Manual Prácticas fisiología

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS MANUAL DE LABORATORIO DE FISIOLOGÍA GENERAL PARA BIÓLOGOS Dr. Iván Villanueva Becerril Dr. Tomás Fregoso Aguilar Academia de Fisiología General para Biólogos 1 NORMAS DE LABORATORIO 1. EL trabajo práctico y la asignación de material se hace por equipos de 3 a 4 personas. 2. Cada equipo ocupa una mesa que será la misma durante todo el curso. 3. Los alumnos deben usar bata en las sesiones prácticas. 4. Cada equipo debe traer a las sesiones prácticas un estuche de disección que contenga, al menos: • Tijeras quirúrgicas de punta fina • Pinzas quirúrgicas finas • Aguja de disección • Bisturí con navaja • Hilo y aguja convencionales 5. Durante todo el curso cada alumno debe traer a las sesiones una franela, un marcador indeleble y una calculadora con funciones estadísticas. 6. Al terminar la sesión práctica cada mesa debe estar limpia y los bancos acomodados en su lugar. Los animales sacrificados deben colocarse en una bolsa de plástico en el lugar designado por los profesores. 7. El material roto, descompuesto o extraviado debe ser repuesto en las siguientes dos semanas de haber ocurrido el percance. De no ser así, los integrantes del equipo no tendrán derecho a asistir a las sesiones posteriores. 8. Sólo se tendrá derecho a calificación si se ha cumplido con un mínimo de 80% de asistencias tanto a las sesiones de teoría como a las de práctica. Se tomará como retardo la llegada dentro de los 15 min. siguientes a la hora de entrada a la clase. Tres retardos constituyen una falta. 9. Dentro del laboratorio no se permite la ingestión de alimentos ni fumar. Así mismo, tanto en el laboratorio como en las clases teóricas, queda estrictamente prohibido el uso de teléfonos celulares. 2 La parte práctica del curso de Fisiología General tiene como propósito el presentar y familiarizar al alumno con la metodología experimental básica que se utiliza para generar, establecer e incluso reexaminar los conceptos teóricos de la fisiología en todos sus niveles. Las actividades dentro de cada práctica incluyen la planeación de un experimento en función de una hipótesis, la realización del experimento, el análisis exhaustivo de los resultados, la emisión de conclusiones y la presentación del trabajo al público, tanto por un reporte escrito como por una presentación oral. El presente manual propone una serie de experimentos ya diseñados para comprobar ciertos conceptos fisiológicos aceptados. Note, sin embargo, que la información teórica provista por este manual no es suficiente para sustentar el objetivo ni el análisis de los resultados de los experimento propuestos, por lo que es necesario que consulte fuentes de información más específicas, como las que se proponen al final de cada práctica. Las actividades que debe realizar el alumno en cada experimento son las siguientes: 1. Antes de presentarse a la sesión práctica debe comprender el experimento, la finalidad de éste (objetivo), los factores de variación que aplicará, las variables que medirá y los posibles resultados. 2. Realizar el experimento según las instrucciones. 3. Reunir los datos de su equipo y, en su caso, del grupo. 4. Calcular las medidas estadísticas básicas (media y error estándar) y presentar los datos en gráficas o tablas. 5. Hacer los contrastes estadísticos pertinentes (prueba de t, ANOVA o equivalentes no paramétricos). 6. Junto con su equipo, reunir la información teórica que sustente el objetivo y que explique los resultados obtenidos. 7. Junto con su equipo, redactar el reporte según los lineamientos que se anexan (siguiente página). 8. Junto con su equipo, organizar una presentación oral con la misma información que el reporte. 3 CÓMO REPORTAR UN TRABAJO CIENTÍFICO El reporte de un trabajo científico debe estar redactado en un lenguaje claro y conciso, con uso de tecnicismos sólo cuando sea necesario. Debe ser lo suficientemente explícito como para que cualquier persona adulta al leerlo se forme una idea general del propósito y las aportaciones del trabajo. Un reporte científico debe incluir los siguientes puntos: 1) carátula, 2) resumen, 3) introducción, 4) objetivos, 5) materiales y métodos 6) resultados, 7) discusión, 8) conclusiones y 9) referencias bibliográficas. A continuación se abundará un poco en cada uno de ellos: CARÁTULA Este apartado debe incluir el título del trabajo (o práctica), los nombres de los integrantes en orden alfabético y comenzando por el apellido paterno. Se debe incluir el equipo al que pertenecen, así como la institución en donde se realizó el trabajo. RESUMEN Es un texto de no más de 250 palabras en el cual se describe brevemente el trabajo realizado. El resumen debe (i) establecer los principales objetivos del trabajo, (ii) describir brevemente la metodología empleada, (iii) resumir los resultados y (iv) establecer las conclusiones principales. Este capítulo es importante porque sirve como una guía rápida cuando se quiere obtener información sobre algún tema y no se tiene tiempo para leer con detalle el reporte completo. INTRODUCCIÓN El propósito de este capítulo es describir brevemente el problema teórico que se quiere abordar, de manera que el lector tenga la suficiente información para justificar la realización del trabajo, comprender por qué se emplea esa metodología y evaluar la importancia del estudio. En la introducción se suelen incluir observaciones de otros autores que han estudiado previamente el tema, y que sirven de apoyo al trabajo. En este caso se incluye la cita entre paréntesis con el apellido(s) del(os) autor(es) que estudiaron el tema y el año en que se publicó su trabajo. Por ejemplo: ‘… es probable que el café causara náusea. Sin embargo, se ha demostrado que la cafeína causa inhibición del vómito en gatos (Álvarez y Smith, 1998)’. Cada cita incluida en el texto debe anotarse completa en la sección de REFERENCIAS, al final del reporte (véase más adelante). Para el curso de Fisiología General para la carrera de Biólogo, la introducción deberá abarcar entre una cuartilla y una cuartilla y media. 4 OBJETIVOS En esta sección se debe establecer, en términos muy concretos, lo que se pretende obtener al realizar los experimentos planteados, de acuerdo con la exposición del problema que se hizo en la introducción. Por ejemplo, si se está estudiando la fisiología del músculo esquelético, un objetivo podría ser: ‘determinar los cambios en la fuerza de contracción al aplicar un estímulo eléctrico prolongado’. Note que: a) el objetivo es la pregunta concreta que el experimentador se compromete a contestar mediante el experimento, y que debe contribuir a aclarar el problema que se expuso en la introducción. b) Se debe cuidar que el objetivo no sea ambiguo o engañoso, como el siguiente caso: “... el objetivo es conocer la fisiología del músculo esquelético”. MATERIALES Y MÉTODOS Este capítulo debe incluir los materiales, animales y equipo utilizados en el trabajo, así como describir brevemente la metodología empleada, de tal forma que algún lector familiarizado con el problema pueda repetir los experimentos solamente con esta información. Esta descripción no debe ser un instructivo, sino una exposición breve de los principales pasos del método experimental, aunque especificando claramente las variantes particulares utilizadas, por ejemplo, dosis de los fármacos administrados, temperatura y tiempo de incubación, volumen de líquido inyectado, tiempo e intensidad de estimulación, etc. También se debe incluir en los materiales y métodos el tipo y la cantidad de sujetos de experimentación que se utilizaron. En el caso de animales de laboratorio, se debe indicar el género y, de ser posible, la especie (ejemplo: Rattus norvegicus, que es la rata de laboratorio). Esta sección también debe incluir el tipo de análisis estadístico que se utilizó para comparar los datos obtenidos y el valor de la probabilidad alfa que se empleó (ejemplo: media y error estándar, prueba t de Student, prueba de Ji cuadrada, análisis de variancia, etc.). RESULTADOS Este capítulo consiste en la presentación de los datos obtenidos. La presentación se hace en forma de una figura (una tabla o una gráfica) acompañada de una descripción escrita de los efectos o tendencias generales que se observan en ella. FIGURAS. Salvo que sea estrictamente necesario, las tablas o gráficas no deben mostrar datos individuales, sino estadísticos de tendencia central (generalmente media) y de desviación (generalmente error estándar). 5 Cada figura debe incluir: a) un pie de figura donde se explique muy brevemente el tratamiento aplicado para obtener esos resultados. b) Los resultados del análisis estadístico. c) Un número de figura con el que debe ser citada en el texto. En la sección de RESULTADOS no se debe interpretar o discutir los resultados, únicamente se describen. Observe el ejemplo: “ Durante el periodo del ensayo, los animales mantenidos con la dieta comercial aumentaron su peso corporal en más de 60 g. Los grupos alimentados con dietas de alto contenido de carbohidratos y de lípidos tuvieron aumentos significativamente mayores que el grupo control (P<0.05), que no fueron diferentes entre sí (figura 3). … ” Ganancia de peso (g) 120 * * CH LIP 90 60 30 0 CTL Figura 3. Ganancia de peso en un periodo de 3 meses de un grupo de ratas alimentadas con una dieta control (CTL), rica en carbohidratos (CH) o rica en lípidos (LIP). Los datos son medias ± E.E. (n=6). *: P<0.05 vs. dieta control. DISCUSIÓN La discusión de los resultados es la parte del reporte en donde el experimentador da su interpretación de los datos y analiza su hipótesis en función de ellos. Este análisis debe tener como base el fondo teórico que se expuso en la introducción para dar una explicación teórica lógica de los resultados obtenidos. Por último el análisis debe contestar cómo los resultados responden al objetivo y, si no lo hacen, debe exponer las razones lógicas de ello. La discusión de resultados suele consistir esencialmente de razonamientos del autor apoyados en citas bibliográficas adicionales, es decir, en datos extraídos de trabajos previos en el tema y que ayudan a explicar el caso presente. Por ejemplo, si en el trabajo se estudiaron características de la sinapsis, una parte de la discusión podría estar redactada así: ‘nuestros resultados indican que en la sinapsis interviene una sustancia química que ayuda en el proceso de transmisión de información entre una célula y la otra, lo cual coincide con las propiedades descritas para la acetilcolina (Anderson y cols., 1983)’. 6 CONCLUSIONES En este capítulo se escriben en forma concisa (no más de dos renglones por experimento) los principales hallazgos obtenidos del trabajo experimental y cómo responden al objetivo planteado al inicio. Se da por entendido que el experimento fue hecho para cumplir el objetivo, y por lo tanto no debe escribirse en la sección de conclusiones: “se cumplieron los objetivos propuestos”; esto no es una conclusión. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS (BIBLIOGRAFÍA) En esta sección se deben anotar completas las referencias bibliográficas que se citaron a lo largo del texto de la introducción y la discusión, pues pueden ser del interés del lector para profundizar en el tema del trabajo. Aunque existen diferentes formas de escribir una referencia bibliográfica, por consenso se ha optado por la siguiente: Si la cita se obtuvo de una revista científica: • Anderson D.C., King S., Parsons S.M. (1983). Pharmacological characterization of the acetylcholine transport system in purified Torpedo synaptic vesicles. Mol. Pharmacol. 24: 42 – 48. Note que: a) Los autores se anotan todos como apellido paterno seguido de las iniciales del nombre. b) El título se escribe todo en minúsculas exceptuando los nombres propios y las palabras cuya notación requiera el uso de mayúsculas (Mel-1, PACAP, GRP, VIP, c-Fos, ACTH, etc.). c) Se abrevia el nombre de la revista y se omite el número; sólo se anota el volumen: páginas. Si la cita es de un libro: • Katzung B.G. (1996). Farmacología básica y clínica. El Manual Moderno. 6ª ed. México, D.F. 111 127. Note, además, que: a) Se subraya el nombre de la editorial, omitiendo la palabra ‘editorial’. b) Si la edición es 1ª no se anota, y ‘edición’ se abrevia ‘ed.’ 7 8 PRÁCTICA No. 1 INTRODUCCIÓN AL MANEJO DE DATOS ACTIVIDADES PROPUESTAS 1. Determine la estatura (cm), el peso (kg) y la frecuencia cardiaca (lat/min) de todos los compañeros del grupo y construya con estos datos una tabla que incluya también el género de la persona (M, F). 1 Para determinar la frecuencia cardiaca: coloque las yemas de sus dedos medio e índice sobre la cara interna de la muñeca del brazo izquierdo, presionando suavemente hasta que sienta las pulsaciones. Cuente el número de pulsaciones en 30 segundos y multiplíquelo por 2 para reportarlo en latidos/minuto. 2. Utilizando herramientas estadísticas compare los grupos obtenidos y conteste las siguientes preguntas: ( ¿El género de las personas induce diferencias en el peso corporal? ( ¿El género induce diferencias en la estatura? ( ¿El género induce diferencias en la frecuencia de latido del corazón? ( ¿La estatura induce diferencias en el peso corporal? ( ¿La estatura induce diferencias en la frecuencia cardiaca? ( ¿El peso induce diferencias en la frecuencia cardiaca? y, además: ( ¿Qué tipo de información arroja una prueba estadística? ¿Cómo se interpreta? 3. Reporte sus resultados como gráficas en las que represente la variación dentro de los grupos y los casos en los que la diferencia sea estadísticamente significativa (probabilidad < 0.05). 4. Discuta sus resultados tomando en consideración los siguientes puntos. No olvide citar sus fuentes de información. Í ¿Qué relación existe entre el género, el peso corporal y la estatura en humanos? Í ¿Qué relación existe entre el peso (tamaño) corporal y la frecuencia cardiaca? Í ¿Qué relación existe entre la estatura (efecto de la gravedad) y la frecuencia cardiaca en mamíferos? 9 Práctica 1. Manejo de datos Género (M, F) Estatura (cm) Peso (kg) Frec.card. (lat/min) Género (M, F) B 10 Estatura (cm) Peso (kg) Frec.card. (lat/min) Práctica 1. Manejo de datos 7 Para hacer una comparación estadística por prueba t de Student: a) calcule las medidas descriptivas de cada uno de los grupos de datos (media y error estándar). media = X = Σ xi error estándar = e.e. = n donde: σ n-1 desviación = estándar muestral = √ σ n-1 √n Σ xi2 - (Σ xi )2 / n n -1 b) Calcule la diferencia entre los grupos en términos de un número t, con la siguiente fórmula: t = Xa - Xb √(e.e.a)2+(e.e.b)2 y calcule también los grados de libertad correspondientes: Grados de libertad = df = na+ nb -2 c) Compare el valor obtenido con el valor límite que aparece en las tablas de la distribución de t. Los valores de probabilidad están representados en la parte superior de la tabla. Sitúese en el valor de probabilidad de 0.05 (es decir, 5%) y encuentre el valor de t correspondiente de acuerdo con los grados de libertad de sus datos. Note que para un cierto número de grados de libertad, al aumentar el valor de t (es decir, a mayor diferencia entre los grupos) la probabilidad es menor. Si el valor de t de sus datos es igual o mayor que el de la tabla (esto es, una probabilidad menor de 5%) podrá suponer que los grupos que está comparando son diferentes entre sí. Si la probabilidad es mayor de 0.05 (5%), se considera que todos sus datos pertenecen a una misma población y que las diferencias entre ellos no son debidas al tratamiento aplicado, sino a la variación normal entre individuos. 11 Práctica 1. Manejo de datos Bibliografía sugerida: Š Schmidt-Nielsen K. Animal Physiology. Adaptation and Environment. Cambridge University Press, 1997. Š Eckert R y Randall D. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. Interamericana-McGraw Hill, 1989. Š Steel DG y Torrie JH. Bioestadística. Principios y Procedimientos; 2ª ed. McGraw-Hill, México, 1988. 12 PRÁCTICA No. 2 CONCEPTOS BÁSICOS EN HOMEOSTASIS ACTIVIDADES Experimento 1. El experimento está basado en la característica de los animales endotermos- homeotermos de regular su temperatura corporal. Por lo tanto, pueden ser considerados como sistemas biológicos de regulación de la cantidad de calor. En este experimento se aplicarán perturbaciones de tipo térmico a dos de estos sistemas: la rata y el humano, y se analizará la manera en que cada uno enfrenta la perturbación, considerando que los dos sistemas son diferentes entre sí (al menos en el tamaño). Se aplicarán perturbaciones en ambos sentidos, es decir, tanto hacia arriba (que tiendan a aumentar la cantidad de calor) como hacia abajo (que la reduzcan) y se determinará el impacto de la perturbación sobre el sistema, esto es, el cambio en la temperatura de cada sistema. Las actividades propuestas son las siguientes: 1a) Prepare tres cámaras en las que creará un ambiente de temperatura controlada. En la primera de ellas la temperatura deberá ser de más de 30º C, en la segunda de menos de 12º C y en la tercera la temperatura no será alterada (es decir, quedará alrededor de 20º C). Ésta será una situación testigo. 1b) Prepare tres individuos de cada tipo (por equipo), cada uno de los cuales irá a una de las cámaras. Mida su temperatura corporal antes de ingresar. 1 Para medir la temperatura de la rata: sujete al animal cubriéndole la vista con un trapo; unte un poco de vaselina en el bulbo del termómetro e introdúzcalo suavemente en el recto, aproximadamente 5 cm, y manténgalo por 3 minutos o hasta que la lectura se estabilice. 1c) Mida la temperatura de cada individuo al momento de ingresar a la cámara (t=0) y cada 5 minutos durante media hora. Al cabo de este periodo retire la perturbación (regrese a los individuos a la temperatura no alterada) y continúe midiendo por 15 minutos más. Registre los cambios comportamentales más evidentes durante la perturbación. 1d) Haga los análisis necesarios a fin de contestar las siguientes preguntas: ( ¿Existen diferencias en la temperatura corporal entre ratas y humanos? ( ¿Todos los grupos empleados tiene la misma temperatura basal? ( ¿Alguna de las perturbaciones altera la temperatura corporal de la rata o del humano? 13 Práctica 2. Homeostasis Experimento 2. Algunos sistemas no biológicos tienen capacidad de resistir los cambios inducidos por perturbaciones ambientales (aunque esto no significa estrictamente que tengan capacidad de regulación). En este experimento se analizará la manera en que un sistema no biológico sencillo resiste diferentes tipos de perturbación externa. Las actividades propuestas son las siguientes: 2a) Utilice un frasco con salida. Coloque una pinza Mohr en la manguera de entrada y otra en la manguera de salida. Establezca un flujo constante de agua a través del frasco y controle la entrada y la salida de manera que el nivel de agua se estabilice, y márquelo. 2b) Sobre el sistema estable aplique una perturbación transitoria (por ejemplo, agregue o retire un cierto volumen de agua) y observe los cambios en el nivel durante varios minutos hasta que se estabilice nuevamente. 2c) Aplique ahora una perturbación continua, primero sobre la entrada (abriendo o cerrando levemente la pinza) y después sobre la salida. Observe durante varios minutos y registre los cambios en cada caso. J Discuta sus resultados tomando en consideración los siguientes puntos (no olvide citar sus fuentes de información): Í La diferencia entre los términos regulación y control. Í Los elementos básicos de un sistema de regulación. Í La relación entre el tamaño corporal y la temperatura en mamíferos (y cómo se relaciona esto con sus resultados). Í ¿Qué diferencias encuentra entre los dos tipos de sistema analizados, en cuanto a su naturaleza y a su respuesta ante perturbaciones transitorias y continuas? Í ¿Qué ventajas y qué desventajas tiene la regulación? ¿Qué alternativas biológicas existen a la regulación? u 14 1 Rata 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) 6 Observaciones 1 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) Humano Temperatura alta (± 30ºC) 6 Observaciones Práctica 2. Homeostasis RESULTADOS Experimento 1 15 16 1 Rata 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) 6 Observaciones 1 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) Humano Temperatura baja (< 10º C) 6 Observaciones Práctica 2. Homeostasis 1 Rata 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) 6 Observaciones 1 2 3 4 5 Temperatura colonal (ªC) Humano Temperatura no alterada (± 23º C) 6 Observaciones Práctica 2. Homeostasis 17 Práctica 2. Homeostasis Experimento 2. Tipo de perturbación aplicada Respuesta del sistema l Material necesario (por equipo):  3 termómetros clínicos (prop. personal)  1 caja de plástico para rata, con tapa  1 regla de plástico transparente (prop. personal)  1 botella con salida  3 termómetros de laboratorio  2 pinzas Mohr  3 cronómetros  1 vaso de precipitados de 50 ml Bibliografía sugerida: Š Russek M. y Cabanac M. Regulación y Control en Biología. Instituto Politécnico Nacional, México, 1990. Š Schmidt-Nielsen K. Animal Physiology. Adaptation and Environment. Cambridge University Press, 1997. Š Eckert R y Randall D. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. Interamericana-McGraw Hill, 1989. 18 PRÁCTICA No. 3 SIMULACIÓN DEL POTENCIAL DE ACCIÓN Prácticamente todas las células, independientemente de su complejidad, forman y mantienen gradientes iónicos a través de su membrana plasmática. Estos gradientes crean una diferencia de carga eléctrica entre el interior de la célula y el medio extracelular, lo que se conoce como potencial de membrana. Solamente algunos tipos celulares (las llamadas células excitables) son capaces de modificar drásticamente su potencial de membrana y recuperarlo después. Esta inversión súbita y transitoria del potencial de membrana es denominada potencial de acción (PA), y es un fenómeno electroquímico esencial para la comunicación entre neuronas y para la transmisión de señales de célula a célula. Existen algunos modelos animales que, por las características que presentan sus axones, ofrecen una oportunidad de estudiar las propiedades del PA; tal es el caso del axón gigante del calamar Loligo sp. A partir de este invertebrado y de algunos vertebrados inferiores como la rana, se han establecido preparaciones biológicas y modelos de simulación por computadora para comprobar la función de células excitables. En el laboratorio se utilizará un modelo de simulación por computadora del PA (programa AXOVACS), así como una preparación de nervio ciático de rana. En ambos casos, se mide el potencial de la membrana de la célula mientras se induce la generación del PA aplicando estimulación eléctrica en forma de “pulsos cuadrados” o “comandos”. Un comando es una descarga de corriente eléctrica que se aplica a una preparación con una intensidad (μA) y una duración (milisegundos: ms) definidas. Tome en consideración que un estímulo eléctrico es una inyección de cargas a la célula, y por lo tanto produce un cambio proporcional en la distribución de cargas en la membrana. Este cambio de cargas se registra como la respuesta pasiva o electrotónica. En algunos casos, cuando este cambio es suficientemente grande, lleva a la apertura de canales dependientes de voltaje y genera entonces una respuesta eléctrica activa, que es el potencial de acción (figura 1). voltímetro (registro) estimulador + V ojo: la respuesta pasiva varía según el estímulo, mientras que el PA es siempre igual I +30 Duración (ms) 0 ++ + + + Intensidad (μA) -60 t Un pulso cuadrado o comando. I t Fig. 1. Preparación experimental para el estudio del PA. 19 Práctica 3. Potencial de acción PARTE A. Simulación del potencial de acción en computadora: El programa AXOVACS (Axovacs electrophisiology computer lab. vers. 10 ©, 1987. Axon Instruments, Inc.) simula la respuesta eléctrica de un axón gigante de calamar, como ocurriría en una preparación en la que se insertaran en la célula electrodos de estimulación y de registro. El programa permite controlar las características del estímulo aplicado (tanto intensidad como duración) y observar la respuesta sobre una escala de tiempo. 1. Umbral (OPCIÓN 4): El objetivo de este experimento es encontrar la intensidad mínima (umbral) que debe tener un estímulo para generar la respuesta activa del axón. 1a) Con un valor de potencial de membrana de –60 mV y una duración de 0.1 ms, encuentre la menor intensidad de estímulo (en μA) que es necesaria para desencadenar un PA. Comience con valores bajos (por ejemplo, 30 μA) y si no observa la forma clásica del potencial de acción, realice varias corridas aumentando la intensidad de estimulación. Considere que el valor máximo de estimulación en este modelo es de 2000 μA. Observe la respuesta pasiva y diferénciela del PA. 1b) Una vez encontrado el valor umbral, reduzca la duración del estímulo (por ejemplo a 0.05 ms) y observe la respuesta. Si es necesario, encuentre el nuevo valor umbral. 1c) Reduzca nuevamente la duración y encuentre el umbral correspondiente. Pruebe ahora valores mayores (por ejemplo, 1 o 2 ms) y haga lo propio. Reúna 10 pares de valores duraciónintensidad. Considere que la duración puede ser tan breve como 0.001 ms o tan grande como 10 ms. 1d) Con los datos reunidos construya una gráfica en la que las abscisas sean los valores de duración y las ordenadas los de intensidad necesaria (curva duración-intensidad). h Observe el trazo del PA en la pantalla. ¿En qué momento se abren y cierran los conductos dependientes de voltaje para los iones Na+ y K+? ¿Se relaciona este hecho con la forma del PA?. h ¿Cómo es el PA cuando se aplica un estímulo subumbral, uno umbral y uno supraumbral? h ¿Qué significa el hecho de que la curva duración-intensidad sea asintótica (es decir, que nunca toca los ejes)? 20 Duración (ms) Intensidad (μA) Práctica 3. Potencial de acción h En la siguiente representación del PA, señale: a. la variable representada en cada eje, b. el momento en que se aplica el estímulo, c. las fases de despolarización, repolarización e hiperpolarización, d. el momento en que aumenta la conductancia de Na+, 0 e. el momento en que aumenta la conductancia de K+, f. el potencial de reposo, g. el potencial de equilibrio (Nernst) del Na+, h. el potencial de equilibrio (Nernst) del K+, i. la despolarización pasiva, j. el umbral de apertura de los canales. I 2. Periodo refractario absoluto (PRA) y periodo refractario relativo (PRR) (OPCIÓN 6): Cuando es estimulada, una célula excitable cambia su potencial de membrana solamente un momento e inmediatamente después recupera su estado inicial. Por lo tanto, si a un axón se le aplica un estímulo prolongado (como en la figura 2) no permanece despolarizado todo este tiempo, sino que sufre sólo una pocas despolarizaciones rápidas. Es evidente que, después de una PA, el axón cae en un estado en el que no es capaz de disparar nuevamente aunque esté siendo estimulado. El tiempo en el que el axón es resistente o refractario a la estimulación (es decir, no genera un nuevo PA) es llamado periodo refractario, y dura sólo V (mV) unos pocos milisegundos. Este periodo refractario +30 puede ser visto como un periodo de recuperación del 0 periodo refractario axón antes de disparar nuevamente. Al inicio del periodo refractario, el axón es resistente a cualquier estímulo, por intenso que sea (periodo refractario absoluto), pero a medida que pasa el tiempo la resistencia disminuye y entonces el axón sí puede responder pero sólo si el estímulo es bastante más intenso (periodo refractario relativo). -60 estímulo prolongado I (μA) 5 10 15 t (ms) Fig. 2. Cambios en el potencial de membrana durante estimulación continua 21 Práctica 3. Potencial de acción Seleccione la opción 6 del programa. Aplique un primer estímulo umbral o ligeramente supraumbral de 0.1 ms de duración que comience en 1 ms. Aplique 20 ms después un segundo estímulo de la misma intensidad y duración, y observe. Comience a acercar el segundo estímulo y, en cuanto desaparezca la segunda respuesta, aumente la intensidad al doble. ¿Qué es lo que observa? Continúe aproximando el segundo estímulo al primero, hasta que desaparezca, y aumente nuevamente la intensidad. Considere que la intensidad máxima que puede aplicar es de 2000 μA, y que un estímulo de estas características produce una respuesta pasiva y un artefacto muy grandes.  Encuentre la duración del periodo refractario absoluto y del periodo refractario relativo. V Aplicación de un segundo estímulo fuera del periodo refractario V +30 +30 0 0 -60 -60 I I primer estímulo 2o. estímulo Aplicación de un segundo estímulo dentro del periodo refractario ojo: sólo aparece la respuesta pasiva t t PRA: 2 PRR: Duración total del PR: 3. Suma de estímulos subumbrales: Cada estímulo aplicado a una célula produce en ésta una respuesta pasiva. La respuesta pasiva puede ser vista como un cambio de cargas en la célula producido por el estímulo aplicado. En un estímulo umbral o supraumbral, la respuesta pasiva es suficientemente intensa para desencadenar un PA. Si el estímulo es poco intenso (subumbral) se producirá la respuesta pasiva pero ésta no inducirá PA. En algunos casos se pueden sumar las respuestas pasivas inducidas por dos estímulos diferentes. 3a) Seleccione la misma opción 6 del programa. Elija valores de un estímulo subumbral (que por sí mismo produzca respuesta pasiva pero no llegue a desencadenar PA; por ejemplo 50 μA con 0.1 ms de duración) y aplique uno a los 10 ms (start: 10) y otro igual a los 20 ms. Observe la respuesta pasiva inducida por cada uno. 3b) Sin modificar la intensidad ni la duración, acorte gradualmente el tiempo entre los estímulos, hasta que las respuestas se sobrepongan. ¿Qué sucede cuando se suman las respuestas pasivas? ¿Cómo explica esto? 22 Práctica 3. Potencial de acción 4. Canales dependientes de voltaje (OPCIÓN 7): El programa AXOVACS permite simular la adición de dos drogas específicas a la preparación de axón, y observar su efecto sobre el PA. Las drogas en cuestión son la saxitoxina (STX) y el tetraetilamonio (TEA), que bloquean cada una un tipo específico de canal dependiente de voltaje. Seleccione la opción 7 del programa, con una escala de 10 ms y pruebe por separado cada droga, en diferentes concentraciones, de la siguiente manera: 4a) Aplique un estímulo de las características que sugiere el programa (intensidad de 320 μA; duración 0.1 ms), pero que comience en 1 ms (start: 1). Realice una corrida de simulación básica del PA. 4b) Sobreponiéndola a la anterior (superimpose: yes) haga una nueva corrida de las mismas características pero aplicando ahora una concentración baja de saxitoxina (por ejemplo, 1 nM). Deje la concentración de TEA en 0. 4c) Sobre el mismo trazo sobreponga corridas aumentando gradualmente la concentración de STX (como sugerencia, utilice 2, 5, 7, 10 y 20 nM). Observe el comportamiento del PA en cada caso. Note también el comportamiento de las conductancias (G) de cada uno de los iones, en la parte inferior de la gráfica. 4d) Borre los trazos anteriores (superimpose: no) y pruebe ahora el efecto del tetraetilamonio (como sugerencia, utilice concentraciones de 1, 2, 5, 7, 10, 20, 50 y 100 mM). Í ¿Cuáles son los iones principales que intervienen en el PA y en qué fase interviene cada uno? Í ¿Qué efecto tiene la saxitoxina sobre el PA y a qué se debe esto? ¿Cuál es el efecto del tetraetilamonio? Í ¿Qué puede decir sobre la potencia de los dos fármacos para alterar el PA? e 5. Concentraciones iónicas (OPCIÓN 8): El PA depende del movimiento de ciertos iones a través de los canales abiertos. Este movimiento de iones, a su vez, depende de la diferencia de concentración de ellos entre el interior y el exterior de la célula (los llamados gradientes). Por lo tanto, al modificar los gradientes de iones debe modificarse la forma del PA. 23 Práctica 3. Potencial de acción Cuando se utiliza una preparación de axón gigante de calamar, una manera de modificar el gradiente es sumergir el axón en un líquido preparado con distintas cantidades de estos iones. Como resultado, se modifica la diferencia entre el exterior y el interior y, por lo tanto, la forma del PA. El programa AXOVACS permite aumentar o disminuir la concentración extracelular de sodio o de potasio, para estudiar el PA en estas condiciones. Note que la concentración está expresada como la relación exterior/interior, donde 1 = conc. normal; 0.5 = conc. extracelular de la mitad de la normal; 2 = conc. extracelular del doble de la normal. 5a) Realice una corrida de simulación básica para una relación de concentraciones externa/interna de 1 para Na+ y K+. Sobreponga a ésta otra corrida aumentando la concentración extracelular de Na+ al doble y reduciéndola después a la mitad de lo normal. ¿Qué sucede con el PA? 5b) Realice otra corrida en condiciones normales y modifique después la concentración extracelular de K+, primero al doble y después a la mitad. Observe la forma del PA. Condición Efecto sobre el PA (respecto a la concentración normal) Conc. extracel. de Na+ doble de lo normal Conc. extracel. de Na+ mitad de lo normal Conc. extracel. de K+ doble de lo normal Conc. extracel. de K+ mitad de lo normal Í ¿Qué efecto tiene el cambio de la concentración extracelular de Na+ o de K+ sobre los gradientes electroquímicos y sobre los potenciales de equilibrio de estos iones? Í ¿Cómo se modifica la forma del PA al aumentar o disminuir la concentración extracelular de Na+? ¿Qué sucede al cambiar la concentración de K+? Í ¿Cómo explica el hecho de que los cambios en Na+ y en K+ tengan distintos efectos sobre la forma del PA? 24 Práctica 3. Potencial de acción 6. Actividad marcapasos: En la misma opción 8 eleve ligeramente la concentración extracelular de potasio (K conc ratio = 1.5) y seleccione la escala de 50 ms. Haga una corrida sin aplicar estímulo (seleccione intensidad 0 μA). Observe la respuesta de la célula. W PARTE B. Potencial de acción compuesto en preparación de anfibio. Utilice una preparación de nervio ciático de rana acoplado por un lado a un estimulador y por otro a un osciloscopio. Esta preparación permite el registro extracelular de los eventos eléctricos de todo el nervio, por lo que el PA tiene una forma diferente al registrado con electrodos intracelulares, y se denomina potencial de acción compuesto. De modo similar a la parte A, determine: a) Estímulos umbral y máximo. El PA compuesto no tiene siempre la misma intensidad. Además de la intensidad umbral, encuentre el valor del estímulo que produce la respuesta máxima. b) Velocidad de conducción: Después de la estimulación del nervio, la respuesta (el PA) no ocurre inmediatamente, sino unos instantes después. El tiempo que transcurre entre la aplicación del estímulo y la aparición de la respuesta se conoce como periodo de latencia, y depende de la distancia entre los electrodos de estimulación y los de registro.  En su preparación experimental encuentre la duración del periodo de latencia y mida la distancia entre los electrodos de estimulación y los de registro. Con estos datos calcule la velocidad de conducción del nervio, expresada en m/s. c) Suma de estímulos subumbrales: Observe el efecto de la suma de dos estímulos subumbrales tal como lo hizo con el programa AXOVACS. Estímulo umbral: μA Estímulo máximo: μA Periodo de latencia: ms Distancia entre los electrodos: mm encuentre la duración de los periodos refractarios Velocidad de conducción: m/s absoluto y relativo. PR Absoluto: ms PR Relativo: ms d) Periodos refractarios: Siguiendo el mismo método que en el programa, 25 Práctica 3. Potencial de acción Presentación de resultados: Esquematice los trazos de las simulaciones realizadas en cada experiencia, describiendo brevemente qué sucede en cada una. Discuta tomando en consideración los siguientes puntos: Š ¿Qué es excitabilidad y cuáles son las células excitables en el organismo? Š ¿Cómo son las concentraciones de externa e interna de los iones Na+ y K+ en una célula excitable? Š ¿Qué es un potencial de acción y cuáles son sus características? Š ¿A qué se refiere el término ‘umbral’? Š ¿Qué clase de estímulo fisiológico puede generar un PA en una célula excitable? Š ¿Qué es el periodo refractario relativo y absoluto, y cómo se explica? Š ¿En que situación fisiológica ocurre suma de estímulos subumbrales? Š ¿Por qué se dice que un PA se autorregenera? Š ¿Qué características definen a un tejido marcapasos? Š ¿Qué diferencias existen entre un PA y un PA compuesto, y a qué se deben? Š ¿Cuál es la velocidad de conducción en un nervio de mamífero y por qué es diferente de la de rana? Š ¿Qué factores morfológicos determinan la velocidad con la que una fibra nerviosa conduce el PA? Bibliografía sugerida: Š Carpenter S.H. Neurofisiología. Manual Moderno. México, D.F., 1996. Š Eckert R., Randall D. y Augustine G. Fisiología Animal: Mecanismos y Adaptaciones. 3ª Ed. Interamericana McGraw-Hill. Madrid, 1990. Š Ganong F.W. Fisiología Médica. 17a Ed. Manual Moderno, México, D.F., 2000. Š Kandel E.R., Schwartz J.H. y Jessell T.M. Neurociencia y Conducta. Prentice Hall, Madrid, 1997. Š Muñoz-Martínez J. y García X. (eds.). Fisiología. Células, órganos y sistemas, Unidad I. Fondo de Cultura Económica, México, D.F:, 1998. Š Nobak R.C. y Demarest R.J. El Sistema Nervioso: Introducción y Repaso. 4ª Ed. Interamericana McGraw-Hill. México, D.F., 1980. 26 PRÁCTICA No. 4 RECEPTORES SENSORIALES ACTIVIDADES Experimento 1. Receptores cutáneos. En este experimento se evaluará la importancia del vello corporal en la percepción de estímulos mecánicos aplicados sobre la piel. 1a) Seleccione dos áreas sobre la piel del dorso de la mano del sujeto, una con vello y otra sin él. Trace sobre cada área una cuadrícula con 25 subdivisiones de 4 mm2 (utilice el sello disponible en el almacén). 1b) Sin que el sujeto observe, aplique estímulos iguales con el estesiómetro sobre la cuadrícula en orden aleatorio, de modo que cada subdivisión sea tocada 2 veces. Registre el Estímulos percibidos Dorso de la mano c/ vello - después de rasurar número de estímulos percibidos por el sujeto en cada Dorso de la mano s/ vello región. 1c) Elimine el vello del área que lo tenía y repita la operación. Compare con áreas sin vello en el cuello y la parte alta de la Cuello Espalda espalda del mismo sujeto. Experimento 2. Capacidad de discriminación táctil. Capacidad de discriminación se refiere a la precisión con que los receptores de una región del cuerpo son capaces de reconocer o diferenciar un estímulo de otros semejantes. En este experimento se compararán las capacidades de discriminación de diferentes regiones de la piel. 2a) Sobre la piel de la espalda aplique dos estímulos mecánicos (las dos puntas de un compás) lo más cercanos posible uno del otro, y váyalos separando hasta que el sujeto perciba los dos estímulos. Registre la distancia mínima que deben tener las puntas para que el sujeto las perciba como dos estímulos diferentes. Distancia mínima (cm) Espalda Cuello Yema del dedo índice 2b) Obtenga y compare los valores correspondientes para regiones del Dorso de la mano cuello, la yema del dedo índice, el dorso de la mano y la cara Cara (cerca de los labios). I Experimento 3. Sensibilidad propioceptiva. La propiocepción se refiere a la formación de una imagen mental sobre la posición de los miembros en el espacio y de unos respecto a otros. Este experimento pretende poner de manifiesto la participación de la sensibilidad propioceptiva en la ejecución de un movimiento sencillo: juntar ambos dedos índice. Puesto que la vista juega un papel muy importante en el ajuste y la corrección del movimiento, se evitará la influencia visual. 27 Práctica 4. Receptores sensoriales  Estando el sujeto de pie, con los brazos ligeramente flexionados y Sujeto 1 los ojos cerrados, intentará juntar las puntas de sus dedos índice con un movimiento rápido. Registre el número de intentos Al frente necesarios para lograrlo, primero frente a sí y después por Arriba encima de su cabeza. Sujeto 2 a Experimento 4. Termorreceptores. 4a) Prepare 3 vasos conteniendo agua fría (10º C), agua caliente (37º C) o agua a temperatura ambiente. 4b) Introduzca los dedos índice uno en el agua fría y el otro en el agua caliente, y manténgalos así por un minuto. Registre las sensaciones percibidas. 4c) Retire ambos dedos e introdúzcalos en el agua de temperatura intermedia. Registre las sensaciones percibidas en cada mano.  ¿Cómo interviene la adaptación de los receptores en la percepción de la temperatura? N Experimento 5. Postimágenes. 5a) Utilice una tarjeta con cuadros de colores distintos (primarios). Registre la distribución que tienen los colores en la tarjeta. 5b) Fije la vista en el centro de la tarjeta y manténgala durante un minuto. Al cabo de este tiempo dirija la vista a una hoja blanca y registre la imagen percibida. ¿En qué es diferente esta imagen de la distribución de los colores en la tarjeta? ¿Cómo lo explica? 1 Experimento 6. Campo visual. La capacidad de percepción de formas y colores por el ojo depende de la distribución de las células sensibles a la luz en la retina. El campo visual es una representación del área en la que un ojo percibe un cierto color, y puede ser diferente entre individuos y de un ojo respecto al otro. Como actividad, construya la representación del campo visual de cada uno de los ojos de un sujeto. 6a) Pegue en la pared un pliego de papel bond en el que se haya trazado un plano cartesiano de 4 cuadrantes con divisiones a 45º y a 90º. Coloque al sujeto a 20 cm del plano y con la vista a la altura del centro de éste. 28 Práctica 4. Receptores sensoriales 6b) Mientras el sujeto se cubre un ojo y con el otro enfoca el centro del plano, acerque por cada una de las líneas una tarjeta de color y registre: 1. la distancia (del centro) a la que el sujeto percibe el movimiento de la tarjeta 2. la distancia a la que percibe el color de la tarjeta. Utilice alternativamente, al azar, las línea del plano y los colores de las tarjetas, hasta construir un mapa completo para cada uno de los siguientes colores: rojo, azul, amarillo y verde. Conteste: Š ¿Qué tipo de receptor percibe el movimiento y cuál el color? Š Cuando se percibe el movimiento de un objeto pero no su color ¿de qué color parece ser? Š Si la percepción del color depende de un tipo de receptor ¿por qué los campos visuales son diferentes para los distintos colores? ^ Experimento 7. Receptores gustativos. En mamíferos existen al menos cinco tipos de receptores gustativos, que responden a ciertas características químicas de los compuestos con los que entran en contacto. En la lengua de los humanos los diferentes tipos de receptores gustativos no se distribuyen al azar, sino siguiendo un patrón que, según se cree, podría estar moldeado adaptativamente. Este experimento tiene el propósito de mostrar el patrón de distribución de cuatro de los tipos de receptores gustativos en la lengua de los humanos. 7a) Identifique sobre la lengua del sujeto las cuatro regiones siguientes: 7b) Usando un hisopo de algodón, aplique en cada una de las regiones IV cada una de las siguientes soluciones: 1. bisulfato de quinina 0.25% 2. sacarosa 5% 3. ácido cítrico 2% 4. cloruro de sodio 2% III (estas soluciones le serán proporcionadas durante la práctica) II diferentes hábitos alimentarios y con fumadores. II I  Registre qué región es más sensible a cada uno de los sabores. Compare (dentro del grupo) con sujetos de III Sujeto Región 1 2 3 I II Tenga la precaución de enjuagar con agua y secar con gasa la lengua del sujeto antes de cada prueba. III IV Hábitos 29 Práctica 4. Receptores sensoriales 7c) Seque bien la lengua con gasa, coloque un cristal Sujeto de sacarosa sobre la región más sensible al sabor dulce y registre el tiempo que tarda el sujeto en Región percibir el sabor. Compare este valor con el tiempo I que tarda en percibirlo si la lengua está húmeda. II  ¿Cómo interviene la formación de soluciones III en la percepción de señales químicas por los IV 1 2 3 4 Hábitos receptores gustativos?  ¿Por qué es diferente de la percepción de señales químicas por el olfato? o Experimento 8. Umbral gustativo. El término umbral se refiere a la intensidad mínima que debe tener un estímulo para despertar una respuesta. En este experimento se determinará el umbral de los receptores a un sabor y se analizarán factores que podrían alterarlo.  Sobre la región de la lengua más sensible al sabor dulce, aplique con un hisopo las siguientes soluciones de sacarosa, comenzando con la más diluida: 0.03% 0.25% 0.062% 0.5% 0.125% 1% (estas soluciones le serán proporcionadas durante la práctica) 2% Registre la menor concentración a la que se percibe el sabor. Compare (dentro del grupo) con sujetos: 1. que gusten de los alimentos dulces 2. que gusten de las bebidas calientes 3. que fumen. ¿Qué concluye sobre los efectos de estos factores en el umbral de percepción del sabor dulce? Nuevamente cuide de enjuagar con agua y secar con gasa la lengua del sujeto antes de cada prueba. 30 Práctica 4. Receptores sensoriales Discuta sus resultados tomando en consideración los siguientes puntos: Í La función de los receptores sensoriales como parte de los mecanismos de control. Í El concepto de propiocepción y las características que la distinguen de las demás modalidades sensoriales. Í Los conceptos de unidad sensorial, campo sensorial y homúnculo sensorial. Í Los procesos que permiten la codificación de la información sensorial en el tejido nervioso. Í Los mecanismos de adaptación de los receptores sensoriales. Í Las observaciones particulares de cada experimento. Material necesario (por equipo): 9 1 rasuradora desechable (personal; llevarla al laboratorio el día de la práctica) 9 2 planos cartesianos trazados en pliegos de papel bond (llevarlos al laboratorio el día de la práctica) 9 1 regla escolar de 30 cm (personal; llevarla al laboratorio el día de la práctica) 9 1 estesiómetro 9 1 compás 9 1 termómetro de laboratorio 9 1 juego de tarjetas de colores 9 6 vasos de precipitados de 50 ml 9 1 cronómetro. Bibliografía sugerida: Š Carpenter S.H. Neurofisiología. Manual Moderno. México, D.F., 1996. Š Ganong F.W. Fisiología Médica. 17a Ed. Manual Moderno, México, D.F., 2000. Š Kandel E.R., Schwartz J.H. y Jessell T.M. Neurociencia y Conducta. Prentice Hall, Madrid, 1997. Š Noback R.C. Demarest R.J. El Sistema Nervioso: Introducción y Repaso. 4ª Ed. Interamericana McGraw-Hill. México, D.F., 1980. 31 PRÁCTICA No. 5 SINAPSIS NEUROMUSCULAR En los vertebrados y otros organismos el movimiento de las extremidades y el desplazamiento del cuerpo dependen de un tipo particular de tejido contráctil, el músculo esquelético. Al igual que el tejido nervioso, el tejido muscular es excitable (es decir, que su membrana es capaz de invertir momentáneamente su potencial para luego recuperar su estado inicial), y este cambio de potencial de la membrana (potencial de acción) es la señal que desencadena la contracción de los filamentos. Como es lógico suponer, la actividad del músculo esquelético es voluntaria, es decir que se origina en el sistema nervioso central y es transmitida al músculo a través de fibras nerviosas. Es por esto que la actividad del músculo esquelético es considerada neurogénica, en contraste con la actividad espontánea (miogénica) presente en otros tipos de músculo. La estructura física en la que un nervio estimula la célula muscular esquelética es conocida como unión neuromuscular o placa motora. En esta estructura las membranas de las dos células (nerviosa y muscular) no están en contacto directo, sino separadas por una hendidura sináptica de alrededor de 30 nm de anchura. El estímulo pasa del nervio al músculo en forma de un mensajero químico o neurotransmisor, la acetilcolina (ACh), que es liberada por el botón sináptico de la célula nerviosa y difunde libremente en la hendidura sináptica. Eventualmente la ACh entra en contacto con los receptores específicos presentes en la membrana de la célula muscular. Estos receptores (conocidos como receptores colinérgicos de tipo nicotínico) son canales iónicos dependientes de ligando, es decir, son complejos proteicos que atraviesan la membrana y que, al entrar en contacto con una molécula específica (ligando), abren un poro que permite el paso de diversos iones. Al abrirse el poro del canal nicotínico, iones Na+ entran a la célula mientras que iones K+ salen de ella, impulsados por sus gradientes respectivos. Puesto que entran más cargas positivas (Na+) que las que salen (K+), la membrana muscular tiende a despolarizarse con una intensidad que depende del número de canales activados y de la cantidad de ACh liberada. Esta despolarización graduada recibe el nombre de potencial de placa terminal (PPT). Note que la región de la placa motora no tiene canales dependientes de voltaje y, por lo tanto, no genera potenciales de acción, sino potenciales graduados, que van reduciéndose con la distancia. Sin embargo, las cargas positivas que entraron a la célula en este punto se dispersan en todas direcciones y pueden alcanzar los canales dependientes de voltaje situados en las regiones vecinas a la placa. Si la despolarización graduada es suficientemente intensa, se generan potenciales de acción que se propagan por toda la membrana de la célula muscular y desencadenan la contracción. El receptor nicotínico para acetilcolina (tomado de Kandel et al., 1997) 32 Práctica 5. Sinapsis neuromuscular Vesículas Vesículas de de acetilcolina acetilcolina Hendidura sináptica impulso nervioso Célula nerviosa Ca++ Unión neuromuscular. El impulso nervioso (1) induce la apertura de canales dependientes de voltaje para iones calcio (2), y la entrada de éste permite la fusión de las vesículas de acetilcolina con la membrana presináptica, y la expulsión del neurotransmisor (3). La ACh difunde libremente en la hendidura sináptica y alcanza y estimula los receptores nicotínicos (4). La ACh es inactivada por la enzima acetilcolinesterasa, presente en la hendidura sináptica. Adaptado de Karp, 1996. acetil colinesterasa Célula muscular Los experimentos que se proponen tienen como objetivo poner de manifiesto diferentes características del mecanismo de activación del músculo esquelético y de la placa neuromuscular. Para ello se empleará la preparación ciático-gastrocnemio practicada en rata. El gastrocnemio es uno de los músculos superficiales más grandes de la cara posterior (caudal) de la pata de la rata. Está formado por dos grupos de fibras, el medial y el lateral, que se extienden paralelos desde la articulación de la rodilla hasta el talón. Es homólogo de los gemelos en los humanos. El ciático (o ischiadicus) es un haz nervioso grueso, formado por varios nervios que van del plexo sacro (junto a la columna vertebral, a nivel L-IV) a diferentes músculos en las porciones proximal y distal de la pata, incluido el gastrocnemio. La preparación ciáticogastrocnemio permite estudiar la respuesta del músculo cuando se estimula el nervio que hace sinapsis con él. ACTIVIDADES 1. Preparación ciático-gastrocnemio. Observe la figura. En esta preparación se sujeta un extremo del músculo gastrocnemio y se le conecta a un transductor de fuerza. El transductor transforma la fuerza recibida en señales eléctricas que son amplificadas, interpretadas y graficadas por un analizador (dispositivo de registro). Por otro lado, se coloca un par de electrodos de estimulación directamente sobre el nervio ciático, de modo que la estimulación eléctrica de éste inducirá la contracción del gastrocnemio. 33 Práctica 5. Sinapsis neuromuscular La respuesta que se mide en el dispositivo de registro es la fuerza de contracción del músculo, y las variables pueden ser las condiciones de estimulación (intensidad, duración, frecuencia) o la presencia de drogas que modifican la conductividad en la sinapsis o el proceso de contracción muscular. Tome la figura, estímulos vertical, y en consideración que el ‘movimiento’ de un músculo consiste sólo en su acortamiento. En el modelo de el músculo produce movimiento horizontal, pero el transductor está diseñado para responder a aplicados en sentido vertical. La polea tiene la finalidad de transformar el movimiento horizontal en mejorar así la sensibilidad del sistema de registro. 1a) Utilice ratas de más de 300 g de peso, de género indistinto. Anestesie al animal con una inyección intraperitoneal de 35 mg/kg de pentobarbital sódico. Para acelerar la absorción puede agregar 0.2 - 0.4 ml de solución salina. Esta dosis mantiene al animal anestesiado por cerca de una hora. 1b) Fije, estirada, una de las patas posteriores y corte la piel hasta descubrir toda la cara posterior, desde el muslo hasta el talón. 1c) Localice el gastrocnemio y el tendón que lo une al talón. Con hilo grueso amarre firmemente el tendón y sepárelo de su unión al hueso (utilice un trozo largo de hilo ―unos 30 cm―, pues le servirá después para unirlo al transductor). 1d) Levantando el tendón, separe el gastrocnemio de los demás músculos de la pierna, pero sólo a lo largo de la parte distal del músculo (la mitad de su longitud, aproximadamente). No fije aún el hilo al transductor. Para hallar el nervio ciático: 1e) Con unas pinzas gruesas levante el músculo glúteo mayor (gluteus maximus) y haga un corte pequeño en su parte media. Introduzca las dos puntas de unas tijeras y, separándolas, fuerce el corte para hacer una abertura mayor. Esto reduce el daño al tejido. Cuide de no lesionar los tejidos situados por abajo del músculo glúteo. 1f) Aplique iluminación suficiente y, empleando los manipuladores de vidrio, localice el nervio ciático a través de la abertura. Considere que el nervio va de la columna vertebral a la pata, y que es bastante grueso (lo verá como un cordón amarillo pálido de alrededor de 2 mm de grueso). No toque el nervio con instrumentos metálicos, sólo de vidrio. 1g) Con los manipuladores de vidrio levante cuidadosamente el nervio y haga pasar por abajo, rodeándolo, la funda de los electrodos, como se observa en la figura. 1h) Coloque los electrodos dentro de la funda y en contacto directo con el nervio. Esto permitirá aplicar descargas eléctricas en el nervio sin que el estímulo pase a otros tejidos. 1i) Conecte las terminales de los electrodos a las salidas del estimulador. N 1j) Utilizando pesas de valor conocido (se recomienda usar 10 g), calibre el sistema de registro para obtener las mediciones en gramos fuerza. 1k) Sujete el hilo del gastrocnemio al transductor (haga un amarre que pueda deshacer fácilmente), acomode las poleas que sean necesarias y tense el hilo moderadamente. 34 Práctica 5. Sinapsis neuromuscular 2. Estímulo umbral y respuesta máxima. 2a) En el estimulador elija una duración de estímulo de 0.2 ms e intensidad muy baja. Aplique estímulos únicos aumentando gradualmente la intensidad, hasta obtener la respuesta de contracción (“sacudida simple”). Registre la intensidad umbral. 2b) Aplique estímulos supraumbrales cada vez más intensos, y observe el aumento gradual en la fuerza de contracción. Encuentre y registre la intensidad del estímulo que produce la máxima respuesta del músculo. 8 Conteste lo siguiente: Í Si en la preparación se estimula el nervio y se mide la respuesta del músculo, y si ambos tejidos tienen canales dependientes de voltaje y, por lo tanto, un voltaje umbral ¿a cuál de ellos corresponde el estímulo umbral que se determinó? Í Si la célula muscular produce potenciales de acción, y si los potenciales de acción son idénticos entre sí ¿por qué aumenta la intensidad de la contracción al aumentar la intensidad del estímulo? (tome en cuenta que se aplicaron estímulos únicos de duración corta). Í ¿Qué sucede durante la respuesta máxima, y por qué no puede ser más intensa? M 3. Sumación de contracciones (tétanos). El potencial de acción de la membrana muscular es relativamente breve (dura sólo algunos milisegundos, incluido su periodo refractario). En comparación con éste, la contracción de las miofibrillas se inicia con retardo, aumenta más lentamente y se mantiene por más tiempo, además de que no tiene periodo refractario. Como consecuencia, el potencial de acción en la membrana termina antes de que haya terminado la contracción que indujo, y la membrana se recupera del periodo refractario antes de que la fibra se relaje completamente. Si se estimula la membrana con frecuencia alta, se puede inducir una nueva contracción cuando la anterior no ha terminado aún, y el resultado es que ambas se suman. El tétanos es la condición en la que el músculo se mantiene contraído completamente durante un periodo prolongado, por efecto de la estimulación eléctrica de frecuencia alta. 3a) Seleccione una intensidad de estimulación para producir una respuesta submáxima (por encima del umbral, pero sin llegar a la máxima). 3b) Con esta intensidad, aplique estimulación continua con frecuencia baja (0.1 a 0.5 Hz) y registre. 3c) Sin detener el registro, aumente gradualmente la frecuencia de estimulación hasta llegar a 100 Hz, y observe la respuesta. Í Si la respuesta máxima representa la máxima intensidad con la que se puede contraer una fibra ¿por qué durante el tétanos el músculo puede desarrollar bastante más fuerza? 35 Práctica 5. Sinapsis neuromuscular Í ¿Cuál es la diferencia entre el potencial de acción y el mecanismo de contracción que permite que este último no tenga periodo refractario? Í ¿Cómo podría modificarse el mecanismo de excitación/contracción del músculo para evitar que las contracciones se sumaran? e 4. Acetilcolina / acetilcolinesterasa. Después de transmitir la señal, la acetilcolina (ACh) liberada al espacio sináptico continuaría activando los canales postsinápticos de no ser por dos mecanismos que detienen su acción: la difusión simple fuera de la zona de la sinapsis y la hidrólisis que sufre por acción de la enzima acetilcolinesterasa, presente en todo momento en el espacio sináptico. Algunos fármacos derivados del carbamato, como la fisostigmina y la neostigmina, tienen una estructura química que es de algún modo similar a la ACh y se unen al sitio activo de la enzima pero se hidrolizan a una velocidad mucho menor (incluso horas), lo que inhabilita temporalmente a la enzima y retarda la degradación de la ACh. En este experimento se evaluará el efecto del bloqueo de la acetilcolinesterasa sobre la fuerza de contracción del músculo. 4a) Prepare una jeringa con 0.1 ml de solución de fisostigmina (1.5 mg/ml) y otra con 0.1 ml de solución de ACh (0.0001%). 4b) Haga un registro basal: aplique estímulos ligeramente supraumbrales (duración de 0.2 ms) en la modalidad de estimulación continua, con frecuencia de 1 Hz (esto es, 1 estím/seg). Registre al menos durante 15 segundos. 4c) Sin dejar de registrar detenga la estimulación e inyecte 0.1 ml de fisostigmina en la región de la placa neuromuscular (esto es, la parte media de la masa del músculo); observe la reacción durante los siguientes 30 segundos. 4d) Todavía sin estimular inyecte 0.1 ml de ACh en la misma zona y observe la reacción durante 30 segundos. 4e) Por último, restituya la estimulación continua y compare la amplitud de la contracción con las del periodo basal. Í ¿Cuál es el efecto de la administración de fisostigmina sobre la fuerza de contracción? ¿Cómo lo explica? Í 36 ¿Cómo modifica la fisostigmina el efecto de la ACh cuando hay y cuando no hay estimulación? Práctica 5. Sinapsis neuromuscular 5. Receptores colinérgicos. El receptor nicotínico, que causa la despolarización de la membrana muscular en la región de la placa motora, tiene un sitio de unión específico para ACh. Aparentemente, el reconocimiento está basado en la presencia de un grupo amino cuaternario en la molécula. Otras sustancias que contengan este grupo pueden unirse a este sitio y bloquear el receptor, sin estimularlo. Tal es el caso de la tubocurarina, que es un alcaloide contenido en el curare, un extracto vegetal (de Strychnos toxifera) empleado por los nativos del Amazonas en sus actividades de caza. En este experimento se analizará la respuesta del músculo a la administración de tubocurarina. 5a) Haga un registro basal con estimulación continua de 1 Hz e intensidad supraumbral (el periodo final de estimulación del experimento anterior puede funcionar como registro basal para éste). 5b) Sin detener la estimulación ni el registro inyecte 0.1 ml de solución de tubocurarina de la menor concentración (10 μg/ml) en la región cercana a la placa motora y observe la respuesta durante 1 minuto. 5c) Sin modificar las condiciones, inyecte ahora el mismo volumen de la concentración siguiente (20 μg/ml) y observe durante 2 minutos. Si no observa efecto sobre la contracción, administre la concentración más alta (50 μg/ml) y observe nuevamente. 5d) Por último, y sin detener todavía el registro ni la estimulación, inyecte en la misma zona 0.1 ml de ACh. Registre durante 30 a 60 segundos más. Í ¿Qué efecto tiene sobre la contracción del músculo la administración de un bloqueador de canales nicotínicos? ¿Cómo lo explica? Í ¿Cómo se modifica este efecto por la aplicación de ACh? 6. Fatiga muscular. Durante la actividad prolongada, la eficiencia de la contracción del músculo se reduce gradualmente, a causa de diversos factores. En este experimento se analizará la importancia de la irrigación sanguínea en la prevención de la fatiga muscular. 6a) Si el número de su equipo es par, anude fuertemente un cordón grueso alrededor de la pata de la rata, tan cercano al tronco como sea posible. Aplique estimulación supraumbral continua a 1 Hz y registre los cambios en amplitud de la contracción durante los siguientes 10 minutos. Si su equipo tiene número non, estimule en las mismas condiciones pero sin amarrar la pata de la rata, y registre de la misma manera. 6b) Reúna los datos de los registros con y sin amarre y compárelos. Í ¿Cómo participa la irrigación sanguínea en la contracción del músculo? (considere tanto entrada como salida de sustancias) Í ¿Qué efecto tiene la interrupción del flujo sanguíneo en la eficiencia de la contracción? ¿El efecto es significativo? ¿Cómo lo explica? 37 Práctica 5. Sinapsis neuromuscular 1 Por último, sacrifique a la rata por exceso de anestesia (aplique una inyección intraperitoneal de más de 100 mg/kg de pentobarbital sódico). Reporte sus resultados haciendo una descripción y anexando segmentos representativos del registro, junto con los valores encontrados y los pies de figura correspondientes. Discuta los resultados de cada actividad tomando como base las respuestas que dio al final de los experimentos. No olvide citar sus fuentes de información. M Material necesario (por equipo): 9 1 ESTUCHE DE DISECCIÓN (prop. personal) 9 polea simple 9 1 diskette 3.5’’ nuevo (prop. personal) 9 1 soporte con base de media luna 9 1 aguja de costura (prop. personal) 9 1 cronómetro 9 2 pinzas dobles 9 1 juego de electrodos 9 2 disectores de vidrio 9 1 estimulador SMI con cables 9 2 tablas de disección 9 1 vaso de precipitados de 50 ml 9 1 caja con tapa para rata 9 3 jeringas insulínicas Material por grupo (le será proporcionado al momento de la práctica): • algodón • solución salina fisiológica (NaCl 0.9%) • hilo grueso • solución de pentobarbital sódico (se le indicará la concentración) • hilo de costura 1 solución de acetilcolina 0.0001% (1:10000) 1 solución de fisostigmina o neostigmina 1.5 mg/ml 1 soluciones de curare 50, 100 y 200 μg/ml • cordón • transductor de fuerza • sistema de registro Bibliografía sugerida: Š Carpenter S.H. Neurofisiología. El Manual Moderno. México, D.F., 1996. Š Kandel E.R., Schwartz J.H. y Jessell T.M. Neurociencia y Conducta. Prentice Hall, Madrid, 1997. Š Karp G. Cell and Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1996. Š Katzung B.G. Farmacología Básica y Clínica, 6ª ed. El Manual moderno, México, D.F., 1996. 38 PRÁCTICA No. 6 MENSAJEROS QUÍMICOS La comunicación a distancia entre células, es decir, el envío de mensajes entre regiones diferentes del organismo, se da por dos diferentes mecanismos: por transmisión nerviosa (despolarizaciones a través de un cableado axónico) o por comunicación hormonal (sustancias químicas transportadas de un sitio a otro por el torrente sanguíneo). En ambos mecanismos, incluso en la transmisión nerviosa, el mensaje que se está transmitiendo toma en algún momento la forma de una molécula química –mensajero– que atraviesa un cierto espacio y estimula a la célula receptora. Para poder captar el mensaje, la célula blanco debe poseer receptores específicos para el mensajero, que son complejos proteicos capaces de reconocer cierta porción de la estructura química de éste y activar alguna respuesta dentro de la célula. La respuesta de la célula depende de los procesos intracelulares a los que esté acoplado el receptor (por ejemplo, el mensajero puede inducir la despolarización de la célula, o desencadenar la hidrólisis de glucosa o de triglicéridos, o activar la síntesis de alguna otra proteína, una enzima, un canal, un transportador, otro receptor, etc.). De este modo, aunque la célula entre en contacto con una gran diversidad de mensajeros, ésta responderá sólo a aquellos para los que tiene receptores específicos, y esto activará solamente algunos procesos particulares. En el caso concreto del intestino de mamíferos, la actividad de contracción (peristaltismo) está controlada, en primera instancia, por células marcapasos y por una red neuronal (plexo mientérico) incluidas dentro de la pared del órgano, lo que permite que las células musculares se despolaricen y se contraigan rítmicamente sin necesidad de estimulación externa. Sin embargo, esta actividad intrínseca está sujeta a modulación por mensajeros provenientes de otras regiones (neurotransmisores u hormonas). De estos mensajeros, sobresalen por su importancia los que producen la rama simpática (noradrenalina/adrenalina) y la rama parasimpática (acetilcolina) del sistema nervioso autónomo. Así, las células de músculo liso de la pared intestinal poseen en su membrana receptores adrenérgicos (específicos para noradrenalina/adrenalina) de tipos tanto α como β, y receptores colinérgicos (sensibles a acetilcolina) de tipo muscarínico, principalmente M3. En el músculo liso, los receptores adrenérgicos activan la síntesis de AMPc o de IP3/DAG, y ambas cascadas pueden estimular la entrada de Ca++ al citoplasma. La presencia de Ca++ favorece la interacción actina-miosina y por lo tanto aumenta la fuerza de contracción muscular, pero en el músculo liso gastrointestinal, además, activa canales de K+ dependientes de Ca++ (que están ausentes en otros tipos de músculo), con lo cual la célula se hiperpolariza y detiene su actividad contráctil. Por otro lado, los receptores colinérgicos M3 inhiben directamente la síntesis de AMPc y, por lo tanto, tienen un efecto anti-adrenérgico. Los experimentos que se proponen aquí tienen como propósito simular el efecto de la estimulación simpática y parasimpática (a través de la administración de sus mensajeros) sobre la actividad de contracción del músculo liso intestinal, y registrar los efectos en cada caso. Además, se analizarán algunas otras características del proceso contráctil del músculo liso. 39 Práctica 6. Mensajeros químicos ACTIVIDADES 1. Montaje de la preparación. La contracción del músculo liso intestinal requiere el mantenimiento de condiciones óptimas de pH, concentración de electrolitos, disponibilidad de nutrientes, disponibilidad de oxígeno y temperatura. Por lo tanto, los valores adecuados de estas variables deberán se mantenidos cuidadosamente a lo largo de la práctica. Las concentraciones de electrolitos y combustibles serán aseguradas mediante el empleo de una solución de composición y pH controlados (solución Tyrode), que le será proporcionada. Ud. deberá aplicar aireación constante y mantener la temperatura de la solución tyrode en 37º C. Para facilitar el control de la temperatura se utilizará un sistema de baño maría. 1a) Llene con agua de la llave el contenedor de acrílico y monte dentro de él un soporte de media luna sosteniendo la cámara de órgano aislado, como se muestra en la figura. La manguera de drenaje de la cámara deberá llevar el líquido fuera del baño. 1b) Encienda el calentador eléctrico y, con un termómetro, verifique que la temperatura del agua se mantenga en 37º C. Encienda y apague el calentador según se requiera. 1c) Prepare un dispensador de Tyrode con un matraz Erlenmeyer, un tapón horadado y dos tubos de vidrio. Al aplicar aire a presión por uno de los tubos (por ejemplo, soplando), la solución saldrá por el otro. Llene al dispensador con solución Tyrode fresca y sumérjalo en el baño maría para mantenerlo a la temperatura adecuada. 1d) Con una pinza Mohr cierre la manguera de drenaje de la cámara y llene ésta con Tyrode. Conecte la manguera de aireación de la cámara a la bomba de aire y ajuste el flujo para tener 2 burbujas/segundo, aproximadamente. 1e) Fije el transductor de fuerza (tensión) por encima de la cámara de vidrio; conéctelo al sistema de registro y calíbrelo con alta sensibilidad (no más de 5 g). u 1f) Sacrifique un conejo por dislocación cervical. Corte inmediatamente la pared abdominal y localice la porción Al sacrificar el conejo, extraiga un fragmento duodenal del intestino. Extraiga un segmento de 20 a 30 grande de intestino delgado y manténgalo cm de longitud y colóquelo en un vaso con Tyrode aireado sumergido en sol. Tyrode CON AIREACIÓN (la temperatura no es crítica en este caso). 40 IMPORTANTE durante toda la práctica. Práctica 6. Mensajeros químicos 1g) Corte un fragmento de intestino de 1 cm de longitud y límpielo de la grasa y del contenido en una caja de Petri con Tyrode aireado. 1h) Con ayuda de una aguja de costura perfore los extremos del fragmento y fije en cada uno un trozo largo de hilo delgado. Procure que los amarres queden en línea uno con el otro, como se muestra en la figura. 1i) Monte el fragmento de intestino en la cámara de órgano aislado, como sigue: amarre uno de los hilos a la varilla inferior, de modo que quede lo más corto posible. Haga salir el otro hilo a través del orificio superior y sujételo al transductor. Tense cuidadosamente el hilo. Cuide que este hilo no roce con otro objeto en ningún punto. Disposición final del sistema de registro 2. Estimulación simpática. 2a) Realice un registro basal de las contracciones, durante al menos 30 segundos. 2b) Sin detener el registro, aplique 1 gota de solución de adrenalina (100 μg/ml) en el líquido dentro de la cámara de vidrio, y registre durante 30 a 60 segundos. 2c) Detenga el registro y lave 2 veces el tejido, drenando el líquido de la cámara y sustituyéndolo con Tyrode fresco del dispensador. Después de lavar observe la respuesta de contracción. Lave nuevamente si es necesario. 2d) En el registro determine la frecuencia (ondas/minuto) y la amplitud (gramos fuerza) de las ondas de contracción y el tono del músculo en el periodo de acción de la adrenalina, y compárelo con las mediciones correspondientes del periodo basal y después del lavado. 3. Estimulación parasimpática. 3a) Realice un registro basal de las contracciones, durante al menos 30 segundos. 3b) Sin detener el registro aplique una gota de solución de acetilcolina (100 μg/ml) en la cámara y registre. Finalmente detenga el registro y lave al menos 2 veces. 3c) Determine el efecto de la acetilcolina sobre la frecuencia, la amplitud y el tono de la contracción muscular comparando las mediciones con los periodos basal y después del lavado. 41 Práctica 6. Mensajeros químicos 8 Conteste lo siguiente: Í ¿Qué diferencias importantes encuentra entre la contracción del músculo liso y la del músculo esquelético (recuerde la práctica de sinapsis neuromuscular)? Í ¿Cómo explica el hecho de que un fragmento de intestino, sin nervios que lo estimulen, se contraiga rítmicamente? Í ¿Qué es y de qué depende el tono del músculo liso? Í ¿Cuál es el efecto de la adrenalina y la acetilcolina sobre la frecuencia y la fuerza (amplitud) de las contracciones rítmicas del músculo intestinal? ¿Cómo explica esto? e 4. Receptores muscarínicos. 4a) Realice un registro basal de las contracciones, durante al menos 30 segundos. 4b) Sin detener el registro aplique dentro de la cámara una gota de solución de atropina (1 mg/ml) y observe durante 30 a 60 segundos. 4c) Lave 2 veces y realice un registro basal. 4d) Sin detener el registro, aplique 1 gota de acetilcolina y después de 30 segundos agregue 1 gota de atropina, y observe durante 30-60 segundos. Al terminar lave 2 veces. 4e) Determine el efecto de la acetilcolina en la actividad contráctil (compare la frecuencia, amplitud y tono vs. el periodo basal) y describa enseguida cómo se modifica este efecto por adición de atropina. Por último, describa los efectos de la atropina sola, sin adición de acetilcolina. conteste: Í ¿Qué efecto tiene la atropina sobre la frecuencia y la amplitud de las contracciones inducidas por la acetilcolina? ¿Cómo lo explica? Í Si la atropina solamente bloquea el efecto de la acetilcolina ¿Cómo explica el hecho de que la administración de atropina sola, sin acetilcolina, altere las contracciones basales? Í ¿Por qué empleó la atropina en combinación con la acetilcolina y no con la adrenalina? Í El tubo digestivo es capaz de actividad endógena y sin embargo tiene receptores para los mensajeros del sistema nervioso autónomo. ¿Qué papel juega la inervación autonómica en la actividad intestinal? 42 Práctica 6. Mensajeros químicos 5. Efecto de la hipoxia. 5a) Realice un registro basal de las contracciones, durante 10 segundos. 5b) Sin detener el registro interrumpa la aireación de la cámara. Observe cuidadosamente las contracciones hasta que vea un descenso evidente en la amplitud. Apague el registro, restituya la aireación y manténgalo hasta que se recupere la fuerza de contracción basal. 5c) Determine el efecto de la aireación comparando las características de la contracción (frecuencia, amplitud, tono) entre el periodo basal, el momento de mayor afectación y la recuperación total. A 6. Efecto de la temperatura. 6a) Coloque una pequeña cantidad de Tyrode (alrededor de 50 ml) en un baño de hielo. 6b) Realice un registro basal de las contracciones, durante 20 segundos. 6c) Drene una buena parte del tyrode de la cámara y sustitúyalo con el Tyrode frío. Registre inmediatamente la temperatura dentro de la cámara. 6d) Registre las contracciones hasta que la temperatura de la cámara alcance nuevamente los 37º C. Describa las modificaciones graduales en la actividad contráctil de acuerdo con la temperatura. 8 Conteste lo siguiente: Í ¿Qué efecto tiene la hipoxia sobre la frecuencia y la amplitud de las contracciones? ¿Cómo lo explica? Í ¿Por qué el músculo liso no trabaja en condiciones anaeróbicas, como otros tipos de músculo? ¿Qué importancia tiene esto en su papel fisiológico? Í ¿Qué efecto tiene la temperatura (frío y calor) sobre la actividad contráctil del músculo liso? ¿Cómo lo explica? I 7. Efecto de la tensión. 7a) Haga un registro basal durante 30 segundos. 7b) Detenga el registro y desplace el transductor hacia arriba, de manera que se tense más el hilo y el fragmento de intestino se alargue 50-100%. 7c) Registre las contracciones durante 30 a 60 segundos. Describa cómo se afecta la contracción (amplitud y frecuencia) por al aumento de la tensión y cómo responde a esto el músculo. 43 Práctica 6. Mensajeros químicos conteste: Í El músculo estriado muestra una relación estrecha entre la longitud de la fibra y la fuerza que desarrolla (su curva longitud-tensión tiene forma aproximada de una campana) ¿Cómo es la relación longitud-tensión para el músculo liso? ¿Cómo explica esto? Í ¿Qué importancia tiene esto en el papel fisiológico del músculo de la pared de los órganos huecos? ) Para reportar incluya una descripción de los resultados, junto con segmentos representativos del registro de cada actividad, los valores descriptivos (frecuencia y amplitud de las contracciones) y los pies de figura correspondientes. De ser posible aplique una prueba estadística (pero recuerde que la muestra de ser representativa de la población estadística). Discuta sus resultados tomando como base las respuestas a las preguntas planteadas. No olvide citar sus fuentes de información. Material necesario (por equipo): 9 1 ESTUCHE DE DISECCIÓN (prop. personal) 9 1 termómetro industrial 9 1 diskette 3.5’’ nuevo (prop. personal) 9 1 resistencia (calentador) 9 1 aguja de costura (prop. personal) 9 1 vaso de precipitados de 100 ml 9 1 cámara de órgano aislado 9 1 vaso de precipitados de 250 ml 9 1 pinza Mohr 9 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml con tapón, tubos de vidrio y mangueras 9 1 pinzas para refrigerante 9 1 bomba de aireación 9 2 pinzas dobles 9 1 caja de Petri 9 1 contenedor de acrílico 9 3 pipetas Pasteur con bulbo 9 1 soporte con base de media luna Material por grupo (le será proporcionado al momento de la práctica): • hilo de algodón 1 solución de adrenalina 100 μg/ml en salina (1:10000) • transductor de fuerza 1 solución de acetilcolina 100 μg/ml en salina (1:10000) • sistema de registro • solución Tyrode 1 solución de atropina 1 mg/ml en salina (1:1000) • 1 conejo con ayuno de 24 horas 44 Práctica 6. Mensajeros químicos Composición de la sol. Tyrode (g/L): NaCl 8 KCl 0.2 CaCl2 anh. MgCl2 0.24 0.01-0.05 NaHPO4 0.05 NaHCO3 1 Dextrosa 1 pH: 7.2 - 7.4 Bibliografía sugerida: Š Eckert R y Randall D. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. Interamericana-McGraw Hill, 1989. Š Ganong F.W. Fisiología Médica. 17a Ed. El Manual moderno, México, D.F., 2000. Š Goodman L., Limbird L., Milinoff P., Ruddon R., Gilman A., Hardman J. (eds.). Goodman & Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a ed. McGraw-Hill, E.U.A., 1996. Š Katzung B.G. (ed.). Farmacología Básica y Clínica, 6ª ed. El Manual moderno, México, D.F., 1996. 45 PRÁCTICA No. 7 REGULACIÓN DE LA PRESIÓN ARTERIAL En los organismos con sistema circulatorio cerrado, la fuerza que propulsa la sangre por el sistema de conductos proviene esencialmente del trabajo del corazón. Esta fuerza permite el avance del líquido a lo largo de los vasos, pero también su salida hacia el espacio intercelular. Es este cambio continuo de líquido lo que permite que las células mantengan el intercambio de compuestos entre su medio interno y el líquido extracelular. Como otras variables, el flujo de la sangre dentro de los vasos puede cambiar por efecto de perturbaciones, principalmente por cambios en la fuerza de propulsión o en la resistencia de los vasos sanguíneos al flujo. Una manera de asegurar que el flujo de sangre sea continuo es mantener constante el valor de la presión arterial, como una variable regulada. La disposición de los sistemas circulatorios cerrados permite ejercer control directo sobre la resistencia de los vasos (resistencia periférica) y sobre el trabajo del corazón (gasto cardiaco), con lo que se corrigen las variaciones en la presión arterial. De este modo, condiciones fisiológicas diversas como el reposo, la actividad física, la situaciones de alarma, el periodo postprandial o simples cambios de postura inducen cambios transitorios en la circulación que son compensados rápidamente mediante cambios en la actividad de contracción del músculo cardiaco y mediante cambios en el calibre de los vasos sanguíneos, tanto arteriales como venosos. En los mamíferos, la actividad cardiaca y el diámetro vascular son controlados mediante estimulación de las ramas simpática (noradrenalina, adrenalina) y parasimpática (acetilcolina) del sistema nervioso autónomo. A su vez, estas eferencias son activadas en la formación reticular del bulbo raquídeo y la protuberancia, en dos grupos neuronales poco delimitados conocidos como región presora (su activación eleva la presión sanguínea) y región depresora (su activación reduce la presión). Estos centros corrigen las variaciones de la presión que son percibidos y enviados a ellos por una serie de receptores periféricos, entre los que destacan los barorreceptores del seno carotídeo y los del arco aórtico, situados en las paredes de arterias importantes. La conexión funcional de estos receptores en particular con los centros presor y depresor, y de éstos con las eferencias autonómicas al corazón y los vasos, forma el llamado reflejo barorreceptor. ACTIVIDADES 1. Efecto de la postura corporal sobre la presión arterial El flujo de sangre a lo largo de los vasos es relativamente rápido si el líquido se mueve entre dos puntos situados a la misma altura, pero requerirá mayor fuerza de propulsión si el líquido debe ascender, venciendo su propio peso, a un punto de mayor altura. Por lo tanto, la orientación de los vasos sanguíneos principales (horizontal o vertical) de una persona puede inducir diferencias en el flujo de sangre a través de ellos y, como consecuencia, diferencias en la fuerza de propulsión que se requiere. En este experimento se determinará si la posición del cuerpo (orientación horizontal o vertical del flujo) modifica de algún modo la presión arterial de un individuo, y si esto afecta el trabajo cardiaco. 46 Práctica 7. Presión arterial 1a) Elija a una persona de su equipo. Manténgala de pie durante al menos 2 minutos y mida su presión arterial (presiones sistólica y diastólica) y su frecuencia cardiaca. Mida también la frecuencia cardiaca tomando el pulso de la persona, tal como lo hizo en la práctica número 1. 1 Para medir la presión arterial utilice el método auscultatorio: a) coloque el brazalete alrededor del brazo izquierdo de la persona, ligeramente por encima del codo. Coloque la membrana del estetoscopio por abajo del brazalete, contra la piel de la cara interna del brazo. b) Cierre la válvula de la bomba y llene el brazalete hasta que la presión del aire sobrepase los 150 mmHg. c) Abra levemente la válvula de manera que el aire del brazalete escape y la presión disminuya lentamente. d) Escuche atentamente; en cuanto detecte el flujo de sangre en la arteria del brazo registre la presión del brazalete. Éste es el valor de la presión sistólica. e) Continúe escuchando mientras la presión disminuye. La intensidad de los sonidos deberá aumentar y disminuir después. En cuanto desaparezcan los sonidos registre la presión del brazalete. Éste es la valor de la presión diastólica. f) Calcule la presión media como el promedio de la presión arterial durante todo el ciclo cardiaco, es decir, sumando dos veces el valor de la presión diastólica y una vez el de la sistólica, y dividendo esta cifra entre tres. 1b) Haga a la persona sentarse y, después de al menos 2 minutos, registre sus presiones sistólica y diastólica y su frecuencia cardiaca. 1c) Haga a la persona acostarse sobre una mesa y repita las mediciones después de al menos dos minutos. 1d) Reúna en una tabla los datos de al menos 5 personas y deles tratamiento estadístico para determinar si la postura corporal (parado, sentado o acostado) modifica la presión arterial y la frecuencia cardiaca de las personas. Como sugerencia, aplique una prueba de análisis de varianza unifactorial y, en su caso, una prueba post hoc. Parado Presión (mmHg) EQUIPO Diast. Sist. Media Sentado Frec. Card. Presión (mmHg) Diast. Sist. Media Acostado Frec. Card. Presión (mmHg) Diast. Sist. Media Frec. Card. 1 2 3 4 5 6 47 Práctica 7. Presión arterial 1 Conteste lo siguiente: Í Í ¿Alguna postura induce valores de presión más altos o más bajos que las otras? Í ¿Alguna postura induce cambios en la frecuencia cardiaca? ¿Qué relación tienen estos ¿Cómo lo explica? cambios con los cambios en la presión? Í ¿Qué son las presiones diastólica y sistólica y qué mecanismos fisiológicos las controlan? Í ¿Por qué se mide la presión en el brazo izquierdo? Í ¿Qué mecanismos podrían intervenir en los cambios de presión sanguínea? Í ¿Cómo esperaría que fuera la presión sanguínea de un organismo de gran estatura (por ejemplo, una jirafa)? z 2. Efecto del ejercicio sobre la presión arterial y la ventilación pulmonar La actividad muscular intensa induce, como primera consecuencia, cambios en numerosas variables, principalmente la utilización de combustibles y oxígeno por las células musculares, su producción de CO2, lactato y calor y la resistencia de los vasos sanguíneos que las irrigan. Esto tiende a modifica el valor de ciertas variables reguladas, entre ellas las concentraciones sanguíneas de CO2 y O2, el pH de los líquidos, la presión arterial y la temperatura corporal. La información sensorial sobre estos cambios induce a su vez respuestas compensatorias que tienden a corregir las variaciones, y que involucran los mecanismos de intercambio de gases, de elevación de la presión arterial y de eliminación de calor. En el caso particular del ejercicio, las respuestas compensatorias comienzan de manera anticipada a la detección de las alteraciones por los receptores correspondientes, y el entrenamiento físico mejora la capacidad del organismo para anticipar y compensar estas alteraciones. En este experimento se caracterizarán las respuestas compensatorias en respiración y presión arterial al ejercicio físico, y la manera en que son modificados por el entrenamiento. 2a) Elija dos personas (por equipo), una con entrenamiento físico y otra sin él. Excluya personas que tengan problemas respiratorios o circulatorios. 2b) Siguiendo las instrucciones del profesor, prepare el sistema de registro en el equipo Biopac (Biopac Student Lab, práctica No. 15 Exercise Physiology). Conecte los electrodos para electrocardiograma y el transductor de respiración, colóquelos a uno de los sujetos y calibre el sistema. 48 Práctica 7. Presión arterial El electrocardiograma (ECG o EKG) es un registro de los eventos eléctricos (despolarizaciones, repolarizaciones) de la masa muscular del corazón, propagados por los líquidos corporales y detectados en la piel del sujeto. Además del EKG, el sistema registrará el ritmo y la amplitud respiratorios. Usted deberá registrar la presión sanguínea utilizando un baumanómetro, tal como hizo en la primera experiencia. Onda T Onda P Complejo QRS Onda U Trazo normal de electrocardiograma y las ondas principales 2c) Estando el sujeto sentado en un banco alto, haga un registro basal de todas las variables. 2d) Sin retirar los electrodos, pida al sujeto hacer 50 sentadillas sin detenerse hasta haber terminado. 2e) Inmediatamente después de terminar, haga al sujeto sentarse y registre las variables durante al menos 15 segundos. Repita los registros cada 3 minutos hasta un periodo total de 21 minutos después del ejercicio. 2f) Haga las mismas determinaciones en el otro sujeto. Calcule para cada caso la frecuencia cardiaca, la amplitud del complejo QRS, la frecuencia y amplitud respiratorias, y la presión arterial media. Reúna los datos del grupo, calcule los valores de la media y el error estándar y compárelos estadísticamente a fin de determinar el efecto del ejercicio sobre cada una de las variables y cómo se modifica por el entrenamiento. Como sugerencia, aplique una prueba de análisis de varianza (ANOVA) bifactorial (tiempo x entrenamiento), para cada variable. Esta prueba le permitirá evaluar el efecto de cada uno de los factores y de la interacción entre ellos. En su defecto, haga las comparaciones que juzgue pertinentes mediante pruebas de t de Student. Represente sus resultados en gráficas e incluya los resultados de la prueba estadística en el pie de figura y/o en la descripción de resultados. 1 Conteste lo siguiente: Í ¿Qué representa la amplitud (altura) de la ondas del electrocardiograma? Í ¿Qué efecto tiene el ejercicio sobre el gasto cardiaco, la ventilación pulmonar y la presión arterial? ¿Cómo lo explica? Í ¿Qué efecto tiene el entrenamiento físico sobre las respuestas fisiológicas al ejercicio? Í Diseñe un diagrama de bloques en el que represente el sistema de regulación de la presión arterial y de la concentración de CO2 durante el ejercicio, incluyendo los subsistemas de salida y de entrada. 49 50 Presión media Amplitud resp. Frec. resp. Amplitud QRS Frec. cardiaca 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 EQ. B 0’ 3’ 6’ Sujeto no entrenado 9’ 12’ 15’ 18’ 21’ B 0’ 3’ 6’ Sujeto entrenado 9’ 12’ 15’ 18’ 21’ Práctica 7. Presión arterial Práctica 7. Presión arterial 7 Reporte sus resultados como gráficas o tablas e incluya en ellas los resultados del análisis estadístico y los pies de figura correspondientes. Discuta sus resultados tomando como base las respuestas a las preguntas planteadas. No olvide citar sus fuentes de información. Material necesario (por equipo): 9 1 diskette 3.5’’ nuevo (prop. personal) 9 2 Cronómetros 9 1 Baumanómetro 9 1 Estetoscopio Material por grupo (le será proporcionado al momento de la práctica): • Sistema de registro Biopac • Sistema de transducción para EKG y electrodos • Alcohol 96º Bibliografía sugerida: Š Eckert R y Randall D. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. Interamericana-McGraw Hill, 1989. Š Ganong F.W. Fisiología Médica. 17a Ed. El Manual moderno, México, D.F., 2000. 51 PRÁCTICA No. 8 APARATO EXCRETOR La característica más importante que permite la vida de un organismo es la existencia de un medio interno de composición distinta de la del medio externo. La composición de los líquidos internos y su osmoticidad son variables críticas en los procesos vitales, ya que pueden modificar los gradientes en la membrana celular y la estructura tridimensional de las proteínas en el citoplasma. En los mamíferos, el mantenimiento de los valores de concentración y el balance osmótico de los líquidos internos requiere mecanismos de regulación, que implican receptores hipotalámicos, varias hormonas y al riñón como principal efector. Para esto, el riñón posee mecanismos específicos de transporte de sustancias entre la sangre y el líquido de excreción, la orina, y con esto es capaz de modificar la concentración sanguínea de solutos (iones, metabolitos, sales, moléculas endógenas) además de la concentración de agua. Si el organismo es sometido a un reto osmótico, el mecanismo de regulación detecta las variaciones y secreta hormonas (principalmente vasopresina y aldosterona) que modifican la ingestión y la excreción renal de sales y de agua. Como resultado, el líquido de excreción tiene características de composición y concentración que se ajustan a los requerimientos de la regulación. El experimento que se propone consiste en la aplicación de un reto osmótico a un organismo, y la evaluación de la respuesta compensatoria a través de los cambios en la composición del líquido de excreción renal. ACTIVIDADES Utilice las 3 ratas asignadas para crear 3 situaciones osmóticas distintas: a) reto hiperosmótico con posibilidad de beber agua, b) reto hiperosmótico sin posibilidad de beber agua, c) control. En cada situación deberá determinar la cantidad de agua consumida y la cantidad y densidad de la orina emitida. a) Inyecte a dos de las ratas 1.3 ml de una solución concentrada de cloruro de sodio (NaCl 6%) por vía intraperitoneal (reto hiperosmótico). Inyecte a la rata restante (rata control) el mismo volumen pero de una solución fisiológica de NaCl (NaCl 0.9%). b) Coloque las ratas inyectadas en jaulas metabólicas individuales para colección de orina. Pese los bebederos y colóquelos en las jaulas correspondientes: a) hiperosmoticidad con posibilidad de beber y c) control. Mantenga a una de las ratas con hiperosmoticidad sin bebedero. c) Determine cada 30 minutos el volumen de agua ingerida. Recupere también toda la orina producida, determine su volumen y su peso y calcule con esto su densidad (δ = m/V). Repita las determinaciones hasta los 120 minutos después de la inyección. d) Al término del periodo de registro retorne los animales a la jaula común y permita que beban ad libitum. t 52 Control Hiperosmótico agua + Hiperosmótico 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 EQ 30’ 60’ 90’ 120’ CONSUMO DE AGUA (mL) 30’ 60’ 90’ 120’ VOLUMEN DE ORINA (mL) 30’ 60’ 90’ 120’ PESO DE ORINA (g) 30’ 60’ 90’ 120’ DENSIDAD DE ORINA (g/mL) Práctica 8. Aparato excretor 53 Práctica 8. Aparato excretor 1 Conteste lo siguiente: Í ¿Por qué la rata control recibió NaCl 0.9% en vez de agua pura? Í ¿Cuál es el efecto de la administración de NaCl concentrado sobre la osmolaridad de los líquidos corporales? Í ¿Cuál es la finalidad de no permitir que uno de los animales beba agua? Í ¿Cómo es la orina emitida, en cantidad y en densidad, de la rata en situación hiperosmótica en comparación con la rata control? ¿Cómo lo explica? Í ¿Qué hormonas intervienen en el mantenimiento de la osmolaridad en las ratas sometidas a un reto osmótico? Í Teóricamente ¿Cómo participaría la hormona aldosterona en el mantenimiento de la osmolaridad en las ratas que presentaron reto osmótico? Recuerde que la aldosterona es una hormona que participa en la reabsorción renal de Na+. Í Si un animal no tiene retos osmóticos ¿por qué continúa orinando? 7 Calcule las medidas de tendencia central y de desviación de los datos de todos los equipos. Presente sus resultados como gráficas comparativas de cada una de las variables medidas (ingestión de agua, volumen y densidad de la orina) en las que se contrasten las 3 situaciones evaluadas, colocando en el eje de las ordenadas el factor tiempo. Incluya en todas las gráficas los resultados del análisis estadístico y los pies de figura correspondientes. Discuta sus resultados tomando como base las respuestas a las preguntas planteadas. No olvide citar sus fuentes de información. A Material necesario (por equipo): 9 2 vidrios de reloj 9 1 balanza con canastilla para rata 9 1 probeta de 10 mL 9 2 jeringas insulínicas (1 mL) con aguja 54 Práctica 8. Aparato excretor Material por grupo (le será proporcionado al momento de la práctica): • balanza digital • jaulas metabólicas • solución de NaCl 0.9% • solución de NaCl 6% Bibliografía sugerida: Š Eckert R y Randall D. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. Interamericana-McGraw Hill, 1989. Š Ganong F.W. Fisiología Médica. 17a Ed. El Manual moderno, México, D.F., 2000. 55 56