1MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA PRESTACIÓN DE SERVICIOS UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 2 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Contenido PRACTICA N° 1 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS ......... 3 PRACTICA N° 2 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS ................................. 6 PRACTICA N° 3 CATÁLISIS ENZIMÁTICA E INORGÁNICA ............................................ 9 PRACTICA N° 4 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS ........................ 12 PRACTICA N° 5 ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS . 16 PRACTICA N° 6 VITAMINAS Y MINERALES .................................................................. 20 PRACTICA N° 7 IDENTIFICACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS EN ORINA................. 22 PRACTICA N° 8 PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN ..... 24 PRACTICA N° 9 TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLÓGICOS................ 26 PRACTICA N° 10 FORMACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO EN LA GLUCÓLISIS .................. 28 PRACTICA N° 11 OBTENCIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS Y COMPROBACIÓN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCÓLISIS. ....................................................................... 30 PRACTICA N° 12 DETERMINACIÓN DE GLUCÓGENO EN HÍGADO Y CORAZÓN ..... 33 PRACTICA N° 13 CUANTIFICACIÓN DE LA RESPIRACIÓN POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO. ......................................................................................................... 35 PRACTICA N° 14 EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE HUEVO ........................................................................................................... 37 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA 3 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA Nº 1 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS OBJETIVOS Observar algunas propiedades físicas de los aminoácidos. Reconocer la presencia de aminoácidos por la reacción de estos con la Ninhidrina Identificar algunos grupos funcionales presentes en aminoácidos específicos mediante la formación de productos coloreados. TEORÍA RELACIONADA Las células vivas producen macromoléculas que son biopolímeros constituidos por unidades monoméricas o bases estructurales. Para las proteínas, estas unidades son los L – á – aminoácidos. Las propiedades biológicas de estas macromoléculas están determinadas en gran parte por las clases de aminoácidos presentes, el orden en el que están dispuestos en una cadena de polipéptidos y por lo tanto la relación espacial de un aminoácido con otro. Los aminoácidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un á – aminoácido, ambos están unidos al mismo átomo (á) de carbono. De los aminoácidos presentes en la naturaleza, sólo 20 de ellos aparecen en las proteínas de todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminoácidos intervienen en la transmisión de impulsos en el sistema nervioso (Glicina y acido glutámico). Los aminoácidos esenciales deben ser suministrados en la alimentación, ya que nuestros cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento (niños) o para conservar la salud (adultos). Reacción de la Ninhidrina: Es un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los á aminoácidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color púrpura. Esta reacción se efectúa también con los aminoácidos prolina e hidroxiprolina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez de púrpura. Reacción Xantoproteica: Los aminoácidos que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color rojo naranja. Reacción de Millon: Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con reactivo de millón formando compuestos rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos son la Tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reacción positiva. El reactivo original de Millon es una solución de nitrato mercúrico en ácido nítrico 50% v/v. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Arginina. Reacción de Sakaguchi: El único aminoácido que contiene grupos guanidinos es la Arginina. y fenilalanina). Agregue suficiente NaOH al 20% hasta que la solución sea fuertemente alcalina. Fenol. Triptófano. deje enfriar y observe el cambio de color.2% en alcohol o acetona.1% Acido glioxílico Reactivo de Millón. líquido. cristal. dando un color rojo. calentar por 3min. esta reacciona con á naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo o hipoclorito en un medio alcalino. 2. polvo. tirosina y triptófano) en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca de la neutralidad (ya esta ajustado).Naftol: 0. deje hervir por 3 minutos y anote sus resultados. Acido sulfúrico. MATERIALES Y REACTIVOS 10 Tubos de ensayo 1 Gotero. 5 y 10 mL Papel indicador Soluciones al 0. Triptófano. Reacción de la Ninhidrina: Coloque 1 ml de solución de aminoácido (glicina. 3. El cambio de DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Reacción Xantoproteica: Adicione 1 ml de solución de ácido nítrico a aproximadamente 1 ml de solución de aminoácido (glicina. Examen Físico: Anote el estado físico de la sustancia (Aminoácidos): Sólido. Olor: Percibir si se trata de olor característico o relacionado con un grupo químico. disolución al 0.2% NaOH al 20% o amoniaco. Agua de bromo PROCEDIMIENTO 1. agregue 5 gotas de solución de ninhidrina. Nitrito de sodio. 1 Beaker de 500mls 3 Pipetas de 1. solución. Tirosina.4 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Reacción del Acido Glioxílico para Triptófano: Grupo indólico del triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia del ácido sulfúrico concentrado dando un color púrpura.5% de aminoácidos: Glicina. tirosina. Ninhidrina: Disolución al 0. Color: Ver si es uniforme o si cambia durante el proceso. Si es homogénea. HNO3 al 10% á. Fenilalanina. 1 Gradilla 1 Estufa 1 Pinza para tubos de ensayo. A. la aparición de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo. Bioquímica F.Explique como se encuentran estructuralmente los aminoácidos en el plasma sanguíneo o líquido intracelular cuyo pH es de 7.5 ml de solución de aminoácido (glicina y arginina) y agregue dos gotas de á naftol. E y ANZOLA. Facultad de ciencias.. Deje enfriar a temperatura ambiente agregue 5 gotas de solución de nitrito de sodio. y fenilalanina) adicione 3 gotas del reactivo de millon y caliente en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.T. Guías de laboratorio de Bioquímica. 4. MaGrawLatinoamericana.5 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA coloración de amarillo en solución ácida a naranja brillante en solución álcali constituye un resultado positivo. Agregue 1 ml de acido sulfúrico por las paredes del tubo. D. C. México. S. 3. tirosina y Triptófano agregue 1 ml de ácido glioxìlico. Mezcle fuertemente y agregue cuatro a cinco gotas de agua de bromo.1 respectivamente.Escriba la reacción para cada prueba realizada. P. LOPEZ. 5. 4. BIBLIOGRAFÍA PLUMER. Reacción de Millon: A 0. 2. 6. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .Cuales son las explicaciones prácticas de las pruebas realizadas.4 y 7. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota. Reacción de Sakaguchi: Mezcle 0. la formación de un anillo color púrpura indica que la reacción es positiva.De acuerdo con las pruebas realizadas en esta práctica proponga una clasificación para los aminoácidos. tirosina. Introducción a la bioquímica práctica.K. E y Stumpf. Observe bien el color inicial en cada caso.5 ml de la muestra (Glicina. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Reacción del Ácido Glioxílico para el Triptófano: A 1 ml de la muestra (glicina.Identifique los grupos químicos que caracterizan a los aminoácidos. 5.5 ml de álcali fuerte con 1. Note el color formado. Hill CONN. es la formación de un coágulo o proceso de coagulación. las proteínas presentan ligeras variaciones estructurales en las diferentes especies. Realizar ensayos de precipitación de proteínas al mezclarlas con sales de metales pesados.6 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA Nº 2 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS OBJETIVOS Comprobar la desnaturalización y coagulación de proteínas. variaciones en los valores de pH y la presencia de solventes que afecten estas interacciones. pueden producir serias alteraciones en la solubilidad. radiaciones. las fuerzas hidrofílicas. o con reactivos ácidicos. Sin embargo factores físicos como el calor. Verificar la importancia de la reacción de Biuret para el reconocimiento de proteínas. Algunas veces pueden ocurrir cambios en la estructura nativa de la proteína y se considera que en estas condiciones la proteína se ha desnaturalizado. Cuando una proteína se disuelve en agua. El fenómeno físico observado en este caso. constituidas únicamente por aminoácidos y proteínas complejas que contienen material adicional como carbohidratos. TEORÍA RELACIONADA Las proteínas son un grupo de biomoléculas caracterizados por su gran variedad estructural y enorme diversidad de funciones biológicas. electrostáticas y los puentes de hidrógeno. Las proteínas pueden variar sus características de solubilidad mediante alteraciones en el medio acuoso en el que se hallen disueltas.. aportando un mayor grado de solubilidad entre más efectivas sean estas interacciones. MATERIALES Y REACTIVOS 10 tubos de ensayo 1 Beaker de 400 ml 1 Pinza para tubo de ensayo 1 Gradilla 1 Estufa o calentador 1 termómetro DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Las proteínas de cada ser vivo. lípidos o ácidos nucleicos. A pesar de que desempeñan la misma función. participan positivamente. Químicamente pueden diferenciarse en proteínas simples. animal o vegetal son específicas ya que están codificadas por su genoma. al segundo 4 gotas de una solución de acetato de plomo al 2%. déjelo enfriar y agregue 4 ml de buffer pH 4. Gelatina: se disuelve 1 g de gelatina en 100ml de solución salina al 1 %. la mezcla se filtra sobre gasa para eliminar la mayor parte de la espuma. Explique. Con agitación continua. Buffer pH 4. obsérvese cuidadosamente la formación o no de precipitados. entonces se presenta floculación.7 al tubo A.5 M. redisuelve después de enfriar o diluir con agua. Determinación del punto de coagulación de una proteína y demostración de la desnaturalización: Rotule 2 tubos de ensayo grandes con las letras A y B. Caseína: se toma 1 g de caseína y se le agrega lentamente 100 ml de NaOH 0. caseína y gelatina Cloruro de mercurio al 2% PROCEDIMIENTO: 1.7. la desnaturalización ocurre primero después de calentar. 3. agregue a cada uno 4. Repetir el procedimiento con solución de caseína y luego por solución de gelatina. Agregue 0. Preparación de soluciones de proteínas. b) Precipitación con reactivos acídicos: En tres tubos de ensayo coloque en cada uno 1. al segundo igual cantidad de una solución de ácido tánico al DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . separe el tubo A. El punto isoeléctrico de la albúmina de huevo esta alrededor de pH 4. 2. adicione a uno 4 gotas de solución de cloruro mercúrico al 2%. llévelos al baño de agua caliente hasta ebullición.7 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Reactivo de Biuret Acido tánico al 10% Ácido Pícrico saturado Sulfato cúprico al 2% Ácido Acético 10% Ferrocianuro de potasio acuoso. reposar la mezcla durante 5 min y de haber espuma se filtra sobre gasa. el calentamiento da origen a que la floculación se transforme en coagulación.5 ml de solución de caseína. Continúe calentando hasta la ebullición del agua y prolongue el calentamiento por 5 minutos mas.7 Acetato de plomo al 2 % Soluciones: Albúmina. Determine si el precipitado que se ha formado. Solución de albúmina: Se prepara mezclando lentamente una clara de huevo con aproximadamente 100ml de agua.7.5 ml de Buffer pH 4. Precipitación de Proteínas a) Precipitación con sales metálicas: En una serie de tres tubos se adiciona en cada uno 1 ml de solución ALBUMINA de huevo. cuando el punto isoelectrico se restablece. Coloque los tubos en un baño de María y aumente la temperatura en forma gradual anotando cualquier cambio en los tubos y la temperatura a que ocurre. . aquí la coagulación por calentamiento ocurre mas rápidamente a pH diferente. Añádale al primero 3 gotas de una solución acuosa saturada de ácido pícrico.5 ml de solución de albúmina de huevo. mas 3 gotas de acido acético y al tercero 4 gotas de sulfato cúprico al 2%. E y ANZOLA. D. y Stumpf. Explique que sucede cuando el cabello se somete a los tintes. Observe lo que ocurre. Explique por que las pezuñas. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . 2. Repetir el procedimiento remplazando la solución de caseína por solución de albúmina. entre los que se encuentra el reactivo de Biuret.8 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA 10% y al tercero 3 gotas de una solución acuosa de ferrocianuro de potasio y 1 gota de ácido acético al 10%. 5. a la bioquímica práctica. Consultar de qué depende la solubilidad de las proteínas. de ris y alisado. México. E. Consultar en forma clara y breve en que consiste la desnaturalización de las proteínas. C.K. Universidad Nacional sede Bogotá. MaGraw- Hill CONN. los cuernos. Reacción de Biuret: Es característica del enlace peptídico. escriba la reacción 6. S. Explique cuando es positiva la reacción de Biuret. 3. P. LÓPEZ. Deje reposar la mezcla y observe lo que ocurre. Consulte otras técnicas utilizadas para la cuantificación de proteínas. las uñas. 4..5 ml de la solución proteica. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. BIBLIOGRAFÍA: PLUMER. Guías de laboratorio de Bioquímica. Introducción Latinoamericana.A. el cabello y las plumas no se disuelven con el agua. Bioquímica F. añada 1 ml de reactivo de Biuret. A 1. Reacciones colorida: Las proteínas pueden formar compuestos coloreados al reaccionar con determinados reactivos. 4.T. Facultad de Ciencias. este proceso es reversible o irreversible. en algunos casos. Observar el efecto de la temperatura sobre la acción catalítica de una enzima y comparar el mismo efecto de temperatura sobre un catalizador inorgánico. TEORÍA RELACIONADA Las enzimas son catalizadores biológicos de estructura proteica y producidos por los mismos organismos que las utilizan para realizar sus propios procesos metabólicos. La reacción que se presenta en la experiencia a realizar se puede describir en la siguiente forma: H2 O2 H2 O2 Catalasa MnO2 H2 O + O2 H2 O + O2 MATERIALES Y REACTIVOS 6 tubos de ensayo Pinza para tubos de ensayo 2 pipetas de 5 y 10 ml Gotero Beaker de 400ml Agua destilada Calentador Probeta de 100ml DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . sustrato y la presencia de inhibidores. por tanto. no son afectados por factores físicos como el calor. pueden catalizar una determinada reacción pese a cambios en la temperatura. La acción catalítica de una enzima está sometida a la influencia de factores físicos como son. Observar la acción de un inhibidor sobre la actividad catalítica de una enzima. el calor. En cambio los catalizadores inorgánicos. con la de un catalizador inorgánico como el bióxido de manganeso (MnO2) al descomponer en peróxido de hidrógeno (H2O2) a temperatura ambiente. las radiaciones o de factores químicos como cambios en el pH y en la concentración de la enzima.9 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA Nº 3 CATÁLISIS ENZIMÁTICA E INORGÁNICA OBJETIVOS Comparar la acción catalítica de la enzima catalasa. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1. Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las siguientes sustancias: Tubo Nº1 1ml de sangre al 10% Tubo Nº2: 1 ml de extracto de papa. Tubo Nª3: Una pequeña porción de MnO2 2. Observar la intensidad de la reacción por el burbujeo del oxígeno y la liberación de calor.10 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Espátula Gradilla Mortero con mano Peróxido de Hidrógeno (H2O2) al 3% Bióxido de Manganeso (MnO2) Cianuro de Sodio (NaCN) Papas como fuente de catalasa (traer) Sangre como (extraerse) fuente de catalasa Hielo (traer de la casa) Gasa (traer) Cuchilla (traer de la casa) PARTE EXPERIMENTAL 1. retirarlos y dejar en reposo dentro de un baño de agua a temperatura ambiente durante 10 min. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalítica con base en este parámetro. luego adicione 2ml de H2O2 al 3% a cada tubo. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalítica con base a este parámetro. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalítica con base en este parámetro. Prepare 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y Colóquelos en un baño con agua a ebullición durante diez minutos. 3. adicione a cada tubo uno 6 gotas de NaCN y dejar en reposo durante 5 min. 4. Adicionar a cada tubo 2 ml de H2O2 al 3%. Agregar a cada uno de los tubos 2ml de H2O2 al 3%. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad catalítica con base en este parámetro. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y colóquelos en un baño de hielo durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2ml de H2O2 al 3%. 5. LOPEZ. Qué diferencias hay entre inhibidores orgánicos e inorgánicos? 7. BIBLIOGRAFÍA: PLUMER. Explique como se da el proceso de regulación de la actividad enzimática en el organismo?. D. E y ANZOLA. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . C. Por qué carece de importancia la lipasa gástrica en los procesos digestivos del estómago de los adultos y en cambio es importante en el estómago infantil? 4. MaGraw.Hill Latinoamericana. Cuál es la importancia médica de las enzimas? De por lo menos un ejemplo concreto. Mexico. Las granadas son fabricadas por la industria militar con un dispositivo especial de seguridad para que no exploten en el sitio donde son fabricadas. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota. S. ¿Qué tipo de enzimas son fabricadas por ciertos órganos que tienen un comportamiento similar al de las granadas? De ejemplos. Facultad de ciencias.11 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. si no durante el combate. E y Stumpf.A.K. P. Guías de laboratorio de Bioquímica. Qué función cumplen las vitaminas hidrosolubles en las reacciones catalizadas por enzimas?. Inhibidores acompetitivos. 8.T. Bioquímica F. Introducción a la bioquímica práctica. 2. Defina que son: Zimógenos. CONN. 5. Isozimas. 3. Explique por qué el captopril y el enalopril son ejemplos de inhibidores competitivos de la enzima conversora de la angiotensina. 6. Esta reacción es general para los carbohidratos pero algunos otros compuestos orgánicos dan también furfural con ácido sulfúrico concentrado. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Esta prueba solo la dan los azucares reductores. Cuando se calientan las pentosas en ácido clorhídrico concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones fèrricos para dar un color verde azuloso. PRUEBA DE BARFOED: reactivo de Barfoed es débilmente ácido y solamente puede ser reducido por monosacáridos. por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se está estudiando. PRUEBA BIAL PARA PENTOSAS. TEORÍA RELACIONADA PRUEBA DE MOLISH: El ácido sulfúrico concentrado hidroliza los enlaces glicosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Diferenciar carbohidratos reductores de no reductores por su comportamiento frente al reactivo de Benedict. lo cual lo hace mucho más simple con la ventaja adicional de que el reactivo es más estable que el de felhing. Realizar ensayos cualitativos para el reconocimiento de carbohidratos específicos. Estos productos se combinan con á-naftol sulfonato. introducida por Benedict. originando un complejo púrpura. En ella se usa únicamente una solución.12 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA Nº 4 PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS OBJETIVOS. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar los disacáridos dando así reacciones falsamente positivas. Las cetosas deshidratan más rápidamente que las aldosas dando derivados del furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rosado. Reconocer la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la prueba de molish. PRUEBA DE SELLIWANOFF. El precipitado de oxido cuproso es menos denso que en los métodos previos y se recomienda dejar el tubo en reposo hasta que el precipitado sedimente. PRUEBA DE BENEDICT: Es una modificación de la prueba de felhing. fructosa. agregue al primero 0.5 ml de solución de lactosa. Prueba de Benedict: Tome 3 tubos de ensayo. lactosa. La hidrólisis ácida libera los monosacáridos constituyentes que luego son ensayados.5 ml de solución de sacarosa. sacarosa. ribosa. así que en la práctica. leche (traer de la casa) Solución de yodo. al segundo 0.5 ml de solución de glucosa y al tercero 0. La sacarosa es el único disacárido común no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre. no son reductores. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . hasta que se formen dos capas. almidón. Añada cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de ácido sulfúrico concentrado.13 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA PRUEBA PARA SACAROSA.5 ml del reactivo de Benedict a cada tubo y colóquelos en un baño de agua hirviendo por 3 min. PRUEBA PARA POLISACÁRIDOS. Esta es hidrolizada en solución ácida y luego se ensayan la glucosa y la fructosa resultante. Los polisacáridos contienen sólo un grupo reductor por varios cientos o más residuos. La formación de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de azúcar reductor. Adicione 0. Observe cualquier cambio de color en la interfase de los dos líquidos. Reactivo de Bial Reactivo de Molish Reactivo de Selliwanoff Acido sulfúrico concentrado Alcohol Amilico Reactivo de Benedict Acido clorhídrico concentrado Reactivo de Barfoed Hidróxido de sodio 1M PROCEDIMIENTO Prueba de Molish: Agregue 5 gotas del reactivo de Molish a 1 ml de una muestra que contenga carbohidratos (Leche). arabinosa. galactosa. MATERIALES Y REACTIVOS Estufa o calentador Pinza para tubos de ensayo Pipetas de 5 y de 10ml Gradilla Beakers de 100 y 400ml Gotero 10 tubos de ensayo Papel tornasol Soluciones de: glucosa. Adicione 1 ml del reactivo de Barfoed a cada tubo. Prueba Bial : Tome 3 tubos de ensayo. La formación de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de monosacáridos.5 ml solución de almidón. Adicione 1ml del reactivo de Selliwanoff a cada tubo. dejar enfriar y luego agregue 1 ml de alcohol amilico y agite. Prueba para sacarosa: A 2. Consulte el fundamento de otras técnicas usadas para la determinación de la glucosa en el laboratorio.5 ml de solución de ribosa y al tercero 0. Consulte las enfermedades producidas por el mal metabolismo de los carbohidratos.5ml de solución de fructosa.5ml de solución de ribosa. 6. al segundo 0. 7. al segundo 0.5 ml de solución de galactosa. caliente durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo. ¿Qué ocurre? Explique sus observaciones. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .5ml de solución de almidón. añada 1 gotas de solución de yodo. Prueba para polisacáridos: Coloque 1ml de solución de almidón. por que la maltosa es un azúcar reductor y por que el almidón no lo sus observaciones 4. Explique los resultados de cada una de las pruebas realizadas? 3. adicione al primero 0. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Adicione 0. la aparición de un color rojo o rosado es prueba positiva para cetosas. 5. hierva por 2 min y deje reposar.5ml de solución de arabinosa y al tercero 0. Por qué la celulosa a pesar de estar formada por moléculas de glucosa es insoluble en agua.14 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Prueba de Barfoed: Tome 3 tubos de ensayo. ¿por que la sacarosa es un azúcar no reductor?. al segundo 0. Prueba de Salliwanoff: Tome 3 tubos de ensayo. divida la solución hidrolizada en dos porciones y realice por separado las pruebas de Benedict y Selliwanoff. la aparición de una coloración azul verdosa es prueba positiva es prueba positiva para pentosas. Caliente el tubo ¿Qué observa? Deje enfriar y observe nuevamente. Explique estructuralmente.5 ml de una solución de sacarosa agregue 3 gotas de ácido clorhídrico concentrado. 2. Escriba cada una de las reacciones en las diferentes pruebas para carbohidratos. Consulte las posibles estructuras de las muestras problemas.5 ml del reactivo de Bial a cada tubo y caliente hasta que empiece a hervir. Caliente durante 1 min en un baño de agua hirviendo. adicione al primero 0. enfrié y agregue Hidróxido de Sodio 1M hasta que la solución sea neutra o ligeramente alcalina (prueba con papel tornasol).5ml de solución de glucosa. 1. Observe la producción de un color azul.5ml de solución de arabinosa y al tercero 0. adicione al primero 0. 15 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA BIBLIOGRAFÍA: PLUMER. Introducción a la bioquímica práctica.K. Hill CONN. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .A. LOPEZ. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. Mexico.T. C. S. D. Guías de laboratorio de Bioquímica. Bioquímica F. MaGrawLatinoamericana. P. Facultad de ciencias. E y ANZOLA. E y Stumpf. El panículo adiposo subcutáneo es así mismo un eficaz protector contra el frío externo. por ejemplo. Los lípidos más comunes y abundantes en los alimentos de origen vegetal y animal son los aceites y las grasas. Realizar la reacción de saponificación y determinar algunas propiedades de los jabones. TEORÍA RELACIONADA Los lípidos. cuyo nombre deriva del griego lipos: (grasa). Comparar el grado de instauración de algunos lípidos. MATERIALES Y REACTIVOS 10 tubos de ensayo Capsula de porcelana 2 gradillas 1 vaso de 250 ml Pipetas de 5 y 10 ml Pinza para tubo de ensayo Calentador Pinza para crisol DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . las hormonas esteroideas o las prostaglandinas. Funciones catalíticas: Algunos lípidos actúan en pequeñas cantidades como activadores o reguladores del metabolismo. glicolípidos y algunas veces esteroides estructurados en bicapas. Todos los métodos de obtención de lípidos utilizan en gran medida estos criterios de solubilidad. las vitaminas liposolubles.16 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA Nº 5 ALGUNAS PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS OBJETIVOS: Determinar la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos. etc. éter. cloroformo. Funciones Estructurales: Todas las membranas biológicas están formadas por fosfolípidos. los cuales consumidos en la dieta y conjuntamente con los sintetizados endógenamente tienen múltiples funciones en el organismo: Función energética o de reserva: Las grasas neutras (Triacilgliceroles) se almacenan en los adipositos y suministran calorías fácilmente utilizables en períodos de escasez. Son moléculas de estructura variada cuya propiedad fundamental que ha permitido su aislamiento y caracterización es la de ser insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos tales como el benceno. Constituyen una excepción a esta regla las esfingomielinas que no son solubles en éter y los fosfolípidos que no son solubles en acetona. etanol. Observe lo que ocurre. PROCEDIMIENTO 1. Explique los resultados? DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . etanol caliente. Cómo esta constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo en la gradilla y obsérvelos varias veces durante quince minutos. Añada a cada uno 2 ml de agua destilada. Solubilidad Numere 7 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal. A una de los tubos agregue algunas escamas de jabón. ¿Cuales no disuelven las grasas? c. 1 ml de cada una de las siguientes sustancias: Agua destilada. Cómo es la estabilidad de las mezclas en los dos tubos? d. benceno. ¿Como explican ustedes los resultados? 2. cloroformo. Agite cada tubo. c. éter etílico y acetona. ¿Cuales son los mejores disolventes para las grasas? b.17 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Espátula Gotero Escamas de jabón (traer de la casa) Cloruro de magnesio (50g/L) Aceite vegetal (traer de la casa) Acetato de Plomo (50 g/L) Etanol al 95% Cloruro de sodio Éter etílico Solución de yodo Cloroformo Acido sulfúrico concentrado Acetona Hidróxido de sodio al 10% Benceno Acido oleico Cloruro de calcio (50g/L) Acido esteárico. Emulsificación En dos tubos de ensayo coloque 2 ml de aceite vegetal. Agite bien ambos tubos. luego agregue a cada tubo de manera diferente. Cómo se denomina la mezcla formada? b. a. Deje en la gradilla por 2 min y observe los resultados. a. hasta que el medio sea claro. un detergente sintético o un jabón ¿por qué? DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Explique las reacciones químicas correspondientes. d. Qué tipo de compuesto químico es el jabón? 2. En que consiste la solución formada? b. Que producto se prefiere generalmente en el trabajo de lavandería domestica. Cuando estén hirviendo añada 1 ml de ácido oleico. Tome 3 tubos de ensayo y agregue. Cuantas gotas de solución de yodo se necesitaron en cada tubo para que el color permaneciera estable? b. Explique lo que ocurre en cada caso. Agregue ahora cuidadosamente y gota a agota una solución de NaOH al 10%. Agregue cinco gotas de solución de cloruro de magnesio. Saponificación En una capsula de porcelana coloque unos 20 ml de agua y sométalos a ebullición (mantenga el volumen constante). Tubo#3. Continué agregando (máximo 15 gotas). 4. Observe y anote los resultados. Tenga cuidado de no añadir un exceso de álcali. La solución de yodo decolora si hay ácidos grasos insaturados. a. Qué diferencia hay entre jabones y detergentes sintéticos? 3. Agregue cinco gotas de solución de cloruro de calcio. Tubo#4. Agregue solución de yodo gota agota a cada uno de los 4 tubos. Agregue cinco gotas de ácido sulfúrico concentrado. Escriba la reacción química general de lo ocurrido. a. hasta que el color del yodo sea estable. Adicione a cada tubo 2 ml de cloroformo y agite bien. agitando después de cada adición. Tubo#2. deje 2 ml de cloroformo en otro tubo como control.18 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA 3. Consultar teoría relacionada de lípidos. 1ml de acido oleico al segundo y una pequeña cantidad de acido esteárico al tercero. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. 1ml de aceite vegetal al primero. sature la solución con NaCl. Insaturación. Escriba la reacción química que ocurre? Numere ahora cinco tubos de ensayo y coloque en cada uno dos ml de la solución anterior realizando las siguientes pruebas: Tubo#1. Tubo#5: Agregue cinco gotas de solución de acetato de plomo. Explique los resultados obtenidos? c. LOPEZ. Guías de laboratorio de Bioquímica. E y ANZOLA.19 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA 4. Explique qué relación hay entre los ácidos grasos omega 3 y la enfermedad cardiaca? 9. Que son detergentes biodegradables y no degradables? 6.A. y aceites vegetales? 8. D. Cuáles son los ácidos grasos presentes en la mantequilla. E y Stumpf. Introducción a la bioquímica práctica. Mexico. Bioquímica F. MaGrawLatinoamericana. margarina. S. P. Cuál es el nombre del esteroide que se presenta como un detergente en el cuerpo humano? BIBLIOGRAFÍA PLUMER. Explique con sus propias palabras y por medio de un dibujo como un detergente puede desprender las manchas de aceite y grasa de las telas? 5. Facultad de ciencias. Hill CONN. Universidad Nacional de Colombia sede Bogota DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .K. Explique estructuralmente y con sus propias palabras por que los aceites vegetales son líquidos a temperatura ambiente y las grasas son sólidas? 7. C.T. crecimiento y reproducción de una gran variedad de seres vivos se encuentra un grupo de biomoléculas orgánicas llamadas vitaminas.2. Los cofactores de naturaleza orgánica se suelen denominar coenzimas. TEORÍA RELACIONADA Algunas enzimas requieren para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis.4 aminonaftolsulfonico NaOH al 10% Cloroformo Alcohol isobutilico DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .20 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO BIOQUÍMICA PRACTICA N° 6 VITAMINAS Y MINERALES OBJETIVOS: Separar algunos constituyentes de la leche Identificar la presencia de vitaminas y minerales en la leche Reconocer la vitamina A presente en la mantequilla. MATERIALES Y REACTIVOS Vaso de precipitados de 400ml Gradilla Probeta de 50ml Embudo de vidrio Erlenmeyer de 100ml Espátula Pipetas de 5 y 10ml Vitamina A (traer) Agitador de vidrio Leche (traer) Tubos de ensayo (5) Acido acético al 10% Oxalato de amonio al 4% Ferrocianuro de potasio al 1% Acido molibdico (SOLUCIÓN) KCL Acido 1. Estas sustancias se llaman en general cofactores. Hay coenzimas que no pueden ser sintetizadas integralmente en el organismo. sino que algunos de sus componentes o precursores debe ser incorporado a partir de la dieta. además de otras sustancias de carácter inorgánico frecuentemente conocidas como minerales. Entre los precursores exógenos necesarios para el normal desarrollo. 5ml de ferrocianuro de potasio al 1% y 1ml de NaOH al 10%. LOPEZ. 2. Introducción a la bioquímica práctica. agitar cuidadosamente por 2 min y centrifugar por 5 min a 2000 rpm. D. VITAMINA B1. el calcio y los fosfatos en mamíferos? BIBLIOGRAFÍA: PLUMER. añada una pequeña cantidad de KCl. luego se disuelve en 1ml de cloroformo y adicionar 5 gotas del reactivo de Carr-Price.5ml de alcohol isobutilico. mezcle y disuelva totalmente el KCl. Vierta 2. E y ANZOLA. la tiamina. MaGrawLatinoamericana. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .5ml de acido 1. PRECIPITACIÓN DE LA CASEÍNA En un vaso de precipitado de 400ml. añadir con una pipeta gota a gota y con agitación constante acido acético al 10% hasta la formación de un precipitado flocúlenlo de caseína. E y Stumpf. Observar el precipitado que se forma. 2. y 0. Agregar 2. descartar la caseína que no es de interés en la presente practicay conservar el filtrado para las posteriores pruebas cualitativas de vitamina B1( tiamina) y minerales. Mexico. 4. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. C.T. VITAMINA A En un tubo de ensayo.5ml de acido molibdico y 0. S.A. P. Hill CONN. FOSFATOS A 0.5 ml de filtrado adicionar 0. agregar 50ml de leche y 50ml de agua destilada.5ml de filtrado en un tubo de centrifuga. disolver una capsula de vitamina A de 100U.( dejar reposar 10min) 4. La formación de precipitado indica la presencia de vitamina B1 3. se produce un intenso color azul que desaparece al poco tiempo.K. Dejar decantar y filtrar sobre gasa. CALCIO A 0.21 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTO 1. ¿Que importancia presenta la vitamina a. Facultad de ciencias. En presencia de vitamina A. ¿Cual es el fundamento químico de los procedimientos desarrollados en la práctica? 2.5 ml de filtrado adicionar unas gotas de solución de oxalato de amonio al 4%. Guías de laboratorio de Bioquímica. Bioquímica F. Observe la coloración obtenida. 5. aminonaftolsulfonico. la acetona y el ácido . de tal manera que solo cantidades insignificantes aparecen en la orina.hidróxibutirico. lo cual permite su determinación cualitativa. inanición. vómitos con deshidratación y después de la exposición al frío y/o ejercicio vigoroso. Bajo buenas condiciones de salud.22 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 7 IDENTIFICACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS EN ORINA OBJETIVOS Determinar la presencia de cuerpos cetónicos en orina. los cuerpos cetónicos se forman en el hígado y son completamente metabolizados. Familiarizarse con algunos protocolos empleados en laboratorios clínicos para el reconocimiento de cuerpos cetónicos TEORÍA RELACIONADA Los cuerpos cetónicos son los ácidos acetoacético. la determinación de acido acetoacético (Método de Gerhrdt). se fundamenta en la formación de un ferropentacianuro con el derivado isonitrado de la acetona. hallamos un aumento de estas sustancias en la sangre y en la orina. Por el contrario.hidróxibutirico es transformado en acetona. MATERIALES Y REACTIVOS 2 tubos de ensayo 1 capsula de porcelana 1 gradilla 1 pinza para crisol 2 pipetas 1 pinza para tubos de ensayo 1 beaker de 250ml DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . el acido . se basa en la aparición de una coloración rojo-vinosa con el cloruro férrico y en el Método de Hart. En la cetósis. La determinación de acetona (Método de Imbert). los cuerpos cetónicos pueden encontrarse en cantidades apreciables en la orina. la cual se identifica mediante el reactivo de Imbert. en casos de diabetes. mediante pruebas cualitativas para cada uno de ellos. Con este calentamiento se eliminan la acetona y el acido acetoacético. Bioquímica F. MaGrawLatinoamericana. Hill CONN. en presencia de acido acetoacético se produce una coloración rojo-vinosa. D. se deja enfriar y finalmente se practica la prueba de Imbert a ambos tubos. E y ANZOLA. adicione 0. es indicativo de la presencia de acetona.23 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Agua destilada Cloruro férrico al 10% Orina de diabético (traer) Peróxido de hidrogeno al 10% Acido acético glacial Nitroprusiato de CH3COOH al 50% Amoniaco sodio al 5% en PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE ACETONA: A 5 ml de orina.K. S. E y Stumpf. uno de estos tubos servirá como control. P.5ml de amoniaco por las paredes del tubo. Qué otro tipo de sustancias pueden determinarse en la orina por un metabolismo anormal de lípidos. LOPEZ. C. la aparición de un anillo rojo violáceo en l contacto de los líquidos. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. al contenido de la capsula se le agregan 10ml de agua y se transfiere en partes iguales a dos tubos de ensayo. al otro se le adiciona 1ml de peroxido de hidrogeno al 10% y se calienta en baño de María por 5 min. Facultad de Universidad Nacional de Colombia sede Bogota ciencias. BIBLIOGRAFÍA PLUMER. 2.T. agregue 0. Mexico. se acidifica con unas 5 gotas de acido acético y se calienta en una estufa hasta reducir el volumen a la mitad. Introducción a la bioquímica práctica. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . DETERMINACIÓN DE ACIDO â-HIDROXIBUTÍRICO En una capsula de porcelana se mezclan 10ml de agua y 10 ml de orina. DETERMINACIÓN DE ACIDO ACETOACÉTICO. Qué es la cetósis y la Cetonuria.A. Guías de laboratorio de Bioquímica.5ml de nitroprusiato de sodio disuelto al 5% en acido acético al 50%. A 5 ml de orina de adicionan unas gotas de cloruro férrico. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo (4) Calentador Tubos de centrífuga (2) Pinzas para tubo de ensayo (2) Beaker de 400mL Termómetro Pipetas de 5mL (3) Espátula Balanza Solución de glucosa 10% Fosfato de sodio dibásico 0.4-dinitrofenilhidracina saturado en HCl 2M NaOH 10% Levadura (TRAER) DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . La reacción total podría considerarse como la transferencia de dos pares de átomos de hidrógeno de la glucosa al nad+.dinitrofenilhidracina. Este proceso se conoce como fermentación o glucólisis. TEORÍA RELACIONADA La producción de piruvato durante la fermentación se realiza por una serie de reacciones enzimáticas que involucran algunos intermediarios.24 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 8 PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN OBJETIVOS Determinar la presencia de piruvato mediante la fermentación de levadura.5 M Fosfato de potasio monobásico 0. de manera que el piruvato se acumula y su presencia se demuestra con la 2. observar la producción de piruvato. Los metabolitos de piruvato y acetaldehído se encuentran normalmente en bajas concentraciones. mediante cambios de color.5 M Ácido tricloroacético 10% 2.4. por lo tanto para comprobar su existencia es necesario impedir su transformación. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas. 4. E y Stumpf. 3.5ml de solución saturada de 2.dinitrofenilhidracina con el pirivato?. mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm. S. Introducción a la bioquímica práctica. Qué función cumple el NAD+ en la producción del piruvato. LOPEZ. luego agregue a cada tubo 2 ml de A. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . E y ANZOLA.5M.5ml de suspensión de levadura al 10% P/V en solución de fosfato de potasio monobásico 0. La formación de un color rojo indica la presencia de piruvato. 5. Al tubo A agregue 2. tome 0. P. Guías de laboratorio de Bioquímica.dinitrofenilhidracina en HCl 2M.T. Consulte la vía de la glucólisis y determine los pasos irreversibles de esta vía.5 ml de agua. Mexico.5 ml de solución de glucosa al 10%.4.A al 10%P/V. Facultad de Universidad Nacional de Colombia sede Bogota ciencias. 2. C.25 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTO En dos tubos de ensayo A y B añada respectivamente 2. Hill CONN. Cuál es la función del ácido tricloroacético?.5ml de suspensión de levadura al 10% P/V en solución de fosfato de sodio dibásico 0. al tubo B agregue 2. A 1 ml del sobrenadante agregue 0. MaGrawLatinoamericana.A. Coloque en baño de maría a 37ºC durante 1 hora.K. Bioquímica F. Repita esta prueba usando una solución de glucosa en vez del sobrenadante.5 M. BIBLIOGRAFÍA PLUMER.T.4. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Qué conclusiones se podrían sacar de los resultados de las muestras A yB? Cuál es la reacción de la 2. D.5 ml de esta mezcla y agregue 1 ml de NaOH al 10% y 0. Mezcle fuertemente. 4 Succinato de sodio 0. Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante el uso de un aceptor electrónico. La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). MATERIALES Y REACTIVOS. Las células de la gran mayorías de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de oxido reducción mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a través de la degradación de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético (ATP). Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima succinato deshidrogenada. La enzima esta sujeta a una poderosa inhibición competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio.1M DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . TEORÍA RELACIONADA. Para estudiar el transporte de cargas en la reacción se empleara un aceptor artificial de electrones (azul de metileno).1M pH 7.26 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 9 TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLÓGICOS OBJETIVOS Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido hepático. La succinato deshidrogenada una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato. Vasos de precipitado de 25y 400 ml Pipetas de 5 ml (2) Tubos de centrifuga Pipeta de 1 ml (1) Mortero con maso Gradilla para tubos de ensayo Termómetro Tubos de ensayo (3) Buffer fosfato 0. cuya decoloración permite diferenciar la actividad enzimatica en los ensayos a realizar en la presente práctica. manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso. Escriba la reacción mediante la cual el succinato se transforma en fumarato. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y marquelo como extracto enzimático.1M Aceite vegetal (traer) Azul de metileno 0. En que rutas esta metabólicas esta involucrado el succinato.1M y solo al tubo 3 agréguele 1ml de malonato de sodio 0. agregar 1. 4. 3.2y 3).4.5ml de extracto enzimático a cada uno de los tubos (1. (Manteniendo la temperatura constante).1%.2 y 3) 0. Sin retirarlos del baño. Que sustancias pueden inhibir la conversión de succinato en fumarato. 5. mezclando ocasionalme. Que papel desempeña el aceite vegetal en el experimento. tenga en cuenta que el tubo 1 es el control. Pase la mezcla a tubos de centrifuga y centrifugue a 1600rpm durante 10min.1M Y pH 7. SEGUIMIENTO DE LA REACCIÓN Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados. 2. agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos. en adición al malonato. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1.1M. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y manténgalo en un baño con hielo durante 15min.5ml de azul de metileno al 0.27 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Malonato de sodio 0.1% Hígado y Hielo (traer de la casa) PROCEDIMIENTO 1. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . 2. Dejar los tubos en incubación a 37ºC durante 10 min. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ENZIMÁTICO Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hígado hepático libre de sangre y colocarlos en un mortero con arena lavada. macere cuidadosamente hasta formar una mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfato0. luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de succinato de sodio 0. Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo. Que efecto tendría un exceso de succinato sobre la reacción. adicionar a cada tubo (1. A al 20%. Las muestras se colocan seguidamente en un baño de agua hirviendo por 4 minutos.28 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 10 FORMACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO EN LA GLUCÓLISIS OBJETIVOS Producir ácido láctico a partir del músculo de rata. En ambos tubos de ensayo agregue (5 ml de solución de glucosa al 0. Comprobar la formación de dicho ácido mediante pruebas características. Pese dos porciones de 1 g del macerado y viértalas en dos tubos de ensayo. el cual se coloca en un baño de hielo y se le agrega 15 gotas de ácido sulfúrico.5g de hidróxido de calcio. TEORÍA RELACIONADA (CONSULTAR). y los contenidos de ambos tubos se filtran aparte.5 ml de la solución de A. E inmediatamente se colocan en un baño de hielo.A al 20%. Con cuidado se toman 1 ml del filtrado y se vierten al otro tubo de ensayo. se agita.2 % y se agitan. agréguele inmediatamente 1 ml de A.T. Seguidamente coloque los tubos en un baño de María a 37 ºC durante 2 horas. Una vez que se ha enfriado se agrega a cada tubo 8 gotas de una solución alcohólica de hidroquinona al 0. Las muestras se agitan cuidadosamente y después durante un periodo de 15 minutos. Después de la incubación en el tubo de ensayo experimental se vierte 0. se repite la operación alternándola con intervalos de reposo. Desmenuce rápidamente con ayuda de una tijera y macere en un mortero limpio y seco manteniendo a baja temperatura.agregue 5 gotas de vaselina o aceite vegetal. Seguidamente se filtran. Observar ambos tubos. se les agrega 2 ml de solución de sulfato de cobre al 20 % y 0.5 M ).5 % en bicarbonato de sodio 0. MATERIALES Y REACTIVOS Bisturí Baño Serológico Mortero con mano Pipetas de 5 y 10 mL 4 tubos de ensayo Balanza DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Para precipitar los carbohidratos se toman de cada uno de los tubos 2. Uno de los tubos de ensayo se utilizará como control.5 ml del filtrado. PROCEDIMIENTO Sacrifique una rata o curiel y extraiga los músculos de las patas.T. Qué condiciones hay que tener en cuenta para la producción de ácido láctico según reacciones de la glucólisis. E.A 20% Hidroquinona 0. Facultad de Ciencias. Qué función cumple la solución de hidroquinona? 2. Introducción Latinoamericana. S. LÓPEZ. D. 1.5 M en Ácido sulfúrico concentrado Sulfato de cobre al 20% Vaselina ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA. 200mL Embudo Tabla de disección Papel filtro Hidróxido de Calcio A. a la bioquímica práctica. México. Bioquímica F.K. E y ANZOLA. MaGraw- Hill CONN. De que depende la producción de dicho ácido? 5. C. ¿En qué tejidos es mayor la producción de este ácido.T. P. BIBLIOGRAFÍA PLUMER.T. Universidad Nacional sede Bogotá. 3. ¿Por qué debe el ratón o rata estar en actividad el día anterior?. 4. Escriba la reacción entre la hidroquinona y el ácido láctico.A.2 % Solución de glucosa al 0.5% bicarbonato de Sodio al 0.29 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA Beaker 400 mL. y Stumpf. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . Guías de laboratorio de Bioquímica. Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de comida. después de los 4 días se filtra y al filtrado se le agrega un volumen igual de etanol. 20.d. PROCEDIMIENTO 1. En dos tubos de ensayo se vierten 3 ml de solución de almidón al 1%. Prepare una solución de sacarosa al 1%. una solución al 1% de esta sustancia se utiliza para el experimento. alejado de los roedores.25 y 30 min. Coloque a calentar hasta que ebulla.fructofuranosidasa y comprobación de su actividad. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . 15. el precipitado se lava con mínimas cantidades de alcohol y éter y se seca al vacio. Repita esta operación a los 10. Tomando una gota de cada tubo y combinándola con una gota de lugol en una cápsula de porcelana. 2. el líquido recogido se filtra a través de un algodón y el filtrado se utiliza para los siguientes ensayos.5ml de fehling B o en su defecto 1ml de reactivo de benedict. obtención del preparado de amilasa salival y comprobación de su actividad. Al tubo que contiene la enzima se le agregan 0.5ml de fehling A y 0. Se añaden 13 ml de cloroformo y se deja por 4 días a temperatura ambiente.d. Se trituran 50 g de levadura de cerveza con 3 g de carbonato de calcio hasta formar una pasta homogénea que se coloca en un beaker de 200ml. CONSULTAR TEORÍA RELACIONADA.fructofuranosidasa. Se mide en una probeta 30 ml de agua destilada y con ella se enjuaga la boca por espacio de 3 a 5 min . Comprobar la actividad de estas dos enzimas en diferentes muestras. Observe. obtención del preparado de . en uno de ellos se agrega 3ml de agua y en el otro 3ml del preparado enzimático y se introducen en un baño de maría a 40ºC por 5min. OBJETIVOS Obtener preparados de amilasa salival y .30 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 11 OBTENCIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS Y COMPROBACIÓN DE SU ACTIVIDAD EN LA GLUCÓLISIS. Obtención de un preparado de peroxidasa y comprobación de su actividad. 5.5 g de papa y se trasladan para una probeta y se le agrega agua hasta completar 20 ml. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .5% y 1ml de solución de peróxido de hidrógeno al 3%. A cada uno se le agrega 1 ml de solución de hidroquinonoa al 0. 3. Con que objeto se utiliza el cloroformo en la levadura para la determinación de la actividad de la enzima . y se filtra.5% Fehling A y B Peróxido de hidrógeno al 3% Levadura (debe traerla cada grupo de práctica 4 días antes).5ml de fehling A y 0. 1. Por que a medida que pasa el tiempo la coloración de la mezcla de amilasa salival va cambiando. Se toman dos tubos de ensayo.31 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA En dos tubos de ensayo se vierten en cada uno 2. Cuál es la reacción que permite la formación del color en la determinación de la actividad de la peroxidasa. Ambos tubos de ensayo se colocan en un baño de maría a 30ºC por 5 min. y se calienta hasta que comience a ebullir. en uno de ellos previamente calentado hasta ebullición. Se trituran 2. Qué función cumple el carbonato de calcio en la actividad enzimática de la enzima invertasa. MATERIALES Y REACTIVOS Beacker de 200 y 500 mL Frasco lavador Espátula Probeta de 50 mL Pipetas de 5 y 10 mL Embudo Mortero Bomba de vacio Capsula de porcelana (2) Papel filtro Sacarosa Etanol Lugol Cloroformo Hidroquinona al 0. 3. en uno se vierte 1 ml de extracto enzimático y en el otro 1 ml de agua destilada. 2.5ml de cada tubo de ensayo y se le agregan 0. PREGUNTAS. Se deja en reposo durante 10 min. Para determinar el poder reductor se toma 0. Por qué se utiliza lugol en la determinación de la actividad de amilasa salival.5 ml de la solución de sacarosa al 1% y 2.fructofuranosidasa. Observar lo que sucede.5ml de fehling B. 4.5 ml de solución de invertasa.d. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . D. C. México. Bioquímica F. Guías de laboratorio de Bioquímica.32 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA BIBLIOGRAFÍA PLUMER. P. E y ANZOLA. y Stumpf. MaGraw- Hill CONN. E.K. Universidad Nacional sede Bogotá. Facultad de Ciencias. Introducción Latinoamericana. S. LÓPEZ.T. a la bioquímica práctica.A. enfríe en un baño de hielo. caliente durante 20 minutos y realice la prueba de Felhing.33 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 12 DETERMINACIÓN DE GLUCÓGENO EN HÍGADO Y CORAZÓN OBJETIVOS Determinar la presencia de glucógeno en diferentes tejidos. Calcular la cantidad de glucógeno presente en un tejido animal. retire los cuerpos sólidos y agregue 2 ml de sulfato de sodio saturado y mezcle fuertemente. agréguele 1 ml de HCl (1. TEORÍA RELACIONADA (CONSULTAR) PROCEDIMIENTO Pese 20 g de hígado o corazón y triture suavemente.2M Sulfato de sodio saturado DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . añada 4 ml de etanol y deje en baño de hielo por 10 minutos. agite de vez en cuando durante el calentamiento. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de centrífuga (2) Pipetas de 5 y 10mL Balanza Agitador Beaker de 400 y 200 mL Beaker de 300 y 100Ml Vidrio de reloj Cuchillo KOH al 10 % Etanol al 96% Reactivo de felhing A y B HCl 1. descarte el sobrenadante. seque y pese. Una pequeña cantidad agregue agua y caliente suavemente hasta disolver.2M). Observe y centrifugue por 3 minutos. páselo a un vaso de precipitado y agréguele KOH al 10% hasta cubrir y caliente en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Cuál es el porcentaje de error de la cantidad de glucógeno obtenida.T. D. México. etanol y ácido Clorhídrico en la determinación de glucógeno. Cuál es el porcentaje de glucógeno en Hígado y corazón teórico. S. 2.A. y Stumpf. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA .K. Bioquímica F. Cuál es la función del Hidróxido de Potasio. a la bioquímica práctica. 3. P. Introducción Latinoamericana.34 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA 1. MaGraw- Hill CONN. compárelo con el calculado experimentalmente. E. BIBLIOGRAFÍA: PLUMER. de modo que la semilla no esté en contacto con el NaOH.2 N NaOH 0. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . siendo una de las primeras consecuencias observables el incremento de los fenómenos respiratorios. un frasco debe quedar sin semilla. de manera preferente. El ATP necesario para llevar a cavo la activación deriva. MATERIALES Y REACTIVOS 2 frascos boca ancha con tapa 2 pipetas de 5 y 10 ml 2 beaker de 50ml Algodón 1 probeta de 50 ml Semillas (50g) Cloruro de Bario 1M HCl 0. la cual ha estado sumergida durante una hora o más y las coloca en saco de gasa. provocado por la combustión mitocondrial de sustratos oxidables.2 N. el cual está unido a la tapa por un cordel.35 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 13 CUANTIFICACIÓN DE LA RESPIRACIÓN POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO. Tales sustratos existen en el endospermo bajo forma exclusiva de polisacáridos de alto peso molecular (almidón) y lípidos complejos (triglicéridos). pese 5g de semilla. OBJETIVOS Determinar la cantidad de CO2 producido por las semillas mediante la cantidad de NaOH consumida. Observar el fenómeno respiratorio de las semillas TEORÍA RELACIONADA La fase de hidratación de las semillas viene acompañada por la dispersión de los coloides celulares e iniciación de procesos enzimáticos a velocidades crecientes. del transporte electrónico respiratorio. en dos frascos de mayonesa de 250 ml y tapa inmediatamente.2 N Fenolftaleina al 1% en etanol PROCEDIMIENTO Cada grupo coloca 25 ml de NaOH 0. 5 ml de BaCl2 1 M. México. hasta que desaparezca el color y anote los volúmenes gastados. D. A los ml de titulación del blanco reste los ml gastados en la titulación de las semillas y multiplique por 5.36 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA A las 36 horas extraiga las semillas y tape rápido. tome de cada frasco 5 ml y le agrega 2. a la bioquímica práctica. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . adicione tres gotas de fenolftaleina y titule con HCL 0. P.2 N. Bioquímica F.T. MaGraw- Hill CONN. S. E. y Stumpf. obtendrá así la cantidad de HCl equivalentes al CO2 desprendido por las semillas BIBLIOGRAFÍA: PLUMER.K. Introducción Latinoamericana.A. La etapa inicial del proceso consiste en la protonación del grupo hidroxilo del colesterol. Cascar un huevo de gallina con precaución y separar la clara de la yema. Añadir sobre la yema 5 ml de acetona fría y agitar con la varilla de vidrio. De los primeros. el colesterol y los fosfolípidos. seguido de su deshidratación para formar un ión carbonio 3. MATERIALES Y MATERIALES Vaso de precipitado 100 mL Agitador de vidrio Vaso de precipitado 50 mL Tubos de ensayo (2) Pipeta de 5 mL PROCEDIMIENTO 1. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el sulfúrico produce un compuesto cromóforo. en el que la reacción tiene lugar en un medio ácido fuerte (ácido sulfúrico). Extracción de colesterol de la yema de huevo. teniendo cuidado de no romper ésta. utilizando acetona como disolvente. sulfónico. hasta DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . en un vaso de 50 ml. TEORÍA RELACIONADA Los lípidos presentes en la yema son de naturaleza variada. que absorbe energía en la zona de la luz visible. a 410 nm. el más popular es el de Liebermann-Burchard.5-colestadieno. Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en la yema de huevo mediante un método calorimétrico. Los métodos analíticos para la determinación del colesterol se dividen en colorimétricos y enzimáticos. Decantar la clara y tomar 1 g de la yema. que serían solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol. Mediante una extracción fraccionada se pueden separar los menos polares. solubles en acetona (triacilglicéridos y colesterol) de los más polares (fosfolípidos). destacando los triacilglicéridos. el colestahexano-ác.37 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRACTICA N° 14 EXTRACCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE HUEVO OBJETIVOS Extraer colesterol de la yema del huevo. Observar los resultados.A. Reconocimiento de colesterol mediante la prueba de Liebermann-Burchard Agregar a cada tubo una cantidad adecuada del reactivo de Liebermann-Burchard. Dónde ha encontrado usted más colesterol. Bioquímica F. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA . LÓPEZ. al que llamaremos extracto acetónico A1. 4. Facultad de Ciencias.K. D. Qué relación existe entre el contenido de colesterol y el riesgo de contraer enfermedad vascular arteriosclerótica. Concluida la centrifugación. agitando con la varilla y repitiendo la centrifugación. 3. en la fracción A1 o en la A2? Por qué? 2. y Stumpf. Que tubo presenta una coloración mas intensa? PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Introducción Latinoamericana.T. El nuevo extracto obtenido se llama extracto acetónico A2. E y ANZOLA. Consultar sobre los métodos enzimáticos para la determinación de colesterol. S. 2. Cuáles son los valores de referencia para el contenido de colesterol en sangre humana. Guías de laboratorio de Bioquímica. Verter el contenido en un tubo de centrífuga y centrifugar a 2000 RPM durante 10 minutos. retirar el sobrenadante con pipeta. MaGraw- Hill CONN. C. E. a la bioquímica práctica. Enfermedad Vascular Arteriosclerótica BIBLIOGRAFÍA PLUMER. y reextraer el sedimento con otros 5 ml de acetona. Guardar el sobrenadante. P.38 MANUAL PRÁCTICAS BIOQUÍMICA obtener una suspensión homogénea. Universidad Nacional sede Bogotá. México.