Manual Exame Chagas

1. MÉTODOS PARASITOLÓGICOS DIRETOS 1.1 Fundamento Conforme relatado anteriormente, os métodos parasitológicos diretos baseiam-se na pesquisa direta do parasita na amostra clínica. Eles podem ser realizados em laboratórios clínicos com condições mínimas de equipamentos, porém é necessário que o profissional tenha passado por um treinamento de reconhecimento do parasito. Nesse treinamento, o T. cruzi deve ser diferenciado de outras espécies de tripanossomas que infectam também o homem. Nas páginas seguintes nos deteremos em protocolos que se baseiam na demonstração do parasito em lâmina, que são procedimentos simples sendo necessário apenas como equipamento um microscópio. É importante voltar a ressaltar que os métodos parasitológicos diretos só apresentam alta sensibilidade na presença de parasitemia patente, sendo por isso o método de escolha na suspeita de casos agudos ou de reativação da infecção. 1.2 Coleta da Amostra A obtenção da amostra de sangue pode ser realizada diretamente por punção digital ou venosa. Vide Figura 21 na página 144 dos Anexos dos Módulos I e II. 2. PROTOCOLOS 2.1 EXAME DE SANGUE A FRESCO O exame a fresco do sangue é mais sensível que o esfregaço corado e deve ser o método de escolha na suspeita de infecção aguda. Por outro lado, não possibilita uma boa visualização das características morfológicas do parasito, por isso recomenda-se em caso positivo fazer distensões coradas com objetivo de fazer um diagnóstico morfológico diferencial com o Trypanosoma rangeli, um outro tripanossoma que também infecta o homem e compartilha vetores comuns com o T. cruzi. 71 No “Consenso Brasileiro em Doença de Chagas”, desenvolvido por especialistas brasileiros, é sugerida a seguinte conduta diagnóstica: “caso os exames diretos sejam negativos, devem ser usados os métodos de concentração, tais como micro-hematócrito, teste de Strout ou QBC (Quantative Buffy Coat). Estes métodos apresentam 80 a 90% de sensibilidade e são recomendados quando houver suspeita de doença de Chagas aguda e o exame direto a fresco resultar negativo”. 2.1.1 PROCEDIMENTO 1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por punção digital ou venosa, no meio da lâmina e cobrir com uma lamínula (20x20 ou 22x22). Se for realizada a contagem de parasitos empregar a lamínula 22x22. 2) Levar ao microscópio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 40X); 3) Se negativa, recomenda-se diariamente fazer várias lâminas em coletas periódicas, antes de dar o exame como negativo. 2.2 DISTENSÃO FINA OU ESFREGAÇO A distensão fina permite a identificação das estruturas morfológicas da espécie alvo de reconhecimento, porém a sensibilidade do diagnóstico é menor que a da gota espessa. Isto ocorre em virtude da menor concentração do sangue. Também proporciona a classificação morfológica do parasita por permitir uma melhor visualização dele. Entretanto, a gota espessa, por ter uma maior quantidade de sangue desemoglobinizado, apresenta uma maior probabilidade de se visualizar o parasito na amostra. Para a confecção da distensão fina devemos utilizar uma lâmina biselada ou escantonada para espalhar o sangue, trabalhando em uma superfície plana horizontal. Devemos formar um ângulo de aproximadamente 45° com a lâmina biselada e, logo após a mesma entrar em contato com a gota de sangue, espalhá-la com um rápido movimento para frente, para formar uma camada fina, sem atingir o final da lâmina. Mais detalhes da confecção serão fornecidos a seguir. A distensão fina “deveria permitir” 72 uma menor perda de parasitas, se comparada com a gota espessa, por ser fixada e não ser submetida à desemoglobinização (Figura 1). As distensões finas conservam por maior tempo a coloração original e resistem mais ao atrito após a remoção do óleo de imersão. Figura 1: Secção de esfregaço. Desenho adaptado por Heloísa Maria Nogueira Diniz. Fonte: PRAT, J.G.; TRAID, M.C.; MORAIS, P.; ANDRADE, S.L. (orgs) Combatendo a Malária no Parque Nacional do Jaú e Resex do Rio Unini. Barcelona: Nucli d’estudis per a l’Amazònia de Catalunya- NeAC, 2009. 2.2.1 CONFECÇÃO E COLORAÇÃO DAS DISTENSÕES 1ª ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 1) Colocar uma pequena gota de sangue, coletada por punção digital ou venosa, na extremidade da lâmina. Tocar a gota de sangue com a borda estreita da lâmina sem canto (lâmina extensora), formando um ângulo de 45º com a face superior da lâmina (Figura 2A); 2) Fazer com a lâmina extensora um ligeiro movimento para trás, até encostar na gota de sangue. Deixar que a gota se difunda uniformemente, ao longo da borda da lâmina extensora, por capilaridade (Figura 2B); 3) Levar a lâmina para frente, de forma que ela carregue a gota de sangue que se quer estender numa camada delgada e uniforme. É essencial escorregar a lâmina extensora de uma só vez, sem deter-se. O movimento de extensão deve ser uniforme. O 73 sangue deverá ser puxado pela lâmina e não empurrado pela mesma (movimento suave, Figura 2C). 4) Deixar secar à temperatura ambiente ou em uma estufa a 28 º C. Figura 2: Modo de estender a gota de sangue: A) O ângulo entre a lâmina e a lâmina extensora deve ser de 45 º; B) Aproximando as duas, a gota de sangue se distende por capilaridade imediatamente; C) O sangue é carreado pela borda da lâmina, que se impulsiona para frente em um movimento rápido e leve; D) Detalhe da lâmina extensora (bizelada). Fonte: BEÇAK, W.; PAULETE, J. Sangue: Técnicas de Citologia e Histologia. Rio de Janeiro: Editora Livros Técnicos e Científicos, 1 v., 1976, 306 p. 2ª ETAPA: COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GIEMSA Neste tipo de coloração descrito, utilizamos o corante Giemsa. A solução de Giemsa destina-se a coloração de esfregaços do sangue ou da medula óssea in vitro, consistindo numa solução tampão de tiazina e eosinato concebida para a coloração de elementos figurados do sangue. Esse corante poderá ser utilizado em separado ou em conjunto com o corante May-Grünwald. O Giemsa, que cora especificamente os grupos de fosfato do ADN, liga-se a regiões onde há alta quantidade de ligações A-T (Adenina - Timina). Em uma coloração bem feita, os núcleos celulares apresentarão diversos tons de púrpura. A coloração citoplasmática apresentará diversos tons de azul a cor‑de-rosa claro. As etapas estão descritas a seguir: 74 306 p.1) Fixar as lâminas com álcool metílico livre de acetona durante 1 a 2 minutos à temperatura ambiente (pela nossa experiência 1 min é o suficiente).8) (preparação do corante e da água tamponada em Preparo de Soluções. Paulete J. Fotografia de Marcello Pelliccione. 2) Corar as distensões com solução de Giemsa. 1976. 3) Colocar o corante sobre a lâmina ou imergir em frasco de vidro tipo Coplin (Figura 3). Fonte: SIMONS. 4) Lavar a lâmina em água da torneira (fluxo fino). 75 . 476p. antes de dar o caso como negativo. preparada no momento da coloração na concentração de 1 volume de Giemsa para 9 volumes de água tamponada (pH 6.Lippincott Company. É conveniente fazer várias lâminas. (Fonte: Beçak. Rio de Janeiro: Editora Livros Técnicos e Científicos. deixando por cerca de 5 a 10 minutos. Um esfregaço novo. Technical Hematology. 1976. 1 v. 5) Escorrer a água e deixar secar. Philadelphia & Toronto: J. OBS: O exame da gota distendida deve ser empregado em caso de suspeita de infecção aguda. A. Quanto mais antigo o esfregaço maior o tempo de coloração. geralmente. Tem a vantagem de possibilitar uma boa visualização da morfologia do parasita. no item 6).. Figura 3: Frasco de Coplin. requer de 10 a 15 min para se corar. porém tem pouca sensibilidade no caso dos parasitos não serem abundantes. W. Sangue: Técnicas de Citologia e Histologia..B.). a desemoglobinização fica prejudicada se esse período for superior a 72 horas. Para a confecção da gota espessa. Como dissemos anteriormente. A gota espessa é também o método oficialmente utilizado no Brasil. Permite a diferenciação específica dos parasitos a partir da análise de sua coloração. A Figura 5 representa um esquema de um corte transversal de uma gota espessa e o que ocorre após a desemoglobinização. nos procedimentos acima descritos devemos. Desenho de Carlos José de C. após coloração pelo método de Walker ou Giemsa. devido a sua alta concentração. Moreira. Figura 4: Gota espessa. O material deve ser corado no máximo até 72 horas após a confecção. fazendo com que o esfregaço ou a gota espessa possam desprender-se durante o procedimento de coloração ou durante a lavagem posterior à coloração. preferencialmente. pois essas substâncias dificultam a fixação do sangue. para o diagnóstico da malária.3 GOTA ESPESSA É um método simples e eficaz de diagnóstico.2. Sua técnica baseia-se na visualização do parasito. através de microscopia ótica. 76 . podemos colocar pequenas gotas de sangue nas posições relativas aos vértices de um quadrado imaginário e uni-las com um movimento circular utilizando um palito descartável ou o vértice de uma lâmina comum (Figura 4). utilizar o sangue sem anticoagulante. No caso da gota espessa. da morfologia e de seus estádios de desenvolvimento no sangue periférico. além de ter baixo custo. . à temperatura ambiente e ao abrigo da luz solar. o que tem como objetivo evitar a hidratação de toda a solução estoque. Os corantes utilizados para corar distensões sanguíneas ou gotas espessas são chamados de pancrômicos. que possa ser periodicamente alimentado com o corante do frasco estoque. 2009. Barcelona: Nucli d’estudis per a l’Amazònia de Catalunya-NeAC. A ingestão acidental do metanol (presente em alguns corantes e também 77 . para isso. dependentes do pH da solução corante. Devemos evitar pipetar o corante com o uso da boca. Desenho adaptado por Heloísa Maria Nogueira Diniz. J..L. permanece estável até a data de vencimento indicada no rótulo do frasco. Fonte: PRAT. ANDRADE. P.G. bem vedado.Figura 5: Corte trasnversal de uma gota espessa e o que ocorre após a desemoglobinização. TRAID. com predominância de tons vermelhos (quando ácidos) e azulados diversos (quando básicos). Devemos utilizar um pequeno frasco com conta-gotas. Na prática diária o corante é utilizado sob forma de gotas. S. que em condições apropriadas coram os componentes nucleares e citoplasmáticos dos leucócitos. M. aconselha-se transferir a mesma para um pequeno frasco com contagotas. Alguns corantes são soluções alcoólicas. (orgs) Combatendo a Malária no Parque Nacional do Jaú e Resex do Rio Unini. O corante deve ser mantido no frasco original. É uma mistura de corantes de características neutras. MORAIS. A solução de coloração deve ser feita com certa antecedência e apenas uma pequena quantidade deve ser colocada em uso.. Sob essas condições. por isso devemos tomar os cuidados inerentes ao uso do álcool em laboratório.C. Normalmente para a coloração de lâminas necessitamos do seguinte material: 1) Pissetas (frascos plásticos de lavagem). 9) Solução de azul de metileno fosfato. As soluções corantes são para uso exclusivo in vitro. evitando-se o contato com pele e mucosas. 78 . 11) Solução do Corante. 6) Relógio marcador de tempo com alarme. dependendo da quantidade absorvida. Em caso de contaminação acidental.utilizado como fixador) pode ser fatal. 2) Uma placa de acrílico (placa côncava para coloração). lavar a área afetada em água corrente. Seu manuseio deve ser cuidadoso. O descarte do corante utilizado deverá obedecer aos critérios de biossegurança estabelecidos pelo laboratório. 10) Água tamponada. 3) Frasco conta-gotas. 5) Suporte próprio para colocar as lâminas na vertical (para secar as lâminas na última etapa da coloração). 8) Papel absorvente. 4) Suporte próprio para colocar as lâminas na horizontal (para uma parte do processo de coloração). 7) Proveta graduada de 100 ml. até tocar o alto da gota de sangue (evitando o contato com a pele). 6) Comprimir o dedo suavemente (como em ordenha) para obter uma outra gota de sangue esférica sobre a pele seca. Se a quantidade de sangue for insuficiente. em um canto da lâmina. Coletamos. 3) Calçar luvas de látex descartáveis. Remover a primeira gota de sangue com gaze ou algodão secos. 4 pequenas gotas de sangue. onde a identificação é feita com lápis. e no outro canto mais 4. Segurar o dedo a ser puncionado entre o polegar e o indicador da mão do operador e puncionar o local de maneira firme e rápida. evitando tocar as superfícies. enxugar com gaze ou algodão secos. também uma perto da outra (vide Figuras 6A e 6B). OBS: Este é o protocolo utilizado rotineiramente nos laboratórios de malária.3. uma perto da outra. Cuidar para não tocar o ponto de saída do sangue. 79 . pode-se colocar outra gota ao lado da primeira ou até duas. lóbulo da orelha ou. 2) Colocar uma das lâminas sobre uma superfície plana e manuseá-la pelas extremidades. a alternativa é usar lâmina com extremidade esmerilhada.1 COLETA DE SANGUE 1) Separar duas lâminas limpas deixando-as em superfície plana e horizontal. 4) Limpar vigorosamente a pele de local de punção (parte lateral do segundo ou do terceiro dedo da mão.2. posteriormente. A lâmina deve estar com etiqueta autoadesiva para o registro da identificação. em lactentes. Segurar a lâmina firmemente pelas bordas da extremidade onde se encontra a etiqueta de identificação. o dedo grande do pé ou calcanhar) com gaze ou algodão embebido em álcool a 70%. 5) Retirar o estilete (lanceta) do envoltório estéril segurando-o firmemente (puxar a tampa de uma só vez). Aproximar a lâmina ao dedo do paciente pela face onde consta a identificação. até que fique seca. após 10 minutos. Isto se obtém no mínimo após 1 hora. C) Esfregaço e gota espessa distendidos. 3) Conservar a lâmina assim preparada em lugar abrigado. usa-se para isso a ponta de outra lâmina (Figura 6). desemoglobinizála colocando a lâmina em posição vertical e mergulhada em um frasco contendo água destilada morna. nota-se que o sangue perdeu sua cor. 9a Ed. Rio de Janeiro.2 GOTA ESPESSA (PROTOCOLO 1) 1ª ETAPA: PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 1) Coletar o sangue por punção digital ou venosa. Guanabara Koogan. V. de maneira que fiquem próximas umas das outras.2. Figura 6: Confecção da gota espessa: A) Colocar 4 gotas de sangue formando um quadrado. tornando-se esbranquiçado. Parasitologia Médica. 2) Aplicar 4 gotas na parte central da lâmina. 80 . cujo detalhamento segue no protocolo seguinte. Fonte: PESSOA. na mesma lâmina.3. 1002 p. Figurada adaptada por Angela C. Junqueira. S B. Tais gotas são reunidas para formar “uma mancha” circular de um centímetro de diâmetro ou quadrada. Ao retirar a lâmina da água. geralmente. 4) Uma vez seca a camada espessa de sangue. B) Unir as gotas enchendo o quadrado. 5) A desemoglobinização verifica-se. empregam-se 3 a 4 gotas. pois. empregar o método comum de coloração pelo Giemsa. com o Giemsa diluído e deixar cerca de 15 minutos.3. em lugar de uma única gota de sangue. conforme já relatado. 2) Enxaguar com água tamponada (sem jato forte). pois às vezes ele é bem menor. por outro lado. 2) Em 2 ml de água destilada acrescentar 3 gotas de Giemsa (vide solução mãe no item Preparação de Soluções) e agitar bem. Cobrir a lâmina. já desemoglobinizada. 81 . OBS. GOTA ESPESSA PROCOLOLO 2: MÉTODO DE COLORAÇÃO DE WALKER MATERIAL NECESSÁRIO: Além do material anteriormente descrito necessitamos de água tamponada de uma solução de azul de metileno fosfato e da solução de Giemsa. antes de dar o caso suspeito como negativo. 3) Passados os 15 minutos. não possibilita uma boa visualização das características morfológicas do parasita.2ª ETAPA: COLORAÇÃO PELO GIEMSA 1) Após a desemoglobinização.3. lavar a lâmina em água destilada e deixar secar. É também conveniente fazer coletas periódicas. 1a ETAPA: DESEMOGLOBINIZAÇÃO PELA SOLUÇÃO HIPOTÔNICA DE AZUL DE METILENO 1) Quando a amostra de sangue em gota espessa estiver bem seca (cerca de 20 minutos ou mais pós-coleta). 2. aplicar sobre a mesma a solução de azul de metileno fosfatado e deixar por dois minutos. Testar este tempo antes de empregá-lo na rotina.: A gota espessa permite a concentração dos parasitos. sem fixar a preparação. Em segundo lugar a coloração pelo corante de Giemsa. 6) Deixar secar ao calor suave (Figura 7). OBS: I. 82 . B) após a desemoglobinização. Homogeneizar. Figura 7: Lâmina de gota espessa: A) antes da desemoglobinização. utilizar as soluções contidas em pissetas (frasco usado para lavagem através de jatos do líquido nele contido) para enxaguar as amostras de sangue fixadas. A coloração pelo método Walker consiste em primeiro lugar no tratamento da gota espessa pela solução de azul de metileno fosfatado para ser desemoglobinizada. livre de artefatos e contatos com soluções contaminadas por sangue. O aumento do consumo é compensado com a boa qualidade das preparações. 5) Enxaguar com água tamponada (sem jato forte). Para evitar essa desvantagem. 2) Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante para 1ml de água tamponada. II. Fotografias de Carlos José de Carvalho Moreira. 4) Deixar corar por 10 minutos (testar esse tempo antes de empregá-lo na rotina). onde já está a lâmina invertida. Nesse método não é recomendável imergir a lâmina na solução azul de metileno (pré-coloração) e na água tamponada (lavagem) em copos. em virtude da contaminação destas soluções repetidamente usadas por vários dias.2a ETAPA: COLORAÇÃO PELA SOLUÇÃO DE GIEMSA 1) Colocar a lâmina com o lado da gota voltada para a superfície da placa de acrílico (invertida). favorecendo a proliferação de bactérias e fungos. C) corada pelo Giemsa. 3) Despejar a solução recém-preparada na placa de acrílico. b) É de extrema importância adicionar somente HCl 5N em. OUTROS MÉTODOS DE COLORAÇÃO: 3. Após. (não deve ficar resíduo de HCl). Observa-se assim uma coloração bem definida. com ausência de rastros de coloração no meio de cultura fixado na lâmina conjuntamente com o parasita. Corar durante 01h10min (em média). Notas importantes: a) É indubitavelmente melhor corar lâminas por este método com esfregaços feitos no mesmo dia. durante aproximadamente 2 minutos. lavar bem as lâminas sob um fluxo delicado de água corrente. no máximo. 5) Lavar as lâminas rapidamente sob um fluxo delicado de água corrente e deixar secar. 2) Escorrer o metanol da lâmina e deixá-la secar. c) Ao aplicar o HCl. 83 . Deixar a lâmina secar.1 GIEMSA TAMPONADO (APÓS HIDRÓLISE ÁCIDA) É recomendado para amostras de sangue e de cultura. durante a lavagem de cada uma a reação prosseguirá acima do período desejado nas outras. 5 lâminas por vez. procurar sempre fazer um colchão fino desta substância sobre a lâmina (1 gota por campo) Isto também evita a digestão excessiva do material pelo ácido. Se houver aplicação numa quantidade maior de lâminas. 3) Cobrir cada lâmina com HCl (ácido clorídrico) 5N (*) e deixar por 10 minutos. prejudicando o resultado da leitura. 1) Fixar com metanol durante 10 minutos (no máximo).3. ocasionando a digestão de estruturasalvo do parasita. 4) Cobrir cada lâmina com a solução corante preparada com 1-2 gotas de Giemsa para cada ml do tampão de coloração (vide preparo do tampão em Preparo de Soluções). Colorações realizadas em meio envelhecido ou bifásico (como meio NNN+LIT.d) Se possível. pois manipulações excessivas induzem a precipitação do corante.2 COLORAÇÃO DE LÂMINAS DE FEZES DE TRIATOMÍNEOS (Usando corante Giemsa) 1ª ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 1) Com o auxílio de duas pinças. por exemplo). combinando a hidrólise ácida a frio da reação de Feulgen e a subsequente coloração do material com Giemsa tamponado. Cobre-se toda lâmina com esta solução. MÜHLPFORDT (1963). sem o sacrifício do mesmo. e CARVALHO (1973). por exemplo) não apresentam resultados excepcionais como os feitos sob esta recomendação. coletar as fezes através de uma delicada compressão no abdômen do inseto. ocasionando “borrões” de Giemsa na lâmina. Pode não produzir os melhores resultados em esfregaços de sangue. É aconselhável substituir o tempo de coloração para 45 min. e) Pode-se encurtar a coloração para 1 hora.” 3. tendo o cuidado com manuseio. OBS: “(*) A passagem pelo HCl é opcional sendo particularmente indicada nas situações em que se deseja visualizar com clareza a posição relativa do núcleo e cinetoplasto (estudo da diferenciação celular). utilizando-se para isto 3 gotas de Giemsa para cada mililitro de tampão. corar lâminas de cultura preferencialmente recém repicadas (em média de 4 dias de cultivo para Tripanossomas) em meio monofásico (LIT. 2ª ETAPA: COLORAÇÃO 1) Misturar as fezes obtidas com uma gota de solução de Errecart (vide preparo do tampão em Preparo de Soluções) e uma ou 84 .” “Nota: Esta técnica dá excelentes resultados e é uma adaptação daquelas utilizadas por IKITAWA & OGURA (1954). ou por outro melhor período de acordo com observações prévias. de preferência durante 12-24 horas. deixar secar. Os elementos básicos celulares (proteínas) serão seletivamente corados pelo corante ácido com a predominância de tons azulados. 2) Espalhar a mistura como um esfregaço espesso de sangue. 1ª ETAPA: COLETA DA AMOSTRA E PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 1) Sacrificar o triatomíneo com clorofórmio ou éter. Obtemos.3 COLORAÇÃO DE LÂMINAS DE FEZES E DE TUBO DIGESTIVO DE TRIATOMÍNEOS (Utilizando os corantes MayGrünwald e Giemsa) Neste tipo de coloração utilizamos 2 corantes diferentes: MayGrünwald e Giemsa. O corante May-Grünwald. 4) Lavar com cuidado. 3. mergulhando a lâmina em água destilada. 3) Com a ajuda de pinças. cruzi com tonalidades distintas. e por um corante básico. sem fixar. através de movimentos de tração. 5) Deixar secar e examinar. 2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do abdômen. uma coloração melhor. utilizamos uma segunda coloração com solução de Giemsa. Esses dois corantes são utilizados através de um método de coloração mais demorado. é um corante neutro sendo composto pela mistura de um corante ácido. com isso. 3) Corar pelo Giemsa.duas gotas de plasma humano ou de outro mamífero. evidenciando o núcleo e o cinetoplasto do T. com bicarbonato de potássio. o azul de metileno. 85 . em que após a fixação e a coloração pelo May-Grünwald. a eosina. que se saiba isento de hemoparasitas. Ambos são solúveis em álcool metílico. retirar todo o tubo digestivo do inseto. Os elementos ácidos celulares (DNA e RNA) serão corados seletivamente pelo corante básico com a predominância de tons vermelhos. 0. 2. apresentou um bom resultado. 2) Adicionar a solução NaHCO3 (Bicarbonato de Sódio) a 1%.13. 6) Realizar as distensões e deixar secar as lâminas “overnight” à temperatura ambiente ou em uma estufa a 28ºC. homogeneizar e deixar durante 1 minuto (podemos utilizar a água da torneira desde que esta tenha o pH ~7. OBS: 1. n.11-15. p. 4) Desprezar o corante e lavar as lâminas em água corrente (fluxo fino). em nossa região.1. Segundo Maekelt (The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene.4) Macerar todo o conteúdo em duas ou três gotas de solução fisiológica. 1964). esta técnica de exame do tubo digestivo permite revelar um maior número de exemplares infectados. 3) Remover o fluido e cobrir as distensões com solução de Giemsa (30 gotas para 10 ml de água destilada ou da bica) durante 1 hora.0). 3. 86 . durante 2 horas. 2ª ETAPA: COLORAÇÃO 1) Cobrir toda a lâminas com May-Grünwald (solução de eosina azul de metileno segundo May-Grünwald comercial) por 3 minutos ( testar o tempo de coloração de 1a 3 minutos em no máximo 10 lâminas). pois o pH. é próximo de 7. v. Verificamos que a secagem em estufa a 28ºC. que se saiba isento de hemoparasitas. 5) Misturar o conteúdo do tubo digestivo do inseto com soro humano inativado ou de outro mamífero. Em nosso Laboratório utilizamos a água da torneira em substituição ao Bicarbonato de Sódio. José da Silva Costa e Natanael Pereira Macedo) MATERIAL NECESSÁRIO: 1) Placa de coloração (“mesa de descanso”. OBS: Caso não possua uma placa de acrílico para coloração. (Carlos Marinho Pereira. Figura 8: Placa de PVC para coloração de lâminas. pipetas de 1mL. pinças. 6) Instrumentos: seringas de 1mL. 3) Solução de azul de metileno. Figura 8). 5) Pisseta com água destilada (caso não tenha água tamponada). 2) Solução salina (ou soro fisiológico). Foto: Marcello Pelliccione.3. 87 . uma similar pode ser improvisada com material de PVC de forma que a placa possua forma ligeiramente côncava. lâminas. copos.4 TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE LÂMINAS DE FEZES BASEADO NO MÉTODO DOS LABORATORISTAS DE TOCANTINÓPOLIS (TO). 4) Solução de Giemsa. 1ª ETAPA: COLETA DA AMOSTRA 1) Injetar 3 ou mais gotas de solução salina pela parte posterior do abdômen com seringa de 1 ml. 2) Deixar secar por ~ 10 min. sob a lâmina invertida. A técnica de colocar a lâmina invertida sobre o lado côncavo da placa permite um maior contato da amostra com o 88 . 3ª ETAPA: PRÉ-COLORAÇÃO PELA SOLUÇÃO DE AZUL DE METILENO 1) Imergir a lâmina em solução de azul de metileno (em copo) rapidamente (~ por 2 segundos). 2) Comprimir o abdômen do inseto com o uso de pinças para retirada das fezes. e portanto. A prática de inserção da agulha seguida da compressão do abdômen pode eventualmente permitir a retirada de algum material oriundo do tubo digestivo juntamente com as fezes. 3) Deixar secar por ~ 2 a 3 horas. A solução salina dilui as fezes facilitando a visualização em lâmina. 2) Preparar uma solução de Giemsa na proporção de 1 gota de corante para 1ml de água destilada. 3) Aplicar esta solução na placa côncava de coloração. 2ª ETAPA: FIXAÇÃO PELO ÁLCOOL METÍLICO 1) Fixar com álcool metílico por ~ 1 minuto. Filtrar com papel filtro ou filtro descartável de café. 2) Enxaguar: Imergir a lâmina em água destilada (em copo) rapidamente (~ por 2 segundos). Proceder da mesma forma inclusive se o triatomíneo estiver vivo. 4ª ETAPA: COLORAÇÃO PELA SOLUÇÃO DE GIEMSA 1) Colocar a lâmina com o lado da amostra (de fezes ou tubo digestivo macerado) para a superfície da placa de coloração. do resultado da coloração. A prática de filtrar o corante Giemsa antes de preparar a solução contribui para melhorar a qualidade do corante. : Desprezar as soluções de azul de metileno. com granulações finas e rosa. água e corante colocadas em copos e placa durante o preparo das lâminas. A sua presença claramente definida. vivax ou P. 2) O esfregaço deve apresentar uma película fina e uniforme que não chega às bordas. sendo padrão o seguinte: • Leucócitos: núcleo azul-escuro ou púrpura. resultando numa boa qualidade das preparações. • Granulações de Schuffner: rosa ou vermelha. com diminuição progressiva do sangue em direção ao final da lâmina. com menor possibilidade de confusão por artefatos que dificultam ou impossibilitam o exame das lâminas. 3) A cor do esfregaço pode variar do cinza-claro ao rosáceo pálido. é um bom indicador de coloração satisfatória. AVALIAÇÃO DAS COLORAÇÕES: 4. o citoplasma dos neutrófilos. 6) Secar por aproximadamente 15 minutos (de acordo com a temperatura e a umidade local). dos eosinófilos róseo.corante. mas formando franjas. citoplasma pode variar de azul-claro. sem alcançar a extremidade. • Plasmódio: cromatina nuclear vermelha ou púrpura.1 ESFREGAÇO 1) A coloração do esfregaço está na dependência da espessura da camada de hemácias. • Plaquetas: azul ou púrpura. 4) Deixar corar por ~ 30 a 40 minutos. 4. 89 . Não reutilizá-los para evitar contaminação. bem como do método de coloração. ovale. nas hemácias parasitadas pelo P. 5) Enxaguar imergindo rapidamente a lâmina em um copo com água destilada (~ por 2 segundos). OBS. o mais limpo possível e branco.2 GOTA ESPESSA 1) Quando a desemoglobinação é adequada. • Os núcleos de leucócitos. em vermelho-cobre profundo. em azul-pálido. O pigmento malárico. com fino estroma cinza-azulado. geralmente azul-profundo à violeta. em média. 3) As cores dos elementos normais devem ser comparadas na seguinte ordem: • Os restos das hemácias azuis.4. outros azulvioleta. A cromatina e o citoplasma dos plasmócitos são facilmente visualizados respectivamente nas cores vermelho-rosado e azul. As preparações supercoradas e precipitadas pelo corante Giemsa podem ser rapidamente descoradas pelo álcool metílico para exame. também aparece com nitidez e a cor varia do castanho ao escuro. entretanto. que não se cora. nas preparações descoradas e no sangue a fresco em tubo capilar (QBC). • O citoplasma dos linfócitos. cada campo microscópio (objetiva de imersão) deve apresentar 10 a 20 leucócitos. o fundo deve estar claro. 90 . • As plaquetas de rosa-vivo à violeta. alguns rosa. No exame de gota espessa. • Os grânulos grossos dos eosinófilos. • Os monócitos. 2) Na espessura perfeita. os elementos aparecem sobre um fundo claro. sendo mais visível. • Os grânulos finos dos neutrófilos. no caso de amostras de sangue. Examinar até encontrar um campo com maior número de leucócitos. condensador e espelho com papel macio e absorvente. Após absorção. • Posicionar a objetiva de 10x na direção da amostra e fazer a focalização com o botão macrométrico até que surjam os leucócitos. A seguir ajustar o foco com o botão micrométrico. acondicionar as lâminas em caixas apropriadas para futura revisão. Regular a intensidade da luz através do reostato ou do balão de vidro. adicionar óleo de imersão no centro do mesmo e girar o revólver até a objetiva de imersão (100x). se for o caso. para que haja absorção do óleo. Não usar xilol e nem tolueno para a remoção do óleo de imersão.5. • Focalizado o campo. retirar a lâmina e registrar os resultados. Abrir o diafragma–íris e levantar o condensador. Colocar a lâmina invertida sobre um papel absorvente. Buscar os campos que apresentem maior homogeneidade na distribuição das células. • Adaptar a lâmina às presilhas da platina mecânica e a seguir ajustar a lâmina de modo que uma área da amostra a ser examinada coincida com o orifício de iluminação. limpar as superfícies superiores das lentes oculares e inferiores das objetivas. 91 . • Terminado o exame. fechando um pouco o diafragma–íris ou abaixando o condensador. O pó depositado na parte interna dos tubos do corpo binocular pode ser removido com jatos de ar produzidos por uma pera de borracha. • Regular o sistema de iluminação do microscópio. • Examinar os campos microscópicos movimentando os parafusos de avanço frontal e lateral do carro (charriot) com a mão direita e botão micrométrico com a esquerda. Procedimentos básicos para exame do material corado • Antes de iniciar o exame. baixar a platina. deixando em repouso por 7-14 dias. . . . Fonte: Simons. . . . O ambiente constantemente seco é ideal. . . . Conservar em lugar fresco. . . . . . . como a Amazônia. o microscópio deverá ser coberto com uma capa plástica ou colocado na caixa original. aos poucos. . . . . . e nunca pelos parafusos. A caixa deverá sempre conter um saco de sílica-gel para manter o ambiente interno seco. . . dotadas de uma lâmpada de 25 watts constantemente acesa. . O óleo mineral é facilmente removido por papel absorvente. misturando com o auxílio de um pistilo. 1 g Glicerina. . . . . . Após as 2 horas.• Não usar também solvente como álcool. . • Outro cuidado importante é sempre transportá-lo pela estativa (braço). . . Philadelphia & Toronto: J.B. . . . a utilização de estufas de madeira. pois impede o desenvolvimento de fungos no sistema de lentes. . homogeneizando a solução. A. . . 66 ml Álcool metílico puro . . 66 ml Adicionar o pó do corante em um gral. Aquecer em uma placa a 60º C por 2 horas. . Preparo de Soluções para a Coloração 6. .1 SOLUÇÃO CORANTE DE GIEMSA Corante de Giemsa em pó. . 1976. . . Em áreas de elevada umidade. .Lippincott Company. Technical Hematology. passado sobre a lente de imersão. com apoio da mão sob a base. . 6. Transferir para um frasco contendo pérolas de vidro que irão facilitar a dissolução. 476p 92 . filtrar em papel de filtro e transferir para um frasco âmbar. Amadurecer a solução. • Após o uso. é mais eficiente que o uso da sílica. . . . . . . . . . Posteriormente. xilol ou tolueno para a limpeza dos componentes do equipamento. . adicionar o álcool metílico lentamente. acrescentar a glicerina. A seguir. . Philadelphia & Toronto: J. Guanabara Koogan. 1976. 93 . . 100 ml 6.47 g. 476p. . . . A. . . . . . 1 ml Ácido Acético. .B. .15 M: 9. . . . . . . . Fonte: SIMONS. . . S B.6. . .4 COMPOSIÇÃO DA ÁGUA TAMPONADA UTILIZADA NA COLORAÇÃO DE GIEMSA (pH=6.2 SOLUÇÃO DE Errecart Formol comercial (40%). .09 Preparar uma solução estoque 0. Parasitologia médica. qsp 1 litro de H2O Mistura para se obter 100 ml de água tamponada. Technical Hematology. . 1002 p. . . .96 Preparar uma solução estoque 0. . . . na proporção de uma gota daquela para cada 10 ml do corante. . . . . . .3 GIEMSA ALCALINO Adicionar uma solução a 1 % de Bicarbonato de potássio à solução corante. . .Lippincott Company.2 ml Solução Fisiológica .15 M: 9. . . .8) Solução A Fórmula: KH2PO4 (fosfato de potássio monobásico) Peso Molecular: 136. . . Rio de Janeiro. . . Fonte: Pessoa. . 0. 9a ed. . . . 6. . . qsp 1 litro de H2O Solução B Fórmula: Na2HPO4 (fosfato de sódio bibásico) Peso Molecular: 141. .08 g. ..0g da mistura acima e dissolver em 250ml de água destilada.. de chuva ou mineral sem gás..0g Misturar em gral seco. Apostila do Curso de Pósgraduação em Biologia Parasitária.59 g qsp 1 litro de H2O Solução B Fórmula: Na2HPO4.6 CORANTES E DILUENTES PARA O MÉTODO DE WALKER Solução de azul de metileno fosfatado 1) Pesar as seguintes substâncias: Azul de metileno (medicinal em pó). 57 p. M..2H2O (fosfato de sódio monobásico) Peso Molecular: 177. IOC-FIOCRUZ.... 2) Pesar 1.. 96 Preparar uma solução estoque 0......2) Soluções estoque Solução A Fórmula: NaH2PO4...3... 2000. qsp 1 litro de H2O Tampão de Coloração: Prepare o Tampão utilizando 100 ml da solução estoque + 900 ml de água destilada e estoque a 4 º C...1..96 Preparar uma solução estoque 0. OBS: Sendo necessário ajuste o pH a 7..59 g. Fonte: Sousa. 94 .... Rio de Janeiro. 6..6..0g Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4).2 M: 35.1.. (fosfato de sódio dibásico) Peso Molecular: 357..5 COMPOSIÇÃO DO TAMPÃO DE COLORAÇÃO (pH 7.. Biologia e taxonomia de tripanosomatídeos.0g Fosfato de sódio bibásico (Na2HPO4)..12H2O...A.2 com HCl ou NaOH...2 M: 71. . . . . .0g Fosfato de sódio bibásico. .000ml de água destilada.0g Misturar em gral seco. . . . . . 4. .A. 35 ml Álcool metílico (P. . 6. . . 0. . . .). . . . . transferir para um frasco escuro (âmbar) contendo dentro algumas pérolas de vidro. . . . 95 . . . . . . .Mistura de sais fosfatados (água tamponada 6. . .0g da mistura acima e dissolver em 1. . . . . filtrar em papel de filtro. . a seguir ir acrescentando muito lentamente o glicerol.4) 1) Pesar as seguintes substâncias: Fosfato de potássio monobásico. . . . .). .75g Glicerol (P. . 65 ml 2) Transferir o Giemsa em pó para um gral. . 2) Pesar 1. . . . . de chuva ou mineral sem gás. . depois deixar em repouso alguns dias e. . . . . . Solução Alcoólica de Giemsa 1) Pesar e medir as seguintes substâncias: Giemsa em pó. . . Assim que estiver bem dissolvido. Por último adicionar o álcool metílico também aos poucos.A. . . . . . . . . antes de usar. . . sempre misturando até formar uma massa homogênea. . . . . até obter completa homogeneização. . . . . . . Inicialmente agitar várias vezes ao dia. . . 4) Macerar todo o conteúdo em duas ou três gotas de solução fisiológica.1 EXAME DAS FEZES DE TRIATOMÍNEOS 1) Fazer uma pequena compressão no abdômen do inseto e depositar as fezes ou urina obtida sobre uma lâmina que já deverá conter um pequeno volume de salina. 7. 5) Colocar o macerado sobre uma lâmina que já deverá conter um pequeno volume de salina. homogeneizar o material com a extremidade de outra lâmina e cobrir a seguir com uma lamínula (20x20 ou 22x22). homogeneizar o material com a extremidade de uma lâmina e cobrir a seguir com uma lamínula (20x20 ou 22x22). 7) Se for positiva. recomenda-se fazer uma distensão e corar o material. com o mesmo objetivo já descrito anteriormente. 2) Levar ao microscópio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 400X). através de movimentos de tração (Figuras 9C e D). com o mesmo objetivo já descrito anteriormente. 3) Se for positiva. PROCEDIMENTOS DE EXAME DE TRIATOMÍNEOS: 7. 6) Levar ao microscópio e fazer a leitura utilizando objetiva de maior poder ampliador (ideal 400X).7. 3) Com a ajuda de pinças retirar todo o tubo digestivo do inseto. 2) Com uma tesoura realizar a retirada da parte posterior do abdômen (Figuras 9A e B).2 EXAME DO TUBO DIGESTIVO DE TRIATOMÍNEOS 1) Sacrificar o triatomíneo com clorofórmio ou éter. recomenda-se fazer uma distensão e corar o material. 96 . 97 . 3) Depositar a hemolinfa sobre a lâmina e cobrir com uma lamínula. 2) Fazer um pequeno corte em qualquer uma das patas por onde fluirá a hemolinfa. Fotografias de Marco Aurélio Peregrino.3 EXAME DA HEMOLINFA (diagnóstico diferencial com Trypanosoma rangeli) 1) Sacrificar o triatomíneo com clorofórmio ou éter. 7.Figura 9: Sequência de retirada do tubo digestivo do inseto para exame. 4) Levar ao microscópio e fazer a leitura utilizando o aumento de 400 X. Depois devem ser muito bem enxaguadas e enxutas com uma toalha limpa. Quando possível. utilizando os equipamentos de proteção individuais (EPIs). fazer a contenção do inseto.4 EXAME DA GLÂNDULA SALIVAR (diagnóstico diferencial com Trypanosoma rangeli) 1) Após a retirada da hemolinfa. 3) Examinar as glândulas salivares entre lâmina e lamínula.7. Nunca usar aquecimento para secá-las. como luvas de látex. deixar as lâminas imersas em uma solução de álcool etílico mais éter (proporção de 9:1). Sempre utilizar produtos de qualidade e evitar produtos hidratados. • As lâminas usadas podem ser limpas em água com sabão em pó (1 colher de sopa cheia para cada litro d’água). • Quando empregar água da torneira. Nunca empregar lâminas que apresentem manchas causadas pela oxidação. através do uso de uma pinça. 98 . • Sempre ter em mente os cuidados com biossegurança. etc. pela primeira vez. apertando-o contra uma lâmina de vidro. • Testar o fixador e os corantes. colocá-las em uma estufa a 28º C. deixando em repouso por 48 horas. principalmente em locais com alta umidade. protetores faciais. • Deixar as lâminas secarem em local arejado e em superfície plana. RECOMENDAÇÕES IMPORTANTES: • As lâminas empregadas devem estar bem limpas e desengorduradas. 8. jalecos. verificar o pH. 2) Com outra pinça puxar a cabeça do inseto de modo a decapitálo e a expor as glândulas salivares. pois existem significativas variações de pH conforme a fonte da água. ou após um longo período de estocagem. Para desengordurar. antes do uso. A dessecação rápida das células é indispensável para uma boa conservação morfológica. a fim de não desorganizar ou desprender a camada de sangue não fixada. • No protocolo da gota espessa. • A amostra corada deve ser examinada ao microscópio. após serem coradas. tanto a desemoglobinização como as etapas de coloração e lavagem devem ser executadas muito cuidadosamente. nítida e uniforme. Se a lâmina tiver a borda esmerilhada. assim como rupturas ou pontos de desagregação. No caso de amostra de sangue. devem ser guardadas em caixas apropriadas até o momento da leitura ou em papel absorvente. não contendo manchas de corante nem bolhas de ar ou falhas. para se evitarem deformações celulares. escrever na parte fosca. sem superposição e nem formação de grãos ou flocos. • É imprescindível que seja colocada uma etiqueta contendo o nome do paciente e a origem (nome. Sua imagem deve ser clara. as células devem estar estendidas em uma única camada. local e a data de obtenção da amostra biológica). • As lâminas. • Sempre fazer um teste prévio para estimar o tempo de coloração ideal. devem ser coradas até o período de 30 min. O rótulo deve ser escrito a lápis e colado na borda da lâmina. • As distensões.• Em uma boa preparação a distensão deve ser delgada. nº de registro. feitas a partir de sangue coletado com anticoagulante. 99 . empregando a objetiva de imersão (100X). isto é. os glóbulos brancos devem apresentar coloração rosácea. v.G. FERRAZ Filho. p. C. MENDOZA.29..L.83-86.M.E.S. Andrade.. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.129-132.B. T.F.. FLORIANÓPOLIS/ SC.26.M. BRUGEROLLE.R.S.. p... P. Carvalho. Andrade.48.K. R. LEWIS. ANDERSON..R. ANONYMOUS.. Moreira A. 1996.A.S. C. P. COURA..G. Revista Patologia Tropical.V. 32-42... MANN. 1). LYNN. p. 1975.. Amato Neto. J.70..... MOZLEY-STANDRIDGE. SHEARER. V. R. V. DIAS. L. M. Mem.. 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