Manual INVIMA 1 Corregido

TABLA DE CONTENIDO1. INTRODUCCIÓN 2. CAPITULO 1: GENERALIDADES 2.1 Precauciones en el laboratorio de microbiologìa alimentos 2.2 Recomendaciones previas a los análisis 2.3 Condiciones que deben reunir los medios de cultivo y reactivos en su preparación. 3. CAPITULO 3: PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS 3.1 Preparación y dilución de los homogenizados de las muestras 3.2 Recuento de microorganismos aeróbios mesófilos 3.3 Recuento de microorganismos aeróbios termófilos 3.4 Recuento de microorganismos anaerobios estrictos y facultativos 3.5 Recuento de esporas aerobias estrictas y facultativas 3.6 Recuento de esporas anaerobias estrictas y facultativas 3.7 Recuento de mohos y levaduras 3.8 Recuento de Estafilococo coagulasa positiva 3.9 Recuento de Bacillus cereus 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 Recuento de esporas clostridium sulfito reductor Recuento de Clostridium perfrinfens Determinación de termonucleasa Determinación de coliformes en alimentos (NMP) Determinación de coliformes de origen fecal en alimentos (NMP) Determinación de coliformes en agua envasada (NMP) Determinación de coliformes de origen fecal en agua envasada (NMP) Determinación de Pseudomona aeruginosa en agua envasada (NMP) Detección de Salmonella Detección de Vibrio cholerae Detección de Listeria monocytogenes Prueba de esterilidad comercial 4. CAPITULO 3: ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD 4.1 Programa interno de garantía de calidad en el laboratorio 5. CAPITULO 4: REACTIVOS FÓRMULAS Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y 5.1 Preparación de medios de cultivo 5.2 Preparación de reactivos 6. ANEXOS 7. BIBLIOGRAFÍA INTRODUCCIÓN El presente Manual recoge las técnicas oficiales tradicionales utilizadas en el control de calidad e inocuidad de alimentos y algunos tipos de bebidas alcohólicas. El Manual de Técnicas de Análisis para control de calidad microbiológico de alimentos está dedicado a la comunidad dedicada al análisis microbiológico de Alimentos. 2. CAPITULO 1: GENERALIDADES 2.1 PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÌA DE ALIMENTOS  Lavarse bien las manos antes de empezar a trabajar, si hay heridas o rasguños en la piel cubrirlas con una cura o algo apropiado.  Llevar siempre bata de laboratorio  No comer, beber ni fumar en la mesa del laboratorio  Las mesas de trabajo deben tener superficies lisas para limpiar y desinfectar con facilidad antes y después de terminar el trabajo diario. Se pueden desinfectar con hipoclorito de sodio al 2%, fenol al 5% o tego.  Colocar tapones de algodón a las pipetas antes de esterilizar  Una vez utilizadas las pipetas, colocarlas inmediatamente en una solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 2%)  Enfriar el asa de inoculación dejándola airear de 10-15 segundos para no crear aerosoles microbianos al introducirla caliente a los cultivos.  Colocar en un recipiente adecuado todo el material contaminado para esterilizar en el autoclave, antes del proceso de lavado  Si el material contaminado se derrama, agregar hipoclorito de sodio al 2% sobre el área contaminada y cubrir con toallas de papel absorbente por lo menos 15 minutos antes de limpiar.  Ser cuidadoso. La mayoría de los microorganismos que se manejan en el laboratorio pueden ser patógenos. 2.1 RECOMENDACIONES TÉCNICAS PREVIAS A LOS ANÁLISIS  Iniciar el análisis tan pronto como sea posible, después de haber llegado la muestra al laboratorio  Las muestras perecederas, deben ser refrigeradas entre 0-5ºC, siempre que no sea posible su análisis en las primeras horas después de recibidas.  Si las muestras llegan congeladas deben mantenerse en este estado hasta su análisis y deben analizarse en un periodo no superior a 7 días.  Las muestras congeladas se deben descongelar para su análisis en su envase original, (o en el recipiente que llegaron al laboratorio) durante un tiempo máximo de 18 horas en un refrigerador entre 2-5ºC; mantenerlas en nevera entre 0-5ºC y comenzar el análisis una vez conseguida la descongelación completa.  Si la muestra congelada puede ser fácilmente triturada (helados) no es necesario descongelarla.  Las muestras sólidas y líquidas deben ser completamente mezcladas antes de su análisis.  Las muestras no perecederas deben almacenarse en un lugar fresco, protegido de la luz, humedad y contaminación y deben analizarse en un plazo máximo de 3 días.  El material a utilizar en el análisis, debe ser esterilizado con anterioridad al procesamiento o análisis de las muestras.  Se deben preparar los medios de cultivo de acuerdo con el número de muestras a analizar.  Marcas las cajas y tubos con el número correspondiente a cada muestra por analizar.  Trabajar lo más cerca posible del mechero, flameando la boca de los frascos y tubos.  Los componentes se añaden en las cantidades correctas con agua destilada a temperatura ambiente.  En algunos casos. los laboratorios que no puedan conseguir un determinado medio preparado por una firma comercial.  Los componentes que están en pequeña concentración.2 CONDICIONES QUE DEBEN REUNIR LOS MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EN SU PREPARACIÓN  Para que un método analítico de alimentos tenga un significado semejante en cualquier lugar donde se utilice. podrá utilizar otro o prepararlo a partir de los componentes básicos. es fundamental que los medios de cultivo. suspensión de yema de huevo y sulfito sódico deben prepararse aparte del resto de los componentes del medio y esterilizarse a menudo por filtración para ser añadidos después en condiciones asépticas. en un recipiente adecuado.  Hacer siempre controles de esterilidad del medio de cultivo y del agua de dilución empleada. al resto del medio esterilizado en el autoclave. o que son poco solubles. el sitio por donde se vaya a extraer la muestra para la preparación de las diluciones. que al mezclarlo con la dilución del alimento no sean inactivados los gérmenes.  Utilizar pipeta por dilución  No calentar las pipetas en el mechero. como los hidratos de carbono. es mejor añadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas o soluciones alcohólicas o alcalinas.  La temperatura del medio debe ser la correcta (45-50ºC) de tal manera.  El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el vertido del medio no debe superar los 20 minutos. 2.  Se recomienda en general utilizar los medios deshidratados que ofrecen las firmas comerciales. los componentes de ellos. por razones de conveniencia y porque su preparación es más uniforme. Desinfectar con alcohol antiséptico. teniendo en cuenta las especificaciones o requisitos que se describen a continuación. ciertos componentes. y los reactivos sean de características comparables. es preferible que sea inferior a los 10 minutos. .  Sin embargo.  El medio se distribuye en tubos. el medio puede esterilizarse en el mismo recipiente en el cual se preparó. CAPITULO 2 : PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS 3.  Los componentes pueden ser disueltos completamente por calentamiento hasta la ebullición si el medio contiene agar.  El secado del medio de cultivo. o hasta 50ºC si el medio contiene agar.1N a un valor predeterminado de tal forma que se obtenga el pH final deseado. el medio recién preparado y esterilizado se distribuye en cajas de petri para uso inmediato en cultivos en superficie.  Se deben hacer pruebas de selectividad y productividad periódicamente a los medios de cultivo utilizados.  El medio debe ser enfriado hasta aproximadamente la temperatura ambiente si se trata de un caldo.  Los frascos de dilución se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos. de modo que después de la esterilización el volumen final sea el deseado +/-2%. El anterior proceso es necesario para evitar degradaciones no deseables o reacciones que tendrían lugar de otro modo durante el proceso normal de tratamiento térmico en el autoclave.1 PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS El procedimiento comúnmente empleado para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en los alimentos consiste en la preparación de una .  Ajustar el pH del medio con solución de NaOH ó HCl 0. Como la evaporación del diluyente durante la esterilización puede disminuir la cantidad deseada. con las cajas destapadas o en una incubadora a 37ºC durante 4 horas con las tapas en su lugar y la superficie del agar hacia arriba. u otros recipientes en la forma y cantidad necesarias. después de la esterilización. frascos. los recipientes deben llenarse con volumen predeterminado. 3. agitando fuertemente. puede hacerse en cabina de flujo laminar. En estos casos las cajas deben secarse antes de su inoculación para evitar la difusión y confluencia de las colonias. Si se va a distribuir en placas inmediatamente después de la esterilización.  En muchos casos. espátulas. pinzas.) según el criterio establecido para cada una de ellas. asi: .suspensión homogénea de alimento y de microorganismos que permita la preparación de las diluciones que posteriormente podrán ser utilizadas en diversos métodos de recuento. (10-4. 10 ml y 11 ml.. 3. con sus vasos de vidrio o metal esterilizable. Abrir aséptica y adecuadamente la muestra. tijeras.1 g Refrigerador a 0 – 5ºC Pipeteador Bolsas de plástico estériles para homogenizador Frascos de dilución aforados a 99 ml Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm Pipetas de 1 ml. Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogenización antes de preparar las diluciones. 10-n . tenedores. morteros con sus respectivos pistilos. de un litro de capacidad Balanza de una capacidad no inferior a 2500 g y una sensibilidad de 0. Equipo y materiales            Cabina de flujo laminar Homogenizador o aparato similar Licuadora. Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. cucharas. Medios de Cultivo y Reactivos:  Agua peptonada al 0. etc.1% estéril (reactivo 1) Procedimiento: Método 1 1. etc. sacabocados. 10-2. previamente esterilizados. 2. Cuando los alimentos son sólidos es necesaria la utilización de aparatos eléctricos de trituración y mezcla como el homogenizador o la licuadora. estériles Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos. 10-3. preparar diluciones consecutivas de la muestra.  Gradillas. transfiriendo 1 ml de la dilución 10-4. 2. Pesar en la bolsa para homogenizador previamente tarada. Para muestras líquidas preparar la dilución 10-4 de midiendo 11 ml de la muestra en un frasco de dilución que contenga 99 ml del agua peptonada 0. 11 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior) 5.1% para obtener la dilución 10-2 agitar cuidadosamente. 3. Para muestras sólidas: macerar. Se deben sembrar siempre tres diluciones consecutivas. 4. 7. 8. para obtener una dilución 10-4. a un tubo de dilución que contenga 9 ml de agua peptonada 0. agitar cuidadosamente. con pipeta de 1 ml a un tubo de dilución que contenga 9 ml de agua peptonada 0. dejar en reposo 10 minutos. el tiempo máximo de homogenización dependerá del tipo de alimento. Añadir 99 ml de agua peptonada 0. previamente tarado. dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración. Preparar la dilución 10-3. agitar cuidadosamente.1%. Cada El rango de diluciones preparadas puede modificarse en función a la cifra de microorganismos esperada. picar. 7. Colocar la bolsa en el homogenizador hacer funcionar el aparato por 2 minutos. 8. Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra. Agitar vigorosamente el frasco. 9. Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias. sobrepasar los 3 minutos. Para alimentos con un elevado contenido de grasa (superior al 20%). Abrir aséptica y adecuadamente la muestra. Mezclar muy bien para asegurar la homogenización de la muestra antes de preparar las diluciones. 6. Mezclar muy bien la muestra para asegurar su homogenización antes de preparar las diluciones. Preparar la dilución 10-2. transfiriendo 1 ml de la dilución 10-3 con pipeta de 1 ml.1%. en el frasco de dilución conteniendo 99 ml de agua peptonada 0.1%. Pipetear 1 ml de dilución 10-4 en un tubo conteniendo 9 ml de agua peptonada 0. No debe . mezclar y pesar 11 g representativos de la muestra total. es necesario añadir un 1% de Tween 80 o de otro tensoactivo no tóxico.1% para obtener una dilución de 10-4 6.1% 5. Método 2 1.4. 2 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS Método de recuento en placa (SPC) Es el método comúnmente utilizado para determinar el número de células viables o de unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento.1% obteniendo así la dilución 10-3 agitar cuidadosamente. ya que incluye todos los géneros aeróbios y facultativos que crecen en medios simples a una temperatura entre 20ºC y 45ºC. Cada 3. Pipetear 1 ml de dilución 10-2 en 9 ml de agua peptonada 0. permite también obtener información sobre la alteración incipiente de los alimentos y su probable vida útil. dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración. Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias. Es el indicador más amplio en alimentos.9. Equipo y material        Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35 ºC +/. 10. Este recuento se considera como indicador del grado de contaminación de los alimentos en cualquier etapa del proceso de producción.2 ºC Baño de agua o incubadora a 45 – 50ºC Refrigerador a 0 – 5ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Medios de cultivo y reactivos Agar plate Count (Agar peptona de caseína glucosa extracto de levadura) (medio 1) Procedimiento . Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. Contar todas las colonias de cada caja. calcular el recuento para cada una de las diluciones y sacar el promedio entre las dos. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. 15 ml de Agar plate Count fundido y mantenido a 45ºC 4. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count. invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/2ºC durante 48 horas. Verter en las cajas de petri. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a) d. La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a. Ejemplo: 10-4: caja 1 = 330 colonias caja 2 = 350 colonias .1. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj 5. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución. Se reporta como “unidades formadoras de colonia” (ufc) g ó ml Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y mayores de 300 colonias. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. 6. 2. Una vez solidificado el medio de cultivo. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count. Cálculo e interpretación de los resultados Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y 300 colonias. Transferir por duplicado. contar las cuatro cajas. 3. 7. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. 400 + 2. informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de dilución más concentrada. Ejemplos: (a) .700 2 Media aritmética : 3. a menos que el recuento mayor contenga dos veces al menor.350 + 330 x 10 = 3.1 ml de la dilución 10-4) Ausencia de colonias Reportar el recuento como menor de 100 ufc /g ó/ml En el caso de que dos diluciones consecutivas estén dentro del rango de 30-300 colonias.050 2 Reportar el recuento como 3.050 ufc / g ó ml Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilución de mayor concentración. Ejemplo: 10-4: Ausencia de colonias Reportar el recuento como menor de 10 ufc /g ó/ml 10-2 (Si se ha sembrado 0. se hace el recuento para cada una de las diluciones y se reporta la media aritmética de los dos valores obtenidos.700 = 3.400 2 10-2: caja 1 = 26 colonias caja 2 = 28 colonias 26 + 28 x 100 = 2. en este caso se reporta el recuento menor. 700 10-2: 35 colonias = 3. Este recuento determina si el tratamiento térmico del alimento fue óptimo.000 = 1. Equipo y material .900 Reportar media aritmética : 3.10-1: 290 colonias = 2.450 ufc/g (b) 10-1: 170 colonias = 1.900 10-2: 40 colonias = 4. que incluye todos los géneros aeróbios y facultativos que crecen en medios simples a temperaturas entre 45ºC y 65ºC Los microorganismos termófilos son importantes en los alimentos conservados o preparados térmicamente por su alta resistencia al calor.05 (mayor de 2) 1.000 4.3 ( menos de 2) 2.500 = 2.3 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AERÓBIOS TERMÓFILOS Es el método utilizado para determinar el número de células viables o de unidades formadoras de colonias (ufc) en un alimento.700 ufc/g 3.500 3.700 Reportar el recuento menor: 1. La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. c. 7. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count. b. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 2. Verter en las cajas de petri. invertir las placas e incubarlas a 55ºC +/2ºC durante 72 horas. 3. 15 ml de Agar plate Count fundido y mantenido a 45ºC 4.       Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 55ºC +/. Transferir por duplicado. . Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj 5. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj. Una vez solidificado el medio de cultivo. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento(a) d.2ºC Baño de agua o incubadora a 45 – 50ºC Refrigerador a 0 – 5ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Medios de cultivo y reactivos Agar plate Count (Agar peptona de caseína glucosa extracto de levadura) (medio 1) Procedimiento 1. 6. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. Se reporta como “unidades formadoras de colonia” (ufc)/g ó ml 3.4 RECUENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS ESTRICTOS Y FACULTATIVOS Este recuento es útil como indicador de la existencia de condiciones favorables para la multiplicación de microorganismos anaerobios productores de intoxicaciones alimentarias. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución. (medio 2) Procedimiento 1.Cálculo e interpretación de los resultados Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y 300 colonias. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado . Contar todas las colonias de cada caja. Equipo y material         Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC Baño de agua o incubadora a 45-50ºC Refrigerador a 0.5 ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Campana de anaerobiosis Medios de cultivo y reactivos Agar cisteína. en las materias primas empleadas en la preparación de conservas y es señalado como agente causante de su alteración. 15 ml de agar cisteína regenerado por 20 minutos como mínimo en baño de agua hirviente y enfriado a 50ºC 4. Equipo y material   Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC . Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido.5 RECUENTO DE ESPORAS AEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS Este grupo de microorganismos está presente. Verter en las cajas de petri. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. en la campana de anaerobiosis. 7. Cálculo e interpretación de los resultados Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y 300 colonias. por lo general. 6. Contar todas las colonias de cada caja. Transferir por duplicado. 3. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar cisteína.2. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar cisteína. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a) d. invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/2ºC durante 72 horas. Una vez solidificado el medio de cultivo. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. 5. Se reporta como “unidades formadoras de colonias”(ufc)/ g ó ml 3. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. 6. 7. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar plate Count. Verter en las cajas de petri 15 ml de agar plate Count.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar plate Count.5 ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Medios de cultivo y reactivos Agar plate Count (Agar peptona caseína glucosa extracto de levadura) (medio 1) Procedimiento 1. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj b. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido. Pasteurizar las diluciones durante 10 minutos a 80ºC +/-5ºC y enfriar rápidamente en agua 3.     Baño de agua o incubadora a 45-50ºC Refrigerador a 0. Transferir por duplicado. Una vez solidificado el medio de cultivo. 4. Cálculo e interpretación de los resultados . La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a. invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/2ºC duante 72 horas. fundido y mantenido a 45ºC 5. 2. 8. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a) c. .6 RECUENTO DE ESPORAS ANAEROBIAS ESTRICTAS Y FACULTATIVAS Este grupo de microorganismos está presente en materias primas empleadas en elaboración de conservas. Se reporta como “unidades formadoras de colonia”(ufc) g ó ml 3. Pasteurizar las diluciones durante 10 minutos a 80ºC +/-0. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.5ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Campana de anaerobiosis Medios de cultivo y reactivos Agar cisteína (medio 2) Procedimiento 1. Equipo y material         Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC Baño de agua o incubadora a 45 – 50ºC Refrigerador a 0.5ºC y enfriar rápidamente en agua. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 2. Contar todas las colonias de cada caja.Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y 300 colonias. 8. Verter en las cajas de petri. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido. 15 ml de agar cisteína regenerado por 20 minutos como mínimo en baño de agua hirviente y enfriado a 50ºC 5. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a) d. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Se reporta como “unidades formadoras de colonia”(ufc) /g ó ml 3.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y agar cisteína. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/2ºC durante 72horas. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución. en la campana de anaerobiosis. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj 6. 4.3. Cálculo e interpretación de los resultados Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y 300 colonias. Transferir por duplicado. tales como la capacidad de alteración y la producción de metabolitos tóxicos. . Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar cisteína 7.7 RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS Los mohos y levaduras tienen algunas características similares a las bacterias cuando contaminan los alimentos. Contar todas las colonias de cada caja. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces b. Una vez solidificado el medio de cultivo. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido. Verter en las cajas de petri. alícuotas de 1 ml de cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles. bajo contenido de humedad y baja temperatura de almacenamiento. 15 ml de agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) o agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol. fundido y mantenido a 45ºC 4.1% (reactivo 2) Solución de Gentamicina al 0.Los hongos (mohos y levaduras) se ponen en evidencia en condiciones desfavorables para el crecimiento bacteriano como: pH bajo. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 2.05% (reactivo 3) Procedimiento 1. Equipo y material        Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 22 ºC +/-2ºC Baño de agua o incubadora a 45-50ºC Refrigerador a 0 – 5ºC Contador de colonias Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Medios de cultivo y reactivos     Agar OGY (Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura) (medio·) Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol (medio 4) Solución de oxitetraciclina al 0. 3. La manera más indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente: a. Transferir por duplicado. alto contenido de sales y azúcares. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces . Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0. en el Equipo y Material   Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC .b.8 RECUENTO DE ESTAFILOCOCO COAGULASA POSITIVA La presencia de Staphylococcus aureus en un alimento se interpreta como indicativo de contaminación a partir de piel. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a) d. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga Agar OGY o Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol. calcular el recuento para cada una de las diluciones y sacar el promedio entre las dos. contar las cuatro cajas. 6. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución. 5. material. Las intoxicaciones estafilocóccicas son causadas por la ingestión de alimentos que contienen una de las enterotoxinas producidas por el Staphylococcus aureus alimento. Una vez solidificado el medio de cultivo. equipos sucios y materias primas de origen animal contaminados. 3. Se reporta como “unidades formadoras de colonia”(ufc) /g ó ml Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 20 y mayores de 100 colonias. invertir las placas e incubarlas a 22ºC +/2ºC (temperatura ambiente) durante 5 – 7 días Cálculo e interpretación de los resultados Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 20 y 100 colonias. boca y fosas nasales de los manipuladores de alimentos. Rotar la caja cinco veces en el sentido contrario de las agujas del reloj. Rotar la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj c. Contar todas las colonias de cada caja.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar OGY o agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol 7. hasta que la superficie quede seca 5. 2. con bordes reducidos blancos.5% (reactivo 5) Emulsión de yema de huevo al 20% (reactivo 6) Procedimiento 1. (medio 6) Plasma deshidratado de conejo.       Baño de agua a 45 – 50ºC Refrigerador a 0 – 5ºC Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Varillas de vidrio de hockey Gradillas Tubos tapa rosca Medios de cultivo y reactivos       Agar base selectivo para estafilococo según Baird Parker (medio 5) Caldo infusión cerebro corazón. Extender el inóculo sobre la superficie del Agar.H. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. E.T.85% (reactivo 4) Telurito de potasio al 3. rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco. Preparar las placas de Agar Baird Parker. Pipetear 0. zona de precipitado. dejar solidificar y secar la superficie de las placas. con la ayuda de la varilla de hockey. Seleccionar las placas que presenten entre 20 y 200 colonias aisladas y contar las colonias negras y brillantes.D.A Solución salina estéril al 0. Invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/-2ºC durante 48 horas 6.I. B. Tomar un minuto de 3 colonias y realizar la prueba de coagulasa. 3. 7.1 ml de cada una de las diluciones sobre la superficie del Agar 4. Prueba de coagulasa . transferir 0. hacer el cálculo de estafilococo coagulasa positiva. Incubar a 35ºC +/-2ºC 7. expresar los resultados como: Estafilococo coagulasa positiva < 100 ufc / g ó ml . Pasado este tiempo.3 ml de plasma deshidratado de conejo E.1.500 Colonias examinadas = 5 Colonias positivas = 4 3. Hacer un control positivo sembrando una cepta de estafilococo coagulasa positiva en un caldo BHI 3.D. Observar cada hora. Incubar a 35ºC +/-2ºC durante 18-24 horas 4. Transferir el número de colonias a confirmar a un número igual de tubos que contienen 5 ml de caldo de infusión cerebro corazón (BHI) 2. Una vez finalizado el tiempo de incubación. En caso negativo descartar hasta las 24 horas 8. Sobre el número total de colonias después de las 48 horas de incubación y la proporción de colonias confirmadas por la prueba de la coagulasa.T.3 ml de cada uno de los cultivos de caldo infusión cerebro corazón (BHI) a tubos que contienen 0.500 x 4 = 2.A 5. hacer la lectura con base en los tubos que presentan coagulación del plasma comparándolos con los controles positivo y negativo 9. durante 6 horas.800 ufc/ g ó /ml 5 Ausencia de colonias. utilizando como factor de corrección la relación: Colonias positivas Colonias examinadas Ejemplo: Recuento en 10-2 : 35 colonias = 3.3 ml de plasma deshidratado de conejo como control negativo 6. Transferir a un tubo 0. 3.9 RECUENTO DE BACILLUS CEREUS Bacillus cereus es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado, común en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un número alto, mayor de 106 colonias/g, en un alimento puede ocasionar intoxicación alimentaria. Equipo y material            Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC Baño de agua a 45 – 50ºC Refrigerador a 0-5ºC Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Varillas de vidrio de hockey Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca Medios de cultivo y reactivos              Agar selectivo para cereus según Mossel (medio 7) Agar almidón (medio 8) Agar gelatina (medio 9) Agar leche (medio 10) Caldo carbohidrato rojo de fenol, (glucosa, xilosa, arabonosa) (medio 11) Caldo nitrato (medio 12) Caldo Smith, (Acetil metil carbinol) (medio 13) Solución de polimixina (reactivo 7) Reactivo de Griess (reactivo 8) Solución acuosa de hidróxido de potasio al 40% (reactivo 9) Solución alfa naftol (reactivo 10) Cloruro de mercurio sublimado al 15% (reactivo 11) Polvo de zinc   Colorantes para tinción de Gram (reactivos No. 12) Emulsión de yema de huevo al 10% (reactivo 6) Procedimiento 1. Preparar las placas de Agar selectivo para cereus (15 ml de medio aproximadamente por placa), dejar solidificar y secar la superficie de las placas. 2. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 3. Pipetear 0.1 ml de cada una de las diluciones sobre la superficie del Agar 4. Extender el inóculo sobre toda la superficie del Agar, con la ayuda de la varilla de hockey, hasta que la superficie quede seca 5. Invertir las placas e incubarlas a 35ºC +/- 2ºC durante 18-24 horas 6. Contar las colonias rosadas(manitol negativo) que presenten un halo denso (lecitina positiva) sobre un fondo rojo violeta. 7. Tomar como mínimo 3 colonias típicas y colorearlas por el método de Gram. Se observan bacilos Gram positivos, con extremos cuadrados, en cadenas cortas o largas, con esporas elipsoidales, centrales o subterminales de pared fina que no deforman el bacilo. Confirmación bioquímica de las colonias de Bacillus cereus Inocular con asa los tubos de los caldos glucosa, xilosa, arabinosa, el caldo nitrato y el cado glucosa tamponado. Sembrar por estría el Agar leche, Agar almidón y Agar gelatina Incubar a 35ºC +/- 2ºC durante 48 horas Pasado este tiempo revelar las pruebas bioquímicas: Reducción de Nitratos: Añadir a cada uno de los tubos, unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta. El color rojo representan una prueba positiva de reducción de nitratos. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba con polvo de zinc. A los tubos negativos de la prueba de Griess; agregar una pequeña cantidad de polvo de zinc, agitar. Color rojo: No reducción de nitratos Color del reactivo: Reducción de nitratos Fermentación de carbohidratos (glucosa, xilosa y arabinosa): Observar el cambio de color, según el indicador de pH utilizado Rojo de fenol: vira de amarillo a rosado cuando la reacción es positiva Andrade: vira de rosado a amarillo cuando la reacción es positiva Producción de Acetil-metil-carbinol según Smith: Comprobar la presencia de acetilmetilcarbinol en el caldo glucosa tamponado. Añadiendo 0.6 ml de la solución de alfa naftol al 5% y 0.2 ml de una solución de hidróxido de potasio al 40%, agitar suavemente. La producción de un color definido rosa a rojo indica una reacción positiva. Hidrólisis de la caseína: La aparición de una zona clara alrededor de la estría realizada en Agar leche indica hidrólisis de la caseína. Hidrólisis de almidón: Cubrir la superficie de la placa de Agar almidón con solución de lugol. La aparición de una zona clara alrededor de la estría indica la hidrólisis del almidón. Hidrólisis de la gelatina: Verter sobre la superficie de la placa de Agar gelatina, cloruro de mercurio al 15% y eliminarlo después de cinco minutos, lavar con agua corriente, la reacción es positiva cuando una zona clara rodea la estría. Bioquímica del Bacillus cereus Fermentación de Manitol - Fermentación arabinosa de - hacer el cálculo utilizando como factor de corrección la siguiente relación: Colonias positivas Colonias examinadas Ejemplo: 10-2 : 6 colonias = 600 colonias examinadas = 3 colonias positivas =2 600 x 2 = 400 ufc / g ó /ml 3 Ausencia de colonias.Presencia de lecitinasa Fermentación de glucosa Reducción de Nitrato Fermentación de xilosa + Hidrólisis de la gelatina Hidrólisis de la caseína Hidrólisis de almidón Acetil-metil-carbinol + + sin gas + - + + + Sobre el número total de colonias después de las 48 horas de incubación y la proporción de colonias confirmadas por las pruebas bioquímicas.10 RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR Este análisis es considerado como el recuento indicador más importante de las bacterias anaerobias espóroformadoras. expresar el resultado como: Bacillus cereus < 100 ufc / g ó ml 3. Varias especies del género Clostridium tienen la propiedad de reducir el ión sulfito a sulfuro. Equipo y material   Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC . que en presencia de citrato férrico u otra sal de metales pesados dan colonias negras. Hacer la lectura con base en los tubos que presenten 5-50 colonias de color negro 9. Dejar solidificar Adicionar una segunda capa de medio. a 80ºC por 10 minutos. por su capacidad de producir . Este microorganismo. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones en tubos estériles Calentar los tubos con cada una de las diluciones. 5. 3. 6. Adicionar 10-12 ml de Agar SPS o Agar sulfito cicloserina. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado 2. Dejar solidificar Incubar a 35ºC +/-2ºC por 72horas Observar diariamente los tubos.        Baño de agua a 45-50ºC Refrigerador a 0-5ºC Campanas de anaerobiosis Pipetas de 1 ml estériles Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca de 150 x 15 mm estériles Medios de cultivo y reactivos    Agar sulfito polimixina sulfadiazina.11 RECUENTO DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Clostridium perfringens es un contaminante común de los alimentos crudos y de los ingredientes de muchos alimentos. Enfriar rápidamente en agua corriente 4. Calcular el número total de colonias multiplicándolo por el inverso de la dilución 3. debido a la producción de color negro por la formación de H2S que puede invadir el medio siendo difícil su lectura 8. 7. SPS (medio 14) Agar triptosa sulfito cicloserina (medio 15) Reactivo coloración de Gram (reactivos 12) Procedimiento 1. se pueden incrementar y producir un brote de intoxicación. mezclando cuidadosamente sin agitar . Equipo y material            Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos Incubadora a 35ºC +/-2ºC Baño de agua a 46ºC +/-0.5ºC Refrigerador a 0-5ºC Campanas de anaerobiosis Cajas de petri estériles Pipetas de 1 ml estériles Gradillas Portaobjetos Microscopio Tubos tapa rosca estériles Medios de cultivo y reactivos           Agar sulfito polimixina sulfadiazina.esporas resistentes puede sobrevivir en bajo número en algunos alimentos tratados térmicamente y al ser almacenados inadecuadamente o recalentados. SPS (medio 14) Agar triptosa sulfito cicloserina (medio 15) Agar TSN-Agar selectivo para Clostridium perfringens según Marschall (medio 16) Agar movilidad nitratos (medio 17) Agar lactosa gelatina (medio 18) Caldo de carne cocida (medio 19) Caldo tioglicolato (medio 20) Reactivo de Griess (reactivo 8) Reactivo coloración de Gram (reactivos 12) Peróxido de hidrógeno al 3% (reactivo 13) Procedimiento 1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. 5ºC durante 3-4 horas Comprobar la pureza de los cultivos haciendo frotis y coloración de Gram A partir del Caldo tioglicolato o caldo de carne.2. agitar. Comprobar la presencia de nitritos en el medio movilidad-nitratos añadiendo a cada un de los tubos. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba con polvo de zinc.5 ml de peróxido de hidrógeno al 3%. Identificación bioquímica de Clostridium perfringens Elegir como mínimo 3 colonias típicas (negras) y sembrar cada una en caldo tioglicolato o caldo de carne cocida. sembrar por punción las pruebas bioquímicas. Colocar las placas con la tapa hacia arriba en la campana de anaerobiosis Incubar a 35ºC +/-2ºC por 48 horas Seleccionar las placas que presenten entre 20-200 colonias y contar todas las colonias negras. no es necesario incubar en anaerobiosis Prueba de catalasa: Tomar aproximadamente 3 ml de cada uno de los cultivos de Caldo tioglicolato o Caldo de carne y mezclar en otro tubo con 0. Color rojo: No reducción de nitratos . Movilidad – nitratos: Observar el tipo de crecimiento a lo largo de la línea de picadura. Si se liberan algunas burbujas de gas se considera una reacción positiva. 6. A los tubos negativos de la prueba de Griess. Los microorganismos no móviles producen un crecimiento que se limita a la línea de picadura. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas. 5. Incubar en baño de agua a 46ºC +/-0. agregar una pequeña cantidad de polvo de zinc. 3. unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta: El color rojo representa una prueba positiva de reducción de nitratos. Pipetear por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en cajas de petri Verter en cada caja 15 ml de Agar SPS ó Agar triptosa sulfito cicloserina y mezclar en la forma recomendada 4. mientras que un crecimiento difuso en el medio indica que el microorganismo es móvil. en caso de ser negativa. Coloración de Gram: Bastones grandes Gram positivos. colocar los tubos lactosa-gelatina en refrigeración por 10 minutos y observar la licuefacción de la gelatina. incubar 24 horas adicionales. hacer el cálculo utilizando como factor de corrección. con o sin esporas subterminales no deformantes. con los extremos redondeados.Color del reactivo: Reducción de nitratos Lactosa – gelatina: La fermentación de la lactosa se evidencia por el cambio de color del medio a amarillo y además hay producción de gas. Bioquímica de Clostridium perfrigens Movilidad Catalasa Fermentación de lactosa Reducción de Nitrato Licuefacción de gelatina +(sin gas) + + Sobre el número total de colonias después de las 48 horas de incubación y la proporción de colonias confirmadas por las pruebas bioquímicas. Una vez leída la fermentación de la lactosa. la siguiente relación: Colonias positivas Colonias examinadas Ejemplo: Recuento en 10-1 : 8 colonias = 80 Colonias examinadas = 5 Colonias positivas =3 80 x 3 = 48 ufc/g ó /ml . H. 2.12 DETERMINACIÓN DE LA TERMONUCLEASA El Staphylococcus aureus produce la enzima desoxirribunucleasa. Equipo y material  Incubadora a 35ºC +/. que es termoestable. sembrando una cepa conocida de Staphylococcus termonucleasa positiva en un caldo BHI. . DNA (medio 21)  Caldo infusión cerebro corazón.I (medio 6) Procedimiento: 1. Hacer un control positivo. característica exclusiva de esta bacteria.2ºC  Baño de agua hirviendo  Refrigerador a 0-5ºC  Cajas de petri estériles  Pipetas Pasteur estériles  Tubos capilares con extremos abiertos  Gradillas  Tubos tapa rosca estériles Medios de cultivo y reactivos  Agar Azul de toluidina. Transferir el número de colonias a confirmar a un número igual de tubos que contienen 5 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI). El hallazgo de esta enzima en un alimento es indicador de un abundante desarrollo de Staphylococcus aureus y de posible presencia de enterotoxina estafilocóccica.5 Ausencia de colonias: Expresar los resultados como: Recuento de Clostridium perfrigens: < 10 ufc / g/ ó ml 3. B. sembrando una cepa de Micrococcus en un caldo BHI 4. falta de higiene de los manipuladores.2 durante 18 a 24 horas 5. indica una reacción positiva. Su presencia en alimentos es signo de mala calidad higiénica en el proceso. Una vez solidificado el medio. practicar varias perforaciones. También es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) Este grupo de microorganismos comprende varios géneros de la familia Enterobacteriacea. agua y suelo. eliminando por aspiración los tapones de medio 7. Dejar solidificar y secarlas 6. Hacer un control negativo. 3.13 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN ALIMENTOS. Colocar con la pipeta de pasteur. está ampliamente difundido en la naturaleza. que se extiende más o menos 1 mm. Preparar las placas de Agar azul de toluidina (DNA). con la ayuda de los tubos capilares de 2mm de diámetro.3. Un halo rosa alrededor de la perforación.2ºC  Pipetas bacteriológicas de 1 ml estériles  Asa de inoculación  Gradillas  Cajas de petri  Tupos tapa rosca de 150x180 mm  Tubos de fermentación (Durham) . recontaminación después del proceso y aún de contaminación fecal. Pasado el tiempo de incubación de los cultivos en BHI colocarlos por 15 minutos en un baño de agua hirviendo. 3 microlitros en cada perforación 9. 8. Equipo y material  Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos  Incubadora a 35ºC +/. Incubar las placas a 37ºC durante 3-4 horas 10. Incubar a 35ºC +/. anotar los tubos que muestren producción de gas. o Agar Endo. Prueba Presuntiva 1.) (medio 25) Procedimiento Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. que se observa por el desplazamiento del medio en el tubo de Durham.M. continuar con la prueba confirmativa. Incubar las placas invertidas a 35ºC +/. Si a las 24 horas todos los tubos muestran producción de gas.2ºC por 24 horas 3.Medios de cultivo y reactivos  Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22)  Agar eosina azul de metileno según Levine E.B.(medio 23)  Agar Endo (medio 24)  Agar violeta cristal rojo neutro bilis (V. 2. Pasado este tiempo se hace la lectura de las colonias típicas de coliformes. 5. Pasadas las 48 horas. sembrando por estría una asada de cada uno de los tubos en la superficie de una placa de Agar eosina azul de metileno (EMB).B. Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas 3.R. utilizando tres tubos por cada dilución.A. 4. Para obtener el NMP. Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA). con positivos a organismos del grupo coliforme. Confirmar que los tubos con producción de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% de la prueba presuntiva. proceder de la siguiente manera: Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el número de tubos en los que se confirmó la . Anotar el número de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilución. 2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos con caldo lactosado bilis verde brillante al 2%. Prueba confirmativa 1. Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo o ml de alimento utilizar la siguiente fórmula: NMP de la tabla x factor de dilución intermedio = NMP / g ó ml 100 Ejemplo: Si se obtuvieron los siguientes datos en la prueba confirmativa: tubos positivos en la dilución 10-1 1 tubo positivo en la dilución 10-2 1 tubo positivo en la dilución 10-3 3 4 5 Tabla NMP 2: 1: 1 = 20 Aplicando la fórmula: 20 x 100 = 20 coliformes / g ó /ml 100 Expresar los resultados como NMP de coliformes /g ó /ml 3.presencia de coliformes. graduado a 44. Equipo y material  Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos  Baño de agua con rotación.5ºC  Asa de inoculación  Gradillas  Tupos tapa rosca de 15 x 150 mm y de 18 x 150 mm . Buscar en la tabla del NMP (tabla 16) y anotar el resultado correspondiente al número de tubos positivos de cada dilución. 6.14 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL EN ALIMENTOS NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) Se utiliza para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes del intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros orígenes.5ºC +/-0. Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44. Caldo Triptófano 2. con producción de gas de la prueba presuntiva del NMP de coliformes. en baño de agua con rotación.15 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN AGUA TRATADA ENVASADA NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) . teniendo cuidado de que el nivel de agua del baño sobrepase el nivel del medio de cultivo. Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente manera: a. Observar la producción de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% b. Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales g ó ml 3.5ºC +/-0.5ºC por 48 horas. 3. A partir de los tubos positivos. Considerar como coliformes de origen fecal lo que demuestren positividad en ambas pruebas: gas positivo e indol positivo 5. de los tubos gas positivo. Tubos de fermentación (Durham) de 50 x 10 mm Medios de cultivo y reactivos  Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22)  Caldo Triptófano (medio 26)  Reactivo de Kovac`s (reactivo 14) Procedimiento: Prueba de Mac-kenzie: 1.2 ml del reactivo de kovac`s. Revelar el caldo Triptófano. agitar suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amílico indicando la presencia de indol cuando la prueba es positiva o el color original de medio cuando la prueba es negativa 4. Confrontar los resultados con la tabla de NMP (tabla 16). Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% conteniendo un tubo de fermentación de Durham b. transferir de cada tubo una asada de cultivo en: a. adicionando 0. está ampliamente difundido en la naturaleza. agua y suelo. Pipetear 1 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado simple concentración. Incubar los tubos a 35ºC +/-2ºC por 48 horas . recontaminación después del proceso y aún de contaminación fecal. 2.Este grupo de microorganismos comprende varios géneros de la familia Enterobacteriacea. Pipetear 10 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado doble concentración. 3. falta de higiene de los manipuladores. Su presencia en agua tratada envasada es signo de mala calidad higiénica en el proceso. Equipo y material  Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos  Incubadora a 35ºC +/-2ºC  Pipetas bacteriológicas de 1 ml estériles  Asa de inoculación  Gradillas  Tubos tapa rosca de 150 y 20 x 180 mm Medios de Cultivo  Caldo lactosado doble concentración (medio 27)  Caldo lactosado simple concentración (medio 28)  Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22)  Solución amortiguadora de fosfato (reactivo) Prueba presuntiva: 1. Pipetear 1 ml de la dilución 10-1 en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado simple concentración 5. También es habitante normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Pipetear 1 ml de la muestra en un tubo que contiene 9 ml de solución amortiguadora de fosfatos para obtener la dilución 10-1 4. la cual se observa por desplazamiento del medio de cultivo en el tubo de fermentación (Durham) 7. Prueba confirmativa: 1.5ºC  Asa de inoculación  Gradillas  Tupos tapa rosca de 15 x 150 mm y de 18 x 150 mm  Tubos de fermentación (Durham) de 50 x 10 mm . Equipo y material  Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos  Baño de agua con rotación. Pasadas las 48 horas. continuar con la prueba confirmativa. Si a las 24 horas todos los tubos muestran producción de gas.5ºC +/-0. Anotar el número de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilución. Pasado este tiempo anotar los tubos que hayan presentado fermentación con producción de gas. Incubar los tubos a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas 3. transfiriendo 0. que hayan presentado producción de gas.1 ml ó una asada de cada uno de los tubos a tubos que contienen 10 ml de caldo lactosado bilis verde brillante al 2% 2. Confirmar los tubos de caldo lactosado. examinar y anotar los tubos que muestren producción de gas. 5. Expresar los resultados como NMP de coliformes en 100 ml 3. Informar el valor correspondiente al número de tubos positivos para organismos coliformes en 100 ml de agua.16 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES DE ORIGEN FECAL EN AGUA ENVASADA NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) Se utiliza para diferenciar los coliformes de origen fecal (procedentes del intestino del hombre y de animales de sangre caliente) de los coliformes de otros orígenes.6. constituyendo una prueba positiva. graduado a 44. 4. 5. Buscar en la tabla de NMP (tabla 17) y anotar el resultado correspondiente al número de tubos positivos de cada dilución. de los tubos gas positivo.17 DETERMINACIÓN DE PSEUDOMONA AERUGINOSA EN AGUA TRATADA ENVASADA. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) . agitar suavemente y observar la presencia de un anillo rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amílico indicando la presencia de indol cuando la prueba es positiva o el color original de medio cuando la prueba es negativa. con producción de gas de la prueba presuntiva del NMP de coliformes.Medios de cultivo y reactivos  Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (medio 22)  Caldo Triptófano (medio 26)  Reactivo de Kovac`s (reactivo 14) Procedimiento Prueba de Mac-kenzie: 1. A partir de los tubos positivos. Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente manera: a. Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44. teniendo cuidado de que el nivel de agua del baño sobrepase el nivel del medio de cultivo. Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% conteniendo un tubo de fermentación de Durham b. Considerar como coliformes de origen fecal los que demuestren positividad en ambas pruebas: gas positivo e indol positivo 5. Caldo Triptófano 2. Confrontar los resultado con la tabla de NMP (tabla 17) Expresar los resultados como NMP de coliformes fecales /g ó /ml 3. Revelar el caldo Triptófano. en baño de agua con rotación.5ºC +/-0. 3. Observar la producción de gas en el caldo lactosado bilis verde brillante al 2% b. adicionando 0. transferir de cada tubo una asada de cultivo en: a.2 ml del reactivo de kovac`s.5ºC por 48 horas. 4. agua. Equipo y material  Lo necesario para la preparación y dilución de los homogenizados de alimentos  Incubadora a 35ºC +/. Pipetear 1 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina simple concentración.2ºC  Pipetas bacteriológicas de 1 ml estériles  Asa de inoculación  Gradillas  Tubos tapa rosca de 18 x 150 y 20 x 180 mm  Lámpara de luz ultravioleta de onda larga. que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. La Pseudomona aeruginosa es la especie más importante en la alteración de los alimentos refrigerados debido a su carácter psicrotrófico. 3. Pipetear 10 ml de la muestra en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina doble concentración 2. Pipetear 1 ml de la muestra en un tubo que contiene 9 ml de solución amortiguadora de fosfatos para obtener la dilución 10-1 4. Incubar los tubos a 35ºC +/-2ºC por 48 horas 6. suelo. . examinar los tubos bajo la luz ultravioleta con onda larga en cuarto oscuro. Medios de cultivo  Caldo asparagina doble concentración (medio 29)  Caldo asparagina simple concentración (medio 30)  Caldo acetamida o Agar acetamida inclinado (medio 31)  Solución amortiguadora de fosfato (reactivo 15) Prueba presuntiva: 1. Pasadas las 48 horas. hortalizas.Son bacilos Gram negativos. Pipetear 1 ml de la dilución 10-1 en una serie de 5 tubos que contienen 10 ml de caldo asparagina simple concentración 5. aves y productos marinos. Expresar los resultados como NMP de Pseudomona aeruginosa en 100 ml 3. confirmación serológica y tipificación por medio de bacteriófagos. 4. Todas las especies deben ser consideradas como potencialmente patógenas para el hombre. siembra en placas con medios sólidos selectivos y diferenciales. producido por la elevación del pH debido a la producción de amoniaco. Prueba confirmativa 1. 3. caracterización bioquímica de las colonias sospechosas. comprenden varias etapas sucesivas: enriquecimiento no selectivo. La producción de un pigmento fluorescente constituye una prueba presuntiva positiva. La presencia de Salmonella sp en productos procesados térmicamente. Los métodos que se utilizan son similares en principio. constituyendo una prueba positiva. transfiriendo 0.1 ml de cada uno de ellos en tubos que contienen 10 ml de caldo acetamida o sembrando por picadura y estría en agar acetamida. que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos. Aún no es posible recomendar un solo método para el aislamiento y la identificación de Salmonella. 2. enriquecimiento selectivo.18 DETERMINACIÓN DE SALMONELLA La única vía de entrada de la Salmonella en el cuerpo humano es la oral. Anotar el número de tubos confirmados como positivos en cada dilución y obtener el resultado en la tabla de NMP (tabla 17). Incubar los tubos a 35ºC +/-2ºC por 36 horas Pasado este tiempo anotar los tubos que hayan presentado color rosado-violeta. Confirmar los tubos de caldo asparagina. que hayan presentado fluorescencia.7. indica tratamiento inadecuado o contaminación pos proceso. Equipo y material  Incubadora a 35ºC +/-2ºC . por lo que es de suma importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia.  Baño de agua a 43ºC +/-0. pinzas. lisina desoxicolato. tijeras. espátulas.500 g sensibilidad 0.2ºC  Refrigerador a 0-5ºC  Cajas de petri estériles  Pipetas de 1 ml estériles  Grdillas  Portaobjetos  Microscopio  Tubos tapa rosca estériles  Pipeteador  Frascos estériles con capacidad de 500 ml  Cabina de flujo laminar  Asa de inoculación  Bolsas de plástico estériles  Homogenizador o aparato similar  Balanza de capacidad no inferior a 2.1 g  Instrumentos para preparar las muestras  Cuchillos. XLD (medio 35)  Caldo selenito-cistina (medio 36)  Caldo tetrationato (medio 37)  Agar citrato de Simmons (medio 38)  Agar hierro triple azúcar (TSI) (medio 39)  Agar fenil-alanina (APP) (medio 40)  Agar motilidad (medio 41)  Agar urea (medio 42)  Caldo Triptófano (medio 26)  Caldo lisina (medio 43) . con novobiocina (BPLS) (medio 34)  Agar xilosa. cucharas. tenedores. morteros con sus respectivos pistilos estériles  Láminas portaobjetos Medios de cultivo y reactivos   Agua destilada estéril Agua de peptona tamponada (medio 32)  Agar bismuto sulfito según Wilson Blair (medio 33)  Agar verde brillante lactosa-sacarosa. Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada (medio de enriquecimiento no selectivo) 3. III. Realizar controles positivo y negativo con cepas conocidas No debe II. Caldo nitrato (medio 12)  Caldo rojo de metilo –Voges Proskauer.1% 4. 5. Incubar a 35ºC +/-2 por 18 – 24 horas 6. (MR-VP) (medio 44)  Reactivo para oxidasa (reactivo 16)  Polvo de zinc  Reactivo de Griess (reactivo 8)  Rojo de metilo (reactivo 17)  Solución acuosa de verde brillante al 0. Pesar en la bolsa para “stomacher” previamente tarada 25 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior 2. IV. Cuando se analiza leche en polvo. utilizar agua destilada adicionada de 5 ml de solución verde brillante al 0. Enriquecimiento no selectivo Enriquecimiento selectivo Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial Identificación I: Enriquecimiento no selectivo 1. el tiempo máximo de homogenización dependerá del tipo de alimento. sobrepasar los 3 minutos.1% (reactivo 18)  Solución de yodo y yoduro potásico (reactivo 19)  Solución acuosa de hidróxido de potasio al 40% (reactivo 9)  Solución de cloruro férrico al 10% (reactivo 20)  Solución de alfa-naftol (reactivo 10)  Reactivos para coloración de Gram (reactivo 12) Procedimiento El aislamiento de salmonella incluye cuatro etapas fundamentales: I. Colocar la bolsa en el “stomacher” y hacer funcionar el aparato por 2 minutos. Enriquecimiento selectivo . II. 1% 4. 2. Incubar en baño a 43ºC +/. 2. Identificación de Salmonella mediante pruebas bioquímicas Coloración de Gram: . el Agar Verde brillante lactosa sacarosa con novobiocina y el Agar XLD. 4.2 durante 24-48 horas Escoger 3 colonias típicas sospechosas de Salmonella (lactosa negativa) Aislarlas en Agar selectivo para garantizar su pureza Proceder a su identificación IV. Identificación de Salmonella La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Salmonella sp incluye dos etapas seguidas:  Comprobación de las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas determinativas  Identificación serológica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros. Agar bismuto sulfito o Agar XLD. 3.1 ml de solución acuosa de verde brillante al 0. Incubar las placas a 35ºC +/. Transferir 1 ml de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo tetrationato. para el aislamiento del microorganismo. Incubar en baño de agua 43ºC +/-0. se recomienda el Agar bismuto sulfito. sembrar en superficie con asa por agotamiento placas con Agar verde brillante lactosa-sacarosa. Transferir 1 ml de cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo selenito cistina.2 por18-24 horas 3.2 ml de solución de yodo y 0.1. 5.2 por 18-24 horas III. adicionado de 0. Siembra en placa con medios selectivos y diferenciales Se deben utilizar mínimo dos medios selectivos por cada caldo de enriquecimiento no selectivo y selectivo. El laboratorio puede utilizar el medio diferencial de su elección. A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento no selectivo. 1.0. Prueba de la Oxidasa: En una caja de petri. Incubar a 35ºC +/. Fermentación de carbohidratos:  Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos glucosa. siguiendo una línea de 3 a 6 mm de longitud.  Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas  Si se produce un cambio de color. a una profundidad de ¼ a ½ de pulgada. lactosa y sacarosa. sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo. Salmonella: bacilo Gram negativo. Si se produce un cambio de color a azul o violeta indica una prueba positiva.2ºC por 24-48 horas El crecimiento es positivo si el microorganismo migra de la línea de siembra y se difunde a través del medio. la reacción es positiva. Hacer un extendido. colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa.2ºC por 24-48 horas El cambio de color a púrpura indica una prueba positiva Movilidad Inocular con asa recta por punción central. de una colonia sospechosa. no esporulado. tubos con Agar movilidad. con asa de vidrio o palillo de madera. Cuando es inmóvil sólo crece en la línea de siembra. Prueba de la Lisina decarboxilasa: Inocular con asa el tubo con el aminoácido L-lisina. según el indicador de pH utilizado. .Hacer frotis de cada una de las colonias seleccionadas y colorearlas por el método de Gram. colocar una capa de aceite mineral estéril Incubar a 35ºC +/. Los cultivos de Salmonella producirán una reacción K/K. Reacción en Agar urea: Inocular cada uno de los tubos de Agar urea. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas. Revelar la prueba de nitrato añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta. Una reacción positiva estará dada por un viraje del color verde a azul intenso.2ºC por 24. . en el caso de que no ocurra cambio de color añadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato residual.2ºC por 24-48 horas. La aparición de un color rojo. sembrando por estría la parte inclinada. Reacción en Agar citrato de Simmons: Inocular cada uno de los tubos de Agar Citrato de Simons. Incubar a 35ºC +/. sembrando por picadura la columna del medio.48 horas. Reacción en Agar LIA: Inocular cada uno de los tubos de Agar LIA.Reducción de nitrato Inocular con asa recta tubos de caldo nitrato. La aparición de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto una reacción negativa.2ºC por 24-48 horas Se observa una reacción positiva cuando el color del medio vira a rosado violeta. Incubar a 35ºC +/.2ºC por 24-48 horas. Los cultivos de Salmonella producirán una reacción K/A con producción de gas y producción de H2S. sembrando por estría la parte inclinada y por picadura la columna del medio. Incubar a 35ºC +/. Incubar a 35ºC +/. Reacción en Agar hierro triple azúcar: Inocular cada uno de los tubos de Agar TSI. indica presencia de nitritos (positividad). sembrando por doble picadura la columna del medio y por estría la superficie. aerobio y anaerobio facultativo.2ºC por 24-48 horas. El vibrio cholerae 01 se . Un anillo color cereza en la superficie del medio indica una reacción positiva. Incubar a 35ºC +/. curvo. no esporulado. Revelar el Voges Proskauer (VP). suele presentarse en comunidades donde las prácticas de higiene son muy deficientes. Agitar el tubo suavemente y dejar en reposo por 10 minutos. enfermedad diarreica producida por una toxina segregada por el microorganismo en el intestino. añadiendo en el otro tubo 0.2ºC por 24-48 horas Revelar añadiendo 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10% sobre la estría de crecimiento. Es un bacilo pequeño.19 DETERMINACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE El Vibro cholerae pertenece a la familia Vibrionaceae. Gram negativo. Rojo de metilo –Voges Proskauer (MR-VP) Inocular dos de los tubos con Caldo MR-VP. El Vibro cholerae 01 es agente causal del cólera. Un color verde indica positividad de la reacción. Revelar añadiendo 3 a 5 gotas de reactivo de Kovac`s. no encapsulado. 3. Un color rojo indica positividad de la reacción. Revelar el rojo de metilo (MR) agregando a uno de los tubos 4 a 6 gotas de rojo de metilo. sembrando por estría la parte inclinada. móvil mediante un flagelo polar único.2ºC por 24-48 horas. Un color rojo indica positividad de la reacción. oxidada positivo. Incubar a 35ºC +/.6 ml de alfa naftol al 5% y 0. Producción de Indol Inocular cada uno de los tubos de Caldo Triptófano.Determinación de fenilalanina (APP): Inocular cada uno de los tubos de Agar fenilalanina. Incubar a 35ºC +/. género Vibrio.2 ml de solución acuosa de hidróxido de potasio al 40%. tijeras.divide en 2 biotipos.500 g sensibilidad 0. tenedores. pinzas.2ºC  Refrigerador a 0 – 5ºC  Cajas de petri estériles  Pipetas de 1 ml estériles  Frascos estériles con capacidad de 500 ml  Cabina de flujo laminar  Pipeteador  Microscopio  Asa de inoculación  Gradillas  Bolsas de plástico estériles  Homogenizador o aparato similar  Balanza de capacidad no inferior a 2.C. el Clásico y el Tor y puede pertenecer a los serotipos Ogawa. (BHI) (medio 48)  Caldo de peptona azúcar 1%: glucosa. Inaba e Hikojima. sacarosa. T.B. manosa. Equipo y material  Incubadora a 35ºC +/. espátulas. e inositol (medio 49)  Caldo L-lisina 1%. cucharas.S. (medio 46)  Agar nutritivo con NaCl al 1% (medio 47)  Agar infusión cerebro corazón. manitol. arabinosa. L-ornitina 1% (medio 50)  Agar hierro triple azúcar (TSI) (medio 39)  Agar Kliger (medio 51)  Caldo nitrato (medio 12) . morteros con sus respectivos pistilos estériles  Láminas portaobjetos  Tubos tapa rosca estériles Medios de cultivo y reactivos  Agua de peptona alcalina (medio 45)  Agar Tiosulfato citrato sales biliares sacarosa. L-arginina 1%.1 g  Instrumentos para preparar las muestras  Cuchillos. Tomar un mínimo de 3 colonias y sembrar en Agar nutritivo o en Agar BHI por estría e incubar a 35ºC +/-2ºC por 18-24 horas . Incubar a 35ºC +/-2ºC por 18-24 horas 5. 6. para conformar la unidad de muestra necesaria para el análisis. para conformar la unidad de muestra necesaria para el análisis.  Moluscos: preparar una muestra de 10 a 12 animales ó 20 a 30 animales pequeños que incluya el licor de conchas.S. Incubar a 35ºC +/. con el centro opaco y la periferia translúcida. Pasado el tiempo de incubación. amarillas y ligeramente aplanadas. Pasado este tiempo observar las colonias típicas de V. 2. sin mezclar el frasco o Erlenmeyer.2ºC por 6 – 8 horas 3. Pesar 25 g del total de la muestra en un Erlenmeyer o frasco que contenga 225 ml de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente.B. Inaba. realizar un barrido de la superficie del cultivo con el asa y sembrar en superficie por agotamiento en Agar Tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (T. Ogawa) Preparación de la muestra para el análisis  Pescado entero: remover la carne alrededor de las tripas. Procedimiento 1. sandía)  Vegetales con hojas: tomar mínimo 5 hojas externas completas.cholerae en el Agar TCBS las cuales son grandes. (2-3 mm) lisas. Reactivo de Griess (reactivo 8)  Polvo de zinc  Desoxicolato sódico 0.5% (reactivo 21)  Reactivo para Oxidasa (reactivo 16)  Reactivos para coloración de Gram (reactivo 12)  Antisueros (Polivalente.) 4. agallas y piel.C.  Crustáceos: extraer la carne para conformar la unidad de muestra  Frutas y vegetales: enjuagar cada fruta o vegetal con el agua peptonada alcalina (225 ml) en una bolsa plástica estéril  Frutas pequeñas: utilizar 5 unidades (ejemplo 5 tomates)  Frutas grandes: utilizar una unidad (ejemplo melón. por medio del asa. Pasado este tiempo realizar la prueba de la oxidasa y de la cuerda de la siguiente manera: Prueba de la Oxidasa: En una caja de petri. según indicador de pH utilizado. manitol e inositol.7. sacarosa. forma hilos. En 60 segundos se forma una masa mucoide. Hacer un extendido con asa de vidrio o palillo de madera de una colonia sospechosa. Prueba de la cuerda: Elegir una colonia del Agar nutritivo o Agar BHI. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas. que al ser elevada del portaobjeto. manosa. colocar una capa de aceite mineral. colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa.5% de desoxicolato sódico. emulsificarla sobre una lámina portaobjeto. El cambio de color a púrpura indica una prueba positiva. Lornitina. con ayuda de un asa. a partir de las colonias de Agar nutritivo o Agar BHI realizar las pruebas bioquímicas. siguiendo una línea de 3 a 6 mm de longitud. Identificación de Vibrio cholerae mediante pruebas bioquímicas Fermentación de carbohidratos Inocular con asa los tubos con caldo carbohidrato azúcar 1%: glucosa. . en una gota de suspensión acuosa al 0. Prueba de la decarboxilación de aminoácidos Inocular con asa cada uno de los tubos para los aminoácidos L-lisina. sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo. la reacción es positiva. Si la prueba de la oxidasa y de la cuerda son positivas. Si se produce un cambio de color. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas. L-arginina. arabinosa. Reacción positiva: azul violeta Reacción negativa: No hay cambio de color Hacer controles positivo negativo con cepas conocidas. Si no hay cambio de color debe efectuarse la prueba del polvo de zinc. A los tubos negativos de la prueba de Griess.cholerae producirán una reacción A/A sin producción de gas. sembrando por estría la parte inclinada y por picadura la columna del medio. Coloración de Gram Bacilos curvos Gram negativos Bioquímica de V. ni producción de H2S. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas. sembrando por estría la parte inclinada y por picadura la columna del medio. el color del reactivo indica la reducción de nitratos. Un color rojo indica la no reducción de nitratos.Reducción de Nitratos Inocular los tubos con Caldo nitrato. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas. Los cultivos de V. agregar una pequeña cantidad de polvo de zinc y agitar. Cholerae Oxidasa Glucosa Sacarosa Arabinosa Manosa Manitol + +(sin gas) + + + Inositol Lisina Ornitina Arginina Nitratos + + + . unos miligramos del reactivo de Griess y observar el color que presenta: El color rojo representa una prueba positiva de reducción de nitratos. Los cultivos de V. Añadir a cada uno de los tubos. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 48 horas. Reacción en Agar hierro triple azúcar Inocular cada uno de los tubos de Agar TSI. Reacción en Kliger Inocular cada uno de los tubos de Agar Kliger.cholerae producirán una reacción K/A sin producción de gas ni H2S. Tomar una colonia aislada en Agar nutritivo o Agar BHI y emulsificarla con una gota de solución salina 0. 5. realizar la prueba con los sueros Inaba y Ogawa. Tomar otra colonia aislada en Agar nutritivo o Agar BHI y emulsificarla con una gota de antisuero polivalente sobre una lámina portaobjeto 3.cholerae NO 01 NR: No se realiza . Interpretación de las pruebas serológicas  Si se observa aglutinación con el antisuero Ogawa se informa Vibro cholerae 01 serotipo Ogawa.85% sobre una lámina portaobjeto. no se debe observar aglutinación con la solución salina.Una vez identificadas las cepas por sus características bioquímicas. Mezclar por minuto 4.cholerae 01 serotipo Inaba V.cholerae 01 sereotipo Hikojima V. Pruebas serológicas Polivalente + + + - Inaba + + NR Ogawa + + NR Interpretación V. Identificación de Vibrio cholerae mediante pruebas serológicas 1. Una reacción positiva está dada por la aglutinación con el antisuero polivalente.  Si se observa aglutinación con el antisuero Inaba se informa Vibro cholerae 01 serotipo Inaba  Si se observa aglutinación con el antisuero Ogawa y con el antisuero Inaba se informa Vibro cholerae 01 serotipo Hikojima. Si se observa aglutinación con el antisuero polivalente. 2. se procede a la identificación serológica.cholerae 01serotipo Ogawa V. por esto es de gran importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia.1 g  Pipeteador  Bolsas de plástico estériles para homogenizador  Pipetas bacteriológicas de 1 ml y 10 ml  Asa de inoculación  Gradillas  Cajas de petri  Tubos de ensayo estériles  Láminas portaobjetos . Monocytogenes que sea completamente satisfactorio para todos los alimentos.20 DETERMINACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES La principal vía de entrada de Listeria monocytogenes en el cuerpo humano es la oral. identificación de las colonias con pruebas bioquímicas. siembra en placas de Agar selectivo. Equipo y material  Centrífuga  Cabina de flujo laminar  Refrigerador a 0-5ºC  Erlenmeyer con capacidad de 500 ml  Incubadora a 30ºC y 35ºC +/-2ºC  Baño de agua a 80ºC  Microscopio  Microscopio estereoscopio  Homogenizador o aparato similar  Balanza de una capacidad no inferior a 2. confirmación serológica y tipificación por medio de bacteriófagos. Los métodos que se utilizan son en esencia similares en principio. indica tratamiento inadecuado o contaminación pos-proceso.3. comprenden varias etapas sucesivas: enriquecimiento selectivo.500 g y sensibilidad de 0. La presencia de L. Aún no es posible recomendar un solo método para el aislamiento y la identificación de L. Monocytogenes en productos procesados térmicamente. etc..5% en agua destilada (reactivo 22)  Solución de ácido nalidíxico sal sódica al 0. espátulas.1N (reactivo 28) .5% en agua destilada (reactivo 23)  Solución de cicloheximida al 1% en solución al 40% de etanol-agua (reactivo 24)  Peróxido de hidrógeno al 3% (reactivo 13)  Colorante de tinción de Gram (reactivo 12)  Reactivo de Griess (reactivo 8)  Polvo de zinc  Solución de xilosa al 5% (reactivo 25)  Solución de ramnosa al 5% (reactivo 26)  Solución de manitol al 10% (reactivo 27)  Solución salina estéril 0. tenedores. con superficie inclinada (medio 63)  Solución de acriflavina HCl al 0. ramnosa manitol (medio 60)  Agar infusión cerebro corazón. pinzas. TSAYE (medio 56)  Caldo de infusión cerebro corazón (medio 6)  Agar movilidad nitrato modificado Hatano Schuch (medio 57)  Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre desfibrinada de cordero* (medio 58)  Agar Columbia doble capa al 5% de sangre desfibrinada de cobayo** (medio 59)  Caldo carbohidrato rojo de fenol para los hidratos de carbono: xilosa. OXA (medio 53)  Agar Palcam en placa (medio 54)  Agar triptosa con ácido nalidixico en placas. ATN (medio 55)  Agar tripticasa soya con extracto de levadura en placa. pistilos. con superficie inclinada (medio 48)  Caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (1)(medio 61)  Caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (2)(medio 62)  Agar triptosa. Medios de cultivo y reactivos  Caldo de enriquecimiento para Listeria.85% (reactivo 4)  Solución acriflavina al 1% en hidróxido de sodio 0. Instrumentos para preparar las muestras: cuchillos. previamente esterilizados. EB (medio 52)  Agar Oxford en placa. sacabocados. morteros. Monocytogenes en las placas de Agar Oxford son de color verde negro con un halo negro. Añadir 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB) 3. aislar por agotamiento. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas 3. Monocytogenes es la recomendada por la FDA. III. 4.2% en hidróxido de sodio 0. No debe sobrepasar los 3 minutos. Enriquecimiento selectivo Siembra en placa en Agar selectivo y diferencial Identificación I. el tiempo máximo de homogenización dependerá del tipo de alimento. II.1N (reactivo 30)  Hidróxido de sodio 0. . Incubar a 30ºC +/-2ºC durante 24-48 horas II.1N (reactivo 29)  Solución de acriflavina al 0. Las colonias típicas de L. Transferir una asada del cultivo obtenido en el caldo de enriquecimiento (EB) a placas con Agar Oxford y Palcam.1N (reactivo 31)  Buffer FA-Difco Kit de sueros tipificadores de Listeria Procedimiento para productos lácteos La técnica utilizada para el aislamiento e identificación de L. Pesar en la bolsa para “stomacher” previamente tarada 25 g representativos de la muestra total (tomando tanto de la superficie como de su interior) 2. modificada en algunos aspectos. debido a la hidrólisis de la esculina. 2. Solución de ácido nalidíxico sal sódica al 2% en hidróxido de sodio 0. Colocar la bolsa en el “stomacher” y hacer funcionar el aparato por 2 minutos. Enriquecimiento selectivo 1. Siembra en placa con medios selectivos a las 24 y 48 horas 1. El aislamiento de Listeria incluye tres etapas fundamentales: I. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 18-24 horas Adicionalmente realizar cultivos en fase estacionaria de cepas estándar de Staphylococcus aureus (CAMP +) y Rhodococcus equi 4. Con asa recta tocar suavemente cada colonia seleccionada. 5. Segunda purificación 1. Seleccionar 3-5 colonias típicas de Listeria en cada placa de Agar utilizado. Otras bacterias pueden formar halos negros. 5. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 18-24 horas III: Identificación de Listeria La identificación de cultivos sospechosos de pertenecer al género Listeria incluye dos etapas seguidas: . Monocytogenes son pequeñas. Primera purificación 1. Monocytogenes en las placas de Agar Palcal son de color verde grisáceo con un halo marrón negro sobre un fondo rojo cereza. 2. Monocytogenes Realizar control negativo: cepa Streptococcus faecalis Las colonias de L. 4. exhiben superficie azulada. Tomar una colonia típica de Listeria de cada placa de Agar (ATN) repicarla por agotamiento en una placa con Agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE). Las colonias típicas de L. Incubar a 35ºC +/. de borde nítido. Las colonias de S. faecalis son amarillas hasta amarillas rojizas tornasoladas. sembrarla por agotamiento en una placa con Agar triptosa ácido nalidíxico (ATN). Transferir una asada de cada una de las cepas estándar a tubos con 5 ml de caldo de Infusión cerebro corazón. pero el desarrollo de color toma más de dos días. Realizar control positivo: cepta L.2ºC por 18-24 horas Observar a las 24 horas las colonias crecidas en el Agar (ATN) por el método de iluminación de Henry con ayuda de un estereoscopio.4. 6. ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz incidente oblicua. 3. 7. 2. 6. 3. 5. debido a la hidrólisis de la esculina y no fermentación del manitol. Un procedimiento sencillo es disponer de una fuente de luz blanca un espejo plano y un trípode. Identificación de Listeria mediante pruebas bioquímicas A partir de los cultivos puros obtenidos en el Agar tripticasa soya extracto de levadura (TSAYE) realizar las siguientes pruebas: Método de iluminación de Henry Observar las colonias con la ayuda de un estereoscopio. de borde nítido. Bacilos o cocobacilos grampositivos . Las colonias de L. La luz debe de incidir sobre el espejo formando un ángulo de 45ºC y reflejarse hacia arriba atravesando la placa del Agar en un ángulo de 45º observar la placa mirándola desde arriba. exhiben superficie azulada. de las colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas Identificación serológica de las cepas sospechosas mediante el uso de antisueros. ligeramente abombadas con superficie lisa y con la luz indicente oblicua.Comprobación determinativas.monocytogenes son pequeñas. Catalasa Colocar en un portaobjeto una gota de peróxido de hidrógeno al 3% Suspender la colonia Observar si se producen o no burbujas de gas. Catalasa (+) b.monocytogenes: bacilos o cocobacilos grampositivos En cultivos viejos: bacilos o cocos gramnegativos. monocytogenes: catalasa (+) produce burbuja de gas Coloración de Gram L. L. Descartar los cultivos que no cumplan con las siguientes características: a. L.monocytogenes: crecimiento típico en forma de sombrilla Descartar los tubos que no presenten esta apariencia Revelar la prueba de nitrato después de la lectura de la movilidad. monocytogenes: Nitrato (-) Crfecimiento típico de sombrilla Nota: Actualmente la prueba de reducción de nitratos es opcional. Color rojo: no reducción de nitrato Color del reactivo: reducción del nitrato. La aparición de un color rojo indica presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto una reacción negativa. indica presencia de nitritos (positiblidad). la aparición de un color rojo.Movilidad y reducción de nitrato Inocular con asa recta por punción central tubos con Agar movilidad-nitrato modificado Hatano Schuch. en el caso de que no ocurra cambio de color añadir unos miligramos de polvo de Zinc para determinar la presencia de nitrato residual. ivanovii: presenta zonas bien delimitadas y amplias de hemólisis L. innocua: no muestra hemólisis . monocytogenes: presenta ligera beta hemólisis L. Incubar a temperatura ambiente 2 – 5 días. L. Hemólisis Dibujar una rejilla con 20-25 cuadrículas por placa en el fondo de una caja de petri con Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre de cordero Tomar una colonia típica y sembrarla por picadura en una de las cuadrículas Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24 horas Realizar controles positivo y negativo L. añadiendo unos miligramos del reactivo de Griess. comprobar la presencia de nitritos en el medi de movilidad-nitrato. innocua L. Seeligeri se intensifica cerca al S. sin tocarlos. sobre placas delgadas y frescas con Agar tripticasa soya adicionado con 5% de sangre de cordero. a 1 ó 2 mm de los cultivos anteriores. Las otras especies de Listeria al no ser hemolíticas presentan una reacción de CAMP negativa. La hemólisis de L. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas.ivanovii L.monocytogenes L. Sembrar líneas verticales paralelas. Aureus. Se observa mejor a las 24 horas.aureus. Prueba de CAMP. La hemólisis de L. Equi. seeligeri + + Rhodococcus equi -ª + - . welshimeri L. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24 horas Prueba de CAMP. Inocular horizontalmente (ángulo 90º) las muestras en estudio y los controles positivos y negativos. Monocytogenes se intensifica cerca al cultivo de S. Reacciones de las diferentes especies de Listeria. Ivanovii se realza cerca al cultivo del R. La hemólisis de L. Especies Interacción Hemolítica Staphylococcus Aureus L. Considerar la reacción positiva para CAMP cuando se presenta una zona clara de beta hemólisis en la intersección de la muestra en estudio con la cepa de Staphylococcus aureus o Rhodococcus equi. de cultivos frescos de Staphylococcus aureus CAMP (+) y Rhodococcus equi.Este procedimiento también se puede realizar sembrando una colonia del cultivo puro en placas con Agar Columbia doble capa adicionado con 5% de sangre de cobayo. ª Raras cepas son S+ y R+. serológica y bioquímica. 2. L. Monocytogenes pueden ser serotipificadas con sueros tipo 1. generalmente ocurre a las 48 horas. Monocytogenes 1995 Fermentación de Carbohidratos Inocular con asa los tubos que contienen cada uno de los carbohidratos xilosa. pero la reacción R+ es mucho menos pronunciadas que la de la L.Monocytogenes Xilosa(-) Manitol (-) Ramnosa (+) Prueba Serológica Esta prueba sirve como evidencia corroborativa en la determinación del organismo como agente etiológico de la enfermedad. L. ramnosa y manitol. Incubar a 35ºC +/-2ºC por 18-24 horas Adicionar al cultivo obtenido. Transferir esta suspensión a un tubo estéril Calentar la suspensión con el organismo a 80ºC por 1 hora Centrifugar por 30 minutos a 1600 revoluciones por minuto . Ivanovii Tomado del Manual de Bacteriología Analítica FDA. La identificación final no se puede hacer sin la caracterización morfológica. 3. Realizar dos transferencias sucesivas del cultivo en estudio en un tubo con la superficie inclinada de Agar triptosa o infusión cerebro corazón. tipo 4. mezclar para desprender el cultivo 4. Más del 90% de L. 5. 3 ml de buffer (FA). Incubar a 35ºC +/-2ºC por 24-48 horas Descartar a los 7 días de incubación Observar el viraje del indicador. Prueba rápida en lámina 1. 6. Bioquímica de Listeria Monocytogenes Catalasa Nitratos Motilidad CAMP Xilosa + +(sombrilla) +(con S. Homogenizar 25 g de la muestra a analizar con 225 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (1) adicionado con 0. 2.aureus) - Manitol Ramnosa Esculina Prueba de Anton Hemólisis + + + + Expresar los resultados como: L.1N. como pertenecientes a un determinado serotipo requiere el envío de cepas a un centro especializado en tipificación. La identificación definitiva de Listeria. Enriquecimiento selectivo primario 1.Monocytogenes/ 25g: positivo o negativo Procedimiento para productos cárnicos La técnica utilizada para productos cárnicos es la recomendada por el Ministerio de Agricultura del Brasil. Los laboratorios que realicen la detección rutinaria de Listeria en alimentos deben utilizar pruebas bioquímicas y posteriormente someter dichas cepas a pruebas serológica para determinar si son Listeria.225 ml de solución de acriflavina al 1% en hidróxido de sodio 0.3 ml del fluido y resuspender los organismos con la porción restante del líquido y continuar con las instrucciones de la casa fabricante correspondiente utilizada. Retirar 2. Tipificación mediante Bacteriófagos Desde el punto de vista epidemiológico es una prueba muy útil y es realizada por laboratorios especializados.2 – 2.7. I. Incubar a 30ºC +/-2ºC por 18-24 horas . 21 PRUEBA DE ESTERILIDAD Esterilidad comercial de un alimento tratado térmicamente.2 ml del cultivo obtenido en el caldo LEB (1) a un tubo con 10 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria LEB (2) adicionado con 0. Este procedimiento analítico determina si los alimentos envasados en recipientes herméticamente cerrados cumplen con el requisito de esterilización comercial al que se sometieron y se aplica a todos aquellos alimentos catalogados como comercialmente estériles.1N. Seguir la misma pauta utilizada en la técnica de la FDA a partir del numeral Purificación. en las que se mantendrá durante su distribución y almacenamiento. Transferir 0. Transferir una asada del cultivo LEB(2) a placas con Agar Oxford y Palcam 4.II. con el objeto de liberar el alimento de microorganismos patógenos capaces de reproducirse en él en condiciones normales. Enriquecimiento selectivo secundario 1. solo o en combinación con otros tratamientos apropiados.1 ml de solución de acriflavina al 0. 2. no refrigerados. 3. es el estado que se consigue aplicando calor suficiente. Equipo y material  Cabina de flujo laminar  Refrigerador a 0-5ºC  Incubadora a 35ºC +/-2ºC  Incubadora a 55ºC +/-2ºC  Microscopio  Campana de anaerobiosis  Pipetas bacteriológicas de 1 ml  Gradillas  Pipeteador  Láminas portaobjetos . Incubar a 30ºC +/-2ºC por 18-24 horas 3.2% en hidróxido de sodio al 0. Medios de cultivo y reactivos  Caldo Infusión cerebro corazón. con el objeto de descubrir cualquier escape del producto. previamente esterilizados. cucharas. II.1% BHI (medio 64)  Colorantes tinción de Gram (reactivos 12) Procedimiento El análisis de esterilidad incluye las siguientes etapas: I. . V. tijeras. Preparación de la muestra Preincubación de las latas Preparación de las latas para el análisis Análisis del contenido de la lata Lectura al microscopio Preparación de la muestra Las dos latas que componen la muestra deben pertenecer al mismo lote de producción. Envolver cada lata en papel de filtro. Enjuagar con agua tibia y secar con toallas limpias desechables 4. etc. 1. Retirar las etiquetas de las latas 2. tenedores. IV. espátulas. 5. sacabocados. Preincubación 1.. Marcar las latas con fecha. número de muestra y temperatura de incubación. Incubar una lata a 35ºC +/-2ºC durante 10 días y otra lata a 55ºC +/-2ºC durante 10 días. Lavar las latas con agua tibia jabonosa 3. II. pinzas. III. Sobres generadores de anaerobiosis  Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm  Instrumentos para preparar muestras: cuchillos. I. con almidón al 0. Desinfectar con alcohol al 70% todas las latas a examinar 2. Observar las latas cada dos días. Lectura Hacer frotis de cada tubo sembrado y colorear con Gram para determinar el tipo de gérmenes presentes. Realizar un frotis directo del producto sobre la lámina limpia y desengrasada y colorearla con Gram. V. IV. Cubrir la lata abierta con la base de una caja de petri estéril. 4. No abrir la tapa o fondo que lleva impreso el número de control. Flamear rápidamente la parte que va a abrirse. No hacerlo nunca con latas 3. con el objeto de descubrir cualquier escape del producto (microfugas). . un tubo aerobio muestre desarrollo. Agitar las latas no alteradas e invertir su posición.1% de almidón. Abrir la lata trabajando en la cabina de flujo laminar y eliminar totalmente la tapa. Preparación de las latas para su Análisis 1. Incubar 3 tubos en anaerobiosis y 3 tubos en aerobiosis a la misma temperatura de preincubación (35ºC +/-2ºC y 55ºC +/. Un número elevado indicará pésimas condiciones de higiene durante la preparación del producto y/o utilización de materias primas muy contaminadas. III. Separar y examinar inmediatamente aquellas que muestren abombamiento o escape de material. adicionados de 0.2. abombadas. Considerar que el producto es estéril cuando máximo. código o lote 4. Análisis del contenido de la lata Transferir aproximadamente 2 gramos del producto (tomando todas las partes representativas) a cada uno de los 6 tubos que contienen 10 ml de Caldo de infusión cerebro-corazón.2ºC) por 72 horas. 3. contar las células bacterianas por campo. 5. 941F77.:03943/.8.443.5705.08..203948 O 3./47.8:1:74 6:003570803.424070.390/0.3..:-./0.8-.8  6:542. 57450/.3.438/07.907.8 ./48/..08 /0 F3074 4897/:2 90303 .70O38:194..3E8808./47.O2    #&% $! #$ $%#&$&% #&% #  890.//070/:.97.O3/:.074-.4:497.O3/04842403./48/0./472E825479.8307.745..907.7.8 085O741472. /0209.7.08508.  .7..  O 430.8 0850.8  './4. .       :1. 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