre o hemoderivados, con agujas, jeringas e instrumental contaminado, pudiendo adquirir infecciones como el HIV, Hepatitis B, C, etc., así como el riesgo de toxicidad, cuando en su trabajo emplea substancias químicas, ya sea como reactivos, o como productos de desinfección, los cuales pueden dañar también el medio ambiente. Según la NOM-018-STPS-2000 se definen como: peligro a la capacidad intrínseca de una sustancia química para generar un daño y riesgo, a la probabilidad de que una sustancia química peligrosa afecte la salud de los trabajadores o dañe el centro de trabajo. Es necesario ampliar estas definiciones para ser aplicadas a y microorganismos y. productos de origen biológico. 8 Aunque existe iste una gran variedad de sistemas para la identificación de riesgos los más usados a nivel nacional e internacional son dos. Ambos sistemas son muy amigables por el uso de colores y números para identificar los riesgos, y por tal razón son los recomendados por l la NOM-018-STPS-2000. A mediados del siglo XX, la Agencia Nacional de Protección al Fuego (NFPA, por sus siglas en inglés) diseña el Código 704 para la identificación de riesgos de las sustancias químicas. Rombo (o diamante) del Sistema NFPA Algunos años más tarde la Asociación Nacional de productores de Pinturas y Recubrimientos (NPCA, por sus siglas en inglés) desarrolla un sistema alterno para ara la identificación de materiales peligrosos. Hay que mencionar que tienen ligeras diferencias en su aplicación, debido a su origen. Rectángulo HMIS Las sustancias químicas son producidas en una región determinada y posteriormente se trasladan al lugar donde se van a utilizar, para esto se deben seguir en México, y en el mundo, 9 las recomendaciones de la ONU para el transporte de materiales peligrosos peligrosos, estas recomendaciones surgen por la movilidad de estos materiales después de la Segunda Guerra Mundial. . En México se debe aplicar la NOM-003-SCT-2008, NOM 2008, que obliga a los transportistas a identificar mediante un código el tipo de material que se está transportando, transportando utilizando colores y números. Existe un sistema alterno llamado HazChem, utilizado en Europa. Sólido inflamable Gas inflamable Misceláneos Paneles del Sistema de Identificación para el Transporte T de Materiales Peligrosos Sistema HazChem Una vez en el lugar donde se utilizaran las sustancias químicas, deben ser almacenadas en base a sus características químicas, y no en orden alfabético. Aunque existen varios sistemas para almacenamiento, los más amigab amigables les son aquellos que utilizan, simultáneamente, colores colores, números y pictogramas. . Estos sistemas toman el nombre de las empresas productoras que los crearon, , y todos ellos fueron creados a principios de la década de los 80’s del siglo pasado pasado. Sistema Baker Saf-T-Date Sistema Chemalert Sistema Winkler Los colores asignados en base al tipo de riesgo, en estos tres sistemas, son los siguientes: Tipo de riesgo Salud Inflamabilidad Reactividad Contacto General (riesgo menor o igual a 2 en cualquiera de los tipos) Incompatibles con otras del mismo grupo Baker Saf-T-Data Azul Rojo Amarillo Blanco Verde Color asignado a rayas diagonales Chemalert Azul Rojo Amarillo Blanco Gris NO EXISTE Winkler Azul Rojo Amarillo Blanco Verde Color asignado y la leyenda SEPARADO 10 La Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó la primera edición del Manual de bioseguridad en el laboratorio en 1983. En ella se alentaba a los países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. Desde 1983, muchos países han seguido la orientación especializada que se ofrece en el manual para elaborar esos códigos de prácticas. La OMS establece que la clasificación por grupos de riesgo se utilizará exclusivamente para el trabajo de laboratorio. Y hace referencia a los peligros relativos que entrañan los microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo (grupos de riesgo 1, 2, 3 y 4). Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo) Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo) Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado) Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. En el siguiente cuadro se relacionan, no se equiparan, los grupos de riesgo con el nivel de bioseguridad de los laboratorios destinados al trabajo con microorganismos de cada uno de esos grupos. 11 Cada contenedor de residuos químicos debe etiquetarse de la siguiente forma: • Laboratorio que lo generó. • Composición aproximada de la mezcla. riesgo biológico para posibles investigación aerosoles Diagnóstico Prácticas de nivel 2 CSB además de otros especial. Cada residuo debe segregarse de los otros y ser depositado en contenedores adecuados. • Fecha de inicio y término de la recolección. salida clase II. • Generador del residuo 12 . autoclave de 4 Nivel 4 doble puerta (a través con ducha y eliminación especial de la pared). señal de descubierto y CSB 2 Nivel 2 diagnóstico. o de diagnóstico clínico. Reactivo. aire de residuos filtrado En todo laboratorio escolar. que engloba las normas anteriores. Toxico. protectora. sin mezclarse entre si. TMA Ninguno. elaborada por profesores del Departamento de Ciencias Biológicas. medios de contención Contención investigación acceso controlado y primaria para todas 3 Nivel 3 flujo direccional del las actividades aire Unidades de Prácticas de nivel 3 CSB de clase III o patógenos más cámara de trajes presurizados Contención peligrosos entrada con cierre junto con CSB de máxima hermético. Explosivo.Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad. trabajo en Básico investigación mesa de laboratorio al 1 Nivel 1 descubierto Servicios de TMA y ropa Trabajo en mesa al Básico atención primaria. Inflamable y Biológico infeccioso). De acuerdo con las NOM-052-SEMARNAT-2005 y NOM-087-ECOL-SSA1-2002 los residuos deben separarse de acuerdo con el código CRETIB (acrónimo de Corrosivo. almacenamiento y disposición definitiva. más ropa especial. y de ser posible el pictograma correspondiente. se generan residuos de diferentes tipos. traslado. las prácticas y el equipo GRUPO DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE EQUIPO DE RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO LABORATORIO SEGURIDAD Enseñanza básica. cada uno de los cuales requiere diferentes condiciones para su recolección. En nuestra facultad debemos seguir las indicaciones proporcionadas en la “Instrucción de trabajo específica para la identificación clasificación y eliminación de residuos peligrosos”. • Tipo de residuos según la clave CRETIB. NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Que establece las características.sct.50. [En línea] http://132.bo/sw_files/mvhvmxjnomq.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigente s/NOM%20052_23_JUN_2006. 3. Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo.mx/fileadmin/normatividad/transporte_terrestre/43. 6. [En línea] http://www.gob.semarnat. el procedimiento de identificación. NOM-018-STPS-2000.pdf.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigente s/NOM-087-ECOL-SSA1-2002. y trabajar con las normas de seguridad adecuadas al laboratorio de esta asignatura.semarnat. destinadas al transporte de substancias.5/CLS/INFORMACIONPARACONSULTA/DERRAMESDEQUIMICOS/NOM -018-STPS-2000. consultada el 12 de junio de 2011.248. Panozo Meneces Adela y Cardozo Salinas Teresa.gob. materiales y residuos peligrosos.Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-Infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. implementar. clasificación y los listados de los residuos peligrosos. 2. [En línea] http://www. Características de las etiquetas de envases y embalajes. Bioseguridad y Seguridad Química en Laboratorio. 2005.who. obtenida el 12 de junio de 2011. obtenida el 12 de junio de 2011.pdf. [En línea] http://whqlibdoc.Los residuos biológicos deben ser segregados de acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 de la siguiente forma: TIPO DE RESIDUOS Sangre y derivados Cultivos y cepas de agentes infecciosos Patológicos ESTADO FISICO Líquido Sólido Sólidos Líquidos Residuos no anatómicos Objetos punzocortantes Sólidos Líquidos Sólidos ENVASE Recipiente hermético Bolsa de polietileno Bolsa de polietileno Recipiente hermético Bolsa de polietileno Recipientes herméticos Recipiente rígido de polipropileno COLOR Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo Rojo Rojo DISCUSIÓN Discutir la importancia de conocer. 4. NOM-003-SCT-2008. obtenida el 12 de junio de 2011. Funes Espinoza Fátima.gob. BIBLIOGRAFÍA 1.pdf. OMS.pdf obtenido el 12 de junio de 2011. [En línea] http://www.pdf.int/publications/2005/9243546503_spa. [En línea] http://www. Manual de Bioseguridad en el laboratorio. 2005.pdf. 5. NOM-052-SEMARNAT-2005. Protección ambiental. 13 . consultada el 12 de junio de 2011.swisscontact. El cuadro central es el de cuenta de eritrocitos. a su vez. • Identificar microscópicamente a las células del sistema inmune presentes en circulación y conocer sus principales características fenotípicas.PRÁCTICA 2 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVOS • Conocer y aplicar la metodología y cálculos para el conteo de células en cámara de Neubauer. están subdivididos en dieciséis cuadrados terciarios. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad 2 se abordan los Mecanismos Inespecíficos y parcialmente específicos de Defensa (MID). 14 . Los cuatro cuadrados de las esquinas se utilizan para el recuento leucocitario y. INTRODUCCIÓN El conteo de leucocitos se refiere a la cantidad total de leucocitos en sangre. en el punto 2. subdividido en nueve cuadros más pequeños. contados utilizando la cámara de Neubauer.5 se deben describir el fenotipo y la función de las células que participan en los MID Y MPE. La cámara de Neubauer tiene dibujado en el centro un gran cuadrado. es parte importante de la evaluación de la serie blanca.6 Agua destilada DIAGRAMA DE FLUJO Sangre con anticoagulante R1 Recuento de leucocitos Cuenta diferencial Diluir 1/20 con líquido de Turk Teñir con Wrigth R2 Llenar la cámara de Neubauer Contar a 100X Contar a 10X R1: Aguja. la fiabilidad de la información obtenida depende principalmente de lo bien hechas y bien teñidas que estén las extensiones. Contenedor especial 15 . El examen de una extensión de sangre. basura municipal. Algodón. MATERIAL Cámara de Neubauer Pipeta de Thoma para leucocitos Caja de Petri humedecida Microscopio Portaobjetos Tubo Capilar Algodón Piano Contador REACTIVOS Solución de Turk EDTA Colorante de Wright Aceite de Inmersión Amortiguador de fosfatos con pH 6. las cuales son sistemáticamente examinadas.La Cuenta Diferencial consiste en evaluar la proporción y la morfología de los diferentes tipos de leucocitos que hay en sangre periférica. al contenedor de punzocortantes. tubo con sangre a contenedor con cloro R2: Residuos de Wrigth. en forma de culebra. 1. Reportar el valor en: leucocitos/mm3 y leucocitos/mL. Agregar el amortiguador. RESULTADOS Valores absolutos y relativos de los leucocitos. Se llena hasta la marca de 11 con la solución de Turk. sin tirar el colorante. Enjuagar con agua destilada y secar. Conteo de leucocitos Se coloca sangre con la pipeta de Thoma para leucocitos hasta la marca de 0. Dejar reposar durante 1 minuto. Colocar la cámara de Neubauer en el microscopio y buscar la cuadricula con el objetivo de 10X. Secar al aire rápidamente. Extenderla con otro portaobjetos con un movimiento suave. haciendo la extensión de sangre lo más delgada y fina que se pueda. en forma de culebra.METODOLOGÍA Tomar una muestra de sangre con el sistema vacutainer. hasta que se forme una capa metálica que cubra el frotis y dejarlo reposar de 5 a 8 minutos. 16 . contando un mínimo de 200 células. Colocar el frotis en el microscopio y enfocar con el objetivo de 40X. Se agita suavemente y se desechan las tres primeras gotas. Realizar el conteo de leucocitos con el objetivo de 40X. utilizando EDTA como anticoagulante. se limpia con algodón el exceso de sangre. 2. colocar una gota de aceite de inmersión y realizar la cuenta con el objetivo 100X.5. Se llena la cámara dejando caer una gota en el borde del cubreobjetos. Cuenta diferencial de la serie blanca Colocar una gota del tubo capilar en el extremo de un portaobjetos. en ambos lados de la cámara. Cubrir con colorante de Wright durante 5 a 8 minutos. Ed. Colombia. DF. BIBLIOGRAFÍA 17 . México. Henry John. 1. Bernard. S. 1993. España. 2. 9ª edición. Salvat Editores. 3. 1992. 4ª edición. William J. 395 pp. Velez A. Williams.DISCUSIÓN Discuta los valores obtenidos contra los valores de referencia y las implicaciones que tienen un aumento y/o una disminución de estas células del sistema inmune. 1503 pp. Diagnóstico y Tratamiento Clínico por el Laboratorio. 1509 pp.A. Editorial Corporación para Investigaciones Biológicas. Hematología. 1ª edición. Barcelona. Fundamentos de Medicina Hematología. Medellín. Salvat Medicina. 1979. Hernan. • Conocer y aplicar los principios de purificación de células por el método de perlas superparamagnéticas acopladas a anticuerpos específicos.9 de la estructura y función de los receptores celulares. en esta práctica se lleva a cabo un procedimiento para la separación de células mononucleares. entre las que se encuentran células de la inmunidad innata. • Realizar el procedimiento de estratificación de sangre sobre Ficoll-Hypaque y la obtención de las células mononucleares. 18 .1 se hace mención del fenotipo y función de las células de los MED y en el 3.PRÁCTICA 3 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO Dr. Salvador Fonseca Coronado y QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVO Y COMPETENCIAS Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las siguientes competencias: • Conocer las principales técnicas de separación y purificación de células a partir de sangre periférica. y un procedimiento para la purificación específica de células NK las cuales son células fundamentales en los MID por su función citotóxica. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad 3 se describen los mecanismos específicos de defensa (MED) y específicamente en el apartado 3. INTRODUCCION En inmunología. al igual que en la mayoría de las ciencias de la vida. o para el estudio de los efectos de otras células. para describir un fenómeno particular. a partir de un grupo heterogéneo de estas. • Separación por adhesión selectiva: Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plástico y se separan de los linfocitos. ha sido posible gracias a que se cuenta con técnicas para la purificación de una estirpe en particular. es necesario aislarlo del conjunto de variables con los que coexiste. Las técnicas más empleadas son: • • • Citometría de flujo con FACS (separador celular activado por fluorescencia) Formación de rosetas por linfocitos B y T Separación por sus antígenos de membrana: Separación magnética Separación por afinidad en columnas 19 . En la actualidad. casi todos los estudios con células del sistema inmune requieren su aislamiento y purificación. agentes o moléculas sobre ellas. Las células inmunes se pueden separar por varios métodos Métodos físicos • Aislamiento por centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll-Hypaque): Con esta técnica podemos obtener de forma separada las células mononucleares (linfocitos y monocitos) de los granulocitos. Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodón (se obtienen poblaciones separadas de LB y LT). el conocimiento de todas las funciones descritas de las células hasta el momento. bien para describir funciones específicas. Estudio de marcadores y antígenos de membrana (diferencia poblaciones y subpoblaciones de células). Micropipetas de 10 y 100 µL. teñir con Wright y observar morfología R1: Aguja. al contenedor de punzocortantes.MATERIAL Y EQUIPO Sistema Vacutainer para obtención de sangre con anticoagulante. tubo con sangre a contenedor con cloro R2 y R3: Palangana con cloro R4: Residuos de Wrigth. basura municipal. Microscopio. Cámara de Neubauer.6 Solución de Turk Opcional Medio RPMI 1640 suplementado Mezcla de anticuerpos monoclonales contra marcadores de identidad acoplados a biotina Anticuerpos monoclonales anti-biotina acoplados a perlas magnéticas Amortiguador de purificación: PBS albúminaEDTA DIAGRAMA DE FLUJO Obtener 2 tubos de sangre periférica R1 Centrifugar un tubo Estratificar el contenido del otro tubo sobre Ficoll-hipaque R3 Obtener la capa de Leucocitos Centrifugar y obtener la capa de mononucleares R2 Resuspender en 1 mL R4 Contar en cámara de Neubauer Preparar un frotis. Contenedor especial 20 . Algodón. con puntas Pipetas de 5 y 10 mL y Pipetas Pasteur Centrífuga clínica Balanza de dos platos Portaobjetos Opcional Equipo magnético para purificación de células REACTIVOS Ficoll-hypaque SSF o PBS Colorante de Wright Aceite de Inmersión Amortiguador de fosfatos con pH 6. Tubos cónicos de 15 mL Tubos de vidrio 13x100 Algodón (Torundas) Contador de células. de tal manera que se formen dos fases. Realizar el conteo de las células obtenidas en la cámara de Neubauer. a 500 g durante 5 minutos. Centrifugar a 500 g por 15 minutos. Separación por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque. 5 mL en cada uno.METODOLOGÍA 1. Con pipeta Pasteur extraer y desechar el plasma. adicionar 5 mL de PBS y centrifugar 5 min a 300 g. Preparar un frotis con la suspensión y teñir con Wright. uno de los tubos. 4. estratificar lentamente la sangre de un tubo sobre la superficie del Ficoll con ayuda de una pipeta Pasteur. 3. Observar la morfología a 100X. repetir el lavado una vez más. 5. 8. Completar a 1 mL con SSF o PBS. Resuspender en 1 mL de PBS 12. Colocar las PBMC en otro tubo. 21 . 6. Colocar 2 mL de Ficoll-hypaque en un tubo de ensaye de13x100. 10. con anticoagulante (heparina de preferencia). Prepara un frotis con la suspensión de PBMC y teñir con Wright. 7. Como se observa en la figura se forman cuatro estratos diferentes introducir una pipeta Pasteur hasta el estrato de células mononucleares (PBMC del inglés: Peripheral blood Mononuclear Cells) y extraer el anillo en forma circular evitando extraer la menor cantidad de Ficoll posible. Obtención de Buffy Coat 2. Observar morfología a 100X. 9. Centrifugar. Obtener dos tubos de sangre. 11. Con pipeta Pasteur obtener la capa de Leucocitos (1 mm aproximadamente) y colocar en un tubo de ensaye. ima03fs21/pdf (Libre acceso dentro de la UNAM).13.miltenyibiotec.3F.com/doi/10.3F.2 Common Immunologic Techniques. Realizar el conteo de las células obtenidas en la cámara de Neubauer.wiley.-human_130-091-155.1002/0471142735. John Wiley & Sons. DOI: 10.pdf 22 . RESULTADOS Indicar la cantidad de células/mL de suspensión y morfología de las células obtenidas por cada método. REFERENCIAS Current Protocols in Immunology (1997) A.com/download/datasheets_en/253/MiltenyiBiotec_DataSheet_CD4+-T-CellIsolation-Kit-II. Inc.ima03fs21 URL´s http://onlinelibrary. DISCUSIÓN El alumno debe comprender y describir detalladamente el fundamento de la purificación de células por selección negativa con perlas magnéticas.1002/0471142735. Supplement 21.1-A. www. Opcional: Purificación de células por perlas perlas superparamagnéticas (MACS) DIAGRAMA DE FLUJO 23 . 4. 24 . 1. 7. 2. Incube 10 min. lave en tres ocasiones por adición de 2 mL de PBS-albúmina colectando el eluato en el mismo tubo (esta fracción es rica en células purificadas). De acuerdo al número de células contadas. Adicione 10 µL de anticuerpos anti biotina acoplados a perlas magnéticas mezcle y deje en incubación por 15 min. 5.Importancia: La purificación de una población celular en particular. Adicione la suspensión en la columna y colecte el eluato en un tubo cónico. Mientras esta en incubación la suspensión. compare su resultado experimental con el teórico esperado de acuerdo a la población purificada. nos permite evaluar una gran variedad de funciones específicas y de respuestas a diferentes estímulos entre ellos por supuesto. en hielo 3. Separe la columna del magneto y adicione en tres ocasiones 3 mL de buffer para sacar de la columna las células marcadas (Esta fracción es rica en las poblaciones no purificadas). los efectos de un determinado fármaco. ajuste una solución de 1x107 células en 40 µL de buffer y adicione la cantidad de cocktail de anticuerpos anti-CD indicado en el instructivo del producto. Realice el conteo de ambas fracciones y calcule la eficacia del proceso. 6. (La finalidad de esto es familiarizar al estudiante con insertos en idioma inglés). coloque una columna LS sobre él magneto y lave tres ocasiones por adición de 3 mL de PBS-albúmina. Preparación de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7. 0.16 g de KH2PO4 y 0. adicionar 10 mL de L-glutamina 100 mM y 10 mL de antibiótico-antimicótico (penicilina/estreptomicinaFungizona). El polvo debe ser disuelto en agua tridestilada y desionizada o en agua milliQ.79 g de Na2HPO4 anhidro.22 µm y etiquetar como medio base. en este último caso se pesa la cantidad adecuada para los mL que se desee preparar. disolver en agua desionizada y ajustar el pH a 7. agregar 2 gramos de bicarbonato de sodio en polvo (grado cultivo celular) y 1 gramo de HEPES.2 g de KCl. hay presentaciones de 100 mL listas para su uso. Para preparar un litro de medio: Disolver la cantidad de polvo indicada en aproximadamente 970 mL de agua. el medio puede venir en varias presentaciones.2 con NaOH o HCl según sea el caso. Preparación de solución amortiguadora de separación para MACS.2 Pesar 8 g de NaCl.5 % de albúmina sérica bovina y EDTA 2mM 25 . sobres con polvo para disolver en un litro y frascos con polvo para preparar 10 litros. ajustar el pH a 7 con NaOH 0. 0.1 N y aforar a 1 litro. El medio para cultivo celular se suplementa por adición de 10% de suero fetal bovino estéril.APÉNDICE Preparación de medio RPMI 1640 Dependiendo del fabricante. Filtrar en una unidad de esterilización de 0. Esterilizar por filtración y almacenar a 4° C. Preparar 1 litro de PBS 1X y adicionar 0. Su cinética de diferenciación es la siguiente: monocito (en sangre). kytos. También pueden actuar como células presentadoras de antígenos. Varias células ejercen funciones fagocíticas: Neutrófilos. 'el que come'. Los macrófagos son células fagocíticas de gran tamaño presentes en la mayoría de los tejidos y cavidades. punto 2.PRÁCTICA 4 FAGOCITOSIS QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVO • Evaluar la función fagocítica en células de sangre periférica humana para determinar: a) Porcentaje de células con capacidad fagocítica b) Porcentaje de células con capacidad de producir radicales intermediarios del oxígeno c) Número de levaduras. Células fagocíticas En los animales superiores. 26 .7 INTRODUCCION En la fagocitosis (del griego -phagos. Algunos permanecen en los tejidos durante años y otros circulan por los tejidos linfoides secundarios. que fagocita una célula RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO Mecanismos inespecíficos y parcialmente específicos de defensa (MID). Unidad 2. monocitos y macrófagos. la fagocitosis es una función de células especializadas (fagocitos profesionales) del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraños y combatir infecciones como primera línea de defensa natural. proceden de los monocitos que migran desde la sangre hacia los tejidos. en promedio. 'célula') algunas células rodean con su membrana citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la introducen al interior celular. Es en ellos donde ejercen su acción fagocítica y eventualmente mueren. osteoclastos. responsables del movimiento de los macrófagos. receptores para manosa. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes (>70%). Estos últimos se relacionan con la formación de seudópodos. Los monocitos son células circulares cuyo diámetro oscila entre 15 a 30 µm y poseen una alta relación núcleo/citoplasma. por ejemplo: receptor para lipopolisacárido (CD14). debido a la influencia de los estímulos quimiotácticos. macrófagos inflamatorios y finalmente los macrófagos clásicamente (M1/CAM) y alternativamente activados (M2/AAM). que poseen una especificidad a ligandos muy amplia como: lipoproteínas. se transforman en macrófagos. Pasan menos de 48 horas en la circulación antes de migrar a los tejidos. o barredores. microtúbulos y microfilamentos. Los macrófagos expresan receptores de membrana para numerosos antígenos bacterianos.Histiocito (células de Kupffer. y receptor para glúcidos entre otros.). Se originan en la médula ósea y constituyen cerca del 5% del total de leucocitos de la sangre. receptores CD11b/CD18. fosfolípidos y otras moléculas. Los macrófagos participan en gran medida de la respuesta inmune innata a infecciones gracias a sus receptores "scavengers". Reconocimiento y unión de partículas por fagocitos A pesar de que la fagocitosis de partículas fue demostrada por Haeckel en 1862 y que los macrófagos y micrófagos fueron descriptos por Metchnikoff en 1892. etc. el número de lisosomas y la cantidad de aparato de Golgi. proteínas. Después atraviesan las paredes de las vénulas y capilares (diapédesis) donde la circulación es lenta. polisacáridos aniónicos. Una vez en los órganos. células de la microglia. 27 . células del mesangio. de la síntesis de proteínas. poli y oligonucleótidos. el rol de los factores séricos que intervienen en este proceso fue puesto en evidencia hasta 1904 cuando Wright y Douglas determinaron que dichas sustancias eran fundamentales para una óptima ingestión. donde permanecen sólo unos tres días. lo que se refleja en el aumento de su capacidad fagocítica. Su tamaño es de 10-20µm de diámetro y se clasifican como granulocitos debido a sus gránulos citoplasmáticos de lisozimas y de lactoferrina. entre ellos CLA. atraviesan entonces el endotelio vascular hacia el foco de infección patógena. a través de uniones moleculares de baja afinidad entre receptores del fagocito y selectinas presentes en el endotelio. En un punto específico. VCAM-1 se adhieren a ligandos específicos sobre los fagocitos. receptor para el complejo LPS-LBP (LBP: proteína de unión al LPS) que está formado por el TLR4 y el CD14. LFA-1 y Mac-1. 3. A pesar que el reconocimiento de partículas recubiertas con IgG y/o C3b vía los receptores Fcγ y C3b. de los fagocitos para el fragmento C3b. receptores para los fragmentos Fc de los anticuerpos opsonizantes IgG2 e IgG3. las cuales son reconocidas por los receptores CR1. CR3 y CR4. ya sea a productos microbianos específicos o sobre opsoninas del sistema inmune del hospedador. 28 . ICAM-1. Algunos receptores de membrana presentes en las células fagocíticas son: receptor de manosa. reconocen a estas partículas recubiertas por los anticuerpos. Esto lleva a que el componente C3b se deposite sobre las partículas. determinado por la presencia y activación de quimiocinas.Quimiotáxis Es la etapa de movilización y reclutamiento de células fagocíticas por medio de interacciones celulares con la zona o tejido lesionado.3. 2. El fagocito se adhiere a la superficie del endotelio previamente activado por citocinas.Etapas de la fagocitosis 1. Los fagocitos atraídos por gradientes de concentración de las quimiocinas. existen otros factores que median o ejercen su influencia sobre este proceso. los fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el endotelio por medio de integrinas y otros ligandos endoteliales. En especial las moléculas endoteliales selectina-E.2.Adherencia Receptores específicos sobre la membrana de los fagocitos permiten la adherencia sobre los microorganismos. pero su unión a las partículas induce la activación del sistema de complemento. llamado “fagocitosis inmune”. es el principal mecanismo de ingestión de partículas extrañas. Debido a que los fagocitos tienen receptores de membrana para el fragmento Fc de IgG. La IgM no tiene capacidad de opsonizar. con o sin complemento.Opsonización La opsonización se consigue recubriendo las partículas con anticuerpos específicos de la clase IgG. Ingestión La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación intracelular que resultan en la invaginación de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando patogénico. la membrana se une en sus extremos y libera al interior de la célula un fagosoma. los cuales se activan al fusionarse el fagosoma con un lisosoma intracelular.4. Al rodear por completo al complejo receptor-molécula. La Autofagia es un proceso del fagocito en el cual su retículo endoplásmico crea un autofagosoma en su misma mitocondria liberando gránulos para la destrucción de la misma mitocondria y así liberar los gránulos contenidos de la mitocondria que son los gránulos secundarios específicos. Esto puede ocurrir en más de un punto de la membrana celular. Safranina al 0. Otros componentes tóxicos usados en la digestión de microorganismos son los intermediarios reactivos del O2 y el óxido nítrico.Digestión Los fagocitos cuentan con variados mecanismos microbicidas. 5.85%) Medio de Cultivo RPMI ó MEM. MATERIAL 4 caja Petri de 35 mm de diámetro 2 pipeta Pasteur 1 vaso de precipitados de 100 mL 1 pinzas de disección 5 tubo de ensaye 13X100 mm 2 pipeta de 1 mL y 1 Pipeta de 2 mL 4 cubreobjetos y 2 portaobjetos 3 aplicadores de madera REACTIVOS Solución Salina Fisiológica (NaCl 0. Nitroazul de Tetrazolio al 0.1% en SSF (NBT). Las enzimas del lisosoma se liberan dentro del fagolisosoma recién formado actuando sobre su contenido.5% en agua destilada Bálsamo del Canadá 29 . al contenedor de punzocortante. NBT y levaduras R5 Incubar Teñir con safranina R6 Lavar con agua destilada Secar y montar en portaobjetos R1: Aguja. basura municipal R2: Paquete de eritrocitos. Algodón. Contenedor con cloro R6: Safranina. Contenedor con cloro R4 y R5: Medio de reacción. Recipiente para safranina Contar a 100X 30 . Contenedor con cloro R3: Suero con diluyente de levaduras.DIAGRAMA DE FLUJO R1 Muestra de sangre periférica Capa de suero en cubreobjetos Opsonización de levaduras R2 Obtener capa de leucocitos Colocar en estufa Incubar Mezclar con RPMI o MEM Colocar en los cubreobjetos e incubar Lavar y resuspender R3 R4 Desechar el sobrenadante y agregar: MEM. A las cajas 1 y 3 agregar 0. sin perder la cara del cubreobjetos donde están las células. contando por lo menos 200 células. incubar 10 minutos a 37 ° C. 3. Colocar una película de suero en cuatro cubreobjetos. y a las cajas 2 y 4 agregar 0. desechar el sobrenadante y resuspender con 1 mL de PBS. Secar sobre papel absorbente.5 mL de nitroazul de tetrazolio a las cuatro cajas. Obtener 5 mL de Sangre periférica con anticoagulante. 5. Numerar cuatro cajas de Petri pequeñas. Colocar 0. centrifugar 5 minutos a 2500 rpm. Decantar el sobrenadante (si lo hay) y agregar 1.5 mL de levaduras sin opsonizar. colocar en las cajas de Petri e incubar 10 minutos a 37 ° C. 7. 1. Incubar por 10 minutos a 37 ° C. en la cara donde están las células y voltear sobre un portaobjetos (dos cubreobjetos en cada portaobjetos). 2. 2. Rotular y dejar secar. 9. Mezclar un mL de suero con un mL de levaduras. 2. 8. 6. Centrifugar 3 minutos a 2500 rpm. Obtener la capa de leucocitos y mezclar con 1 mL de MEM Proceder en forma simultanea: 1. distinguiendo lo siguiente: C) Reduce el NBT A) Célula fagocitando D) No reduce el NBT E)Levadurasfagocitadas B) Célula que no fagocito NOTA: A+B > 200 31 . en cada cubreobjetos. 10. Decantar el sobrenadante y cubrir con safranina durante 10 minutos. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Decantar y lavar con agua corriente.3 mL de la suspensión de leucocitos en MEM.5 mL de MEM y 0.METODOLOGIA 1. Observar a 100X.5 mL de levaduras opsonizadas. Colocar una gota de bálsamo del Canadá. 4. México DF. Roitt. 32 . Argentina.RESULTADOS Expresar los resultados como: % de fagocitosis= A (100) A+B % de reducción del NBT= C (100) C +D Índice fagocitico= E A DISCUSIÓN Discuta la importancia de la fagocitosis como un mecanismo inespecífico y parcialmente específico de defensa BIBLIOGRAFÍA 1. Volumen I. Madrid. Editorial Panamericana. Fagocitosis en cerdos alimentados con diferentes niveles de aflatoxina B1. Ladislao. España. 2001. 4. Tesis UNAM. 5ª edición. 8ª edición. 2. Buenos Aires. 204 pp. 1ª edición. Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico. 423 pp. Faviola. Ivan. 1110 pp. 2000. Editorial ENCB IPN. Palomar Morales. Inmunología. Manual del Curso Practico de Inmunología. 3. Aguilar Torrenta. Harcourt ediciones. Gradwohl. FES Cuautitlán. 1988. 1986. el punto 3.10 plantea el estudio de la estructura y función de las inmunoglobulinas. Salvador Fonseca Coronado OBJETIVOS Y COMPETENCIAS • Al finalizar el desarrollo experimental es deseable que el alumno adquiera la competencia y habilidad técnica para purificar proteínas por técnicas basadas en inmunoafinidad así como los fundamentos para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales. mecanismos específicos de defensa. es la basada en el acoplamiento de proteínas con alta afinidad por la Fc de los 33 . es decir. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad 3. unirse a los agentes o moléculas extrañas para inactivarlos y evitar que sigan uniéndose a sus moléculas blanco. Hasta el momento. cromatografía de filtración por gel. INTRODUCCIÓN Uno de los principales productos de la respuesta inmunológica es la producción de anticuerpos por las células plasmáticas (linfocitos B). una de las técnicas más utilizadas para la purificación de anticuerpos en la actualidad. Los anticuerpos son moléculas de naturaleza proteica que tienen como función el reconocimiento y neutralización de antígenos específicos. tales como precipitación con sales. Existen diferentes técnicas de obtención y purificación de anticuerpos. Los anticuerpos son moléculas de naturaleza proteica que tienen como función el reconocimiento y neutralización de antígenos específicos.PRÁCTICA 5 PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS POR SALTING OUT Dr. cromatografía por intercambio iónico y diálisis. electroforesis. se sabe que uno de los principales productos de la respuesta inmunológica es la producción de anticuerpos por las células plasmáticas (linfocitos B). el estudio de los anticuerpos continuará durante el resto del curso. lo cual se reforzará de con el desarrollo de esta práctica. 1 agitador magnético y barra magnética 1 gradilla con 10 Tubos de ensaye 13x100 1 Pipeta Pasteur. Soporte universal con pinzas para bureta Membrana de diálisis e Hilo de cáñamo REACTIVOS Suero Solución saturada de Sulfato de amonio Agua destilada 34 . sobrenadantes de cultivo y líquido de ascitis (principalmente en la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales).) y su posterior purificación por técnicas de inmunoafinidad. ratas. PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS POR SALTING OUT MATERIAL 1 bureta graduada de 50 mL 3 vaso de precipitados: 50. cabras. con antígenos purificados o recombinantes. se pueden obtener anticuerpos contra antígenos específicos con fines de diagnóstico. Actualmente. terapéuticos o de investigación mediante la inoculación. 100 y 250 mL 1 Recipiente de plástico. de animales de experimentación (ratones. ambas obtenidas en la actualidad como proteínas recombinantes) a matrices inertes (principalmente sefarosa). lo que permite su inclusión en columnas sobre las cuales se pueden purificar los anticuerpos a partir de suero. conejos. etc.anticuerpos IgG (como la proteína A de Staphylococcus aureus o la proteína G de Streptococcus. y resuspender los precipitados. Decantar el sobrenadante. en un volumen final de 10 mL. en una charola con cloro. 6. Colocar 20 mL de suero.DIAGRAMA DE FLUJO Obtener suero Colocar el resuspendido en baño de hielo Adicionar con bureta el (NH4)2SO4 en 15 minutos Mantener la agitación. durante 15 minutos más Colocar el precipitado en tubos de ensaye Centrifugar a 2500 rpm 15 minutos Colocar el precipitado en tubos de ensaye y centrifugar a 2500 rpm 15 minutos R2 Resuspender el precipitado en un volumen final de 5 mL R1 Resuspender el precipitado en un volumen final de 10 mL Cerrar uno de los extremos con hilo de cáñamo Colocar la suspensión del precipitado en membrana de diálisis Cerrar el otro extremo de la membrana Hervir 5 min la membrana de diálisis con agua destilada Dializar contra agua por 72 Horas R1 y R2: Sobrenadante al contenedor con cloro METODOLOGÍA 1. 3. Montar el soporte universal completo y colocar 20 mL de (NH4)2SO4 en la bureta. 35 . Mantener la agitación otros 15 minutos. con agua destilada. Este paso debe tardar 15 min. lentamente y agitando continuamente. 4. Agregar el (NH4)2SO4. 5. Colocar el precipitado en tubos de ensaye y centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos. durante 15 minutos más Colocar el suero en baño de hielo Adicionar con bureta el (NH4)2SO4 en 15 minutos Mantener la agitación. poner en baño de hielo. en el vaso de precipitados de 100 mL. 2. Decantar el sobrenadante. utilizando pinzas y guantes. 10. 11. y resuspender. 12. Cerrar el otro extremo de la bolsa de la diálisis. Cerrar uno de los extremos con hilo de cáñamo. Este paso debe durar 15 minutos. el precipitado en un volumen final de 5 mL.7. Mientras se realiza esta última agitación Hervir la membrana de diálisis. en baño de hielo. 9.1 M pH = 8 Tris 0. y adicionar 5 mL de (NH4)2SO4 lentamente y agitando continuamente.01 M pH = 8 Glicina 0.0 M pH = 8 Tris 0.1 M pH = 3 36 . Colocar el precipitado en tubos de ensaye y centrifugar a 2500 rpm durante 15 minutos. en agua destilada. en una charola con cloro. Mantener la agitación otros 15 minutos. con agua destilada. Colocar el resuspendido en un vaso. Colocar en la membrana de diálisis. y dializar contra agua destilada por 72 Hr. durante 5 minutos. MÉTODO ALTERNO Purificación por columnas de afinidad MATERIAL Y EQUIPO Suero humano Jeringa de 5 mL Tubos cónicos de 15 mL tubos de vidrio 13x100 Pipetas de 10 mL Pipetas Pasteur Centrífuga clínica Espectrofotómetro REACTIVOS Proteína A de Staphylococcus aureus PBS Tris 1. aureus unida covalentemente a sefarosa. tiene alta afinidad por la fracción Fc de las Inmunoglobulinas IgG. lentamente Colectar en tubos que contengan 50 µL de Tris 1 M Cuantificar proteínas a 280 nm. si se realiza por el método de Lowry guardar en contenedor especial METODOLOGÍA Purificación de IgG por inmunoafinidad con proteína A Fundamento: La proteína A de S.1M R2 Lavar la columna. con 19 volúmenes de Tris 0. en una jeringa de 10 mL.01 M R3 Formar una columna. colocar en un soporte universal Eluir con 10 mL de glicina 0.DIAGRAMA DE FLUJO Lavar la proteína A con PBS Ajustar el pH del suero con Tris 1M Centrifugar a 400 g Pasar el suero por la columna Desechar el sobrenadante y lavar dos veces R1 Resuspender en PBS Lavar la columna. o por el método de Lowry R4 R1.1 M. 37 . con 10 volúmenes de Tris 0. R2 y R3: Contenedor con cloro R4: Si la lectura se realiza a 280 nm los residuos se colocan en el contenedor con cloro. Ajustar el pH del suero con los anticuerpos a purificar por adición de 1/10 del volumen de Tris 1.180 0. 5. Colectar el eluato en tubos que contengan 50 µL de Tris 1M pH=8. Colocar la columna en un soporte.0 M pH=8 8. Lavar las esferas con 10 veces el volumen de columna con Tris 0. 38 . 7. 13. 2.1 M pH=8 eliminando el eluyente. Resuspender la proteína A-sefarosa en 5 mL de PBS. 12.5 gramos de proteína A-sefarosa comercial (Sigma. Pesar 1.5 g de esferas al hidratarlas en agua hacen un volumen de 5 mL. Ejemplo: DO= 0. Eluir la columna con 3 mL de glicina 0. Lavar las esferas con 19 veces el volumen de la columna con Tris 0. 11.180x1. Realizar determinación directa de Abs a 280 nM (1. 6. una molécula de proteína A une dos moléculas de anticuerpo). catálogo P9424) e hidratar con 5 mL de PBS. Centrifugar por 15 min a 400 g 3. eliminado el eluyente. Empaquetar la columna (Jeringa de 5 mL adaptada) evitando la formación de burbujas.35x Dilución= Concentración de proteína en mg/mL. 10.01 M pH=8. hacer un par de lavados más.35 Abs≈1 mg/mL de proteína) de la siguiente forma: diluir 1/50 (40 µL de suero + 1960 µL de PBS) y 1/100 (20 µl + 1980 µL de PBS) del suero y de la proteína purificada y se lee la densidad óptica.1 mM pH=3 adicionado de manera lenta.Montaje de la columna de afinidad 1.2 mL de Tris pH=8 9. Desechar el sobrenadante con ayuda de pipeta Pasteur. Pasar la solución de anticuerpo por la columna de proteína A (en la columna se unen aproximadamente 10 a 20 mg de anticuerpo por mL de esferas húmedas. NOTA: 1. Ejemplo: Para 2 mL de suero adicionar 0. 4. DOI: 10.21 g en 90 mL con agua bidestilada. 1999. 2933. ajusta pH a 8 con HCl 2 N Tris 10 mM Disolver 0. ajusta pH a 8 con HCl 2 N Tris 100 mM Disolver 1. en congelación.com/immunodetection/id2/affinitypurification#ap Preparación de Soluciones Tris Base 1M PM 121.114 g en 90 mL con agua bidestilada.970 5 g para 100 mL. ajusta pH a 8 con HCl 2 N Glicina 100 mM PM 97.14. Methods In Molecular Biology. Purification of Antibodies Using Protein A-Sepharose and FPLC. para medir la eficacia del proceso.121 g en 90 mL con agua bidestilada.millipore. DISCUSIÓN Discuta de forma grupal la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales y la importancia de las técnicas de inmunoafinidad en la purificación de proteínas. para realizar la determinación de proteínas por el método de Lowry en una siguiente práctica. Ajustar pH a 3 con HCl 2 N.1385/1-59259-213-9:29 ULR´s: 2. http://www. APÉNDICE 39 . 115. REFERENCIAS 1.14 Disolver 12. Kent UM. I. Vol. Guardar el sobrante. En Immunocytochemical Methods and Protocols.05g Disolver 0. 10 Estructura y función de las inmunoglobulinas. INTRODUCCIÓN Los reactantes de la reacción Ag + Ab. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO La práctica está relacionada con los siguientes puntos del programa de teoría: 3. ya que es muy preciso al cuantificar nitrógeno presente en las proteínas. 40 .PRÁCTICA 6 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MVZ Ángel Germán Martínez Sosa OBJETIVO • Determinar la concentración de proteínas del precipitado y dializado de gama globulinas obtenido en la práctica anterior. es el procedimiento estándar para la calibración de los patrones de referencia de las otras técnicas. son generalmente de naturaleza peptídica. se considera que las proteínas contienen 16 % de N2. c) Absorción y titulación del NH3. b) para la formación de derivados químicos. por lo que es importante conocer sus concentraciones. 3. El método consiste de 3 pasos: a) Digestión de la proteína para la obtención de: NH4HSO4.7 Sueros hiperinmunes y 3. El método de Kjeldhal. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el rango UV del espectro electromagnético.3 Antígenos y antigenicidad. ya sea para su uso como inmunógenos. o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.25. por lo tanto el contenido de proteína presente se obtiene al multiplicar el % de N2 por el factor 6. estableciendo la concentración idónea de proteína a inocular. b) Destilación del NH3. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. así como su utilización como Ag en el montaje de pruebas de laboratorio cuantitativas o semicuantitativas con fines diagnósticos. formándose un compuesto de color azul que absorbe luz a =595 nm. que es proporcional al contenido proteico de la muestra. el azul de Coomassie G-250 a los aminoácidos básicos presentes en la proteínas.Las soluciones de proteínas tienen la capacidad de absorción de luz Uv a una longitud de onda (λ). Reacción de Lowry 41 . El método del ácido bicinconínico (BCA). reduciendo su color amarillo inicial hacia un color azul intenso. fenilalanina y triptófano El método de Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado entre el catión Cu+2 y los grupo NH de los enlaces peptídicos en medio básico. los grupos indol e imidazol del triptófano e histidina reaccionan también con el reactivo. de 210-215 nm y a =279 nm. pero la reacción es más débil. a la solución de proteína se le agrega el ión cúprico en tartrato débilmente alcalino. la intensidad de la coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas. se basa en el principio de que las proteínas reducen los cationes Cu+2 a cationes Cu+ bajo condiciones alcalinas. un catión Cu+2 se acompleja con 4 grupos NH. los cationes Cu+ reaccionan con el BCA (verdoso) para formar un compuesto de color morado. En la modificación de Lowry. oxida compuestos fenólicos (tirosina) en condiciones alcalinas. el complejo de tipo biuret entre cobre y proteína se trata a continuación con el reactivo de fenol diluido. El método de Lowry (Folin-Ciocalteu) se basa en que el reactivo de fenol del ácido fosfotúngstico-molíbdico. El método de Bradford se basa en la unión del colorante. el primero se debe a la presencia de los enlaces peptídicos y el segundo a los anillos aromáticos de los aminoácidos: tirosina. sulfato amónico. etc. Bradford Muy sensible Muestra interferencia con los detergentes BCA Es el método más sensible y muestra menos interferencias Métodos Fluorométricos O-ftalaldehído Muy sensible Interferencia con aminas y no todas las muestras reaccionan igual MATERIAL 1 gradilla 10 tubos de ensaye de 13 x 100 1 pipeta de 2 mL 2 pipetas de 1 mL Espectrofotómetro con 2 celdas 1 matraz aforado de 100 mL 1 vaso de precipitados de 100 mL REACTIVOS Sulfato de cobre pentahidratado CuSO4•5H2O al 1 %.1 N Patrón de albúmina 1 mg/mL en SSF Reactivo de fenol al 2 N SSF DIAGRAMA DE FLUJO Preparación de reactivos A y B Preparar curva patrón con lo siguiente: Solución patrón de albúmina SSF Muestra(s) problema(s) Reactivo A Agregar reactivo B Mezclar e incubar R1 Mezclar e incubar Leer a 550 nm R2 R1: Sobrante del Reactivo A. ventajas y desventajas. sensibilidad presenta interferencias con detergentes no iónicos. El sobrante del Reactivo B debe guardarse en contenedores adecuados R2: Debe ser almacenado en un contenedor especial 42 . neutralizar y desechar al drenaje. pocas interferencias y es barato Lowry Tiene bastante No todas las proteínas reacciona igual. Método Ventajas Desventajas Método de Absorción No se pierde las muestras Interfieren muchos compuestos que absorben en UV Métodos Colorimétricos Biuret Bastante específico para Tiene poca sensibilidad proteínas.Principales métodos para la cuantificación de proteínas. Tartrato de sodio y potasio al 2 % Carbonato de sodio al 2 % en NaOH 0. 2 Reposar 30 minutos y leer a λ=550 nm. 0.0 2 3 4 5 6 7 0.2 Muestra 2 0 0.36 0..1 0.2 0. de acuerdo con la siguiente tabla: Blanco Estándar SSF Muestra Reactivo A Reactivo B 1 0. Imagen de los tubos de la curva patrón.2 0.1 N La relación de la mezcla es 1:1:98 2.Preparar el reactivo A realizando la siguiente mezcla: Tartrato de sodio y potasio al 2 % 0.5 mL 49.0 0.METODOLOGÍA 1.06 0.5 mL CuSO4·5H2O al 1% 0.36 0.2 RESULTADOS No.2 0.3 0.0 Mezclar y dejar en reposo 10 min.0 mL Agua destilada 2.04 2.. 3 4 5 6 7 Muestra 1 Muestra 2 43 .0 0.0 mL La relación de la mezcla es 1:1 3.0 mL Na2CO3/NaOH al 2 %/0.02 0. Muestra 1 0 0.4 0 2.2 0.0 0 2.04 0.0 0.1 0 0 0 0 0 2.Preparar la curva patrón (todas las cantidades se indican en mL). Tubo [Alb mg/mL] Absorbancia 1 2 Cuadro de Resultados.2 0.2 0.4 0.2 0.0 0.39 0..01 2.2 0 0.3 0.0 2.0 2.0 2.2 0.38 0 2.0 2.Preparar el reactivo B realizando la siguiente mezcla: Reactivo de Fenol (Folin-Ciocalteau) 2N 2.34 0. W.. & Sussdorf. BIBLIOGRAFÍA 1 Garvey. En Methods in Immunology.L.J. UK. Métodos de determinación de proteína. Cremer.Chem. graficando la concentración de proteína contra la absorbancia. 1977. Rosebroug. 1951.O. Protein measurement with the folin phenol reagent.71-92. 1986. D..H. R. México. No ensuciar las celdas. Benjamin. así como en la curva patrón. J.J. J. Editorial Diana. A. A. Farr. tercera edición. 2 Lowry. Precauciones en la Técnica.. N. 4.R. se interpola la absorbancia de las muestras problema para conocer su concentración. Usar siempre el tubo blanco para la calibración correcta del espectrofotómetro. Pegar la hoja de papel milimétrico con la gráfica de la curva patrón.E.. 44 .Con los resultados obtenidos se construye una gráfica de regresión lineal. London. G. 193:265. pp. primera edición. Los reactivos A y B se deben de preparar al momento de la determinación de proteínas. Estimation of protein. 2. A. N. D. & Randall. 3 Morilla. 3. pp. Tener cuidado y certeza en la preparación de la solución estándar de proteína (ASB Fracción V concentración 1 mg/mL en SSF). G.388-394. En el Manual de Inmunología. 1.Biol. & Bautista.S. H.C.F. tejidos y órganos con un origen embriológico común: el mesodermo. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad Mecanismos específicos de defensa. su función primordial es la maduración de las células. color y textura. bazo y placas de Peyer) haciendo énfasis en su posición anatómica. Los órganos linfáticos primarios.PRÁCTICA 7 ANATOMÍA DEL SISTEMA INMUNITARIO MVZ Ángel Germán Martínez Sosa OBJETIVOS • Que el estudiante identifique in situ los órganos linfáticos visibles del ratón (ganglios linfáticos axilares. Los órganos linfáticos secundarios. los órganos primarios y secundarios del sistema inmune y la circulación de células del sistema inmune son analizados. con la eliminación por apoptosis de las células autorreactivas. INTRODUCCIÓN El Sistema Inmune está formado por células. y a su vez complementados con el desarrollo experimental de esta práctica. está constituido por alrededor de 1011 linfocitos B y 1018 linfocitos T con diferentes receptores para el antígeno. su función primordial es filtrar la linfa formada durante los procesos 45 . apariencia. periféricos o antígeno-dependientes son los ganglios linfáticos que constituyen cadenas ganglionares en diversas partes del cuerpo. • Que logren la separación de células de un órgano linfoide primario (timo) y uno secundario (bazo y placas de Peyer) y su identificación. centrales o independientes son el Timo para los linfocitos T y la Bursa de Fabricio. para los linfocitos B. que realizan una función de patrullaje o vigilancia de antígenos procedentes tanto de nuestro medio ambiente interno como externo. dependiendo de la especie animal. inguinales y mesentéricos. el bazo y las placas de Peyer. timo. Los órganos linfáticos terciarios son aquellos que alojan a las células de memoria y en los procesos inflamatorios crónicos son los sitios ectópicos donde se organizan estructuras linfoides in situ. los cuales debemos conocer para su identificación y purificación que pueden realizarse tanto por de citometría de flujo. como por purificación por perlas magnéticas MACS (del inglés: Magnetic Antibody Cell Sorter). A nivel celular es importante tener presente que cada estirpe celular. MATERIAL Equipo de disección 1 gradilla con 10 tubos de ensayo de 13x100 3 pipetas Pasteur 3 coladeras y 3 émbolos de jeringa 2 cajas Petri y 3 portaobjetos 2 pipetas de 2 mL Microscopio REACTIVOS 100 mL de SSF o PBS pH 7. envolverlos en papel y depositarlos en bolsa amarilla para congelarlos hasta el momento de su incineración. en su interior se activa y desarrolla la respuesta inmune y mediante los vasos linfáticos eferentes egresan los linfocitos B y T activados/memoria para posteriormente ingresar a la circulación sanguínea sistémica. así como sus diferentes estadios funcionales se caracterizan por la expresión de un fenotipo o marcadores celulares específicos.4 Tinción de Giemsa DIAGRAMA DE FLUJO Sacrificar un ratón por dislocación cervical Incidir en la piel para localizar e identificar los ganglios linfáticos inguinales y axilares R1 Macerar y lavar las células obtenidas R2 Resuspender en 1 mL de PBS Realizar frotis y teñir con Giemsa Obtener bazo. R3: Contenedor para residuos de Giemsa o Wright. timo y placas de Peyer Observar a 100X para realizar conteo diferencial R1: Los cadáveres de ratón y órganos. 46 .inflamatorios en los tejidos circunvecinos. R2: Todos los residuos líquidos depositarlos en el contenedor que contiene agua con cloro. 5. R. Quinta edición Mc Graw Hill..J. Osborne. 2. Roitt. 2. desde la laringe hasta la pelvis. Madrid. Cortar la piel sin interesar órganos internos. B. 6. Inmunología.. 2004.METODOLOGÍA 1. 1. agregar 1 ó 2 mL de SSF. para localizar e identificar los ganglios linfáticos inguinales y axilares. BIBLIOGRAFÍA 47 .F. 7. Macerar individualmente los órganos anteriores en una coladera. Quinta edición Harcourt Editions. Lavar. Kindt. I. con el extremo plano del émbolo de una jeringa.. 2000. Sacrificar un ratón por alumno. timo y placas de Peyer. 3. Goldsby. centrifugando 2 veces con SSF. 4. Realizar un frotis con cada una de las poblaciones celulares obtenidas y teñir con Giemsa o Wright. J. bazo. 423 pp. España. T. & Kuby. Iztapalapa. colocándolos en una caja de Petri con un poco de SSF. 665 pp. RESULTADOS Describir el aspecto macroscópico de los ganglios y órganos linfáticos del ratónReportar lo observado en los frotis de cada suspensión celular. Resuspender las células en 1 mL de SSF. Inmunobiología.A. México D.A. por dislocación cervical. Realizar la identificación y disección de los siguientes órganos. por lo que aquí la separación dependerá fundamentalmente de su carga neta. Planteándose además como contenido práctico la separación y purificación de anticuerpos. En algunos geles.N'. pueden producirse poros de diferentes diámetros. INTRODUCCIÓN La electroforesis puede definirse como un tamizado molecular a través de un gel de corrimiento. como catalizador N.10 los conceptos de Antígeno e inmunoglobulinas. de la acrilamida (CH2 = CH − CO − NH2 ) y de su entrecruzamiento con la N-N-metilen bisacrilamida (CH2 = CH − CO − NH − CH2 − NH − CO − CH = CH2 ) . el tamaño molecular y la carga neta serán los factores determinantes de la separación de las moléculas de una mezcla. para un gel de determinado poro. Marco Antonio Vega López y QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVO • Realizar la separación de una mezcla de proteínas sometiéndolas a un campo eléctrico utilizando como soporte un gel de poliacrilamida. En los geles de poliacrilamida.N'-tetrametil 48 . respectivamente. además.N. ambos de naturaleza proteínica principalmente. La polimerización de la acrilamida necesita de un iniciador del proceso. los poros no son homogéneos y son suficientemente grandes como para no impedir la migración de la mayoría de las moléculas proteínicas. como los de agarosa. Se añade. El poro del gel formado dependerá de las concentraciones relativas de ambos reactivos durante la polimerización. Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización.PRÁCTICA 8 ELECTROFORESIS Dr. Los más comúnmente usados son el persulfato de amonio y la riboflavina.3 y 3. por lo que. modificando las condiciones de la polimerización. abordándose en el punto 3. RELACIÓN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA En la Unidad tres se estudian los Mecanismos Específicos de Defensa. Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol). Por lo que comparando su movilidad con sustancias de peso molecular conocido. que se ha hecho polimerizar sobre el gel separador (pH 8. en un gel de determinada porosidad. Dado que el colorante es preparado con ácido acético. el gel se coloca en azul de Coomassie. En algunas situaciones sólo puede variar la concentración iónica en los vasos de contención o tanques. para eliminar la carga intrínseca del péptido ante el exceso de carga negativa del SDS.8). la solución amortiguadora de los geles y el de los tanques de los electrodos son diferentes. para teñir las proteínas corridas. La electroforesis en gel de poliacrilamida se desarrolla usando sistema amortiguadores continuos o discontinuos.etilendiamina (TEMED). La base libre TEMED retarda la polimerización. los iones que constituyen la solución amortiguadora durante todo el recorrido de la muestra (gel separador) son los mismos y el pH es constante. se determina el peso molecular relativo de las proteínas a analizar. como consecuencia. la estructura cuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas polipeptídicas individuales.1 µg de cualquier proteína en una banda fina. Las muestras a analizar se colocan en un gel de poro grueso (gel concentrador). En el primer caso. Este colorante permite detectar de cantidades hasta a 0. dependerá exclusivamente de su tamaño molecular.3. conteniendo dodecilsulfato de sodio (SDS). TINCIÓN CON AZUL DE COOMASSIE Una vez terminado el corrimiento electroforético. En los sistemas discontinuos. El persulfato de amonio-TEMED cataliza la formación de radicales libres. 49 . las muestras a analizar se colocan directamente en el gel separador. Normalmente el pH de ambas soluciones amortiguadoras es diferente. Cuando se usan estos sistemas. la fijación de las proteínas y su coloración ocurren al mismo tiempo. los enlaces disulfuro intra e intercatenarios se disocian. La electroforesis en geles de poliacrilamida se realiza en condiciones fijas de pH. por lo que su desplazamiento en un campo eléctrico. que se corren simultáneamente. lo que inicia la polimerización. la carga de todas las moléculas será prácticamente idéntica. La solución amortiguadora del recipiente que contiene el cátodo es Tris-glicina con pH 8. se debe incinerar R2: La solución de corrimiento del tanque inferior puede reutilizarse dos o tres veces. En caso de desecharse deben guardarse en contenedores destinados para ello. Agar noble al 1 % Agua destilada Solución reguladora de corrimiento Solución reguladora de muestra Marcadores de peso molecular Muestras a separar Solución de azul de Coomassie Soluciones decolorantes I y II Carbón activado *Opcional 2 mercaptoetanol.8 y pH = 8.MATERIAL Cámara de electroforesis con accesorios Fuente de poder 2 vasos de precipitados de 50 mL 2 vasos de precipitados de 200 mL 1 vaso de precipitados de 500 mL 1 matraz Erlenmeyer 1 pipeta Pasteur y propipeta 1 triángulo de porcelana 1 tripie Tela de asbesto Mechero Tubos Eppendorf Micropipetas y puntas para micropipetas Gradilla de unicel para colocar muestras Baño María Recipiente hermético Agitador Embudo y triángulo de porcelana Transluminador Regla REACTIVOS Solución de monómeros TEMED SDS al 10 % Persulfato de amonio al 10 % Amortiguador TRIS-HCl pH = 6. 50 .8. la del tanque superior deberá neutralizarse antes de ser desechada al drenaje R3: Los decolorantes I y II deben filtrarse con carbón activado para su recuperación y posterior reutilización. urea 6 M ó enzimas DIAGRAMA DE FLUJO Preparación de las muestras Preparación de la cámara R1 Colocar las muestras en la cámara R2 Correr la electroforesis Determinar el Rf de las diferentes proteínas y calcular sus pesos moleculares R3 Teñir el gel R1: El polímero de acrilamida aunque no es un residuo peligroso. El papel filtro debe ser incinerado. Preparación del gel concentrador. sellar tres lados con agar y dejar secar. 3. Preparar el gel separador. el persulfato de amonio y el TEMED. se deben observar bandas de antígeno reveladas y finalmente colocar en decolorante II. 9.METODOLOGÍA 1. en forma semejante al gel separador. En tubos eppendorf colocar de 20 a 30 µg de la muestra a separar y agregar el mismo volumen de la solución reguladora de muestra. prender la fuente de poder a 100 volts. en los carriles. con micropipeta. 10. dejar gelificar y desechar el isopropanol. 7. 2. Desteñir el gel con el decolorante I (ácido acético. cubrir con 150 µl de isopropanol. Llenar los tanques superior e inferior con la solución de corrimiento. para calcular el Rf de cada proteína y de los marcadores de peso molecular. teñir el gel con azul de Coomassie. se agregan a la mezcla justo antes de verterla en la cámara. Una vez terminada la electroforesis desmontar la cámara y retirar el gel. dejar correr hasta la separación total de los antígenos. verter el gel hasta una altura de aproximadamente 75 % de la cámara. distancia recorrida por la muestra distancia del frente de corrimiento Rf = 51 . y verter en la cámara. metanol y agua). 8. colocar el peine para formar los carriles. a la concentración deseada (ver tabla en el anexo). Colocar las muestras y marcadores de peso molecular. 5. hervir 3 minutos en baño María. Conectar los cables de la corriente eléctrica en los polos correspondientes. 4. 6. Ensamblar los cristales de la cámara de electroforesis. Colocar en el transluminador y medir la distancia recorrida por el frente del disolvente y cada una de las muestras. H. no gelificar o no separar adecuadamente las proteínas. Nature. 3. Towbin. Manejar con guantes la acrilamida y bisacrilamida.Ejemplo de bandas de Proteínas en una electroforesis RESULTADOS Grafica de Rf vs. Ricardo Anibal. 2006. Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose-Sheets. 227: 680-685. p. Sci. Preparar correctamente los geles. Stahehelin.cultek. BIBLIOGRAFÍA 1. proc. [En línea] http://www. purificación e identificación de antígenos y anticuerpos. Argentina. USA. 5ª edición. 1979. 1996. 3. Gordon. 4. 76 (9): 4350-4354. procedure and some applications. V. Cuidar el proceso de decoloración. 4. Tabla de Rf y peso molecular de las proteínas de las muestras. ya que son carcinógenos. Nat. 976. 2. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head Bacteriophage t. Acad. obtenida el 31 de junio de 2011. La cámara de electroforesis debe quedar bien ensamblada y bien sellada con el agar.pdf. Log del peso molecular de los marcadores de peso molecular. Buenos Aires. para evitar decolorar totalmente las proteínas DISCUSIÓN Discutir la importancia de la electroforesis para la separación. PRECAUCIONES 1. 1970.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB. Laemmli. 2. Inmunología e Inmunoquímica. T. K. Cultek. Editorial Panamericana. Margini. Soluciones Western Blot. ya que pueden fragmentarse. 52 . 2 g) y bisacrilamida (0.4 g de glicina (192 mM) Pesar 1g de SDS (0.5M pH 8. Se puede preparar una solución 10 veces más concentrada y diluir el volumen necesario en el momento del corrimiento.8 Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL) Tris/HCl 1 M pH 6.24 mL de Tris/HCl 1M pH 6. Esta solución puede almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente. Solución Reguladora de muestra 2X 0.8 2 mL de Glicerol 50 % 0.96 mL de agua destilada 53 .5 g de sulfato de amonio Disolver en 5 mL de agua destilada Solución Amortiguadora de Corrimiento Pesar 3 g de Tris (25 mM) Pesar 14.15 g de Tris Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 8. Pesar ambos reactivos y añadir agua destilada hasta 100 mL Filtrar en papel de filtro Whatman No1 Persulfato de amonio al 10 % (p/v) Pesar 0.8 Pesar 12.5 mL de 2-mercaptoetanol* Opcional 0.8 Pesar 18.8 mL de SDS 10 % 0.8 Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL) SDS 10 % (p/v) Pesar 10 g de SDS Añadir agua destilada hasta completar el volumen de 100 mL Glicerol 50 % (v/v) Tomar un volumen de 50 mL de glicerol al 100 % Añadir 50 mL de agua destilada Azul de bromofenol 1 % (p/v) Pesar 100 mg de azul de bromofenol Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver Filtrar la solución en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto Acrilamida 30% La solución de acrilamida al 30 % (p/v) es una mezcla de acrilamida (29.1 g de Tris Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 6.APÉNDICE: PREPARACIÓN DE REACTIVOS Tris/HCl 1.1 %) Añadir agua destilada hasta completar 1 L NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8.5 mL de azul de bromofenol 0.8 g).3. 006 20 mL 4.3 0.8 0.3 10.4 0.1 8.0 7.4 0.7 5.3 0.3 0.3 0.5 6.15 0.9 6.5 0.3 0.0 0.0 3.25 0.008 25 mL 8.02 0.7 2.5 1.009 20 mL 9.5 0.4 0.0 7.5 0.03 0.0 12.3 0.0 1.8 0.2 0.3 0.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED Cantidad en mL a preparar 5 mL 2.6 10.0 0.1 0.2 0.4 0.0 1.0 5.7 0.3 0.012 40 mL 15.08 0.02 15 % H2O 30 % Acrilamida Mix 1.2 13.0 6.25 0.9 8.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED 1 mL 0.5 0.008 25 mL 9.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED 5 mL 1.04 0.5 0. Gel Separador 6% H2O 30 % Acrilamida Mix 1.4 0.4 0.4 0.7 2.016 25 mL 13.8 13.04 0.006 20 mL 7.6 2.5 0.4 0.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED 5 mL 2.25 0.3 5.9 5.3 1.5 10.003 4 mL 2.25 0.0 M Tris (pH 6.005 6 mL 4.008 15 mL 8.0 12.0 0.0 16.0 7.1 0.5 0.006 20 mL 6.3 0.7 1.016 50 mL 20.05 0.6 10.3 2.05 0.9 8.02 Gel Concentrador H2O 30 % Acrilamida Mix 1.0 6.004 5 mL 3.5 0.04 8% H2O 30 % Acrilamida Mix 1.002 10mL 3.5 0.06 0.01 30 mL 9.5 0.01 30 mL 11.3 0.0 0.05 0.05 0.0 7.25 0.03 10 % H2O 30 % Acrilamida Mix 1.3 0.0 5.5 M Tris (pH 8.7 12.6 12.0 2.8 0.0 2.01 54 .9 15.5 3.5 0.3 0.9 6.0 10.05 0.05 0.8 0.004 15 mL 5.016 50 mL 11.002 10mL 4.5 M Tris (pH 8.3 0.0 0.6 4.05 0.03 0.2 0.02 30 mL 15.002 3 mL 2.6 6.5 7.3 0.008 25 mL 5.5 0.0 10.5 0.012 40 mL 9.1 0.25 0.01 30 mL 6.5 0.004 15 mL 3.25 0.05 0.5 M Tris (pH 8.15 0.4 0.7 6.6 8.05 0.83 0.7 1.15 0.0 4.004 15 mL 5.0 7.5 0.004 10mL 5.5 1.4 25.2 0.1 0.05 0.1 1.1 0.008 10 mL 6.25 0.5 0.9 10.016 50 mL 16.0 0.5 0.0 3.3 2.3 5.1 0.0 2.5 0.4 0.3 5.2 0.05 0.25 0.5 0.0 3.01 0.25 0.8 1.0 12.0 3.CANTIDADES PARA LA PREPARACIÓN DE GELES POLIACRILAMIDA.5 0.3 0.1 0.0 0.2 14.5 M Tris (pH 8.15 0.05 0.06 0.38 0.0 1.2 0.3 0.0 5.1 0.3 10.68 0.25 0.01 0.1 0.018 40 mL 18.3 0.67 0.4 0.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED 5 mL 2.2 20.7 1.0 0.5 0.3 0.8 0.0 0.15 0.001 2 mL 1.012 25 mL 11.5 0.15 0.3 0.015 30 mL 13.0 3.4 12.0 10.4 0.0 3.75 0.0 0.003 10mL 4.15 0.3 6.024 50 mL 23.002 10mL 2.1 0.1 0.08 0.33 0.8) 10 % SDS 10 % APS TEMED 5 mL 1.17 0.032 50 mL 26.3 4.3 1.7 10.3 5.012 20 mL 10.0 6.5 0.25 0.1 0.5 0.5 M Tris (pH 8.2 0.006 8 mL 5.5 0.0 0.3 0.02 12 % H2O 30 % Acrilamida Mix 1.024 40 mL 21.13 0.5 0.2 0.15 0.9 12.15 0.2 0.1 0.63 0.2 0.0 0.3 1.4 20.5 0.006 15 mL 7.02 0.2 2.012 40 mL 13.15 0. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la Unidad 3 se estudian los Mecanismos Específicos de Defensa (MED). separadas por electroforesis y transferidas a un soporte sólido (por ejemplo: papel de nitrocelulosa). la electroforesis. Revelado La primera de ellas. Transferencia 3. planteándose además como práctica de laboratorio la conjugación y manipulación de inmunoglobulinas.3 antígenos y antigenicidad.10 Estructura y función de inmunoglobulinas y 3. es semejante a la realizada la clase pasada. la transferencia de proteínas o blotting supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas. La segunda de ellas. de tal manera que se conserve el perfil electroforético. seguido de la detección empleando sistemas especialmente diseñados para la tinción de blots. • Realizar el reconocimiento de proteínas. por medio de anticuerpos y su posterior revelado con el uso de conjugados. La electroforesis difiere en que sólo se forman dos carriles en el gel.PRÁCTICA 9 INMUNOELECTROTRANSFERENCIA QFB Ladislao Palomar Morales OBJETIVO • Realizar la transferencia de proteínas separadas electroforéticamente de un gel de poliacrilamida hacia una membrana. en los puntos 3. sustratos y cromógenos. Electroforesis 2.11 reacción antígeno cognato. uno pequeño para los marcadores de peso molecular y otro grande para la muestra. 55 . INTRODUCCIÓN La inmunoelectrotransferencia (o Western blot) se realiza en tres etapas: 1. 3. Armado del cartucho de transferencia 56 . occidental) le fue dado por el investigador W. mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel (electroblotting). 112:195-203. por oposición se denominó Northern a la técnica aplicada al ARN. Neal Brúñete (Analytical Biochemistry. Una vez completada esta operación las proteínas de interés son reveladas por el agregado de un anticuerpo específico. Se dispone de forma que el gel quede hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+) (figura 1). 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero que son aplicadas a los ácidos nucleicos. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana papel de filtro empapado en buffer de transferencia. Figura 1.El método para proteínas más potente es el denominado Western blot en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes Y posteriormente se transfieren a una membrana. más papel de filtro y finalmente una esponja plana. La carga neta de las proteínas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS. el gel. El nombre Western (oeste. Luego que Edwin Southern diseñara la técnica que lleva su nombre para detectar ADN. la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas fue denominada Western El electroblotting es el método donde las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente. Finalmente como una broma. la membrana en contacto directo con el gel. Este conjunto se recoge entre dos capas de plástico perforado (cartucho) y se introduce en una cámara en la que se encuentra una solución amortiguadora de transferencia y dos electrodos planos (diseñados para conseguir un campo uniforme en toda la superficie del gel). En la primera reacción el antígeno pegado al papel de nitrocelulosa interacciona con su anticuerpo específico: Ag + Ab → AgAb Una segunda reacción ocurre entre este complejo y un anticuerpo ligado a una molécula para hacer visible la reacción: AgAb + AbM → AgAbAbM Y finalmente esta molécula reacciona para hacer visible la reacción. La tercera etapa consta de tres reacciones sobre la membrana. que suele corresponder a 0. El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el amortiguador.3 a 2 Ampere. cuya velocidad puede ser modificada por factores como: La concentración de los reactivos. Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien conservarla en frío (2 a 8 ºC) durante meses.La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos). En el caso de un flourocromo se hace incidir luz de determinada longitud de onda. de 1 a 4 horas. las primeras dos de ellas son reacciones inmunológicas. Figura 2. un flourocromo. Esquema de las reacciones en el papel de nitrocelulosa 57 . la temperatura. Esta molécula puede ser una enzima. el pH. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamaño de la proteína. etc. o un isótopo radiactivo: En el caso de la enzima se agrega el sustrato y un cromógeno. R4. se puede tirar al drenaje.Parte importante de esta técnica es la eliminación de las moléculas que no han reaccionado. formando enlaces permanentes (covalentes). R7 y R8: Se colocan en la palangana con cloro. antes de desecharlos al drenaje. 58 . R5. R6. R2: Amortiguador de transferencia. ver práctica anterior. puede ser reutilizado dos o tres veces. papel filtro y esponjas en amortiguador de transferencia Transferir R1 Revisar la transferencia con rojo de Ponceau Eliminar el colorante con agua destilada Bloquear la membrana con Leche descremada R2 R3 R3 R4 R5 Cortar el papel de nitrocelulosa en tiras de 3 a 5 mm Colocar el número de tiras necesarias en los carriles Diluir el suero de ratón con solución de bloqueo Agregar el suero problema e incubar. DIAGRAMA DE FLUJO Electroforesis de IgG Humana Formar el “cartucho” para transferir Hidratar membrana de nitrocelulosa. el residuo final se coloca en un contenedor adecuado. R3: La solución de rojo de Ponceau. R3a: El agua de los lavados del rojo de Ponceau. mediante el uso de tensoactivos suaves como el tween 20. puede ser reutilizada varias veces. Lavar Diluir el conjugado con solución de bloqueo R6 Agregar el conjugado e incubar R7 Preparar el sustrato/cromógeno Agregar el sustrato y cromógeno Detener la reacción R8 R1: Residuos de electroforesis. Muestras a separar (IgG humana purificada) Marcadores de peso molecular Agar noble al 1% Agua destilada Solución reguladora de corrimiento Solución reguladora de muestra Amortiguador de transferencia Tiras de papel de nitrocelulosa Rojo de Ponceau Solución bloqueadora Sueros problema Conjugado (anticuerpo-enzima) Solución de lavado: PBS-tween 20 Sustrato para la enzima y cromógeno *Opcional 2 mercaptoetanol. Transferir a 125 mA. desmontar el gel y colocar en solución reguladora de transferencia 2.8. 4. aclarar en agua destilada y poner en la solución reguladora de transferencia. urea 6M ó enzimas METODOLOGÍA 1. una esponja. por 1 hora. un papel de filtro y el gel PAGE-SDS. 5. Una vez terminada la electroforesis. Colocar en la posición adecuada en función de los electrodos. Hidratar la membrana de nitrocelulosa durante 10 segundos en metanol. Pinzas y Bisturí. Sobre el gel perfectamente plano. Hidratar en la solución reguladora de transferencia las esponjas y el papel filtro. 6.MATERIAL Cámara de electroforesis con accesorios Cámara de transferencia con accesorios Micropipetas y puntas para micropipetas Papel de nitrocelulosa Fuente de poder 2 vasos de precipitados de 50 mL 2 vasos de precipitados de 200 mL 1 vaso de precipitados de 500 mL 1 matraz Erlenmeyer 1 pipeta Pasteur y propipeta 1 triángulo de porcelana 1 tripie Tela de asbesto Mechero Tubos Eppendorf Gradilla de unicel para colocar muestras Baño María Pipeta. Llenar con la solución amortiguadora de transferencia la cámara de transferencia hasta el 85 %. Colocar el cartucho en la cámara de transferencia. 3. y alisar varias veces MUY CUIDADOSAMENTE con un tubo de ensayo para eliminar las burbujas de aire.8 y pH = 8. Cubrir de nuevo con papel de filtro y esponja. colocar cuidadosamente la nitrocelulosa. 7. 59 . Regla Placa de pozos para tiras de papel de nitrocelulosa Agitador REACTIVOS Solución de monómeros TEMED SDS al 10% Persulfato de amonio al 10% Amortiguador TRIS-HCl pH = 6. Ricardo Anibal.5 mL del conjugado diluido 1/10 000 en solución bloqueadora. con 1. 13.5 mL de la mezcla sustrato/cromógeno hasta la aparición de las bandas. Agregar 0. Soluciones Western Blot. 3. V. para comprobar si se realizó la transferencia. decantar el sobrenadante. 15. 976 pp. 18. 2006.8. con 1.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.cultek. incubar con la solución bloqueadora durante 2 Hr a temperatura ambiente o toda la noche a 4 ° C. 227: 680-685 pp. Incubar las tiras de papel. 76 (9): 4350-4354 pp. 1970. Teñir el papel de nitrocelulosa con rojo de Ponceau. decantar el sobrenadante. por 20 minutos a temperatura ambiente. 11. CulteK. 10. e incubar 20 minutos a temperatura ambiente. RESULTADOS Indicar el PM de las proteínas del extracto antigénico que son reconocidas por cada uno de los sueros problemas. H. con 1. 60 .5 mL de la solución de paro. Argentina. Lavar 5 veces. Gordon. Stahehelin. 14. Towbin. Incubar las tiras de papel. 5ª edición. 17. Decolorar con agua destilada. 16. Buenos Aires. por 1 minuto cada vez. Lavar 5 veces con la solución de lavado. 1979 Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nirtocellulose-Sheets. USA. procedure and some applications. K. 2. 9. proc Nat Acad Sci. 1996 Inmunología e Inmunoquímica. decantar el sobrenadante. T. 12. BIBLIOGRAFÍA 1. Cortar el papel de nitrocelulosa en tiras de 3 a 5 mm de ancho. por 1 minuto cada vez. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head Bacteriophage τ Nature . Editorial Panamericana. [En línea] http://www. Secar las tiras al aire. Margini. Colocar las tiras de papel de nitrocelulosa en los carriles de a placa. Incubar las tiras de papel.5 mL de los sueros problema diluidos 1/100 con solución bloqueadora. 4. obtenida el 31 de junio de 2011. Laemmli.pdf. con la solución de lavado. 05 %. Sueros y anticuerpos Todos los sueros y anticuerpos deben ser diluidos en solución bloqueadora. Para algunos procedimientos se puede agregar Tween-20 al 0. caseína o gelatina. Solución de lavado PBS pH 7.5 % y ácido tricloroacético al 5 % en agua destilada.Reactivos para la electroforesis Ver práctica anterior ANEXO PREPARACIÓN DE REACTIVOS Amortiguador de transferencia (según Laemmli Tris -HCL 50 mM. glicina 0. disolver 30 mg de 4-Cloro-1-naftol en 10 mL de metanol (proteger de la luz). las más usadas son albúmina.5 y 25 µL de peróxido de hidrógeno concentrado (35 %). Albúmina bovina al 1 % (caseína al 1 % o gelatina al 1 %) en PBS pH 7. Agregar 50 mL del amortiguador Tris pH 7. Solución Bloqueadora Debe ser una proteína inerte al sistema inmune. Solución de paro Ácido sulfúrico 2 N.3 con 20 % de metanol añadido Solución de rojo de Ponceau Rojo Ponceau S al 0. Solución de sustrato cromógeno (para peroxidasa) Para 60 mL. 61 . no utilizar azida de sodio (inhibe la peroxidasa). pH 8.2 con Tween-20 al 0.2.05 %.196 M. se fija en un soporte sólido. antes de su interacción con la muestra del paciente y el reactante revelador de la reacción que. baratos y de sensibilidad aceptable para su uso en el laboratorio. Marco Antonio Vega López OBJETIVO • Determinar la presencia de anticuerpos en muestras biológicas. que indica y detecta la presencia del reactante a analizar virando a un color. 2 La amplificación de la señal generada a través de la acción de una enzima. un trazador emisor de luz (quimioluminiscencia) o un trazador fluorescente (fluorografía). casi siempre una placa de plástico. Las pruebas de ELISA o EIA. b) Heterogéneas. 62 . es un anticuerpo conjugado a una enzima que actúa sobre un substrato-cromógeno. se basan en dos fenómenos biológicos importantes: 1 La especificidad de los anticuerpos (Ab). Clasificación de las pruebas inmuno enzimáticas: Las pruebas inmuno enzimáticas pueden clasificarse en: a) Homogéneas. hace que sean sencillos. por lo general. para el diagnóstico indirecto de patologías como el sarampión a través del inmunoensayo enzimático ELISA.PRÁCTICA 10 INMUNO ENSAYO ENZIMÁTICO (ELISA) Dr. el anticuerpo o el antígeno. La sencillez metodológica del ELISA y sus reducidos requerimientos de equipos especiales. (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay). INTRODUCCIÓN Los inmunoanálisis ligados a enzimas son técnicas en las cuales uno de los reactantes. sumada a la especificidad de los Ab monoclonales (MAb). (radioinmunoanálisis –RIA-). por encima de los basados en la utilización de un trazador radiactivo. a partir de ello. dependiendo del tipo de analito que se busque. que debe ser incoloro y soluble y éste. deberá convertirse en un producto colorido y soluble. En este caso. donde se fija en la placa un anticuerpo primario (Ab de captura). específico para el analito que se busca (por ejemplo citocinas). 63 . al ser degradado. donde se trata de cuantificar la cantidad de analito de interés. líquido cefalorraquídeo. El Ab secundario reaccionará con el sustrato.). Haciendo curvas de concentración puede cuantificarse la cantidad de analito en la muestra. También existe la variante de “sándwich”. saliva. donde se busca la presencia de anticuerpos (Ab) en los pacientes. Estas últimas son las de mayor uso en el laboratorio. En ellas se fija el Ag de interés (de un virus o bacteria) en la placa y sobre él se aplica la muestra (suero. etc. se coloca la muestra y el analito capturado por el Ab primario se identifica mediante otro Ab que está conjugado con una enzima y que también reacciona con el analito. pero en otro epítopo. En este caso se usa una variante de la técnica de “sándwich”. Los anticuerpos específicos en la muestra (anticuerpo primario) se fijarán en el Ag y se harán evidentes usando otro anticuerpo (secundario) que reconozca al primero y que está conjugado con una enzima.Las primeras se realizan exclusivamente en fase liquida y con los reactivos añadidos en forma simultánea. entre más concentración de analito tenga nuestra muestra. éste competirá con el conjugado que añadimos y evitará que se fije al Ab de captura. se realiza la reacción específica de detección. En las pruebas heterogéneas. Las segundas emplean un soporte sólido para inmovilizar a uno de los inmunorreactantes y. Finalmente. Si la muestra contiene cantidades altas del analito. cuya concentración se medirá por espectrofotometría. existen muchas variantes. nuestro conjugado se unirá por completo al Ab de captura y tendremos la máxima señal. menos señal tendremos porque no se fijará el conjugado. Las pruebas más comunes son las de detección indirecta. Se emplean para aparatos automatizados y no son de uso común. donde al pozo con el Ab de captura se añade tanto la muestra como una cantidad conocida del analito marcado con un fluorocromo o una enzima. si la muestra no contiene al analito. El revelado se hace como ya se explicó. Esto establecerá una competencia entre el analito de la muestra y el que nosotros añadimos en cantidades conocidas. existe la variante competitiva. de esta manera. se realiza para diagnosticar sarampión. Uno de esos sistemas involucra a la estreptavidina que es una proteína producida por estreptococos y ciertas levaduras y que tiene elevada afinidad por la biotina (Ka = 1015 M −1 ). Debido a que la biotina puede conjugarse fácilmente a distintas proteínas (entre ellas. Tiene 4 sitios de unión pero usualmente sólo reaccionan dos. El resultado de la reacción es la formación de un producto coloreado soluble. Es una proteína de la pared de Staphylococus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afinidad (Ka = 108 M −1 ) por el Fc de algunos isotipos de las Ig. que consiste en buscar Ab contra Ag conocidos. Ab y enzimas) por unión covalente. En la presente práctica se realizará un ELISA indirecto. Se esquematiza la prueba de “sándwich”. Sistemas alternativos de reconocimiento.Diagrama con los componentes principales de las pruebas de ELISA. Proteína A. que después se revela adicionando el substrato de la enzima y un cromógeno. 64 . Estas propiedades permitieron el desarrollo de diversos ELISA con proteína A. sin afectar su actividad biológica. Es posible aumentar la sensibilidad de la técnica usando conjugados con otras proteínas distintas a los Abs. se han desarrollado métodos inmunoenzimáticos basados en la interacción estreptavidina/biotina. Los Ab. los pozos se recubren con el Ag. retenidos por el Ag se detectan por adición de un segundo Ab conjugado a una enzima (conjugado). después se lavan y se tratan con proteína bloqueadora irrelevante y luego se incuban con en el suero problema. sacudir contra papel absorbente. Colocar 100 µL de suero inactivado y absorbido a un pozo A y un pozo C. Agitar suavemente 15 segundos. tubo (contenedor con agua clorada) R2: Sobrenadantes y residuos de los lavados al contenedor con agua clorada METODOLOGÍA Opción A (diagnostico de sarampión) 1.MATERIAL Y REACTIVOS Tubo sin anticoagulante Juego de micropipetas Puntas para micropipetas Equipo para diagnosticar sarampión DIAGRAMA DE FLUJO Obtener suero R1 Diluir y absorber el suero Agregar el suero a los pozos Lavar y agregar el conjugado R2 Lavar y agregar el sustrato y el cromógeno R3 Parar la reacción enzimática R1: Algodón (basura municipal). En un tubo de ensayo diluir el suero 1/40 (5 µL de suero con 195 µL del diluyente). 65 . incubar 20 minutos a temperatura ambiente. mezclar. Vaciar el contenido en recipiente con cloro. 2. 3. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. En otro tubo mezclar 150 µL de suero diluido y 150 µL de solución absorbente. aguja (contenedor rígido para punzocortantes). Agregar 50 µL de los substratos A y B a cada pozo. cubrir con papel parafilm hasta el momento de su uso y guardar en refrigeración. sacudir contra papel absorbente. Vaciar el contenido en recipiente con cloro.4. 9. 66 . Agregar 300 µL de la solución de lavado. 7. Una coloración amarilla indica prueba positiva y negativa si es incolora. vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres veces). 5. Agregar 300 µL de la solución de lavado. Sensibilizar una tira de pozos con 100 µL de IgG (50 µg/pozo) en amortiguador de carbonatos pH 9. 10. vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar tres veces). incubar 20 minutos a temperatura ambiente.6. Dejar secar. vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar tres veces). 4. sacudir contra papel absorbente. Agregar 50 µL de la solución de paro a cada pozo. Agregar 300 µL de la solución de lavado (PBS Tween). 6. Agregar 300 µL de la solución de lavado. vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar tres veces). incubar durante 1 hora a 37 ° C (o toda la noche a 4 ° C). incubar durante 1 hora a 37 ° C (o toda la noche a 4 ° C). Vaciar el contenido en recipiente con cloro. Agitar suavemente 15 segundos Incubar 10 minutos en obscuridad. sacudir contra papel absorbente. 8. Vaciar el contenido en recipiente con cloro. Agitar suavemente 15 segundos. 3. 6. Agregar 200 µL de caseína (leche descremada) al 5 % en PBS-Tween. Agregar 100 µL del conjugado a cada pozo. 2. 5. Opción B (búsqueda de Ab de ratón contra Gama Globulina Humana. IgG) Los pasos 1 al 6 se realizan previamente en otra sesión 1. bio.El día de la práctica 7. Cubrir los pozos con papel parafilm. 14. Faviola 2001.html 5. 5ª edición. Buenos Aires. Incubar 40 min a temperatura ambiente.arizona. Inmunología e Inmunoquímica. Ricardo. Aguilar Torrenta. Agregar 300 µL de la solución de lavado (PBS-Tween). 8.edu/courses/genomics/method/ELISA. vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres veces). 2ª edición. http://www. Editorial Panamericana. Inmunología (de memoria). Argentina. Colocar 100 µL de suero de ratón (inmunizado con IgG) diluido 1/100 con solución bloqueadora en cada pozo. 13. 374 pp. Vaciar el contenido en recipiente con cloro. 3. 15. México. 9. Editorial ENCB IPN. DF. en caso de no contar con el lector de ELISA se hará la lectura de manera visual.edu/immunology/activities/elisa/technique. sacudir contra papel absorbente. Una coloración amarilla indica prueba positiva y negativa si es incolora. Agitar suavemente 15 segundos. 2. Agregar 300 µL de la solución de lavado. Agitar suavemente 15 segundos. 11. Agregar 50 µL de la solución de paro a cada pozo. 204 pp. Margini.html 67 . Agregar 50 µL de solución reveladora (diaminobencidina/peróxido de hidrógeno) a cada pozo. Oscar.biology. vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar tres veces). incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 1996. 1ª edición. http://www. unido a peroxidasa) diluido 1/10 000 con solución bloqueadora a cada pozo. Agregar 100 µL del conjugado (anti IgG de ratón. 2001. Editorial Panamericana. Rojas Espinosa. México DF. Anibal. 4. 10. BIBLIOGRAFÍA 1. Incubar 10 minutos en obscuridad. 12. Manual del Curso Practico de Inmunología. Vaciar el contenido en recipiente con cloro.davidson. agitar suavemente 15 segundos. RESULTADOS Si se cuenta con un lector de ELISA el resultado (+) se asignará a la lectura mayor del valor de la densidad óptica por sobre los controles. sacudir contra papel absorbente. producido en cabra. 976 pp. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad 3. 68 . el estudio de las citocinas continuará durante el resto del curso. Por ejemplo.PRÁCTICA 11 GENOTIPIFICACIÓN DE SNP´s MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Dr. En este caso. el cual esta mediado por citocinas. los encontrados en el gen para IL-28B (rs12979860 y rs8099917) que están relacionados con el éxito del tratamiento antiviral convencional en pacientes con hepatitis C. INTRODUCCIÓN Recientemente se han reportado asociaciones entre diferentes polimorfismos de nucleótido único (SNP) (sustitución nucleotídica que es frecuente en una población) localizados dentro de la región promotora de diferentes genes que codifican para citocinas y otras moléculas del sistema inmune. Salvador Fonseca Coronado OBJETIVOS Y COMPETENCIAS Al finalizar el desarrollo experimental es deseable que el alumno adquiera la competencia y habilidad técnica para utilizar la herramienta de PCR en tiempo real cuantitativa aplicada el estudio e identificación de moléculas de importancia inmunológica. Por lo tanto. contrario a los sujetos homocigotos de T y en el caso de rs8099917 los portadores del alelo G no tienen buena respuesta al tratamiento pero si aquellos que resultan homocigotos a T. mecanismos específicos de defensa. los estudios sugieren que los pacientes homocigotos a C en el SNP rs12979860 presentan una excelente respuesta en el tratamiento contra el virus.12 plantea el estudio de la activación de los linfocitos. la genotipificación de los pacientes es crucial para predecir y personalizar los esquemas de tratamiento antiviral de los pacientes y una metodología muy eficiente para el procesamiento de un gran número de muestras es la basada en la tecnología de sondas TaqMan para PCR en tiempo real (QPCR). lo cual se reforzará con el desarrollo de esta práctica. el punto 3. 3. Centrifugar para bajar las gotas en la tapa del tubo. esta enzima utiliza su actividad de nucleasa para así seguir incorporando los nucleótidos y simultáneamente liberar al fluorocromo que será el encargado de generar la señal. por lo que el color de la señal detectada dará el resultado final de la genotipificación en cada muestra. Incubar a 56 ° C por 10 minutos. 69 . Pipetear 20 µL de proteinasa K (QIAGEN protease) en el fondo de un microtubo de 1. 10.5 mL Puntas con filtro de 10. Agregar 200 µL de etanol y mezclar en vórtex durante 15 segundos. • Preparar el baño maría a 56 ° C antes de dar inicio a la extracción. 100. región sobre la cual se diseña una secuencia complementaria que se denomina “sonda” y que contiene una u otra de las bases complementarias al polimorfismo y que está marcada con una molécula apagadora o “quencher” y un fluorocromo en sus extremos 3’y 5’ respectivamente. Adicionar 200 µL de sangre en el mismo tubo. Cabe destacar que cada alelo (nucleótido) del polimorfismo esará asociado a un fluorocromo diferente. Una vez que se alinean los iniciadores y las sondas con sus secuencias complementarias durante la PCR. 200 y 1000 µL Vórtex Baño María a 56 ° C Microcentrífuga Espectrofotómetro Placas de PCR de 96 pozos y micas selladoras Centrífuga para placas Termociclador de tiempo real REACTIVOS Etanol grado Biología Molecular Estuche de extracción de DNA: QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) Sondas TaqMan para determinación de SNPs (Life Technologies) Master Mix para sondas TaqMan (Life Technologies) PROCEDIMIENTO: Extracción de DNA a partir de sangre completa: NOTAS: • Todo el procedimiento se lleva acabo a temperatura ambiente. la DNA polimerasa se une al extremo 3’-OH de los iniciadores para comenzar a incorporar los nucleótidos complementarios a la secuencia molde y al llegar al extremo 5’ de la sonda. MATERIAL Y EQUIPO Micropipetas de 2. 200 y 1000 µL Microtubos de 0. 5. 1. Agregar 200 µL de Buffer AL y mezclar en vórtex durante 15 segundos.5 mL. 2. 4. 6.5 µL y 1.Para este proceso se necesita un par de iniciadores cuyo producto contiene en al SNP que se quiere identificar. 20. 18. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto. Colocar la columna en un nuevo tubo colector. 8.5 mL. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto.25 DNA** 3 TOTAL 20 **La mezcla de reacción debe contener entre 50 y 100 ng de DNA. Agregar 500 µL de Buffer AW2 a la columna. • Una vez colocadas todas las reacciones en la placa. Se almacena a 4 ° C. Colocar la mezcla anterior en la columna QIAamp Mini Spin (en un tubo colector de 2 mL). Centrifugar a 20. 13.7. se prepara un stock de 20 ng/µL que se empleará en la mezcla. Colocar la columna en un nuevo tubo colector. 19. Agregar a la columna 200 µL de Buffer AE o agua destilada 17. 10. 15. Con estos resultados se calcula la relación 260/280 para verificar la pureza del extracto. 70 . 9. esta se cubre cuidadosamente con una película adhesiva transparente.75 Sondas TaqMan 0. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 minuto. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Adicionar a la columna 500 µL de Buffer AW1.000 x g (14. Preparar una mezcla por pozo: Reactivo Volumen (µL) Master mix 5 Agua 1. Genotipificación por MELT-MAMA-PCR: Mezcla de Reacción: • Se prepara la siguiente mezcla de reacción en placas de 96 pozos para termociclador Light Cycler 480 (ROCHE). 12. 11. 16. 14. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.000 rpm) por 3 minutos. Cuantificación de DNA: La cuantificación de DNA se realiza en un espectrofotómetro y se obtienen las lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm. por lo tanto. La columna se descarta y el filtrado que se colectó en el tubo es el producto de extracción (DNA). quantification y modo de adquisición: single La placa se coloca en el equipo y se inicia la amplificación (aproximadamente 75 min). en el eje Y el fluorocromo verde (FAM) (homocigoto al alelo A) y en el extremo superior derecho la detección de ambos colores (heterocigoto). Determinación de SNPs con sondas TaqMan y análisis “end point genotyping”. de tal manera que se generará una gráfica de doble fluorescencia para clasificar a las muestras como homocigotos o heterocigotos (figura 1). Al termino del proceso la placa se retira del equipo y los resultados se guardan para realizar el análisis de la amplificación de genotipificación por “end point genotyping”.PCR • El termociclador se programa con las siguientes condiciones: 10 minutos 95 ° C 10 segundos 95 ° C 1 minuto 60 ° C 40 ciclos. Homocigotos alelo A Heterocigotos Homocigoto alelo B Figura 1. En el eje X se observa la detección del fluorocromo azul (VIC) (homocigoto al alelo B). 71 . • • Análisis de resultados El análisis consiste en verificar la fluorescencia (fluorocromo) que se emitió durante la reacción en cada muestra o pozo. El haz de luz láser cuando atraviesa una célula sufre una dispersión que puede ser evidenciada en un fotodetector situado enfrente de la fuente emisora. tanto de células eucariotas como procariotas. la presencia de moléculas de superficie. granularidad (o complejidad de la célula) y la emisión de fluorescencia. Además del detector de luz situado frente al haz láser. FUNDAMENTOS La citometría de flujo (CF) es un método que permite el análisis de múltiples características celulares como su morfología. clínica y diagnóstica. con la estructura y función de inmunoglobulinas y con la interacción antígeno-anticuerpo. y por tanto al volumen o tamaño celular. el cual permite la detección de los parámetros de tamaño. como una disminución de la luz incidente. así como su dinámica de expresión. El tiempo que dure el corte en la llegada de fotones al detector será proporcional al diámetro. RELACIÓN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA Se relaciona con los Mecanismos Específicos de Defensa. Este estudio de interrupción frontal del haz láser se denomina como Forward Scatter (FSC).PRÁCTICA 12 CITOMETRÍA DE FLUJO Dr. intracelulares y secretadas. a una cámara donde incide sobre ellas un rayo láser. con la estructura y función de los receptores celulares para el antígeno. del inglés: Fluorescence Activated Cell Sorter). El equipo utilizado para estos fines es el citofluorómetro de flujo (denominado FACS. 72 . El principio básico de la CF (Figura 1) consiste en obtener una suspensión celular (las células se pueden marcar con anticuerpos u otras proteínas acopladas a fluorocromos capaces de unirse en la superficie o intracelularmente a las moléculas a evaluar) y hacerlas pasar de forma individual a través de un capilar. Salvador Fonseca Coronado OBJETIVO • Comprender los fundamentos de la Citometría de flujo y sus aplicaciones en la determinación de marcadores celulares en investigación básica. mediante un sistema de tarjetas electrónicas. Esta luz es descompuesta. Figura 1.existe otro grupo óptico. Como se observa en la figura 1. en un gráfico en dos dimensiones que permite la separación de las diferentes poblaciones celulares de acuerdo a su tamaño y granularidad (Figura 2). será proporcional a la complejidad de la superficie celular y a las estructuras y organelos celulares. mediante los filtros apropiados para poder estudiar tanto la dispersión de luz de la misma longitud de onda del láser como la emitida por los fluorocromos. permite que la CF sea una herramienta poderosa para realizar la caracterización de múltiples funciones celulares. el equipo amplifica las señales eléctricas y las convierte. 73 . El marcaje de toda una amplia gama de moléculas. existen una serie de detectores incorporados en el citómetro que permiten detectar estas señales de fluorescencia. que detecta la luz dispersada por las células y que se coloca formando un ángulo de 90º con el haz láser. La mayor o menor dispersión de la luz y por tanto la mayor o menor detección de luz en éste detector. con estos parámetros. Esquema de los sistemas de detección del citómetro de flujo. denominándose Side Scatter (SSC). las células pueden ser marcadas con fluorocromos libres o acoplados a moléculas con afinidad por el componente celular que se desee evaluar. las moléculas más utilizadas para este fin son los anticuerpos (debido a su especificidad). mediante los cuales es posible analizar marcadores de la superficie celular (CD4. proteínas virales. CD8 y todos los marcadores de identidad).) y marcadores nucleares (DNA. marcadores intracelulares (citocinas. etc. 74 . la intensidad de la emisión será directamente proporcional a la concentración o cantidad de la citada molécula. RNA). si estos compuestos se encuentran acoplados a anticuerpos contra una molécula en particular. cinasas. Como se mencionó.Figura 2. Los fluorocromos son una serie de compuestos químicos que tienen la capacidad de absorber la luz del rayo láser en forma de fotones y emitirlos con menor energía (mayor longitud de onda). En la figura 3 se muestra el espectro de emisión de algunos fluorocromos utilizados en CF. caspasas. Diagrama de tamaño vs granularidad (DOT-PLOT) de una muestra de sangre periférica donde se muestra la capacidad de separación de las diferentes poblaciones celulares mediante los sistemas detectores FSC y SSC. estos se pueden visualizar en un grafico denominado histograma en el que se grafica la intensidad del fluorocromo en cuestión contra el número de eventos (células) positivos a dicha molécula (Figura 4). ECD: Electron Coupled Dye A partir de la grafica FSC vs SSC se pueden generar regiones para realizar el análisis de poblaciones en particular. Figura 4. por ejemplo. se muestran los excitados por un rayo láser de argón (488 nm) y de helio-Neón (630 nm). Histogramas de la región correspondiente a los linfocitos donde se observan las poblaciones positivas a CD8 y a CD4 75 . 1 se señala en rojo la región correspondiente a los linfocitos. PE: Ficoeritrina. FITC: Isotiocianato de fluoresceína.Figura 3. Principales fluorocromos utilizados en CF. en la figura. si se marcó esta suspensión con anticuerpos acoplados con fluorocromos contra las poblaciones de linfocitos T cooperadores (CD4-PE) y citotóxicos (CD8FITC). en la clínica y en la terapéutica de las cuales se mencionan algunas a continuación: ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR: • Cambios en tamaño • Cambios en granularidad ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO: • Inmunoproliferación/ Inmunodeficiencia • Inmunodisfunción ALTERACIONES EN EL GENOTIPO: • Cambios en el contenido de ADN (ploidía) • Cambios en la expresión de genes ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR: • Cambios en la síntesis y concentración de moléculas • Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a través de rutas de activación • Alteraciones en el número y la función de orgánelos subcelulares • Cambios en la respuesta bioquímica a estímulos controlados 76 . por ejemplo. La CF tiene múltiples aplicaciones en investigación básica. figura 5.A partir del diagrama FSC vs SSC también se puede generar un grafico Dot Plot donde se esquematice la emisión de dos fluorocromos de manera simultánea. se puede identificar en el dot-plot el porcentaje de células CD4 que están activadas (cuadrante superior derecho) de las que no lo están (cuadrante superior izquierdo). si la muestra marcada con el anticuerpo anti CD4-PE. se marca también con un anticuerpo anti CD69-FITC (el cual es un marcador de activación celular). F. Practical Flow Cytometry. Wiley-Liss. H. The kinetics of antibody binding to membrane antigens in solution and at the cell surface.1002/0471142735.) 1994.. Biochem. estudios del ciclo celular.interscience.1-5.0.3.im0500s87 2. Mason. 1988.wiley. Z.P. and Williams.A. and Crissman. 4. Academic Press. REFERENCIAS 1. etc. M. New York. Robinson. 1980. Darzynkiewicz. J.187:1-9. J. A. 2nd ed. 77 . 3. DOI: 10. D. 2nd ed. Flow Cytometry..W. Shapiro. H. purificación de subpoblaciones celulares.: 41 & 42. (eds. San Diego.0.DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (“CELULAS RARAS”) • Detección de células tumorales circulantes • Detección de células fetales en sangre materna • Detección de células activadas o antígeno-específicas circulantes PARAMETROS IMPLICADOS DIRECTAMENTE EN EL PROCESO PATOLOGICO: • Análisis de parámetros específicos de la patología SELECCION DE CELULAS EN LA TERAPIA CELULAR: • Análisis de progenitores en el transplante autólogo • Pruebas cruzadas (“cross-match”) en transplantes heterólogos • Detección y cuantificación de leucocitos residuales en hemopreparados ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL CELULAR: • Cambios en parámetros estructurales • Cambios en parámetros funcionales ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL DEL PACIENTE: • Detección de recidivas y enfermedad mínima residual • Establecimiento de patrones pronósticos de éxito terapéutico DETECCION Y ANALISIS DE RESISTENCIA A LA TERAPIA: • Análisis de la captación y retención de fármacos (fenotipo MDR) • Análisis del metabolismo de fármacos CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR: • Identificación y análisis de células apoptóticas • Identificación de células necróticas Discusión Discuta con sus compañeros otras aplicaciones de la citometría de flujo como la cuantificación de citocinas con perlas fluorescentes. Published online November 2009 in Wiley Interscience (www.com). Current Protocols in Immunology 5. identificación de vías de señalización. Methods Cell Biol. Dr. RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO En la unidad 3 se abordan los mecanismos específicos de defensa (MED). Manejo de animales de laboratorio e identificación de las principales vías de inoculación en ratón. • Conocer las vías de inoculación de antígenos y adquirir la habilidad de realizar la inoculación de antígenos por vía intraperitoneal. 13 MODELOS EXPERIMENTALES Y VIAS DE INMUNIZACION. • Entender los procedimientos y manejar de manera adecuada y ética a los ratones sujetos de experimentación en el curso. Importancia: Un profesional del área debe adquirir la competencia de conocer y manejar adecuadamente modelos experimentales y animales de experimentación. Salvador Fonseca Coronado OBJETIVOS Y COMPETENCIAS • Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las siguientes competencias: • Conocer la importancia de los modelos de experimentación en el ámbito de la investigación básica. • Comprender la importancia del uso de adyuvantes en la activación de los MID y los MED. en esta práctica se lleva a cabo una introducción a la forma en que se da lugar a la activación de los MED mediante la inoculación (exposición) a agentes inmunógenicos y a la importancia de los adyuvantes como activadores de los MID. clínica y diagnóstica en inmunología.PRÁCTICA No. 78 . se efectúa a través de múltiples enlaces no covalentes entre una parte del antígeno (denominada epítopo) y los aminoácidos del sitio de unión del anticuerpo. se ve afectada por factores como la temperatura. La reacción se caracteriza por su especificidad. En este primer acercamiento se conocerán las principales vías de inoculación de antígenos en ratón y las implicaciones inmunológicas dependientes de cada vía.INTRODUCCIÓN Un modelo experimental es un sistema que nos permite imitar un fenómeno en condiciones controladas con la finalidad de describirlo lo más detalladamente posible. Casi todo lo que damos por sentado del conocimiento en inmunología se ha estudiado y descrito a partir de modelos experimentales tanto in vitro como in vivo. es reversible y. el pH y la fuerza iónica. en tanto que el estudio en ratones es. en esta práctica. por mucho. Reversibilidad: Dado que la reacción se debe a fuerzas no covalentes. en particular la activación de linfocitos B con la consiguiente producción de anticuerpos. En este punto el alumno ya ha trabajado modelos experimentales in vivo en asignaturas como farmacología. Con respecto a los modelos in vitro. el modelo in vivo que más aportaciones a dado en el estudio de la inmunología. la proporción de Ag-Ab. espontaneidad y reversibilidad. Espontaneidad: La reacción Ag-Ab no requiere energía adicional para efectuarse. 79 . el alumno adquirirá los conocimientos para el establecimiento de un cultivo primario y el mantenimiento de una línea celular. además. La unión dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas a pesar de su similitud. Especificidad: Capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno que lo estimuló. El reconocimiento Ag-Ab es una reacción de complementariedad. los cuales serán posteriormente obtenidos y utilizados en las pruebas de ELISA y Western blot. Las líneas celulares y los cultivos primarios constituyen el principal modelo in vitro. permite la detención de un sólo antígeno en cuestión. en consecuencia. ahora se abordara el modelo en ratón para conocer y analizar uno de los fenómenos más relevantes en el campo: la reacción antígeno-anticuerpo. MATERIAL Y EQUIPO Jeringas de 1 y 3 mL Cánulas de alimentación oral para neonatos REACTIVOS Ácido pícrico Adyuvante completo e incompleto de Freund Solución inyectable Albúmina Sérica Bovina Gama Globulinas Humanas DIAGRAMA DE FLUJO Repartición de ratones y aprendizaje de manipulación Demostración de las diferentes vías de inoculación para animales de laboratorio: Oral. Jeringas (bolsa roja) 80 . Subcutánea. Intraperitoneal Formación de grupos de experimentación e inoculación intraperitoneal Lote 1 100 µL de solución inyectable/ratón Lote 2 20 µg de IgG purificadas en 100µL de solución inyectable/ratón Lote 3 20 µg de IgG purificadas en 100µL de adyuvante/ratón R1 R1 Mantener a los ratones e inmunizar nuevamente a los 7 y 14 días. El día 21 se obtiene muestra de sangre y se sacrifican los ratones R1: Aguja (contenedor rígido para punzocortantes). 7 u 8) Inmunización de ratones II puntos 6.METODOLOGÍA Calendario de actividades de está práctica Actividad Día Manejo e inmunización de ratones I puntos 1 al 5 y (6. Al grupo 2 se le administrarán 20 µg de Ig´s en 100 µL de solución inyectable a cada ratón por vía intraperitoneal. intramuscular. 8. 4. 6. 7 o 9 Inmunización de ratones III puntos 6. Al grupo 1 se le administrarán 100 µL de solución inyectable a cada ratón por vía intraperitoneal. 2. la selección e importancia estadística de los grupos de experimentación. y se llevará a cabo la primera inoculación en ratones. 3. A cada alumno se le proporcionará un ratón y será responsable de su cuidado durante el tiempo de desarrollo del proceso experimental. con las inmunoglobulinas humanas purificadas y cuantificadas en las prácticas anteriores (las cuales se comportarán ahora como inmunógenos). los alumnos llevarán a cabo el marcaje de sus animales. 81 . solo se sustituirá el adyuvante completo por adyuvante incompleto. Se formarán tres grupos de experimentación de 6 ratones cada uno. 7. Se administrará la misma dosis a cada grupo a los 7 y 14 días. Se enseñara a los alumnos las técnicas de marcaje. 9. Se hará una demostración del manejo adecuado de los ratones y los cuidados y riesgos de su manipulación. Al grupo 3 se le administrarán 20 µg de Ig´s en 100 µL del adyuvante seleccionado a cada ratón por vía intraperitoneal. 7 o 9 Sacrificio y muestreo Práctica Anatomía del Sistema Inmune 08/marzo/2013 15/marzo/2013 22/marzo/2013 05/abril/2013 1. 5. subcutánea) y cada alumno seleccionará una ruta para practicar evitando al máximo maltratos innecesarios de los animales. Se hará una demostración de las diferentes rutas de administración de sustancias a los ratones (oral. intraperitoneal. im1900s91 82 . 115 p. and Brown. Shevach. 2. UNAM.1–19. Discusión El alumno en base a la información previa obtenida. Los alumnos tendrán una mesa de discusión acerca de la importancia de los adyuvantes. Animal Models for Infectious Diseases. 11. M.0. N. D. M.0. Guía Práctica para el Manejo de Animales de Laboratorio.1–1. El día 21 se tomara una muestra de sangre y se sacrificaran los animales.10. DOI: 10.1002/0471142735. Referencias 1. Care and Handling of Laboratory Animals. Current Protocols in Immunology. Current Protocols in Immunology.4. P. J.F. México. 2010.0. 2007. Delgado. Los animales serán mantenidos en condiciones adecuadas con agua y alimento ad libitum durante todo el periodo de experimentación. DOI: 10. 76:1.1002/0471142735. 1993.0. Facultad de estudios Superiores Cuautitlán.im0100s76 3. C.4. E. para utilizarlos en la Práctica de Anatomía del Sistema Inmune. Revuelta. discutirá las implicaciones de la administración de un determinado antígeno por cada una de las vías analizadas y que órganos y células se ven implicadas en cada caso. Donovan. 91:19.