UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZINSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS MANUAL DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA-II PROGRAMA DE MEDICINA EVANGELINA OLIVAS ENRÍQUEZ BERTHA ALICIA BORREGO PONCE ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍAY PARASITOLOGÍA 2015 1 INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS DIRECTOR Dr. Daniel Alberto Constandse Cortés DEP. CIENCIAS DE LA SALUD Dra. Beatriz Araceli Díaz Torres PROGRAMA MEDICINA Dr. Jorge Camargo Nassar DEP. CIENCIAS QUÍMICOBIOLÓGICAS Dr. Alejandro Martínez Martínez COORDINADORA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA M.en C. Bertha Alicia Borrego Ponce 2 AGRADECIMIENTO A todos los profesores de la Academia de Microbiología y Parasitología, por sus valiosas sugerencias en la elaboración de este manual. 3 CONTENIDO Pag. Reglamento del Laboratorio 5 SECCIÓN- I VIROLOGÍA 7 Práctica #1. Métodos de diagnóstico de virus humanos 8 Práctica #2. Inmunodiagnóstico de virus humanos 16 Práctica #3. Pruebas de reacciones febriles 25 Práctica #4. Bacteriófagos 28 Práctica #5. Diagnóstico serológico del Virus Hepatitis B 32 Práctica #6. Diagnóstico de Rotavirus 38 Práctica #7. Diagnóstico del Virus Rubeola 41 Práctica #8. Virus de la Rabia 44 Práctica #9. Virus Carcinogénicos 48 Bibliografía 52 SECCIÓN-II MICOLOGIA 53 Práctica #10. Cultivo e identificación de los hongos 54 Práctica #11. Micosis superficiales 61 Práctica #12. Micosis subcutáneas 64 Práctica #13. Micosis sistémicas 67 Práctica #14. Micosis oportunistas 68 Bibliografía 73 REGLAMENTO DEL LABORATORIO PARA ESTUDIANTES Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del estudiante dentro de los laboratorios de Microbiología y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un área donde se manejan microorganismos patógenos, parásitos y algunos compuestos químicos peligrosos. 4 Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la cristalería. 1. Todos los alumnos deberán asistir con bata blanca larga y el cabello recogido. 2. La entrada al laboratorio quedará restringida exclusivamente a los alumnos inscritos. 3. Se prohibe estrictamente introducir al laboratorio cualquier alimento o bebida, para evitar el riesgo de contaminación con microorganismos patógenos. 4. No está permitido fumar dentro del laboratorio, debido al manejo de sustancias inflamables. 5. Las mochilas, cajas, y otros artículos ajenos al laboratorio, deberán guardarse en los casilleros de la entrada. 6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deberá comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de accidentes y de contaminación con los microorganismos patógenos manejados en las prácticas. 7. Se nombrará un jefe de mesa quien será el responsable del cuidado del material y equipo en uso para cada práctica y de que la mesa quede aseada y desinfectada al final. También vigilará que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con antiséptico antes de retirarse. 8. En cada práctica, el jefe de mesa recibirá del profesor los microscopios, materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de la práctica y posteriormente los devolverá en las mismas condiciones que los recibió, a excepción de los materiales especiales indicados por el profesor, para colocarse en lugares especiales, tales como los cultivos u otros. 9. En caso de algún daño al material o aparatos, los alumnos integrantes del equipo estarán obligados a reparar dicho daño, en la forma que indique el profesor. 10. El alumno deberá capacitarse con la NOM-087 sobre la Separación, Tratamiento y Destino de los Residuos Biológico- Infecciosos 11. Para tener derecho a la evaluación final en la teoría, el alumno deberá contar con el 80 % de asistencias. Para tener derecho a la asistencia, se concederán 10 minutos como retardo. 12. La calificación final de la asignatura Microbiología, se obtendrá mediante la suma de: la calificación final obtenida en el laboratorio, equivalente a 30 %, más la calificación final obtenida en la teoría, correspondiente al 70 % = 100 %. 5 13. El alumno no podrá acreditar la materia si obtiene calificación reprobatoria en el laboratorio o en la teoría. Debe aprobar ambas para promediarse. 6 SECCIÓN I PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA PRÁCTICA# 1 METODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS HUMANOS. 7 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que el alumno conozca teóricamente los principales métodos de diagnóstico de virus humanos y la diferencia con respecto a los métodos para bacterias y otros microorganismos humanos. INTRODUCCIÓN. El diagnostico de infecciones virales humanas puede ser obtenido desde las etapas iniciales de la enfermedad por detección de los antígenos virales, en los especímenes, lo que constituye una importante herramienta para un diagnóstico rápido. Los virus presentan pocas propiedades de las células y no pueden ser clasificados dentro de ninguno de los grupos que incluyen a los seres vivos. No están formados por células y no pueden realizar actividades metabólicas en forma independiente, por lo cual no se pueden cultivar in vitro como las bacterias y los hongos. Un virus es una partícula infecciosa que presenta un ácido nucleico rodeado por una cubierta proteica llamada cápside. Algunos virus presentan una cubierta membranosa externa denominada envoltura externa. El genoma viral está contenido en el ácido nucleico ya sea DNA o RNA y posee de 5 a varios cientos de genes. Todos los virus, excepto el de la viruela, el más grande, tienen un diámetro menor de 0.25 μm y pueden ser observados sólo con microscopio electrónico. La forma de un virus está determinada por la organización de las subunidades proteicas que forman la cápside. La cápside puede ser de forma helicoidal, como el virus de la rabia. Las proteínas de su cápside se ensamblan en una hélice como un cilindro hueco, que encierra al ácido nucleico, en este caso los virus se observan como barras cortas o largas. Otra forma es la Poliédrica, en la cual las proteínas forman placas triangulares que se disponen en un poliedro, adquiriendo el virus una forma casi esférica. Algunos virus poliédricos, como el virus de la influenza, pueden presentar una envoltura membranosa, así como glucoproteínas, o picos proteicos como en los adenovirus. 8 TIPOS DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES VIRALES: Las muestras deben tomarse precozmente en la fase aguda de la infección. Deben trasladarse al laboratorio a la mayor brevedad posible, en un medio de transporte. Las muestras más comunes son: - Torundas nasofaríngeas: Adecuadas para el diagnóstico de enterovirus, adenovirus, y herpes simplex. Las nasofaríngeas se prefieren para el virus respiratorio sincitial y la mayoría de los otros respiratorios. Las nasales son las mejores para los rinovirus. - Aspirados faríngeos: son mejores que los hisopos (torundas) nasofaríngeos, pero estos últimos son más prácticos. - Torundas rectales y muestras de heces: en virus no cultivables, como rotavirus, o adenovirus, que se detectan por microscopía electrónica o con técnicas de detección de antígenos. - Secreciones, Sangre o Líquido cefalorraquídeo: Como en en el caso de los virus VIH, de laHepatitis- B y la Hepatitis-C - Biopsias: En algunas virosis el diagnóstico solo puede efectuarse por biopsia de cerebro, como en la encefalitis por Virus Herpes Simplex. En huéspedes inmunodeprimidos y con citomegalovirus, el virus solo puede identificarse en el órgano afectado. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE VIRUS HUMANOS. INTRODUCCION.- Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por partedel huésped en el curso de la infección. 9 Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.). En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad. I. MÉTODOS DIRECTOS La muestra clínica se examina directamente para determinar la presencia de partículas de virus, de antígenos del virus o de ácidos nucleicos virales. 1. Microscopía de luz. Durante la replicación de los virus, a menudo se producen cambios histológicos en las células infectadas. Estos cambios pueden ser característicos o inespecíficos. Los cuerpos de inclusión virales son básicamente colecciones de partículas de virus, después de la replicación ya sea en el núcleo o en el citoplasma. Ejemplos de cuerpos de inclusión son los cuerpos de Negri que se encuentran en la rabia y los cuerpos de inclusión citomegálicos en infecciones por Citomegalovirus (CMV). Aunque la histología no es sensible o específica, sirve como un complemento útil en el diagnóstico de ciertas infecciones virales. 2. Microscopía electrónica. Las partículas de virus son detectadas e identificadas con base en la morfología. Normalmente se utiliza un aumento de alrededor de 50.000. Esta técnica se utiliza principalmente para el diagnóstico de la gastroenteritis viral mediante la detección de virus en las heces, tales como los rotavirus, adenovirus, astrovirus, calicivirus y los virus tipo Norwalk. Ocasionalmente puede ser utilizada para la detección de virus en vesículas y otras lesiones de la piel, tales como los virus del herpes y los virus del papiloma. La sensibilidad y especificidad de la EM puede ser potenciada por microscopía electrónica inmunológica, por lo que se utiliza un anticuerpo específico del virus para aglutinar las partículas virales y haciéndolos más fáciles de reconocer, o para capturar partículas de virus en la red usada en microscopía electrónica. El principal problema con ME es el gasto que supone la compra y el mantenimiento de las instalaciones, la sensibilidad de la ME es a menudo pobre. Por lo 10 tanto, el observador debe estar altamente calificado. Con la disponibilidad de otros métodos efectivos y económicos, es cada vez menos utilizada. Electromicrografías de rotavirus, adenovirus, astrovirus, virus tipo Norwalk. 3. Técnicas Moleculares para la detección directa del genoma viral. Los métodos basados en la detección del genoma viral también se conocen comúnmente como métodos moleculares. A menudo se dice que los métodos moleculares constituyen la dirección futura del diagnóstico viral. Sin embargo, aunque en la práctica el uso de estos métodos moleculares en efecto está aumentando, su papel desempeñado en un laboratorio de diagnóstico viral de rutina es aún pequeño, comparado con los métodos convencionales, aunque el papel de los métodos moleculares aumentará rápidamente en un futuro muy cercano. Técnicas moleculares clásicas como el Dot-blot y el Southern-blot dependen del uso de sondas específicas de ADN / ARN para la hibridación. La especificidad de la reacción depende de las condiciones usadas para la hibridación. Estas técnicas pueden permitir la cuantificación de ADN / ARN presente en la muestra. Técnicas moleculares más recientes, como la reacción de la polimerasa en cadena (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), la basada en la amplificación del ácido nucleico (NASBA), y del ADN ramificado (bDNA) dependen de alguna forma de amplificación, ya sea el ácido nucleico diana, o de la señal misma. El bDNA es esencialmente una técnica de hibridación convencional con aumento de la sensibilidad, sin embargo, no es tan sensible como la PCR y otras técnicas de amplificación. La técnica de PCR es la única técnica de amplificación que es de uso común, es extremadamente sensible, ya que es posible lograr una sensibilidad de hasta 1 molécula de ADN en una muestra clínica. Sin embargo, la PCR tiene muchos problemas, el principal de ellos es la contaminación, ya que sólo se necesita una pequeña cantidad de contaminación para dar un resultado falso positivo. Además, debido a que la PCR es tan sensible en comparación con otras técnicas, un resultado positivo de la PCR es a menudo muy difícil de 11 interpretar ya que no indica necesariamente la presencia de la enfermedad. Este problema es particularmente grande en el caso de los virus latentes, tales como los citomegalovirus (CMV), ya que los genomas de CMV latentes pueden ser amplificados a partir de la sangre de individuos sanos. A pesar de todo esto, la PCR se utiliza cada vez más para el diagnóstico viral, sobre todo porque el costo de la prueba disminuyó, así como de la disponibilidad de los sistemas automatizados cerrados que también pueden realizar la cuantificación (PCR cuantitativa) por ejemplo, PCR en tiempo real y Cobas Amplicor.systems. Es poco probable, que las otras técnicas de amplificación desafíen el predominio de PCR ya que es mucho más fácil de instalar la técnica de PCR en el laboratorio, que cualquier otro método. 4. Técnicas de detección de antígenos. Ejemplos de detección de antígeno incluyen pruebas de Inmunofluorescencia, muy usada en aspirados nasofaríngeos para virus respiratorios por ejemplo el virus sincitial respiratorio (RSV), virus de la gripe A, y de la gripe B, los adenovirus; la detección de antígenos de rotavirus en heces, la prueba de antigenemia para citomegalovirus CMV pp65; la detección del virus del herpes simplex (HSV) y virus de la varicela-zostervirus (VZV) en raspados de la piel, y la detección en el suero de antígenos de superficie del virus de la hepatitis B (HB). Sin embargo, este último se considera generalmente como una prueba serológica. La principal ventaja de estos ensayos es que son rápidos de realizar, con el resultado disponible en unas pocas horas. No obstante, la técnica es a menudo tediosa y lenta, el resultado es difícil de leer e interpretar y una pobre sensibilidad y especificidad. La calidad de la muestra obtenida es de suma importancia para que la prueba funcione correctamente. 5.- Cultivo de virus. En los métodos directos, también se incluye el cultivo de los virus, a partir de la muestra, realizado en tejidos celulares, para realizar diversas pruebas, tales como observación del efecto citopático, pruebas como la hemadsorción, confirmación por neutralización, interferencia, inmunofluorescencia, otros. También puede recurrirse al cultivo en embrión de pollo y realización de pruebas como observación de hemaglutinación y determinación de cuerpos de inclusión. Por otro lado, puede efectuarse la inoculación de 12 la muestra en animales, pudiendo causarles infección o la muerte, o para confirmar por pruebas de neutralización. a).- Aislamiento de virus en cultivo de tejidos. Debido a que los virus no se multiplican por sí mismos, requieren de una célula viva que los replique, se recurre a su aislamiento en cultivos celulares de tejidos, el embrión de pollo y a los animales de laboratorio. Sin embargo el embrión de pollo y los animales son difíciles de manejar y la mayoría de los laboratorios de diagnóstico viral dependen sólo del cultivo de tejidos. Tipos de cultivos de tejidos: Células primarias, son esencialmente células normales obtenidas de animales adultos, tales como de riñón de mono. Estas células sólo pueden cultivarse una o dos veces. Células semi-contínuas, tales como los fibroblastos de riñón y piel de embriones humanos. Estas son células tomadas de tejido embrionario y pueden ser cultivadas hasta 50 veces. Células contínuas, líneas de células tumorales inmortalizadas y pueden ser cultivadas en forma indefinida, entre las cuales se tienen a las células HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2 y BGM. Los cultivos de células primarias son ampliamente reconocidos como los mejores sistemas de cultivos celulares disponibles, ya que apoyan la más amplia gama de virus. Sin embargo, son muy caros y con frecuencia es difícil obtener un suministro fiable. Las células contínuas son los más fáciles de manejar, pero el rango de virus que apoyan es a menudo limitado. b).- Identificación de los virus cultivados. Una vez que el virus se aisló, la confirmación de la identidad puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos, como la observación del efecto citopático, cuerpos de inclusión, neutralización, hemadsorción, inmunofluorescencia, pruebas moleculares y otros. - La hemoadsorción, se basa en la capacidad de glóbulos rojos de determinada especie animal de unirse a proteínas virales que están siendo incorporadas en la membrana plasmática en las células infectadas. Agregando glóbulos rojos a una monocapa infectada con virus es posible observar microscópicamente la adherencia de los mismos a células que contienen virus y que están expresando antígenos virales en su superficie. Por medio de esta técnica, es posible demostrar la infección por aquellos virus que presentan proteínas 13 hemoaglutinantes. La Hemoadsorción es principalmente usada para la detección de virus de la influenza y parainfluenza. - El efecto citopático (ECP) por virus en los cultivos de células, se refiere a cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles al microscopio de luz. El efecto citopático puede ser específico o inespecífico. Puede observarse degeneración, formación de corpúsculos denominados cuerpos de inclusión muy diferentes según el tipo de virus, puede observarse fusión celular con formación de sincitios (masa celular multinucleada); puede haber transformación celular en caso de virus oncogénicos. En los cultivos celulares también puede haber producción de interferón, como respuesta de las células infectadas por virus, que interactúa con las células no infectadas, haciéndolas resistentes. Hígado. Inclusiones de citomegalovirus II.- Metodos Indirectos . SEROLOGÍA. Estas técnicas constituyen la mayor parte del trabajo de cualquier laboratorio de virología. Un diagnóstico serológico se puede hacer mediante la detección del aumento de los títulos de anticuerpos entre la fase aguda de la infección y la de convalecencia, o por la detección de IgM en la infección primaria. La IgM se produce únicamente en la respuesta primaria (fase aguda). Su presencia se interpreta como exposición-infección reciente, o activa. Las IgM, no atraviesan la placente humana. Importantes en diagnóstico de recién nacidos (infección fetal) Pruebas serológicas comunes: Dentro de las técnicas clásicas se cuenta con la Prueba de Fijación del Complemento, Prueba de inhibición de la hemaglutinación, Prueba de neutralización, y l aprueba de Hemolisis Radial Individual. Más recientemente, ya se puede recurrir a métodos como el Radioinmunoensayo(RIA), Ensayo por inmunoabsorción ligada a enzymas (ELISA), Aglutinación de Partículas, Western Blot (WB), al Inmunoblot 14 Recombinante (RIBA) y otros. En general, la mayoría de las infecciones virales comunes puede ser diagnosticada por serología. Ejemplo: Virus del Dengue CONCLUSIONES 15 PRÁCTICA #2 INMUNODIAGNÓSTICO DE VIRUS (SEROLOGÍA) OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que los alumnos adquieran un panorama general de los métodos serológicos comunes utilizados en el diagnóstico de enfermedades virales.para virus INTRODUCCIÓN En el laboratorio clínico, la serología utiliza las reacciones antígeno-anticuerpo en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Los anticuerpos se encuentran en el suero, como resultado de las infecciones por virus, microorganismos y parásitos, siendo altamente específicos para el organismo contra el cual se produjeron. En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre células o sustancias de su propio organismo y las extrañas, incluyendo los organismos patógenos, moléculas tales como toxinas, toxoides, vacunas, etc. La Inmunología estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del huésped frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la inmunidad adquirida específica. El término inmunidad se refiere al estado relativo de resistencia del huésped ante la enfermedad infecciosa. El sistema inmunológico se compone de dos grandes subdivisiones, el sistema inmune innato o inespecífico y el sistema inmune adaptativo o específico. El sistema inmune innato es un mecanismo de defensa primaria contra los organismos invasores, mientras que el sistema inmune adaptativo actúa como una segunda línea de defensa. Ambos aspectos del sistema inmunológico presentan componentes celulares y humorales, mediante los cuales desarrollan sus funciones de protección. Además, hay una interacción entre estos dos sistemas, es decir, las células o los componentes del sistema inmune innato influyen sobre el sistema inmune adaptativo y viceversa. Las células germinales de la médula ósea que participan en las respuestas inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles poblaciones de linfocitos: 1.- Linfocitos B, o células B. Viven días o semanas. Las Células B son las responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el antígeno, originan células plasmáticas productoras de anticuerpos. También pueden originar células con memoria, 16 linfocitos de larga supervivencia que están en reposo después de haber sido estimulados por un antígeno; cuando se renueva el contacto con un antígeno igual, producen la llamada "respuesta secundaria" que es más rápida y vigorosa que la "respuesta primaria", porque hay una mayor y más rápida producción de anticuerpos. 2.- Linfocitos T, o Células T. Como consecuencia de la activación antigénica, los Linfocitos T dan lugar a las células Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T participan en la muerte de patógenos o eliminación de materiales extraños, e incluso células cancerosas. Se encargan de movilizar a los macrófagos en la destrucción de patógenos y de estimular a las células B para intensificar la producción de anticuerpos (hay una "cooperación celular"). También hay células T con memoria. En el laboratorio clínico, la serología permite el uso de las reacciones antígeno-anticuerpo en el trabajo de diagnóstico de enfermedades infecciosas. Cuando uno de los componentes es conocido, el desconocido puede ser detectado con un alto grado de sensibilidad y exactitud. Las pruebas serológicas de reacción antígeno-anticuerpo, amplían la capacidad diagnóstica del clínico y orientan la terapéutica. La mera presencia de anticuerpos específicos en contra de un determinado virus, no permite el diagnóstico de dicha infección, debe tomarse en cuenta el cambio en los títulos en un lapso corto de tiempo y observar si hay seroconversión. La clase IgM se producen únicamente en la respuesta primaria (fase aguda). Su presencia se interpreta como exposición-infección reciente, o activa. Las IgM, no atraviesan la placenta humana, son importantes en el diagnóstico de recién nacidos (infección fetal). Las clase IgG pueden permanecer -incluso a tasas elevadas- mucho tiempo (años) después de que la infección esté resuelta. Contactos posteriores con Antígenos producen una respuesta de Ac clase IgG (Respuesta Secundaria); en el caso de microorganismos intracelulares puede persistir toda la vida, tales como Toxoplasma, Herpesvirus, etc. Existen muchas técnicas inmunológicas disponibles para las diferentes virosis. PRUEBAS SEROLÓGICAS COMUNES. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN. Aquí se utiliza un antígeno soluble y un anticuerpo homólogo. La reacción se manifiesta por la formación de un precipitado visible en la interfase de los reactivos. Generalmente la cantidad 17 del anticuerpo (antisuero) es constante y la del antígeno es variable. A medida que la cantidad del antígeno aumenta, el precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, cuando las proporciones de ambos son óptimas. A partir de aquí, si continúa incrementándose la cantidad del antígeno, entonces disminuye el precipitado. Por ello las pruebas de mayor utilidad son las que se realizan hasta alcanzar las proporciones óptimas. PRUEBA DE DIFUSIÓN SIMPLE En un tubo se deposita la solución del antígeno sobre una solución del antisuero, mismas que al difundir forman un anillo de precipitación en la interfase. DOBLE DIFUSIÓN En el método de Ouchterlony, los reactivos difunden desde pocillos excavados en una placa de agar. Las bandas de precipitación aparecen entre los dos pocillos correspondientes a antígeno y anticuerpo. INMUNOELECTROFORESIS Cuando se aplica la electroforesis al estudio de las reacciones antígeno anticuerpo, se le denomina electroforesis. Es un proceso electroquímico en el que las partículas o macromoléculas coloidales suspendidas, con una carga eléctrica neta, emigran en solución o en el gel de agar, bajo la influencia de una corriente eléctrica. Las cargadas positivamente emigran hacia el cátodo, mientras que las negativas van hacia el ánodo. Cuando se deposita una solución que contiene antígenos proteicos en un pocillo excavado dentro de una lámina de agar y se aplica la corriente eléctrica, los antígenos se distribuyen en manchas separadas a lo largo de una línea. Cuando se suspende la corriente comienza la difusion de esas sustancias a partir de las manchas correspondientes. Si se depositan los anticuerpos en una zona 18 rectangular excavada en paralelo a la línea de distribución de los antígenos, se produce una reacción de precipitación, adecuada para estudiar la naturaleza de las macromoléculas que se difunden. En este caso los anticuerpos se difunden en un frente lineal, mientras que los antígenos se difunden circularmente, como si estuvieran impregnando un disco, dando zonas de precipitación en forma de arco. En el suero aparecen 2 o más arcos. FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO Esta prueba es útil en aquéllos casos en que la interacción antígeno-anticuerpo no se traduce en un efecto observable, como precipitación o aglutinación. Se basa en la presencia de anticuerpos fijadores de complemento en el suero. Estos anticuerpos, en presencia del complemento, son capaces de provocar la lisis de células específicas. La finalidad de esta prueba es detectar anticuerpos específicos en suero en forma indirecta. -Reacción positiva: 1. Antígeno + Suero conteniendo el Anticuerpo homólogo + Complemento. Incubación. 2. El complemento se agota durante la reacción antígeno-anticuerpo (pero no hay cambios visibles). 3. Adición de eritrocitos de carnero + Hemolisina anti-eritrocitos de carnero (anticuerpo hemolítico). Incubación. 4. No hay hemólisis, porque no queda complemento disponible para que ocurra la reacción antígeno-anticuerpo (eritrocitos de carnero con el anticuerpo homólogo: hemolisina antieritrocitos). Se deduce que si se agotó previamente el complemento, fue porque se utilizó en la primera reacción Ag-Ac. - Reacción negativa: 1. Antígeno + Suero que no contiene el anticuerpo homólogo + Complemento. 2. Incubación 3. El complemento no se gastó (no se utilizó), porque no hubo reacción antígeno-anticuerpo. 4. Adición de eritrocitos de carnero + hemolisina-antieritrocitos de carnero 5. Incubación 6. Hemólisis de eritrocitos de carnero. Esto es debido a que el complemento no fué utilizado al no ocurrir la reacción Ag-Ac previamente, por lo tanto siguió quedando disponible para que ocurriera la segunda reacción Ag-Ac (eritrocitos de carnero con la hemolisina antieritrocitos). 19 Fijación de complemento en placa de microtitulación. Las líneas 1 y 2 exhiben fijación del complemento, obtenido con muestras de suero en la fase aguda y en la de convalescencia, respectivamente. El incremento observado 4 veces es significativo e indica infección. TÉCNICA DE RADIOINMUNOENSAYO (RIA) 1. En el primer paso debe haber competencia entre el antígeno no marcado (no radiactivo) a ensayar, en concentración desconocida y el antígeno marcado (radiactivo) en concentración conocida. Esta competencia se establece al adicionar una cantidad limitada de anticuepo específico para el antígeno marcado. 2. Se incuba varias horas. 3. En el segundo paso, se adiciona al sistema un suero conteniendo anti-anticuerpo específico, y por lo tanto, capaz de fijarse al anticuerpo integrante de los complejos inmunitarios formados durante el primer paso. Esto conduce a la precipitación de los complejos antígeno- anticuerpo. Si el antígeno que se ensaya en el primer paso ha reaccionado con el anticuerpo, el antígeno radiactivo indicador no podría reaccionar con el anticuerpo. En este caso la radiactividadad en 20 el precipitado sería muy baja. Sin embargo, si el antígeno que se ensaya no reacciona con el anticuerpo, el anticuerpo quedará libre para reaccionar con el antígeno indicador radiactivo. Con ello la radiactividad del precipitado será elevada. Esta técnica es importante para detectar el antígeno del virus de la Hepatitis B, en suero del donante de sangre. Es una microtécnica de gran sensibilidad para la determinación de cantidades pequeñas de antígeno: ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ELISA: Es una técnica de inmunoabsorción ligada a una enzima, utilizada para el diagnóstico serológico de infecciones vírales y para la detección de otros antígenos microbianos. Además de ser tan sencillo como el RIA, es de menor costo, mayor rapidez y seguridad y tiene la misma confiabilidad. Es muy sensible y se pueden detectar antígenos y anticuerpos a niveles de 10 a la menos 10 gramos, o de una parte por 10 a la 4 millones. Las pruebas inmuno-enzimáticas para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, que es generalmente el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada obtiene un color característico. Procedimiento de ELISA en microplaca: El antígeno se fija por adsorción pasiva a pocillos de una placa de poliestireno. Se añade el antisuero a probar y se incuba. Si los anticuerpos que contiene el antisuero son homólogos, quedarán fijados al antígeno. Después se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana marcados con enzima, que se fijarán a los complejos antígeno-anticuerpo formados en el primer paso. Finalmente se añade el sustrato de la enzima cuya degradación determina un cambio de color, proporcional a la concentración de anticuerpo presente en la muestra ensayada, que se puede apreciar por observación o medir en el colorímetro. Es aplicable en la determinación de muchos hongos, parásitos y virus tales como herpes 2, rubeola, otros. 21 INMUNOFLUORESCENCIA En esta técnica se utilizan anticuerpos fluorescentes. Se basa en la capacidad de ciertos colorantes de presentar fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta, tales como los isocianatos de fluoresceína y de rodamina. Los anticuerpos pueden conjugarse con estas moléculas, constituyendo anticuerpos marcados con fluorescencia. Las observaciones se llevan a cabo en un microscopio de campo oscuro con luz ultravioleta. Método directo: Se mezclan en un portaobjetos microorganismos con suero conteniendo anticuerpos fluorescentes y se observan al microscopio de fluorescencia, solo se observan los microorganismos (antígenos) que reaccionan con los anticuerpos marcados. Método indirecto: En primer lugar el anticuerpo no-fluorescente es enlazado a su antígeno. A continuación se aplica un segundo anticuerpo (antisuero-humano) marcado con fluoresceína. Inmunofluorescencia. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital) 22 NEUTRALIZACIÓN Cuando se incuba un virus con anticuerpos homólogos específicos de tipo, el virus no es capaz de producir la infección en un sistema de cultivos celulares indicadores. La respuesta de anticuerpos neutralizantes es específica del tipo de virus y se desarrolla al comienzo de los síntomas, elevándose los títulos rápidamente durando mucho tiempo. INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN Se puede realizar con diversos virus que aglutinan selectivamente los eritrocitos de varias especies animales (de pollo, cobayo o humanos). Se fundamenta en el bloqueo de las proteínas virales hemoaglutinantes por los anticuerpos específicos. La capacidad de hemoaglutinación del suero se inhibe por el suero humano específico. Los anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación se desarrollan tras el comienzo de los síntomas, posteriormente se elevan y al final disminuyen. Esta prueba es útil para detectar virus de rubeola, virus influenza, parainfluenza, y para determinar el estado inmunitario.\ AGLUTINACIÓN En las reacciones de aglutinación el antígeno es una célula o una partícula, la adición del anticuerpo homólogo provocará la aglutinación o la agregación, dando como resultado la formación de agregados visibles de células o partículas. Pueden llevarse a cabo en portaobjetos o en tubos de ensayo. La mayoría de estas pruebas se efectúan en tubo, con diluciones seriadas del suero conteniendo el anticuerpo (antisuero), añadiendo una cantidad fija del antígeno (la célula o la bacteria). Después de la incubación se observa la formación de agregados, determinándose el título. El título es un valor relativo representado por el recíproco de la máxima dilución que provoca la aglutinación. Por ejemplo, si un antisuero aglutina a una dilución 1:256, pero no aglutina a 1:512, su título es 256. Un ejemplo de esta técnica es la Prueba de Vidal para diagnóstico de Salmonella, la Prueba de Weill-Felix para Rickettsias, otras. La aglutinación ha sido usada para detectar antígenos de Rotavirus en heces mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con otras técnicas. Además es una técnica rápida y económica. También se la ha usado para detectar 23 antígenos de Adenovirus. La prueba de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para la detección de antígenos virales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas. DISCUSIÓN CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Diga el nombre de cuatro virus que puedan mantenerse en cultivo de tejidos. 2. Qué son los cuerpos de inclusión virales. 3. Haga una lista de virus que se puedan diagnosticar en heces. 4. haga una lista de virus que se puedan diagnosticar en vías respiratorias. 5. Haga una lista de virus que se pueden diagnosticar en lesiones dérmicas. 6. Haga una lista de virus que se puedan diagnosticar en sangre. 7. Haga una lista de virus que se puedan diagnosticar en L.C.R. 8. Cuándo se produce el Interferón y cómo actúa contra los virus. 24 PRÁCTICA #3 PRUEBAS DE REACCIONES FEBRILES OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Conocer el desarrollo y fundamento de una prueba de aglutinación para el diagnóstico de una enfermedad microbiana. INTRODUCCIÓN Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinación entre los antígenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero del paciente. Para el desarrollo de la técnica, normalmente se siguen las instrucciones del proveedor. - Reacción de Widal: Para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante. La reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensión de antígenos conocidos de Salmonella typi, S. paratyphi A y S. paratyphi B. - Reacción de Huddleson: Para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis). - Reacción de Weil-Felix: Para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OX-K). En esta prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo. MATERIALES Y MÉTODOS I. Obtención de la muestra sanguínea 1. Se revisan ambos brazos del paciente para localizar una vena adecuada. 2. En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule látex, aproximadamente a 6 cm por encima de la vena. 3. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar antes de sangrar, para evitar posibles reacciones alérgicas y que no arda. 4. Introduzca la aguja del vacutainer paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando que el bisel de la aguja, quede con el orificio hacia arriba. 25 5. Se introduce el tubo para recolección de muestra, en el soporte del vacutainer y automáticamente se obtendrán 3 ml. 6. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga más sangre del paciente. 7. Deje coagular la sangre y centrifugue. 8. Separe el suero con una pipeta pasteur y deposítelo en un tubo limpio, para las pruebas serológicas. 9. Deje coagular la sangre y centrifugue, separe el suero con una pipeta Pasteur para desarrollar las reacciones. II. El desarrollo de la técnica, se efectúa utilizando un juego comercial de reactivos, siguiendo las instrucciones del proveedor. Antígenos comerciales: Brucella (B. abortus) Paratífico B (flagelar) Tífico O (somático) Tífico H (flagelar) Paratífico A (flagelar) Proteus OX-19 Prueba cuantitativa Pozo # Suero mL Antígeno Aglutinación Título 1 0.08 1 gota 4+ 1:20 2 0.04 1 gota 4+ 1:40 3 0.02 1 gota 3+ 1:80 4 0.01 1 gota 2+ 1:160 5 0.005 1 gota 1+ 1:320 6 suero 1 gota 3+ 1:80 control (+) 7 suero 1 gota Sin aglutinar - control (-) 26 Interpretación de los resultados: Se observa la aglutinación macroscópicamente y se valoran los resultados en la siguiente forma: positividad Aglutinación 4+ 100 % 3+ 75 % 2+ 50 % 1+ 25 % 0 - Los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas 1:80 o mayor. Pueden persistir por meses o años. Un título tífico somático (O) significativo es 1:80, pero mayor es importante. Para el tifo, el menor título significativo es 1:80. Un aumento cuádruple se considera importante. Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete días. Si en la segunda muestra se encuentra un título más elevado que en la primera, indicará una infección activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un título menor que en la primera, indica que el paciente está en recuperación y los anticuerpos detectados son de memoria. RESULTADOS Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tífico “O” positivo 1:80, Proteus negativo, etc. Interprete los resultados. DISCUSIÓN Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cómo se puede saber en base al título obtenido, si el resultado de una titulación alta es como consecuencia de una infección activa actual, o de inmunoglobulina (IgG) de memoria. 27 CONCLUSIÓN PARÁCTICA #4 BACTERIÓFAGOS OBJETIVO DE LA PRÁCTICA El alumno aprenderá a manejar los fagos en el laboratorio y conocerá su importancia en la Microbiología. INTRODUCCIÓN. Las bacterias son huéspedes de un grupo especial de virus denominados bacteriófagos o "fagos". Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la multiplicación viral y estudios de ingeniería genética; es necesario el conocimiento previo del ciclo de vida del bacteriófago para entender uno de los mecanismos por los cuales los genes bacterianos pueden transferirse de una bacteria a otra. Por otro lado, también son muy útiles en la tipificación de cepas bacterianas en estudios de investigación. Fago FAGOS LÍTICOS Este tipo de fagos se replica dentro de la bacteria huésped causando su lisis y liberando nuevos fagos. Los fagos más estudiados hasta ahora son los de Escherichia coli, mismos que se han designado con la letra T y diferentes números. Los fagos virulentos al destruir a las 28 bacterias producen placas de lisis que se tornan evidentes en cultivos de la bacteria huésped, en placas de agar. Fago lítico FAGOS LISOGÉNICOS (temperados o moderados): Los fagos lisogénicos o temperados son aquellos que bien pueden multiplicarse vía el ciclo lítico o entran en un estado quiescente en la célula. En este estado quiescente la mayoría de los genes del fago no se transcriben; el genoma del fago existe en un estado reprimido. Al DNA del fago en este estado reprimido se le conoce como profago porque no es un fago pero posee el potencial para producir fagos. En la mayoría de los casos el DNA de fago realmente se integra en el cromosoma del huésped y se replica junto con el cromosoma del huésped y se transmite a las células hijas. La célula que alberga un profago no se ve negativamente afectada por la presencia del profago y el estado lisogénico puede persistir indefinidamente. A la célula que alberga un profago se le conoce como lisógena. El genoma del fago se replica sincrónicamente con el cromosoma bacteriano, pasando a la progenie. En este estado lisógeno, los fagos integrados al cromosoma bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógena expresar nuevas actividades y producir nuevas proteínas, pueden modificar la estructura del polisacárido 29 bacteriano y su antigenicidad, o puede codificar la producción de toxinas en bacterias que causan enfermedades humanas. En cualquier momento en que la bacteria lisogénica quede expuesta a condiciones adversas, el estado lisogénico puede ser terminado. Este proceso se le llama inducción. Las condiciones que favorecen la terminación del estado lisogénico incluyen: desecación, exposición al la luz UV o radiación ionizante, exposición a químicos mutagénicos, etc. MATERIALES Y MÉTODOS. ENSAYO PARA DETERMINAR FAGOS LÍTICOS. I. PRUEBA CUALITATIVA. Una placa se define como el área clara que resulta de la lisis de bacterias. Cada placa se origina de un solo fago infeccioso. A la partícula viral infecciosa que da origen a la placa se le llama una unidad formadora de placa (ufp) Procedimiento: 1. Siembre una placa de agar-cerebro-corazón, depositando en la superficie 0.2 ml de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago. 2. Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con una asa bacteriológica. 3. A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en cada uno deje caer una gotita de suspensión del colifago, usando una pipeta Pasteur. 4. Incube a 37 C por 24 hs. 5. Determine la formación de placas de lisis (áreas circulares sin crecimiento de la bacteria), equivalentes a zonas de bacterias lisadas por replicación del fago. II. PRUEBA CUANTITATIVA POR DILUCIÓN EN PLACA. 1. Haga diluciones de una suspensión del fago en la forma siguiente: En un tubo estéril coloque 0.5 mL del fago, más 4.5 mL de caldo cerebro corazón (c.c.c.). 2. De ahí transfiera 0.5 mL a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica (s.s.f.) para diluir 1: 10 y continúe haciendo diluciones hasta 1:1000 000. 3. De cada dilución del fago, transfiera 0.1 mL a tubos conteniendo 0.l mL de la bacteria. Mezcle e incube a 37 oC por 20 min. 30 4. Al cabo de ese tiempo adicione a cada tubo 4 mL de agar cerebro corazón blando (0.5% de agar), mezcle y vacíe sobre placas de agar cerebro corazón en cajas de Petri. 5. Deje solidificar e incube a 37 oC durante 24 hs. Determine las placas líticas (calvas) y cuéntelas. 6. Para calcular el número de partículas de fago / mL, cuente el número de placas líticas en las cajas de cultivo y aplique la fórmula: UFP / ml = PV x FD, en la cual: PV = número de placas líticas virales FD = Factor de dilución de la caja de Petri UFP / mL = unidades formadoras de placas / mL de suspensión del fago. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES CUESTIONARIO 1. Investigue las posibles aplicaciones de bacteriófagos, en el laboratorio. 2. Haga una lista de enfermedades humanas causadas por bacterias, cuya patogenicidad es conferida por fagos lisogénicos 31 PRÁCTICA #5 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS-B OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que el alumno desarrolle dos técnicas serológicas diferentes, para el diagnóstico del Virus de la Hepatitis-B en suero humano y comprenda el fundamento. INTRODUCCIÓN El virus de la hepatitis B es el miembro más importante de los Hepadnavirus, infecta el hígado, sólo de humanos y chimpancés. El virión completo es una partícula esférica de 42 nm de diámetro. La principal proteína es el antígeno de superficie (HBsAg). La nucleocápside contiene el ADN circular, parcialmente bicatenario, una ADNpolimerasa y el antígeno del "core" (HBcAg); en la superficie de este antígeno se experesa otro, llamado antígeno "e" (HBeAg) y es uno de los principales constituyentes de la cápside. El suero de los individuos infectados muestra más partículas virales incompletas, que viriones. Por microscopía electrónica se pueden observar tres tipos de partículas, compuestas de proteína, lípidos y carbohidratos, pero sin contener ácido nucleico: a) partículas completas de 42 nm, b) partículas esféricas de 22 nm, y c) partículas tubulares de longitud variable hasta de 200 nm. El antígeno de superficie (HBsAg) se halla en la cubierta y en la superficie de las partículas esféricas y filamentosas y éste mismo induce la aparición de una inmunidad protectora; está compuesto por lípidos y por siete o más polipéptidos que contienen los determinantes específicos de grupo y de tipo del VHB. Las infecciones agudas y crónicas se diferencian entre sí por la prevalencia del HBsAg en el suero y por el patrón de anticuerpos frente a los antígenos HBs y HBc. Por lo que respecta a los linfocitos B no pueden fabricar anticuerpos hasta que no detectan los antígenos y, por otro 32 lado, los anticuerpos unidos a los antígenos en forma de complejos no se pueden determinar. Los antígenos HBsAg y HBeAg pueden detectarse en el laboratorio. En la mayoría de los casos de hepatitis aguda por virus B, el HBsAg desaparece en pocas semanas o meses. La persistencia del HBsAg por más de 6 meses sugiere un estado de portador. Conforme el título de HBsAg declina en la hepatitis aguda, empiezan a aparecer anticuerpos contra HBsAg (es decir anti-HbsAg). Estos anticuerpos son neutralizantes y su ausencia se correlaciona con estado de portador. El VHB resiste el éter, los pH reducidos, la congelación y temperaturas moderadamente altas, lo que facilita su transmisión de un individuo a otro mediante sangre, vía percutánea y contacto personal íntimo. El VHB es una de las principales causas de carcinoma hepatocelular en el mundo; de hecho, la infección por el VHB puede ser la causa de más del 80% de los carcinomas hepatocelulares. Esto es particularmente cuando el paciente es HBeAg-positivo. En una infección aguda por el VHB se puede distinguir de una infección crónica por la presencia de anticuerpos (IgM) contra HBcAg. Los exámenes que detectan HBsAg y HBcAg y anticuerpos contra HBcAg, HBsAg y HBeAg (el panel de la hepatitis B) se utilizan en el diagnóstico. Debido a las grandes cantidades de HBsAg que no están asociados con virus infeccioso, la presencia de HBeAg es el mejor marcador para el virus infeccioso. Los anticuerpos anti-HBsAg detectables no se elevan hasta unos ocho meses después de la infección, mientras que el antígeno, HBsAg, es detectable mucho antes y después disminuye. El fracaso para detectar anti-HBsAg en los principios de la infección no es debido a la falta de los anticuerpos, sino que son indetectables porque forman complejos con la gran cantidad de antígeno que se libera de las células infectadas. El período de alrededor de seis a ocho meses, cuando no pueden ser detectados ni HBsAg libres ni sus anticuerpos, es conocido como la "ventana de HBsAg". Este fenómeno también se aplica a HBeAg que es liberado de las células infectadas, aunque en un grado mucho menor; Por lo tanto, la mejor herramienta para el diagnóstico de una infección aguda por VHB durante la “ventana” es la presencia de IgM anti-HBc. 33 MATERIALES Y MÉTODOS. I.- PRUEBA SEROLÓGICA DE HEMAGLUTINACIÓN INVERSA PARA EL VHB. Esta técnica se basa en la detección del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B (antígeno HBs) en suero del paciente. En la hemaglutinación inversa, se cubren eritrocitos de pollo con anticuerpos antihepatitis-B de superficie, previamente preparados en cobayos. En esta técnica se buscan antígenos en el suero del paciente, a diferencia de la hemaglutinación directa, donde se buscan anticuerpos en el suero. En esta prueba los eritrocitos de pollo son sensibilizados con inmunoglobulina (IgG) altamente purificada, anti-HBs, obtenida de cobayos. Esta aglutinación inversa es específica cuando existe antígeno de HBs en el suero (o plasma) del paciente. La técnica ofrece varias ventajas prácticas, en comparación con otras, ya que detecta al antígeno con mayor sensibilidad, es sencilla y no requiere mucho tiempo (aproximadamente una hora) y se puede leer a simple vista. JUEGO DE REACTIVOS COMERCIALES: Los reactivos comerciales se utilizarán en el desarrollo de la prueba, siguiendo las instrucciones del proveedor. 34 1. Reactivo diluyente de absorción: Buffer de fosfatos salino que contiene suero normal de conejo y de cobayo para diluir la muestra de suero, así como para reconstituir las Células Sensibilizadas y las Células Control. 2. Células Sensibilizadas con Anticuerpos (liofilizadas): Contiene eritrocitos de pollo, sensibilizados con inmunoglobulina anti-HBs. Para la reconstitución se agrega la cantidad especificada de diluyente de absorción, en el momento de usarse. 3. Células Control (liofilizadas): Preparación de eritrocitos de pollo sensibilizados con IgG normal de cobayos. Para la reconstitución agregue la cantidad especificada de diluyente de absorción en el momento de usarse. 4. Suero Control (líquido): Una dilución 1:10 de suero humano positivo inactivado (con título de 1:320) para el antígeno HBs que contiene 20 ng/mL del antígeno HBs. 5. Absorbente (liofilizado): Debe usarse para la absorción del suero de prueba. En el momento de usarlo se agrega la cantidad especificada de diluyente de absorción. Procedimiento: 1. Preparación del suero problema: Se obtienen 3 ml de sangre del paciente, se deja coagular y se centrifuga. El suero no debe contener eritrocitos ni otros componentes visibles del plasma. 2. Ejecución de la prueba Cualitativa: Realice la prueba en una microplaca, usando dos pozos para cada muestra de suero, como se muestra en la tabla: P ozos Reactivos I II III 1V Diluyente 100 µL 25 µL 25 µL descartar Suero problema 25 µL mezclar 25 µL 25 µL 25 µL Células control 25 µL Células 25 µL sensibilizadas Agite 5 min y cubra la placa para evitar la evaporación. Deje reposar 1 hora a temperatura ambiente. Interpretación de los resultados: La prueba es positiva, cuando se observa: 35 1) Asentamiento de los eritrocitos en forma de anillo mayor en diámetro y más delgado que el del control. 2) Eritrocitos aglutinados dispersos uniformemente en el fondo. II.- PRUEBA SEROLÓGICA DE ELISA Se utiliza un juego de reactivos comerciales, siguiendo las instrucciones del proveedor. Los reactivos se utilizarán en la prueba, 1 - Microplaca R2 - Solución de lavado concentrado 20X. Diluir 1:20 el reactivo con agua destilada R3 – Control Negativo R4 – Control Positívo Conjugado, mezclar R6 + R7 y dejar reposar 10 min. R8 + R9 Solución de revelado. Diluir el reactivo R9 en el reactivo R8 1:11, ej: 1 mL. de R9 en 10 mL de R8. R10 – Solución de parada o sol. stop Procedimiento: 1.- Colocar 100µL de la muestra en un primer pozo de la microplaca y en sus respectivos pozos el control positivo y el negativo. 2.- Agregar 50µL del conjugado (agitarlo previamente), homogenizar 3.- Tapar con película adhesiva y esperar 1 hora 30 minutos, incubando a 37 oC 4.- Retirar la película después del tiempo de reposo y aspirar el contenido de los pocillos 5.- Lavar 5 veces con la solución de lavado e invierta la placa sobre papel absorbente 6.- Distribuir 100 µL de la solución de revelado en cada muestra o control, dejar que la reacción se desarrolle en la oscuridad a temperatura ambiente sin cubrir. 36 7.- Agregar a cada pozo utilizado 100µl de solución de parada, homogenizar la mezcla de reacción Interpretación de los Resultados: Una coloración amarilla significa Positivo; Incoloro es negativo. Prueba de ELISA en Microplaca: Los pozos coloreados indican reactividad. Mientras más oscuro es el color, mayor reactividad. RESULTADOS Y DISCUSION CONCLUSIONES CUESTIONARIO. 1. Haga un esquema del VHA y uno del VHB. 2. Investigue la incidencia del virus de la Hepatitis A, Hepatitis B y Hepatitis C, en México. 3. Investigue el riesgo de contraer cáncer hepático en portadores de Virus de la Hepatitis A, B yC 4. Mencione otras técnicas comerciales utilizadas para el diagnóstico del virus de la Hepatitis-B. Compare su sensibilidad, su especificidad y otros aspectos. 37 PRÁCTICA # 6 DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Conocer una técnica serológica común para diagnóstico de rotavirus y comprender su fundamento. INTRODUCCIÓN. Los Rotavirus forman un grupo de virus productores de gastroenteritis en mamíferos y aves. Desde 1973 se conocen como agentes comunes causantes de diarrea infantil. Pertenecen a la familia de los Reovirus y son icosaédricos, de 65-75 nm de diam. Presentan una cápside de doble capa, un genoma ARN bicatenario y segmentado que es inactivo como ARNm. En la primera etapa de replicación, ocurre la transcripción de la cadena menos, como matriz para fabricar el ARNm. Los Rotavirus se dividen en: - Grupos. Se basan en la antigenicidad de la proteína VP6 y en la movilidad electroforética de los segmentos del genoma. - Subgrupos. Son definidos por la fijación del complemento y dependen de la proteína de la cápside interna VP6. - Serotipos. Se determinan por reacciones de neutralización y dependen de la proteína VP7. Se han identificado rotavirus en casi el 40% de las heces de niños con gastroenteritis,. Las gastroenteritis por virus entéricos, pueden resultar mortales en poblaciones de riesgo como niños, ancianos o individuos inmunodeprimidos. Su transmisión tiene lugar por vía oral – fecal, siendo el periodo de incubación entre 1 a 3 días . Los síntomas característicos son vómito, diarrea acuosa por 3 a 8 días, fiebre y dolor abdominal. Entre las técnicas de diagnóstico se incluyen la detección directa del antígeno, el aislamiento en cultivos celulares y el diagnóstico serológico. La detección directa del antígeno viral en heces representa el método diagnóstico de elección. La disponibilidad de anticuerpos específicos ha permitido el empleo del inmunoensayo enzimático y la aglutinación con látex. Se prefieren estos métodos por rápidos, sencillos, relativamente económicos y efectivos. 38 MATERIALES Y MÉTODOS PRUEBA DE AGLUTINACIÓN DE LÁTEX. Mediante la técnica se detecta el antígeno VP6 de la cápside viral de Rotavirus Gpo. A, utilizando anticuerpos monoclonales conjugados a partículas de látex rojas. Para el desarrollo del método se utiliza un juego comercial de reactivos y se siguen las instrucciones del proveedor. 1.- La muestra de heces se coloca en un tubo que contiene la solución para extracción de los antígenos del virus. 2.- Se colocan unas gotas de la solución obtenida de la extracción, en la placa de reacción. 3.- La muestra fluye a través del absorbente; el conjugado del anticuerpo marcado con colorante, se une al antígeno de Rotavirus de la muestra, formando un complejo antígeno- anticuerpo, produciendo una banda de color rosado de la membrana de la placa reacción, que significa Reacción Positiva. 4.- En ausencia de Rotavirus, no se produce la línea colorida 5.- Se observa la línea de color, de acuerdo con el contenido viral, a los 5 minutos de incubación a temperatura ambiente. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Anote detalladamente la técnica desarrollada y lo que ocurrió en cada paso. Interprete los resultado, consultando con la literatura. CONCLUSIONES 39 CUESTIONARIO. 1. Investigue en la literatura la sensibilidad de esta técnica y su especificidad, en comparación con otras comunes en el mercado para los Rotavirus Gpo. A., describa las diferencias. 2. Qué enfermedades pueden confundirse con la causada por rotavirus 3. Que técnicas se utilizan para el diagnóstico de los Rotavirus –Gpo. B y del Gpo. C. 40 PRÁCTICA # 7 DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DE LA RUBEOLA OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Desarrollar una técnica serológica común para diagnóstico de rubeola y comprender su fundamento. INTRODUCCIÓN La rubeola es un virus respiratorio, que causa una enfermedad exantemática leve en los niños, pero de serias consecuencias para los neonatos. La rubeola materna causa graves defectos congénitos. Los virus de la rubeola (sarampión alemán) comparten propiedades estructurales y el modo de replicación de los togavirus, pero se diferencian en la vía de diseminación y transmisión. Son partículas esféricas de 60-70nm, con tres tipos de proteínas estructurales asociadas con la envoltura viral y una proteína que forma parte de la nucleocápside interna. El virión contiene una densa región central rodeada por una doble capa de lípidos. Son virus con ARN monocatenario. Muy posiblemente el 50% de las infecciones son aparentemente subclinicas y muchas no son reconocidas, incluso cuando están presentes los síntomas (el exantema no siempre se presenta). Hay infecciones con muchos otros agentes que ocasionan síntomas similares a la rubeola, tales como infección por parvovirus humano, ciertos arbovirus, muchos de los enterovirus del grupo de los picornavirus, algunos adenovirus, Epstein-Barr virus (EBV), fiebre escarlatina, etc. El diagnóstico suele confirmarse por la presencia de anticuerpos IgM específicos. Un incremento del 400% en las tasas de IgG, entre la fase aguda y la convalecencia indica infección reciente. Los anticuerpos contra el virus se determinan al principio del embarazo, para conocer el estado inmunitario de la paciente. Puede permanecer indetectable en personas asintomáticas. Se previene con la vacuna a base de virus vivos, subcutáneamente. 41 MATERIALES Y MÉTODOS. TÉCNICA DE ELISA (inmunoabsorción unida a una enzima) Es un método sensible y fiable para la detección de la rubeola. Está diseñado para detectar anticuerpos de tipo IgM contra el virus de la rubeola en suero humano. Los pocillos están sensibilizados mediante adsorción pasiva del antígeno de la rubeola. El sustrato cromógeno es medido por espectrofotometría, cuantificando así la cantidad producto enzimático marcado, resultante de la reacción inmunológica por unión antígeno-anticuerpo. En este método se hace reaccionar suero del paciente con antígenos específicos del virus de la Rubeola, utilizando el juego comercial de reactivos, siguiendo las instrucciones del proveedor. PROCEDIMIENTO: 1.- Los reactivos deben haber estado un rato a temperatura ambiente 2.- Diluir 1 mL del buffer de lavado con 9 mL agua destilada 3.- Preparar una dilución 1:40 de muestras del suero problema y controles. Para el efecto se mezclan 5µL de suero y 200 µL de diluyente 4.- Colocar 100 µL de muestra diluída en los pozos de reacción 5.- Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos 6.- Lavar tres veces con buffer diluído 7.- Agregar 100 µL de la enzima conjugada a cada pozo 8.- Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos 9.- Lavar tres veces con el buffer diluído 10. Agregar 100 µL de sustrato cromogénico a cada pozo 11. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos 12. Agregar 100 µL de HCl 2N para detener la reacción 13.- Asegurarse que no hay burbujas 14.- Leer en el espectrofotómetro con luz visible 15.- La intensidad de color marcará la positividad 42 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Interprete los resultados y discútalos. CONCLUSIONES CUESTIONARIO. 1. Investigue cuál es la incidencia de la Rubeola en México. 2. Qué otros virus causan síntomas semejantes al de la rubeola. 3. Qué otras técnicas se conocen para el diagnóstico de la rubeola, y diga brevemente en qué consisten. Comparar su sensibilidad y especificidad. 43 PRÁCTICA #8 VIRUS DE LA RABIA OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que el alumno conozca ejemplos de virus productores de inclusiones en el célula huésped y que aprenda a diferenciarlos dentro de ella. INTRODUCCIÓN La rabia es una enfermedad que se presenta en todo el mundo y se transmite principalmente por mordida de un animal rabioso. Menos del 10 % son por rasguño o por aerosolización de los murciélagos. El virus de la rabia pertenece al grupo de los Rabdovirus. Presenta forma de bala y mide 70 nm x 170-200 nm, con una sola cadena de RNA. La nucleocápside helicoidal está cubierta de lípido, mismo que obtiene al brotar a través de la membrana plasmática de la célula huésped, ya que se replican en el citoplasma celular. De acuerdo con el Centro para la Prevención y Control de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, más del 90% de los casos de rabia reportados ocurren en animales silvestres; antes de 1960, la mayoría se presentaban en animales domésticos. Actualmente los principales huéspedes rabiosos son carnívoros silvestres y vampiros (murciélagos hematófagos, se alimentan de sangre de animales y humanos). El virus penetra al huésped a través de la herida causada por el animal rabioso y se replica de manera local dentro de las fibras musculares. Después migran a la unión neuromuscular y se replican dentro de las células neuronales y posteriormente infectan los nervios de todo el sistema nervioso central. A continuación infectan los nervios motores, sensoriales y autónomos y regresan a los órganos periféricos. La saliva también está muy infectada. En humanos el diagnóstico normalmente es en base a los síntomas en personas que sufren mordeduras de animales. La presencia de virus de la rabia en un animal o una persona infectada.está.determinada.por.múltiples.pruebas: - Serología. Búsqueda de anticuerpos contra la rabia, los cuales pueden ser detectados pero sólo.muy.tarde.en.la.enfermedad. 44 - Detección del antígeno por inmunofluorescencia a partir de biopsias de piel, de cerebro o especímenes..de..córnea. - La saliva puede ser examinada para detección del ARN del virus de la rabia por RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa). - Aislamiento del virus. Estas pruebas incluyen el cultivo de virus en el cerebro de ratones o en cultivo de tejidos, después de lo cual se utilizan pruebas de antígeno para determinar la presencia del virus. - Histológicamente muy característica es la presencia de cuerpos de Negri. Estos son inclusiones intracitoplasmáticas eosinofílicas formadas por agregados de nucleocápside en las neuronas de aproximadamente 50 a 80% de los seres humanos infectados. Son típicos de la rabia, pero los resultados tienen que ser leídos por alguien con experiencia en la rabia y puede haber falsos positivos - por lo que todos estos resultados necesitan ser confirmados por otro método. Cuando se sospecha que un animal presenta rabia, se le sacrifica y se revisan impresiones de contacto del cerebelo, el hipocampo y la médula. Las células cerebrales infectadas comúnmente muestran la presencia de cuerpos de inclusión del virus rábico, denominados cuerpos de Negri. MATERIALES Y MÉTODOS. Haga observaciones de las inclusiones “Cuerpos de Negri” en laminillas con impresiones de cerebro de animal rabioso. Para evitar el riesgo de una posible contaminación con el virus, se manejarán laminillas ya fijadas y teñidas. Haga observaciones a 40 y 100 X. Haga dibujos de las inclusiones. En base a la literatura, haga dibujos del virus de la rabia, del virión completo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Interprete los resultados. CONCLUSIONES 45 CUESTIONARIO Diga de qué están formadas las inclusiones observadas en el virus de la rabia, de acuerdo con la literatura. Investigue si la composición de las inclusiones es igual en otras clases de virus humanos y en que difiere. Investigue en la literatura, en cuáles otros virus humanos se pueden detectar cuerpos de.inclusión en las células afectadas. 46 47 PRÁCTICA # 9 VIRUS CARCINOGÉNICOS. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Conocer los virus que inducen la formación de carcinomas y los mecanismos. INTRODUCCIÓN TIPOS DE CÁNCER El cáncer puede resultar de la proliferación de cualquier tipo de célula. La distinción más importante para el paciente está entre tumores benignos, los cuales permanecen confinados a su sitio de origen, y los tumores malignos pueden invadir tejidos normales y diseminarse a través del cuerpo. DESARROLLO DEL CÁNCER Los tumores se desarrollan a partir de células únicas alteradas que comienzan a proliferar anormalmente. Las mutaciones adicionales conducen a una selección de células con capacidad para incrementarse progresivamente, por proliferación, sobrevivencia, invasión y metástasis. CAUSAS DEL CÁNCER La radiación y muchos carcinogénicos químicos actúan por daño del DNA e induciendo mutaciones. Otros carcinogénicos químicos contribuyen al desarrollo del cáncer por estimulación de la prolifercaión celular. Los virus también causan cáncer en humanos y otras especies. PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS CANCEROSAS: La proliferación sin control de células cancerosas es reflejada en los requerimientos reducidos para factores de crecimiento extracelulares y carecen de inhibición por contacto célula-célula. Muchas células cancerosas también son defectuosas en la diferenciación, misma que es consistente cuando se continúa su proliferación continuada "in vivo". La falla de las células cancerosas a sufrir apoptosis (muerte celular programada), también contribuye substancialmente al desarrollo de un tumor. PROTO-ONCOGENES Y ONCOGENES. 48 Los proto-oncogenes son genes que están incluídos en el genoma humano, regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Sus proteínas se expresan en diferentes momentos del ciclo y son imprescindibles para su regulación. En principio, el término proto-oncogén puede ser confuso, ya que implica de forma errónea que estos genes existen con el único fín de expresar un fenotipo tumoral, cuando realmente su función es esencial para la regulación del ciclo celular. Determinados cambios estructurales y/o funcionales en los proto- oncogenes contribuyen a la malignización de la estirpe celular, convirtiéndolos en oncogenes. Estos oncogenes originarán proteínas con expresión/función alterada que favorecerán el crecimiento y/o la invasividad tumoral. La mayoría de las proteínas oncogénicas funcionan como elementos que señalan las rutas que estimulan la proliferación celular. El gene que codifica la cyclin D1 también es un oncogene potencial, que estimula la progresión del ciclo celular. Otras proteínas oncogénicas interfieren con la diferenciación celular y con el Bcl-2 que inhibe la apoptosis. Las células tumorales también pueden presentarse por medios no genéticos, por medio de acciones de virus específicos tumorales. Los virus tumorales son de dos tipos distintos: a) Virus con genoma de ADN, tales como el virus del papiloma y los adenovirus y b) virus con genoma de ARN, como los retrovirus. La investigación de estos genes, ha ido asociada a los avances que se han realizado en biología molecular sobre los genes transformantes de los virus. De esta manera se descubrió la relación entre el virus del papiloma humano y cáncer de cérvix, del virus VHB y el cáncer hepático, del Virus de Epstein Barr (VEB) y el linfoma de Burkitt, entre otros. Los oncogenes sólo precisan ser mutados en un alelo, para que se produzca la sobre- expresión de una proteína dada y ésta ejerza su acción promotora. En cambio, en los genes supresores es necesario que estén mutados los dos alelos, de forma que el gen no se exprese de ninguna manera (si uno de los alelos permaneciera inalterado podría producir la proteína supresora normal). Este es el motivo por lo que a los primeros se les conoce como oncogenes dominantes y a los últimos oncogenes recesivos. GENES SUPRESORES DE TUMORES El prototipo es el gene Rb. La pérdida o inactivación mutacional de Rb y otros genes supresores de tumores como el p53, contribuyen al desarrollo de tumores cancerosos. FUNCIONES DE PRODUCTOS DE LOS GENES SUPRESORES DE TUMORES 49 Las proteínas codificadas por la mayoría de los genes supresores de tumores actúan como inhibidoras de proliferación celular. Algunas son reguladoras negativas de la progresión del ciclo celular. Un ejemplo es la proteína p53 requerida para la apoptosis, inducida por daño del DNA y otros estímulos; por lo tanto su inactivación permite que las células sobrevivan. VIRUS TUMORALES Virus de la Hepatitis B: Causa cáncer en humanos y otras especies. SV40 y Polyomavirus: Aunque ninguno de los dos causa cancer en humanos, son modelos importantes para estudiar la biologimolecular de la transformación celular. El antígeno del SV40 induce transformación al interactuar con las proteínas celulares supresoras de tumor Rb y p53. Herpesvirus: Se encuentran entre los más complejos virus animales, causando cáncer también en humanos. Retrovirus: Causan cáncer en humanos y animales. Algunos contienen genes específicos responsables de la inducción de transformacion celular. Su estudio ha conducido a la caracterización de oncogenes virales y celulares. Adenovirus: No causan cáncer humano pero son modelos para investigación de cáncer. Papilomavirus: Inducen tumores en animales y humanos, incluyendo carcinoma cervical humano. Sus proteínas de transformación interactúan también con el Rb y p53. A la mayoría de las mujeres se les diagnostica el VPH sobre la base de resultados anormales en la prueba del Papanicolau. En la siguiente figura se observa la Patogenia de la infección por el virus del papiloma humano VPH. Acciones de las distintas proteínas codificadas por VPH. Una vez que las células son infectadas por VPH comienza la replicación del virus gracias a factores de transcripción de la célula hospedera y la proteína E1 viral. E7 se une la proteína retinoblastoma dejando libre al factor de transcripción E2F, lo que permite la activación de genes que aumentan la proliferación celular. La oncoproteína E6 es capaz de inducir la ubiquinización y posterior degradación de p53, lo que conlleva a disminución de la 50 apoptosis mediada por p53. E2 regula la transcripción de las oncoproteínas E6 y E7. La proteína E5 aumenta la acción de las kinasas celulares lo cual promueve la proliferación y disminuye la diferenciación celular. E4 ayuda al ensamblaje de las proteínas de la cápside viral L1 y L2 para el empaquetamiento de los viriones de VPH: MATERIALES Y MÉTODOS En la mayoría de las mujeres se les diagnostica el VPH sobre la base de resultados anormales en la prueba de Papanicolau, la cual constituye la herramienta primaria de detección del cáncer cervical o cambios precancerosos en el cuello uterino, muchos de los cuales están relacionados con el VPH. Asímismo, existe una prueba específica para detectar el VPH en el ADN de las mujeres. 1. Obtenga del profesor una preparación fija, conteniendo muestra de raspado del cérvix o útero, teñida con Papanicolau, positiva al VPH. 2. Determine la presencia de células anormales (cancerosas) y note las diferencias con respecto a las normales. Haga dibujos. DISCUSIÓN CONCLUSIONES 51 BIBIOGRAFIA Sobre diagnóstico de virus Arens M. 1999. Methods for Subtyping and Molecular Comparison of Human Viral Genomes Clin. Microbiol. Rev. 12: 612-626 Boonham,N., J. Kreuze, S. Winter, R.van der Vlugt, J.Bergervoet, J.Tomlinson, R. Mumford. 2014 . Methods in virus diagnostics: from ELISA to next generation sequencing. Virus Res. 186:20-31. CDC. 2014. Genital HPV Infection - Fact Sheet. Human papillomavirus (HPV) is the most common sexually transmitted infection in the United States. Some health effects caused by HPV can be prevented with vaccines. http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm GreerS, G.J.Alexander.1995 Viral serology and detection. Bailliers Clin. Gastroenterol. 9(4):689-721. Grandien M. 1996. Viral diagnosis by antigen detection techniques. Clin.Diagn.Virol. 5(2-3):81-90. Illumina. 2013 Viral Detection and Research. A review of publications featuring Illumina Technology. Illumina, Inc. All rights reserved. Pozo F, I.Casas, G.Ruiz, A.Falcón. y P. Pérez-Breña P. 2008. Aplicación de los métodos moleculares al diagnóstico y el estudio epidemiológico de las infecciones respiratorias causadas por virus. Enferm Infecc Microbiol Clin. 26 Supl 9:15-25 52 SECCION II PRÁCTICAS DE MICOLOGÍA 53 PRÁCTICA # 10 CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Aprender a determinar las características macro y microscópicas más sobresalientes de algunos grupos de hongos (mohos y levaduras) patógenos humanos y comprobar su alta distribución en el ambiente. INTRODUCCIÓN Dentro de la división Eukaria se encuentra el reino Fungi que incluye a los hongos. El cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular. Los hongos se dividen según su morfología: a) hongos filamentosos formados por hifas (pluricelulares), a éstos se les conoce como mohos y están formados por hifas microscópicas que consisten de filamentos tubulares ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocíticas (sin divisiones y multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de hifas constituye el micelio. En las hifas se producen diferentes clases de esporas reproductivas, tales como esporas asexuales (conidios, esporangiosporas) o esporas sexuales, como las ascosporas y las basidiosporas. b) las levaduras son unicelulares, se reproducen asexualmente por blastoconidios (gemación). Dimorfismo es la condición en la que un mismo hongo puede exhibir ya sea la forma de levadura o la forma de hifa, dependiendo de las condiciones de crecimiento, sea parásito o saprófito. 54 La presencia / ausencia de conidios y su tamaño, forma y ubicación son las características principales utilizadas en el laboratorio para identificar las especies de hongos en muestras clínicas. CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS HUMANOS Los hongos patógenos humanos se encuentran en tres divisiones dentro del reino de los hongos: Zygomycota (zigomicetos), Ascomycota (ascomicetos) y Basidiomycota (basidiomicetos). Los Zigomicetos se caracterizan por poseer micelios cenocíticos no- tabicados y reproducción sexual mediante zigosporas. Los Zigomicetos del orden Mucorales causan infecciones graves, de rápida evolución y frecuentemente fulminantes en pacientes inmunodeprimidos. Las especies más frecuentes pertenecen al género Rhizopus y a Mucor. Los Ascomicetos se caracterizan por tener hifas tabicadas y producir ascosporas endógenas en ascas. Pueden ser unicelulares o pluricelulares. Son la división más grande dentro del reino de los hongos y también la que cuenta con un mayor número de patógenos humanos, entre ellos Candida albicans y Aspergillus sp., últimamente Fusarium y Scedosporium. Los Basidiomicetos se caracterizan por producir basidiosporas en basidios, como resultado de una reproducción sexual. A este grupo pertenecen las setas comestibles. El género Cryptococcus se compone de organismos unicelulares encapsulados, responsables de la criptococosis que es una micosis sistémica. CLASIFICACION DE LOS HONGOS, SEGÚN EL AREA ANATÓMICA AFECTADA Uno de los métodos más comunes de clasificar las micosis humanas, se basa en la localización del hongo en el huésped, lo que refleja en parte su variable grado de severidad y su grado de invasividad. De acuerdo con este tipo de enfoque, las micosis se consideran superficiales (cutáneas: piel, uñas y cabello), subcutáneas (capas superiores de la piel, los huesos, los tendones y los músculos) y profundas (son sistémicas, causadas por hongos que infectan pulmón y se diseminan a todo el cuerpo). Los hongos patógenos oportunistas que normalmente no están asociados como patógenos en personas inmunocompetentes, pueden causar infecciones severas en las personas inmunodeficientes. Así también, llegan a producir enfermedades que varían en su gravedad, pudiendo asociarse con una infección superficial de 55 la piel o las mucosas hasta llegar a producir una afectación sistémica con afectación de múltiples órganos internos. Ejemplos comunes de hongos oportunistas son Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus y Pneumocystis carinii. IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS (MOHOS): Los hongos filamentosos presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo es más lento que el de las bacterias, necesitando varios días de incubación. Las características más empleadas para la identificación de los hongos filamentosos (mohos) son: el tipo de talo, la morfología macroscópica del micelio, micelio aéreo y profundo, es decir las características coloniales, tanto de frente como en el reverso. Las colonias de hifas son macroscópicas, de variados aspectos y colores (algodonoso, aterciopelado, polvoso. La morfología microscópica del micelio se refiere al tipo de hifas, estructura y modo de formación del cuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas: forma, tamaño, aspecto externo, agrupación, número de células, flagelos. Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificación se debe hacer por el examen macroscópico de la colonia: forma, color, textura, velocidad de crecimiento y reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproducción se emplea la técnica del scotch o cinta adhesiva transparente, que consiste en tocar la superficie de la colonia con la cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una gota de azul de lactofenol y observar al microscopio. Cuando no se puede conseguir una buena observación de las formas de reproducción por las técnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta técnica consiste en depositar sobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado según el género de hongo filamentoso que se presume, de 1 cm2 de superficie aproximadamente, en cuyos extremos se inocula el hongo problema (en profundidad). Posteriormente se le coloca un cubre encima y se incuba en cámara húmeda a 25ºC hasta observar crecimiento. Los criterios de identificación son fundamentalmente morfológicos basados en la presencia de estructuras de reproducción sexual, estructuras de reproducción asexual y características especiales de las hifas, cuya descripción pueden ser consultados en atlas micológicos. En ocasiones, la identifi-cación se complementa con pruebas bioquímicas, como la investigación de la ureasa, que diferencia T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum (negativo). 56 Todavía limitada a determinados laboratorios especializados, pero en continuo desarrollo, está la identificación molecular de los aislamientos fúngicos, basada en los mapas de restricción de fragmentos del operón ribosomal, digeridos con un panel de enzimas de restricción, que permite la elaboración de árboles filogenéticos. Aspergillus Penicilium levaduras IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificación de levaduras se requiere conocer además de la morfología, la determinación de características fisiológicas y bioquímicas, especialmente su acción sobre azúcares. La identificación de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otro líquido corporal estéril está plenamente justificada. También es conveniente la identificación de las levaduras de otras procedencias, sobre todo cuando ocurre de forma reiterada en diferentes muestras clínicas del mismo paciente, y siempre que se asuma que se trata de un organismo responsable de patología. La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiología (agar sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sin antibióticos añadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la identificación de levaduras. En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olor dul-zón agradable, volviéndose más pastosas a medida que la colonia envejece. Por lo general, las colonias de levaduras no desarrollan micelio aéreo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias. 57 Identificación convencional: Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera posibilidad de levaduras, se realiza un frotis en fresco. Si en el mismo se observan levaduras, se procede a la identificación mediante subcultivo a un medio cromogénico, Cromocandida. En el caso que no se trate de ninguna de las especies que este medio identifica, se procede a hacer la identificación mediante mediante alguno de los métodos comerciales. La identificación bioquímica debe completarse con una identificación morfológica mediante un subcultivo al medio agar harina de maíz con o sin Tween 80. Si se observa un micelio aéreo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate de un hongo dimórfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelio verdadero como Geotrichum, Dipodascus o Trichosporon. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formación de cápsulas y puede ser el paso inicial para la identificación de C. neoformans. Las colo-nias de color rojo–anaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso son características de las es-pecies del género Rhodotorula ( rhodo: rojo), color que manifiesta esta levadura por su riqueza en carotenoides. MATERIALES Y MÉTODOS I. AISLAMIENTO DE HONGOS DE DIFERENTES MATERIALES Mantenga abierta una caja de Sabouraud-agar-penicilina en el jardín, en alguna habitación, o en cualquier cualquier otro lugar, durante 15 min. Después de este tiempo tápela e incúbela a temperatura ambiente o a 28 oC, durante una semana, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos, las cuales pueden mostrar diferentes colores, con aspecto algodonoso, aterciopelado, velloso, polvoso, granuloso, etc. 1. En otra caja espolvoree unas cuantas partículas de polvo del jardín e incube igual. 2. Guarde en una bolsa de plástico unas fruta y verduras, incube igual y revise periódicamente, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos en los vegetales. 3. En una caja Petri coloque tierra del jardín e introduzca verticalmente hasta la mitad, varias uñas y pequeños manojos de cabellos. Humedezca la tierra con agua destilada. Incube igual, por varios días. Vigile diario y vuelva a regar la tierra con agua destilada, para impedir que se seque, hasta observar desarrollo de hongos, mismos que colonizarán las uñas y pelos. Guarde este cultivo de tierra, para observarlo en la siguiente práctica referente a Micosis Superficiales (no se utilizará en esta práctica). 4. Compare las colonias desarrolladas entre sí, tanto en los medios de cultivo como en los vegetales. Note las diferencias de la morfología colonial. Haga dibujos. 58 II. IDENTIFICACIÓN DE LOS HONGOS AL MICROSCOPIO 1. Coloque una gota de lactofenol en el centro de un portaobjetos. Enseguida corte un fragmento de cinta adhesiva transparente del largo de un portaobjetos y ayudándose con un lápiz, doble la cinta a la mitad con la parte adhesiva hacia afuera sujetando con los dedos los dos extremos. Adhiera la parte del doblez sobre la colonia del hongo y enseguida coloque la cinta sobre el portaobjetos, haciendo que coincida la muestra de la colonia del hongo con la gota de lactofenol, de tal forma que la cinta actúe como cubreobjetos. Observe al microscopio a 10 y a 40 X. 2. Trate de identificar los hongos hasta género, mediante una comparación de las hifas y esporas observadas al microscopio, con los claves de los libros. Haga dibujos detallados, con los nombres de las estructuras del hongo y el nombre del género identificado. 3. A partir de levadura para pan o cerveza, haga observaciones entre porta y cubre, en una gota de lactofenol. Haga dibujos. III. MICROCULTIVO DE CEPAS PURAS DE HONGOS: 1. Obtenga del profesor una caja de Petri conteniendo un círculo de papel filtro en el fondo, una varilla doblada en V, un portaobjetos y un cubreobjetos, previamente esterilizada. Debe acomodar en condiciones estériles, con una pinza estéril, el portaobjetos sobre la varilla. 2. Con un bisturí estéril, corte cuadros de agar-Sabouraud de aprox. 1 cm2 y acomode uno en el centro de cada portaobjetos, dentro de la caja. 3. Con una asa micológica obtenga fragmentos (aprox. 1 mm de diám.) de una colonia pura de un hongo, también obtenido del profesor y vaya inoculando el centro de cada lado del cuadro. 4. Enseguida cubra estérilmente el cuadro de agar con el cubreobjetos, humedezca el papel filtro con agua-glicerinada estéril, y tape la caja. Incube una semana a temperatura ambiente. 5. Separe cuidadosamente el cubreobjetos y móntelo sobre un cubreobjetos conteniendo una gota de lactofenol-azul de algodón. Por otro lado, separe el portaobjetos y en su centro deposite una gota de lactofenol, montando con un cubreobjetos. Cuide que en ninguna 59 preparación quede reactivo fuera del cubreobjetos. Selle los bordes de ambas preparaciones con barniz de uñas y deje secar. 6. Observe a 10 X y a 40 X. Haga dibujos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES 60 PRÁCTICA # 11 MICOSIS SUPERFICIALES OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que el alumno observe al microscopio las diferencias macro y microscópicas de los hongos causantes de infecciones superficiales y que conozca las técnicas de diagnóstico. INTRODUCCIÓN En las infecciones cutáneas del hombre por hongos Dermatophytos se afectan piel y sus anexos (pelos y uñas). En general, el daño está limitado a las capas cornificadas muertas, pero pueden presentarse diversos cambios patológicos en el huésped, debido a una reacción al hongo y sus productos. Causan enfermedades denominadas tiñas, incluyen los géneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton, con varias especies. Causan lesiones extendidas en forma circular o de anillo, son queratinolíticos y se reproducen por conidios. La mayoría se desarrollan en la tierra como saprófitos; las especies que afectan al hombre están restringidas a algunas zonas, siendo influídas por factores propios del huésped. Los hongos dermatophytos en la piel, crecen en la capa córnea de manera radiada, formando lesiones anulares con intensa reacción inflamatoria, la cual conduce a la destrucción y eliminación del hongo del área central, el micelio fúngico continúa su crecimiento de manera centrífuga hacia la piel no infectada. Las lesiones se transforman en placas anulares con un centro claro y el proceso inflamatorio se distribuye sólo en la periferia, a lo que se denomina “borde activo”, constituído por pápulas y/o vesículas. La infección inicial del cuero cabelludo es por la invasión del micelio dentro de la vaina externa del pelo, con crecimiento hacia el bulbo del pelo, mismo que se detiene en la zona de queratinización incompleta. El pelo se debilita y se rompe, dejando el pelo de pocos milímetros sobre la superficie de la piel (pseudoalopecia). En la infección de las uñas, la destrucción de la queratina es por la formación de canales, dentro de los cuales se presentan hifas. Es una manera de evidenciar la capacidad queratolítica de los hongos. Existen otras clases de micosis superficiales causadas por hongos que se desarrollan demasiado lejos del tejido vivo, en las cuales no hay patología por la presencia del hongo y suele haber una falta de respuesta celular del huésped. En estos casos los pacientes pueden no darse cuenta del trastorno. Aquí se incluyen las micosis siguientes: 61 - "Pitiriasis versicolor" causada por la levadura lipolítica Malassezia furfur, una infección crónica, asintomática, puede haber caspa en la cabeza o en áreas cutáneas en tórax, espalda y miembros, que cambian de color. "Costras de leche" en el cuero cabelludo de neonatos. - "Piedra" es causada por Trichosporon beigelii y Piedra hortae. Es una infección del talo piloso, procuciendo nódulos firmes como costras arenosas blancas o negras. - "Tiña negra" es causada por Exophiala wernekii. Es asintomática, con máculas oscuras no- escamosas en la piel. MATERIALES Y MÉTODOS. I. TOMA DE MUESTRAS DE PACIENTES: 1) Piel. A partir de piel cabelluda, se pueden recolectar los pelos de las áreas lesionadas,escamas y/o pus. Para recolectar las escamas de la piel, se utilizan dos portaobjetos, con uno de ellos se raspa en el límite de la lesión, colectando en el otro portaobjetos la muestra que se va desprendiendo y se guarda para hacer la preparación. 2) Uñas. Con un bisturí se toman fragmentos y polvo de las uñas. II. IDENTIFICACIÓN MICROSCÓPICA DE LOS HONGOS. 1) Pelos. Se colocan entre porta y cubre con una gota de KOH al 20 %, calentando ligeramente la preparación, o manteniéndola durante 15-20 min a temperatura ambiente. Al observar al microscopio se encuentran abundantes esporas y filamentos dentro del pelo y sobre él. 2) Escamas de piel o uñas. Se montan igual entre porta y cubre, con KOH. En el microscopio se pueden observar las células parasitadas por hifas. En las uñas se pueden observar filamentos más abundantes, mezclados como una red, con muchas artrosporas en cadenas. 3) Pelos y uñas incubados en tierra en la práctica anterior. Monte pelos y uñas entre porta y cubre igual. Identifique los hongos y compárelos con los observados en las muestras de pacientes. 4) Cultivo de las muestras. Los medios rutinarios para el cultivo de escamas, pelos o uñas, son placas de Sabouraud-dextrosa-agar con o sin antibióticos y en Mycosel. Las muestras se siembran colocándolas directamente sobre la superficie del medio y se incuban a 28 oC durante una semana, hasta observar colonias. 62 III. OBSERVACIÓN DE CEPAS CONTROL DE HONGOS DERMATOFITOS 1. Haga preparaciones o recíbalas ya hechas, de hongos dermatofitos control, entre porta y cubre en una gota de lactofenol. De preferencia, se recomienda que el alumno reciba del profesor, preparaciones fijas de los hongos, para evitar el contacto con las esporas. 2. Note las diferencias morfológicas al microscopio entre las diferentes especies. Haga dibujos detallados con sus colores correspondientes. Compare con las claves taxonómicas para la identificación. 3. Haga una descripción de la morfología colonial de cada hongo, observada en los medios de cultivo. 4. De acuerdo con las observaciones realizadas, determine cuáles fueron las diferencias fundamentales entre los diferentes hongos dermatofitos observados en las cepas control. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES 63 PRÁCTICA # 12 MICOSIS SUBCUTÁNEAS OBJETIVO DE LA PRÁCTICA. Que el alumno compare las diferencias macro y microscópicas de los hongos y bacterias causantes de micosis subcutáneas. INTRODUCCIÓN En las micosis subcutáneas el agente causal penetra por heridas. Las micosis de este tipo más conocidas en México son los micetomas, la esporotricosis y la cromomicosis. Cuando el agente etiológico es una bacteria actinomicetal, se le denomina actinomicetoma, por ejemplo: Nocardia brasiliensis, Nocardia asteroides, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletieri, Streptomyces somaliensis. En México la mayoría de los micetomas son causados por bacterias, principalmente Nocardia. Cuando esta enfermedad es causada por hongos, se le denomina eumicetoma, por ejemplo: Madurella mycetomatis, Madurella grisea, Pyrenochaeta romeroi, Scedosporium apiospermum. - Micetoma. Es un síndrome, que se caracteriza por localizarse inicialmente en el tejido subcutáneo y de evolución crónica. Clínicamente, se observa un aumento de volumen en la región afectada y la formación de fístulas, por las que drena un material seropurulento, conteniendo los "granos". Estos, contienen en su interior conglomerados de hifas del patógeno con aspecto de “bolas de estambre”. Diagnóstico del micetoma: - examen directo al microscopio de la secreción de una fístula que esté activa (la que cause prurito). Si está cerrada se abre con ayuda de una aguja de disección; el exudado se recoge con el asa para cultivo y para observación en un portaobjetos. Los “granos” fúngicos aunque son muy pequeños, pueden distinguirse a simple vista, a diferencia de los de actinomycetos que sólo se observarse bajo el microscopio. - biopsia de las lesiones e histopatología - cultivo de las lesiones o de un fragmento de biopsia - Esporotricosis. Es producida por el hongo Sporothrix schenckii, un hongo dimórfico, que afecta primordialmente la piel y los linfáticos, dando lesiones de aspecto gomoso y que rara vez profundiza. 64 Diagnóstico de la esporotricosis: El cultivo de la lesión es el mejor método de diagnóstico, aunque la intradermorreacción con esporotricina es bastante específica. - Cromomicosis. es causada principalmente por hongos "dematiáceos" (micelio negro). En México son comunes Fonseca pedrosoi, Cladosporium y Phialophora verrucosa, produciendo nódulos verrucosos localizados preferentemente en miembros inferiores, expuestos a traumatismos. Diagnóstico de la Cromomicosis: Examen directo al microscopio de escamas de las lesiones, entre porta y cubre con KOH, dejando reposar 30 min. Cultivo de escamas en Sabouraud y micosel-agar, incubando 30-40 días a 28 C, hasta observar el desarrollo de las colonias. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Haga preparaciones entre porta y cubre con una gota de lactofenol, de los hongos causantes de micosis subcutáneas, utilizando cepas control. De preferencia, se recomienda que el alumno reciba del profesor las preparaciones fijas de los hongos, para evitar el riesgo de la manipulación por los alumnos y contacto con las esporas de los hongos. Haga dibujos detallados del micelio y sus esporas observados al microscopio y compare con claves taxonómicas para la identificación. Complemente con la descripción de la morfología colonial de cada uno en el cultivo. 2. Micetoma. Haga preparaciones de las bacterias Actynomadura madurae y Nocardia brasiliensis con Gram y también con Ziehl-Neelsen. De preferencia, también en estos casos reciba preparaciones fijas. Haga dibujos, con sus colores correspondientes. 3. Compare la morfología colonial de las bacterias con la de los hongos. Describa las diferencias. Haga dibujos. 4. Haga observaciones al microscopio, de laminillas conteniendo cortes histológicos de tejidos infectados con hongos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Note las diferencias del micelio entre las bacterias actinomycetales y los hongos. Qué dificultades tuvo en las observaciones de los patógenos al microscopio, al comparar con los dibujos y fotografías de los libros de referencia. 65 CONCLUSIONES. CUESTIONARIO 1. Que zonas de México son epidémiológicas de micetoma y de esporotricosis. 2. Que núcleos de la población en México serían los más expuestos a las micosis subcutáneas. 3. Cómo se caracterizan las células fumagoides en los hongos dematiáceos. 66 PRÁCTICA # 13 MICOSIS SISTÉMICAS OBJETIVO DE LA PRÁCTICA. Determinar las diferencias macro y microscópicas de los hongos causantes de micosis profundas y conocer las técnicas de diagnóstico. INTRODUCCIÓN. Los hongos más comunes causantes de infecciones generalizadas o sistémicas son Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis y Paracoccidioides brasiliensis. Se desarrollan activamente en el suelo, donde producen abundantes conidios; al madurar se desprenden y quedan libres en el aire. La entrada al huésped es mediante la inhalación de dichos conidios. Este grupo de hongos muestra una transición morfológica de la forma miceliar saprófita, a la parásita, que es la de levaduras en la mayoría de ellos, como una respuesta a la adaptación. Este cambio es acompañado por modificaciones metabólicas del hongo. Más del 90% de las infecciones son asintomáticas o de breve duración, acompañadas de una fuerte resistencia específica a la reinfección. En los pocos casos con infección residual o crónica, el proceso es semejante a la tuberculosis. En el huésped hay factores individuales predisponentes a la enfermedad. Se presentan en una distribución geográfica muy restringida. Estas infecciones han cobrado nueva importancia en inmunodeprimidos, ya que en ellos la infección progresa rápidamente con consecuencias fatales. Histoplasma capsulatum crece naturalmente en suelos de espacios o recintos, donde hay pájaros o murciélagos. Las epidemias con frecuencia están asociadas con la presencia de excremento abundante de estos animales. Los microconidios al ser inhalados, en el pulmón se transforman en levaduras dentro de los espacios alveolares de e invaden las células del sistema fagocítico mononuclear. Es un hongo dimórfico, que en medio Sabouraud-dextrosa-agar y a temperatura ambiente desarrolla una fase filamentosa asexual. Coccidioides immitis es común en los desiertos del sudoeste de los Estados Unidos 67 y en del noroeste de (Mojave, Sonora y Chihuahua). También hay focos de regiones endémicas. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1. Examen directo. Puede ser a partir de muestras de esputo, lavados bronquiales, exudados de las lesiones secundarias, escamas, etc. Es posible observar las esférulas de Coccidioides, o las levaduras correspondientes a la fase parásita de otros hongos sistémicos. 2. Cultivo. De las mismas muestras tomadas para examen directo, se siembra una parte en Sabouraud dextrosa agar, incubando a 28 C por más de una semana. El micelio desarrollará los conidios correspondientes a cada género. Para Coccidioides no basta la observación micróscopica, por su similitud con otros hongos, debiendo recurrir a técnicas más exactas, como pruebas serológicas y estudios de DNA. 3. Pruebas inmunológicas: - IDR a la histoplasmina: solo tiene valor de primocontacto. Es positiva 4-8 semanas post- infección. - La fijación de complemento, la inmunodifusión en gel y la inmunofluorescencia, son efectivas en el diagnóstico de Histoplasma y de Coccidioides, dando además información del avance del padecimiento. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Observe al microscopio preparaciones fijas de hongos causantes de micosis profundas. Haga dibujos detallados de las estructuras observadas, las diferentes clases de conidios en la fase filamentosa de cada especie. 68 2. Diferencie las formas saprófitas de las parásitas en cada caso. Investigue el ciclo vital completo, con los nombres de sus estructuras, para cada uno de los hongos observados y relacione las fases observadas dentro de su ciclo correspondiente. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES. CUESTIONARIO: 1. En qué áreas de México es endémica la coccidioidomicosis. 2. Relacione las condiciones climáticas de Cd. Juárez, con la posiblilidad de endemicidad de Coccidioides en este lugar. 3. Cuales hongos sistémicos humanos infectan animales y cuál es la lista de animales en cada caso. 69 PRÁCTICA # 14 MICOSIS OPORTUNISTAS OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Que el alumno se familiarice con los hongos oportunistas más comunes y con las técnicas de laboratorio para su diagnóstico. INTRODUCCIÓN En las micosis oportunistas no existe una lista precisa de hongos patógenos, ni hay especificidad de ninguno de ellos por lo que respecta a órganos o tejidos. Casi cualquier hongo saprófito del suelo o de los que constituyen la flora normal, puede transformarse en parásito en sujetos inmunocomprometidos total o parcialmente; por lo tanto, las vías de entrada también son variadas, ya sea través de piel intacta, heridas o inhalación. Antiguamente estas enfermedades eran raras, pero en años recientes se han vuelto cada vez más comunes y de gran significación médica, en forma paralela al incremento de pacientes en terapia intensiva, con VIH, cancerosos o que reciben trasplantes, uso de antibióticos, citotoxinas, inmunosupresores, esteroides, así como resultado de otros procedimientos que provocan disminución de la resistencia del huésped. Son microorganismos con baja virulencia, y es necesario que las defensas del huésped estén muy disminuídas antes de que se establezcan como patógenos. La candidosis o candidiasis es una micosis causada por diversas especies de levaduras del género Candida. Cualquier tejido puede ser afectado por lo que se presentan diversos cuadros clínicos, cada uno de ellos asociado directamente al estado inmunológico del paciente. Las candidosis de mucosas y piel son las más frecuentes, mientras que las sistémicas son de evolución aguda o crónica y generalmente severas. 70 Candida Aspergillus Cryptococcus es una levadura capsulada, de amplia distribución en la naturaleza. C. neoformans var. grubii y C. neoformans var. neoformans se han aislado a partir de varias fuentes naturales como vegetales, pero es notoria su asociación con deshechos aviarios, especialmente excrementos de palomas. Cryptococcus En las micosis oportunistas se requieren diagnósticos rápidos para evitar en lo posible que el paciente desarrolle una infección diseminada, por lo que en muchas de estas micosis el tiempo va a ser crucial. El médico, debe evaluar los parámetros clínicos y saber si existe realmente una concordancia entre el resultado del laboratorio con la sintomatología del paciente; la comunicación sirve también para empezar a tomar muestras seriadas y ver la evolución clínica y el monitoreo terapéutico del paciente. Por lo general estas micosis son insidiosas y algunas veces no pueden ser diagnosticadas sino hasta la necropsia. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Haga observaciones de laminillas con preparaciones fijas de hongos oportunistas. Haga dibujos detallados, tomando en cuenta sus estructuras reproductivas, principalmente los conidios y compare con las claves de la literatura para identificarlos. 2. Observación de Candida: A p’artir de una cepa control de la levadura, haga una preparación en fresco entre porta y cubre. Observe a 40X. Tiña con Gram y observe a 100X. Haga dibujos. 71 3. Aislamiento y observación de Cryptococcus: - Recolecte muestras de heces secas de palomas y siembre 10 gramos en frascos con solución salina 0.85% estéril-penicilina, se agita y se deja sedimentar. Se obtienen 0.1 mL del sobrenadante y se descargan en el centro de una placa de agar-saboraud-acidificado, extendiendo enseguida con una asa por estría sencilla. Se incuba a 37ºC por 3 a 7 días. En este medio se detecta el crecimiento de colonias mucosas de Cryptococcus sp. - Haga una preparación con lactofenol entre porta y cubre y observe al microscopio. - Haga otra preparación entre porta y cubre, usando tinta china, y observe. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES. 72 BIBLIOGRAFÍA Referencias de Hongos Wistreich G.A. 2005. Coccidioidomycosis and histoplasmosis. RC Educational Consulting Services, Inc. 16781 Van Buren Blvd, Suite B, Riverside, CA 92504-5798. http://www.rcecs.com/MyCE/PDFDocs/course/V7125.pdf Laniado-Laborin R. 2007. Expanding Understanding of Epidemiology of Coccidioidomycosis in theWestern Hemisphere. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1111: 19–34 (2007). Ayala de Chavarría D, F.M.López de Henríquez, R.E.Valencia de Recinos. 2011. Aislamiento de Cryptococcus neoformans en muestras del ambiente contaminadas con excrementos de palomas en diferentes zonas en El Salvador. Minerva, Revista en Línea CIC-UES, El Salvador, 2(1):21-2. Reséndiz-Sánchez J. 2013. 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Report "Manual Lab Micr- II Ene-2 de 2015[1]Corregido"