Facultad de Bioanálisis, VeracruzManual de Procedimientos de Laboratorio MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO CLINICO VETERINARIO INDICE I. II. III. La Historia Clínica y su uso en el Diagnóstico Clínico Veterinario. Métodos de sujeción y obtención de muestras para diagnostico de laboratorio en animales domésticos. El método de flotación para la identificación de huevecillos de Nematodos en cánidos y felinos. El método de sedimentación para la identificación de huevecillos de Trematodos en heces. El método de Harada Mori para cultivo larvario de Ancylostoma y Uncinaria en perros y gatos. Identificación de larvas de nematodos pulmonares por el método de Baerman Técnicas Hematológicas en medicina veterinaria. Diagnóstico de Mastitis mediante las pruebas de Hotis y del Azul de Bromotimol Elaboración de autovacuna en la terapéutica de la Papilomatosis bucal canina. Tinción de esporos de Bacillus anthracis Prueba de intradermo-reacción para detección de Fasciola y Tuberculosis Determinación de copto antígenos Reacciones de aglutinación pruebas serológicas y lácteas para la determinación de Brucelosis. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. XIII. Laboratorio Clínico Veterinario www.quimicaclinicauv.blogspot.com Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio METODOS DE SUJECION Y OBTENCION DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO EN ANIMALES DOMESTICOS. 1. INTRODUCCION Los veterinarios tienen la necesidad de consultar laboratorios para resolver determinados problemas de diagnóstico. Sin embargo, este esfuerzo puede verse mermado por una selección, preparación, manejo y envío inadecuado de las muestras. Esta situación puede ser evitada mediante el seguimiento cuidadoso de algunos principios generales: La muestra seleccionada deberá ser representativa del padecimiento. Suele ser preferible el envío de varios especimenes del mismo lugar. Las muestras deberán ser perfectamente identificadas. Deberá incluirse la Historia Clínica del individuo. Para cada caso se elegirá el tipo de recolección, manejo, conservación y envío más adecuado, a la especie y tipo de padecimiento presentado. Cuidar en lo posible, el manejo estéril de la muestra y en una cantidad adecuada. En caso de envío Postal, especificar en la envoltura el tipo de muestra, forma de manejo y verificar que se lleve a cabo en el menor tiempo posible. En esta práctica se llevarán a cabo las técnicas de Punción venosa en distintas especies domésticas, así como la toma de Muestra de orina y Recolección de heces. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN TECNICA DE PUNCION VENOSA En la práctica veterinaria los exámenes hematológicos se realizan más satisfactoriamente con la sangre venosa. La punción venosa, se realiza con aguja y jeringa de distintas medidas según el caso, ejecutándola sobre cualquiera de las venas superficiales del individuo: Por ejemplo en el caballo, la vaca y la oveja se emplea la vena yugular; Las venas safena y radial, pueden sugerirse para el perro y gato; El cerdo es sangrado normalmente en la vena cava anterior y en algunas razas en la auricular; Los animales de laboratorio como el cobayo, ratón, rata y conejo son desangrados fácilmente en el corazón, vena caudal o auricular. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Alcohol Benzal Xilol Vaselina pura Xilocaina Ketamina CONC. 70° 100% 10% 50% CANTIDAD 1L 1L 50 ml 500 gr 100ml 100 ml 3.2 Equipos de Laboratorio 1. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 7 Guantes desechables 7 Jeringas desechables de 3 ml 4 Agujas desechables del No 21 3 Agujas desechables del No 22 2 Agujas desechables del No 25 3 Jeringas de insulina 1 Sonda de alimentación infantil 1 Cinta adhesiva opaca, tela adhesiva de 2-3 cm. 5 m. Cordón de algodón de 0.5 cm de diámetro 1 Tijeras 5 Gradillas 5 Tubos de ensaye 13 x 100 10 Porta objetos de vidrio 10 Cubreobjetos de vidrio 1 lanceta o bisturí 3 Hojas de bisturí 1 paquete Algodón 5 Ligas 10 abate lenguas 10 Cucharillas rectales o tubos de vidrio 10 frascos de vidrio 3.4 Material biológico 1 Perro macho de talla mediana o grande 2 Conejo adulto 3 Gallina o pollo grande Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 4 Gato adulto 5 Rata blanca o ratón. 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 TECNICAS DE SANGRADO EN ANIMALES DE LABORATORIO. PUNCIÓN INTRACARDIACA. Se coloca al individuo en posición dorsal, se palpa entre la 2a y 3a costilla del lado izquierdo, se coloca la aguja entre las citadas costillas, se presiona ligeramente sobre la zona y se jala él embolo de la jeringa para obtener la muestra (Es necesario cuidar la introducción de aire para evitar producir embolia gaseosa). PUNCIÓN EN LA VENA MARGINAL DE OREJA. Se coloca una torunda dentro del conducto auditivo del conejo, se limpia con alcohol y se recorta el pelo de la oreja con una tijera. Se pasa un algodón con xilol para irritar la zona, con una lanceta o bisturí se podrá obtener la muestra. PUNCIÓN DE VENAS CAUDALES. RESERCION DE COLA Y DEDOS. SANGRADO EXHAUSTIVO Y DECAPITACION. 4.2 TECNICAS DE SANGRADO EN PERRO Y GATO. El sangrado en perro y gato se lleva a cabo principalmente en las venas safena y radial. Lo más importante para una correcta obtención de muestra será la adecuada sujeción del individuo. Posteriormente se deberá ocluir la vena por presión digital o torniquete. La piel sobre la vena es móvil, por lo cual se deberá inmovilizar con los dedos de la mano que sujeta el miembro. La aguja deberá insertarse con el bisel hacia arriba (No 21 para perros y 22 al 25 para gatos). Se deberá evitar interrumpir la circulación por tiempos prolongados para evitar hemoconcentración. La cantidad a obtener será de 5 a 10 ml. evitando colapsar la vena. Al final se retirará la aguja y se vaciará cuidadosamente en un tubo previamente preparado. 4.3 TOMA DE MUESTRA DE ORINA. El análisis de orina es uno de los procedimientos de laboratorio más comunes aplicados a la practica veterinaria, es de gran ayuda para el diagnóstico diferencial tanto de padecimientos generalizados como del aparato genitourinario. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio Para su recolección es necesario emplear recipientes limpios, preferentemente estériles. La muestra se recogerá durante la micción o por sondeo, siendo este último más adecuado por estar libre de detritus uretral o vaginal. Es difícil cateterizar a un perro más de una o dos veces al día puesto que la reacción tisular al traumatismo, causa un estrechamiento del lumen uretral a través del os penis. 4.4 RECOLECCION DE MUESTRA DE HECES. Es indispensable la aplicación de medidas higiénicas estrictas como medida de protección en la toma de muestras de heces, así como seguir las indicaciones especificas para cada tipo de animal, utilizando recipientes limpios o estériles para la recolección de la muestra. En las especies de talla grande es más práctico e higiénico obtener muestras directamente del recto del animal, con un guante de plástico. Una vez obtenida una muestra adecuada, el guante es reversado hacia adentro, sirviendo de esta forma como recipiente de recolección, una vez colectado se sella, se identifica y se envía refrigerada al laboratorio. En los animales pequeños, las muestras fecales son obtenidas por medio del termómetro o una varilla de vidrio, aunque esta pequeña cantidad será apenas suficiente para un examen directo. En caso de no ser posible la recolección directa se procederá a tomar la muestra directamente del recto, se cuidara que la defecación ocurra sobre un piso previamente lavado. En este caso la muestra se recogerá con guante plástico, espátula de madera, tomando solo la capa superior que no entró en contacto con el suelo. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFÍA De la Puente G. José. Manual de Exterior y manejo y Técnicas de sujeción de los animales domésticos. UNAM. México. Oteiza Fernández, José. Manejo de Animales. Editorial Textos Universitarios. México. El Manual Merck de Veterinaria. Merck & CO. INC. USA. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio EL METODO DE FLOTACION PARA LA IDENTIFICACION DE HUEVECILLOS DE NEMATODOS EN CANIDEOS Y FELINOS. 1. INTRODUCCION La parasitología estudia los seres que viven momentánea y/o permanentemente, sobre o dentro de otros organismos vivientes, obteniendo de los mismos su subsistencia. Las enfermedades parasitarias son la interrelación entre el agente etiológico (parásito), el hospedero y el medio ambiente, en donde al romperse la relación de equilibrio se produce sintomatología y se origina la enfermedad. Existen algunos parámetros que nos sirven para destacar la importancia que guardan en Medicina Veterinaria, por ejemplo: la incidencia en animales domésticos, la mortalidad por parasitosis, las erogaciones económicas producidas a los productores, así como la repercusión social y económica. Todo ello nos lleva a considerar la importancia de conocer no solo a las enfermedades parasitarias, sus agentes etiológicos, patología, sintomatología, y la forma de combatirla, sin lograr su control mediante el diagnóstico e identificación que permita el control de las infestaciones subsecuentes. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN La presente práctica consiste en la determinación de parásitos mediante técnicas de frotis directo y flotación. Consiste en dispersar una suspensión de material fecal en solución de mayor densidad que los huevecillos de parásitos, la diferencia en la gravedad específica hace que los huevos se eleven a la superficie. Cuando los huevos permanecen demasiado tiempo en la solución de concentración, pueden deformarse. Esta técnica es recomendada para la identificación de quistes de protozoarios y huevos de helmintos, ya que son capaces de flotar en pesos específicos de 1,000 a 1,200. Los huevecillos de tremátodos son mucho más pesados, por tanto solo flotarán en líquidos con pesos específicos superiores a los 1,300. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos (soluciones de enriquecimiento) NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD Solución saturada de sal 1.190 a 20°C 5L Solución saturada de azúcar 1. 120 a 15°C 5 L Solución cloruro de zinc 1.890 a 20°C 5 L 3.2 Equipo de Laboratorio 1. Microscopio 2. Centrífuga (opcional) 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 5 Vasos de precipitado 100 ml 10 Tubos de ensaye 10 Portaobjetos 10 Cubreobjetos 5 Gradillas 5 Pinzas 5 Coladeras de malla fina de plástico 6 a 7 cm diámetro 10 Abatelenguas o varillas de vidrio 10 Gasas 10 Guantes desechables 5 Lazos de alambre 5 Espátulas 3.4 Material Biológico 1. heces de perro 2. heces de gato 3. heces de aves 4. heces de cerdo 5. heces de bovino u ovino 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 FROTIS DIRECTO Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio Se emulsifica una pequeña cantidad de heces en agua y se aplica una pequeña capa sobre el portaobjetos. Se coloca el cubreobjetos y se examina el frotis en el objetivo de menor aumento, investigando la presencia de huevos, quistes y larvas. Este método es valioso cuando se sospecha de la presencia de larvas de nemátodos o protozoarios móviles. 4.2 MÉTODO DE FLOTACION En un vaso de precipitado de 100 ml se mezclan 2 g de heces con algo de solución de enriquecimiento utilizando para ello una espátula. Luego se agregan 90 ml de solución de enriquecimiento agitando vigorosamente para obtener una mezcla bien homogénea. Si las heces contienen muchas partículas grandes se cuela la mezcla en colador fino. Se debe recordar que algunos huevos quedan en el residuo detenido por la malla del colador. Lugo se deja reposar la mezcla por unos minutos hasta que las burbujas de aire hayan salido y dejar flotar cuidadosamente un cubreobjetos sobre la superficie del líquido. Los huevos de parásitos flotarán hacia la superficie y se adherirán al cubreobjeto. Después de media hora el cubreobjeto es cuidadosamente tomado con una pinza y colocado sobre el portaobjetos. La preparación es observada al microscopio. La flotación de los huevos en la solución de enriquecimiento se puede acelerar por medio de la centrifugación. El tubo para centrífuga debe ser lo suficientemente ancho que permita colocar el cubreobjetos sobre la superficie del líquido. La suspensión se centrifuga con el cubreobjeto sobre la superficie del líquido. Si ello no es posible, la capa superficial del líquido puede ser sacada con un lazo de alambre y luego colocada sobre el portaobjetos. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFÍA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnóstico de las Helmintiasis por medio del examen coprológico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitología y Enfermedades parasitarias de los animales domésticos. Ed Limusa. México. LAPAGE, G. Parasitología Animal. Logia. Ed. Continental. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio EL METODO DE SEDIMENTACION PARA LA IDENTIFICACION DE HUEVECILLOS DE TREMATODOS EN HECES. 1. INTRODUCCION La Fasciolasis, Distomatosis hepática, Palomilla o Mariposa del hígado, es una enfermedad que afecta comúnmente a las ovejas, así como a las cabras, bovinos, cerdos, equinos, eventualmente al hombre y a algunos animales silvestres, presentando una amplia distribución mundial. Es una enfermedad parasitaria debida a la presencia y acción del Tremátodo Fasciola hepática . Presenta un proceso inflamatorio crónico del hígado y conductos biliares, causando trastornos digestivos y nutricionales 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN Los huevecillos de tremátodo son fácilmente identificables en frotis directo o por la técnica de sedimentación, debido a la presencia de un opérculo polar, el cual puede ser destruido en soluciones hipertónicas, por lo cual no se recomiendan las técnicas de flotación. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solución Salina Fisiológica Éter Ácido acético Azul de metileno CONC. 5% 1% CANTIDAD 1L 1L 100 ml 100 ml 3.2 Equipo de Laboratorio 3. Centrífuga 4. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 10 20 20 20 10 10 10 10 10 10 10 10 3.4 Material Biológico • heces de ovino • heces de bovino Vasos de precipitado 100 ml Tubos para centrífuga (cónicos) Portaobjetos Cubreobjetos Gradillas Pipetas Pasteur Coladeras de malla fina de plástico palillos finos de madera Gasas Guantes desechables Goteros de cristal Espátulas 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 METODO DE SEDIMENTACION SIMPLE Como se mencionó anteriormente, esta técnica se utiliza únicamente cuando se sospecha la presencia de huevecillos de tremátodo u otra clase de huevecillos operculados. 1. 2. 3. 4. Se coloca una suspensión de heces en agua (puede utilizarse solución salina) en un tubo de ensaye cónico, colada a través de una malla fina. Se deja el tubo en reposo por un mínimo de 15 minutos o a centrifugación a baja velocidad. Se extrae el sedimento mediante una pipeta Pasteur o gotero. Se examina al microscopio en un portaobjetos. 4.2 METODO DE TELEMAN. 1. 2. 3. 4. En 5 ml. de solución de ácido acético al 5% se suspende 1 gr. de heces agitándolo. Se deja reposar por un minuto y se coloca dentro de un tubo de centrifugación. Se le agrega igual cantidad de éter y se agita vigorosamente. Se centrifuga durante un minuto a 1500 RPM. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio El sedimento que se forma contiene los huevecillos de tremátodo, y presenta encima una capa de ácido acético y una capa de éter, con una capa de restos de heces entre ambas. 6. Con un palillo fino y largo se afloja el sobrenadante de las paredes del tubo y se decanta, debiendo quedar solo el sedimento. 7. Se agregan unas gotas de agua al sedimento y se mezcla vigorosamente 8. Se toman unas gotas de esta suspensión y se colocan sobre el portaobjetos, examinándolo bajo el pequeño aumento. Con este método es posible evaluar la intensidad de la infestación. 5. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6. BIBLIOGRAFÍA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnóstico de las Helmintiasis por medio del examen coprológico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitología y Enfermedades parasitarias de los animales domésticos. Ed Limusa. México. LAPAGE, G. Parasitología Animal. Logia. Ed. Continental. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio EL METODO DE HARADA MORI PARA CULTIVO LARVARIO DE ANCYLOSTOMA Y UNCINARIA EN PERROS Y GATOS. 1. INTRODUCCION La Anquilostomiasis o Uncinariasis es la Infestación causada por la presencia ya acción de larvas y adultos de varias especies de Ancylostoma y Uncinaria en intestino delgado y otros tejidos en perros y gatos, Clínicamente se caracteriza por anemia ferropénica, adelgazamiento, diarrea sanguinolenta y en algunos casos edema en patas. Es común en cachorros posterior al destete, pudiéndose observar también en perros confinados. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN El cuadro clínico por tanto es característico en zonas con problemas enzooticos. Su diagnostico se debe apoyar con la observación de huevos en heces, en relación con u cuadro anémico (hematocrito). Para el diagnostico de larvas se recomienda el método de Harada Mori, ya que las larvas son muy sensibles a la sequedad. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3. 1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Agua destilada CONC. CANTIDAD 1L 3.2 Equipos de Laboratorio 1. Estufa de cultivo 2. Lupa 3. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 50 cm Papel filtro. (13 x 120 mm) Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 10 10 10 tubos de centrífuga cónico de 15 ml Tapones para los tubos de centrífuga de 15 ml Pipetas 3.4 Material Biológico 1. heces de Perro parasitado o sospechosos 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS El cultivo de larvas en heces de perro o gato infectado, se lleva a cabo por el Método de Harada Mori dentro de un tubo de ensaye . 1. Se toma una delgada capa de heces de 1 a 2 mm, y se extiende sobre el 2. Se agregan 3 ml de agua destilada en el tubo de ensaya. 3. Se coloca el papel filtro con la muestra dentro del tubo, de tal modo, que papel filtro, colocándola en el tercio medio. 4. 5. 6. 7. 8. el extremo inferior haga contacto con el agua (un cm aproximadamente) sin que haga contacto el agua con las heces. En el extremo superior del tubo se coloca un tapón de algodón, sosteniendo el otro extremo del papel. Este cultivo se lleva de 7 a 10 días en la estufa a temperatura promedio de 24 a 28 C. Cada día se deberá verificar que el agua contacte con la superficie de papel, en caso necesario se agregará más agua destilada. Las heces se mantendrán húmedas gracias al papel filtro y tan pronto como las larvas se hallen libres, emigrarán hacia el agua. Las larvas son sacadas con una pipeta y examinadas al microscopio con el menor aumento. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFIA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnóstico de las Helmintiasis por medio del examen coprológico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitología y Enfermedades parasitarias de los animales domésticos. Ed Limusa. México. LAPAGE, G. Parasitología Animal. Logia. Ed. Continental. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio IDENTIFICACIÓN DE LARVAS DE NEMATODOS PULMONARES POR EL METODO DE BAERMAN 1. INTRODUCCION Los huevos de nemátodos y larvas en heces de bovinos, son casi los mismos que se encuentran en pequeños rumiantes domésticos y salvajes, en medicina veterinaria, el aparato de Baerman ha sido de gran ayuda para la identificación de parásitos pulmonares de la familia Protostrongylidae principalmente. Cuando se usan heces recién extraídas siempre que se encuentren larvas, estas serán identificadas como nemátodos pulmonares, puesto que solo estas son vivíparas. Si por ejemplo se utilizan heces de más tiempo de recolectadas, las larvas de Strongyloides, Trichostrongylídeos y otros nemátodos pueden ser encontradas, tras la eclosión de los huevecillos, lo que obviamente interferirá en el diagnóstico. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN Cualquier infección por pequeña que sea, puede ser detectada por medio de este aparato y puede ser utilizado cuantitativamente, siempre que se pese con exactitud la cantidad de heces a utilizar. El aparato de Baerman consiste en un embudo de vidrio sostenido por un soporte y en su parte inferior tiene colocado un tubo de goma de 10 cm de largo que termina en una pequeña pipeta (gotero). El tubo de goma es cerrado por un clip. La boca del embudo es cubierta con una malla coladora de gasa o alambre cuya abertura sea de 0.6 a 0.7 mm, la que se empuja un poco en la mitad de manera que se sumerja principalmente en el embudo, ésta se cubre por debajo con doble capa de gasas. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Agua destilada CONC. CANTIDAD 2L 3.2 Equipos de Laboratorio Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 1. Microscopio 2. Centrífuga (opcional) 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 10 Embudos de vidrio 10 Soporte universal con pinza 5m Tubo de goma 10 goteros 10 Clips 20 Gasas 10 Mallas coladoras de alambre con abertura de 0.6 a 0.7 mm 20 Portaobjetos 20 Cubre objetos 3.4 material Biológico 1. Heces de bovino u ovino sospechoso a parásitos pulmonares 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO Colocar sobre las gasas 20 g de heces frescas. Llenar el embudo con agua tibia (max. 30°C) en la cual deben sumergirse completamente las heces. Si las heces son muy líquidas se deben usar varias capas de gasas. Colocar todo el aparato a temperatura ambiente durante 24 hrs. las larvas saldrán de las heces ya remojadas y pasando a través del colador, irán a depositarse en el cuello del embudo concentrándose en el fondo. Cuando el clip es abierto se deben recolectar las primeras 3 a 4 gotas (no más) en un portaobjetos de vidrio y sin cubreobjetos deberán ser examinadas al microscopio bajo el aumento menor. Las larvas de nemátodos se verán mover activamente. También se podrá recolectar dentro de un tubo para centrífuga de 5 a 10 ml, procediendo al centrifugado, tras la decantación del sobrenadante, larvas obtenidas deberán estar en el sedimento del tubo. 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFÍA THIENPONT, D; ROCHETTE, F; VANPARIJS, O.F.J. Diagnóstico de las Helmintiasis por medio del examen coprológico. Janssen Research Foundation. Beerse Belgica. 1979. QUIROZ, R. H. Parasitología y Enfermedades parasitarias de los animales domésticos. Ed Limusa. México. LAPAGE, G. Parasitología Animal. Logia. Ed. Continental. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio TECNICAS HEMATOLOGICAS EN MEDICINA VETERINARIA. 1. INTRODUCCION En la práctica veterinaria los exámenes hematológicos se realizan mas satisfactoriamente con la sangre venosa prefiriéndose como se indicó en la primera práctica : la vena yugular para caballos, bovinos, ovejas y cabras; el corazón en conejos, cobayos y ratones, y la vena cava para el cerdo. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION Las técnicas empleadas en medicina veterinaria son similares a las utilizadas en hematología humana, sin embargo existen algunas consideraciones que serán necesarias indicar. En primer lugar los eritrocitos de perro son especialmente susceptibles a la hemólisis, por lo cual se deberá evitar el exceso de presión negativa sobre la jeringa, así como la formación de espuma que la favorezca (utilizar jeringas de 5 a 10 c.c. con émbolo bien ajustado). Es importante recordar que para las determinaciones de hemoglobina y la cuenta globular, se requiere un anticoagulante y refrigeración (solución al 10% con 4 partes de oxalato de potasio y 6 de oxalato de amonio, colocando 0.15 c.c. en tubos de 5 c.c. para perro y gato o 0.3 para tubo de 10 c.c. en especies mayores. También podrán utilizarse de 2 a 4 mg de cristales de oxalato de sodio y citrato de sodio en solución evaporando a sequedad en tubo de ensaye inclinado). 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Cianometa Standard para cianometa CONC. CANTIDAD 3.2 Equipos de Laboratorio Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 1. 2. 3. 4. Microcentrífuga Microscopio Espectofotómetro Disco lector 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 10 Tubos de vacutainer con EDTA 10 Tubos de ensaye de 13 x 100 50 Portaobjetos 10 Capilares 5 Lámparas de alcohol 5 Pipetas de sahli 5 Boquillas 5 Gradillas 3.4. Material biológico 1. Muestras de sangre de diferentes especies animales a. Bovino b. Ovino c. Perro d. Gato e. Pollo 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS Una vez recibida la muestra se mezcla por inversión, se preparan 4 frotis de sangre y se dejan secar, y se llenan dos pipetas: una para determinación de hemoglobina y otra para conteo de leucocitos. Se procederá a la verificación de la cuenta leucocitaria, a la tinción de frotis para el estudio microscópico y la cuenta diferencial (fórmula blanca) y la determinación de hemoglobina. 4.1 PREPARACION DEL FROTIS DE SANGRE. 1. Este procedimiento requiere sangre fresca. 2. Para extender la preparación serán necesarias varias láminas limpias, sobre las cuales se colocará una gota de sangre en el extremo de la lámina. 3. Con otra lámina se procede a extender la sangre, deslizándola mediante un movimiento rápido, al poner en contacto el borde de la lámina con la gota, en un ángulo agudo. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 4. Secar mediante calor o aire, evitando la fragmentación y crenación de los eritrocitos. 5. La laminilla deberá ser identificada y teñida con los procedimientos usuales (Wright). 6. Una vez seca, se observará al microscopio tanto los eritrocitos como los núcleos de los leucocitos. 4.2 DETERMINACION DE HEMOGLOBINA Existen dos tipos de procedimientos para la determinación de hemoglobina, ambos son colorimétricos, el directo es el método de Tallqvist en donde el color de la sangre total expuesto en un papel secante se compara con un patrón, este es utilizado en campo, y dentro de los métodos indirectos se utilizan el hemaglobinómetro de Shali o el de Handen - Hausser, en el cual la hemoglobina es convertida primero en hematina ácida y entonces se compara con un patrón (escala graduada). 4.3 CUENTA DE LEUCOCITOS Para esta prueba se requiere sangre venosa oxalatada, extraída en las 24 horas previas al examen. 1. La muestra de sangre se vierte sobre un frasco pequeño con ácido 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. clorhídrico 1-10 normal, mezclándola cuidadosamente por inversión repetida. Se procede al llenado de la pipeta de glóbulos blancos hasta 0.5 3. La punta de la pipeta deberá introducirse en el frasco que contiene diluyente y se aspira cuidadosamente, mezclando el contenido mediante movimientos de rotación, hasta la marca 11. Una vez lleno deberá ser agitado manual o eléctricamente hasta asegurar la homogeneización de la mezcla. El siguiente paso consiste en el llenado de la cámara contadora, la cual deberá estar limpia y libre de grasa. Se procede a colocar el cubreobjetos sobre la cámara. Nuevamente se agita la pipeta, y se desechan dos o tres gotas del capilar graduado de la pipeta. Posteriormente, se procede al llenado por capilaridad, de la cámara sobre las dos hendiduras que separa al borde del cubreobjetos con la misma. Una vez llena, se procede a la observación al microscopio para el conteo de los leucocitos existentes en cuatro de los cuadros grandes del campo, la suma de su contenido, se multiplica por 50 para dar el total. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 10. Cada cuadro grande posee 16 cuadros secundarios y presenta un área de 1 milímetro cuadrado y su profundidad es de 0.1 mm (cuatro décimas de milímetro cubico a una dilución de 1 a 20). 4.4 CUENTA DE ERITROCITOS. Para el llenado de la pipeta se sigue una técnica semejante a la anterior, sustituyendo el liquido de dilución (Hayem), se llena hasta la marca 101 y se procede al llenado de la cámara contadora. 1. la cuanta de los eritrocitos se lleva a cabo en el área central finamente graduada de la cámara. 2. Se cuentan los cuadros secundarios de las esquinas y el cuadro central (cinco en total). 3. Para el cálculo de la cifra total, la suma de los eritrocitos de los 5 cuadros es multiplicada por 10,000 y da la cifra total. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6. BIBLIOGRAFIA BENJAMÍN M. M. Manual de Patología Clínica Veterinaria. 4ª Edición. Ed. Limusa. México. 1990 COLES, E. H. Diagnóstico y Patología Veterinaria. 5ª Edición. Ed. Interamericana. México. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum España 1988 Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio DIAGNOSTICO DE MASTITIS MEDIANTE LAS PRUEBAS DE HOTIS Y DEL AZUL DE BROMOTIMOL 1. INTRODUCCION La mastitis es una enfermedad aguda o crónica de tipo bacteriano que afecta la glándula mamaria de diversas especies animales siendo de importancia económica significativa en el caso del ganado bovino, el agente causal puede ser variado entre los que tenemos a los Staphylococcus spp., Corynebacterium pyogenes, E. coli, Pseudomonas spp. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION Para el diagnóstico de la mastitis se han aconsejado un sinnúmero de procedimientos clasificándose de la siguiente manera: 1. Examen físico del animal (palpación e inspección). 2. Examen físico de la leche. 3. Examen químico de la leche (con indicadores como el azul de 4. Examen microscópico de la leche investigando la presencia de leucocitos bromotimol). y bacterias (directo o en muestra incubada). 5. Pruebas presuncionales de cultivo encaminadas a identificar al microorganismo, así como la prueba de Hotis. 6. Procedimientos específicos de cultivo para el aislamiento e identificación del germen. El éxito en el resultado de la prueba dependerá en gran medida de un estricto procedimiento de recolección que evite la contaminación de la muestra. Estas precauciones no serán tan estrictas en caso de que las pruebas sean de carácter físico y químico. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solución clorada Alcohol Azul de bromotimol Púrpura de bromocresol Tinción de Gram CONC. 200 ppm 70% 1 - 300 CANTIDAD 10 L 5L 1L 1L 3.2 Equipos de Laboratorio 1. Estufa de cultivo 2. Microscopio 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 20 Lienzos de tela estéril (magitel) 5 Paletas para prueba de mastitis 20 Frascos de vidrio estériles 30 Tubos de ensaye 13 x 100 30 Tubos de ensaye 20 cc con tapón de rosca 10 Pipetas pasteur 20 Portaobjetos 3.4 Material biológico 1. Vacas en etapa de lactación 2. Muestras de leche directa de la ordeña 4. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS 4.1 PROCEDIMIENTO DE TOMA DE MUESTRA Limpieza de la ubre. Lavado con solución clorada (200 ppm). Secar con lienzo limpio. Secar y esterilizar el pezón con alcohol al 70%. Despuntar para la prueba de paño negro, en su caso. Ordeñar directamente sobre el recipiente evitando el contacto con el pezón. 7. Las muestras de cada cuarto deberá ser tomadas por separado, identificando el cuarto a que corresponden. 8. lavar y desinfectar las manos del ordeñador antes y entre la toma de cada cuarto. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 4.2 PRUEBA DE AZUL DE BROMOTIMOL. 1. Extraer con cuidado 5cc de leche de cada cuarto y colocar en los tubos 2. Agregar 0.5 a 1.0 cc de solución de azul de bromotimol en cada tubo. 3. Proceder a la lectura apoyado con iluminación natural preferentemente. dispuestos. • Reacción amarillo verdoso equivale a un pH normal. • Reacción verde a verde oscuro o azul, presencia de exudado inflamatorio. 4. Vaciar las soluciones de las pruebas después de cada examen, y lavar con agua neutra. Esta prueba no es exacta al comienzo ni en la fecha cercana al final de la lactancia. Los papeles indicadores pueden suplir a la solución con menor exactitud en los resultados. 4.3 PRUEBA DE HOTIS 1. Preparar cada tubo agregando 1cc de solución estéril de púrpura de 2. 3. 4. 5. 6. • • • bromocresol al 1-300. Marcar los tubos a 16 cc. extraer suficiente leche mediante la técnica estéril, para llenar el tubo hasta la marca. Tapar y mezclar el contenido por inversión. Incubar por espacio de 24 Hrs a 37 C y observar los cambios físicos que experimente. Interpretación de la prueba : esta prueba esta destinada a revelar la presencia de Streptococcus agalactiae. Cuando el color vire a amarillo, revela la presencia de gérmenes que fermentan la lactosa debido a la baja del pH de la solución. Reacción negativa. cuando no hay cambios o adquiere una coloración grisácea con o sin sedimento. Reacción positiva. el color de la solución varia del gris al amarillo brillanteñ se presentan los flóculos amarillentos, observandose desde unos cuantos en el fondo y los lados del tubo hasta un sedimento denso. La prueba de Hotis puede ser asociada al examen microscópico directo, para lo cual se procederá a incubar los tubos de ensaye invertidos, para que, en caso de muestras positivas, el sedimento adherido al tapón sea observado al microscopio preparando los frotis necesario 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFIA BENJAMÍN M. M. Manual de Patología Clínica Veterinaria. 4ª Edición. Ed. Limusa. México. 1990 COLES, E. H. Diagnóstico y Patología Veterinaria. 5ª Edición. Ed. Interamericana. México. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum España 1988 Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio ELABORACION DE AUTOVACUNA EN LA TERAPEUTICA DE LA PAPILOMATOSIS BUCAL CANINA. 1. INTRODUCCION La papilomatosis en una enfermedad viral (Papovavirus) en perros jóvenes, que se manifiesta con tumefacciones epiteliales benignas (verrugas blanquecinas y rugosas) en hocico, boca, lengua, paladar y garganta. Pudiendo causar muchas molestias y ser altamente contagioso. La práctica señala que los perros se recuperan de manera espontánea después de 6 o 7 meses adquiriendo inmunidad permanente, sin embargo se recomienda la aplicación de autovacuna para estimular la velocidad de la respuesta. La presente práctica tiene como objeto provocar la respuesta inmune en un canideo con papilomatosis bucal, utilizando como antígeno el virus de las lesiones neoplásicas, para obtener anticuerpos específicos contra el mismo. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN Los antígenos son sustancias que al ser introducidas en el organismo, inducen una respuesta inmune detectable y que puede reaccionar los mecanismos efectores humorales o celulares de la respuesta. Cualquier sustancia o célula que es reconocida como extraña por el sistema inmune puede ser un antígeno (bacterias, virus, glóbulos rojos, células de transplante, etc.) Dentro de las características químicas que debe poseer un antígeno están: 1. Composición química. Preferentemente proteínas, o bien polisacáridos, lípidos complejos, o ácidos nucleicos. 2. Carácter extraño. Alejados filogenéticamente del sistema inmune receptor. 3. Peso molecular. Superior a 10,000. 4. Rigidez estructural. La complejidad estructural eleva la inmunogenicidad. Para una adecuada respuesta inmune se requiere alto grado de pureza e integridad para facilitar la reacción. Los antígenos pueden ser moleculares Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio o celulares, y al encontrarse intracelularmente deberán ser liberados para provocar una mejor estimulación. Los métodos empleados para la ruptura de tejidos o células pueden ser: congelación y descongelación simultánea, maceración en mortero, licuadora, sonicación, prensas, Bombas y crío impactación entre otras. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solución salina fisiológica Formaldehído Penicilina sódica Anestesal Estreptomicina CONC. 1% 800 UI CANTIDAD 5L 1L 1 fco 1 fco 1 fco 3.2 Equipos de laboratorio 1. Balanza. 2. Centrífuga 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 3 Mortero estéril 3 pistilo estéril 3 Tijeras 3 Pinzas de disección 3 Caja de petri 3 Embudo de cristal 3 Soporte universal 3 Gradillas 10 Gasa estéril 3 Pipetas de 1ml 3 Pipetas de 10 ml 6 Tubos de centrífuga 9 Jeringas de 3 ml 3 Jeringas de 5 ml 3 Jeringas de insulina 1 Kg Arena estéril Tubos de ensaye estériles de 13 x 100 con tapón 3.4 Material biológico Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 1. Papilomas bovinos 2. Papilomas bucales caninos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 1. Para la obtención de la muestra se procederá a tranquilizar al animal (con Anestesal), se pinza la base del papiloma (pedúnculo) y se corta con bisturí, (colocando la muestra en una caja de petri estéril, conservándola con solución salina fisiológica en refrigeración) se procede a cauterizar la base de la lesión. Dependiendo del tamaño de la lesión se deberán tomar 5 o 6 gramos de muestra. 2. Una vez obtenida la muestra, se troceará con tijeras lo mas pequeño posible colocándola sobre una caja de petri para poder pesarla, obteniendo 4 gr . 3. Se colocan sobre el mortero y se procede a macerar con el pistilo, hasta obtener la destrucción celular, en caso necesario utilizar arena estéril (muestras muy grandes y duras) 4. Agregar solución salina fisiológica hasta lograr una suspensión al 20% (4ml se SSF por cada gramo de tejido). 5. Filtrar el macerado con gasa estéril y centrifugar a 2,000 rpm durante 10 a 15 min. 6. Titular el sobrenadante, por cada ml agregar 500 U.I. de penicilina y 500m g de estreptomicina como conservador 7. Como inactivador del virus se utilizará Formaldehido al 1%. 8. Incubar a 37 C durante 24 hrs. 9. Refrigerar hasta su uso. 10. Aplicar 5 ml subcutáneos en tres aplicaciones cada 8 días. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFIA BENJAMÍN M. M. Manual de Patología Clínica Veterinaria. 4ª Edición. Ed. Limusa. México. 1990 COLES, E. H. Diagnóstico y Patología Veterinaria. 5ª Edición. Ed. Interamericana. México. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum España 1988 CARTER, G. R. Bacteriología y Microbiología Veterinaria. Ed. M.M.M. México. 1990 Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio TINCION DE ESPOROS DE Bacillus anthracis 1. INTRODUCCION La formación del esporo es un mecanismo especializado para la supervivencia bacteriana en circunstancias difíciles. Su función es encerrar un genoma o paquete genético, en un vehículo aislante que le permita la germinación subsiguiente en un medio adecuado. Los esporos, que son células en el sentido estricto de la palabra, se encuentran en un estado de criptobiosis o vida latente, sin actividad metabólica y muestran un aumento marcado en la resistencia a diversos agentes químicos o físicos como por ejemplo la desecación, congelación y resistencia al calor y a las radiaciones. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION El efecto que las condiciones ambientales tienen sobre la formación del esporo varía de un tipo de bacteria a otra. Ejemplo; el bacilo de la Fiebre carbonosa (Bacillus anthracis), solamente forma esporos en condiciones de aerobiosis y estas no pueden encontrarse en impresiones de órganos como el bazo de animales muertos de Antrax, en donde la insuficiencia de aerobiosis del tejido impide la formación del esporo. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Cepa vacunal de Bacillus anthracis. Verde de malaquita Solución acuosa de safranina CONC. CANTIDAD 1 fco 1 fco 1 fco 3.2 Equipos de laboratorio 1. Microscopio 3.3 Material de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 5 5 5 5 1 Portaobjetos Lápiz graso Asa bacteriológica Platina Jeringa desechable de 3 ml 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 1. Con ayuda de una jeringa, depositar una gota de Cepa vacunal en el centro de un portaobjetos y fijar. 2. Aplicar verde de malaquita y calentar hasta la emisión de vapores, durante 1 minuto. 3. Lavar con agua corriente. 4. Contrastar con solución acuosa de Safranina, durante 15 segundos. 5. Lavar, secar y observar al microscopio. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS Resultados a observar: formas vegetativas en rojo. Los esporos se tiñen en verde claro y las RESULTADOS Y OBSERVACIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFIA BENJAMÍN M. M. Manual de Patología Clínica Veterinaria. 4ª Edición. Ed. Limusa. México. 1990 COLES, E. H. Diagnóstico y Patología Veterinaria. 5ª Edición. Ed. Interamericana. México. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum España 1988 CARTER, G. R. Bacteriología y Microbiología Veterinaria. Ed. M.M.M. México. 1990 MERCHAT, I. A. y PARCKER, R. A. Bacteriología y Virología Veterinaria. Ed. Acribia. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio PRUEBA DE INTRADERMO-REACCION PARA DETECCIÓN DE FASCIOLA Y TUBERCULOSIS 1. INTRODUCCION La práctica se basa en la posibilidad de diagnosticar en condiciones de campo a algunas enfermedades crónicas de los animales, mediante la inoculación de antígenos conocidos y demostrando una respuesta inmune previa, denominada Hipersensibilidad. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION Siendo la tuberculosis bovina una zoonosis muy importante en el campo de la Salud Pública, además de la campaña nacional de control y erradicación de este problema, es para nosotros conocer perfectamente la técnica de detección, así como saber dictar las políticas a seguir en el momento de encontrar uno o más animales afectados (reactores), evitando así mayores problemas debido a su alta transmisibilidad. La observación de la reacción de la tuberculina, es una hipersensibilidad de tipo IV (Gell-Coombs), debido a que en ella participan linfocitos T y macrófagos, esto es, se precisa que haya una infección primaria de tuberculosis que pudiera ser clínica o subclínica y que se hubiese implementado una respuesta inmune y que ahora estaremos en posibilidad de demostrarlo y que estas células al momento del contacto con la tuberculina liberen unas substancias denominadas genéricamente como "linfocinas" y otras substancias como las amino-vaso activas; Esto dar por resultado que en el sitio de la inoculación o de contacto se forme un proceso inflamatorio con infiltración de linfocitos, monocitos y polimorfonucleres "neutrófilos", así como las aminas vaso activas e interleucinas que promueven la salida de líquidos del torrente sanguíneo, provocando el edema. Aunque generalmente existe un elevado grado de resistencia del hospedador, en numerosas ocasiones se han registrado casos de inmuno supresión en enfermedades crónicas, lo que hace que el microorganismo prolifere de manera relativamente incontrolada en los tejidos del individuo y al mismo tiempo se podría observar una reactividad negativa a la prueba de la tuberculina; también se han registrado casos de resistencia familiar baja a Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio la tuberculina, lo cual indica que existe una gran capacidad para producir diversos grados de inmunidad celular a un organismo infectante determinado, esto es bajo control genético en los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Aparte de la tuberculosis existen otras enfermedades que pueden ser diagnosticadas mediante el mismo tipo de prueba, obviamente cada una requiere de su antígeno específico, estas son, como: lepra (lepromina), brucelosis (brucelina), paratuberculosis (johnnina), muermo equino (maleína), histoplasmosis (histoplasminina), coccidioidomicosis (coccidioidina), hidatidosis (líquido del quiste hidatídico, prueba de Cazzoni), linfogranuloma venéreo (macerado de neoplasias, prueba de Frei), y con algunos virus inactivados (rinotraqueítis infecciosa bovina, Aujezsky, rabia, etc.). En la prueba diagnóstica de la tuberculosis hay dos tipos de antígenos según la bacteria de donde se originen: aviar o mamífero (bovino), estas substancias se conocen como Derivado Proteico Purificado de la tuberculina. Debiéndose aplicar por vía intradérmica 1/10 de mililitro (0.1 ml ó 100 ml), en el pliegue caudal o en la tabla del cuello del bovino, registrándose las lecturas a las 72 horas; los resultados deben anotarse como: REACTORES O NO REACTORES (positivos o negativos, respectivamente). Es necesario conocer la Norma Oficial Mexicana para el control y erradicación de la tuberculosis bovina. También como pruebas intradérmicas podemos manejar algunos diagnósticos de parasitosis, pero estas reacciones no las podemos ubicar como hipersensibilidad tipo IV, sino como del tipo III puesto que en ellas participan complejos inmunes (Ag-Ab-C'), y su reactividad puede ser observada en unos cuantos minutos, permaneciendo hasta 6 u 8 horas. Un problema parasitario común en nuestra zona y diagnosticable por este método es la fasciolasis; para ello necesitaremos un extracto proteico de Fasciola hepática en una concentración final de 0.03%. Esta prueba se considera muy útil cuando se trata de determinar el estado de salud de un hato muy grande y que para el cual en el laboratorio de parasitología no habría suficiente tiempo ni lugar; se pueden elaborar antígenos parasitarios de Strongylus sp., Metastrongylus sp., Áscaris sp., Stephanurus sp., Cisticercus sp., Aunque en muchos de ellos existir el problema de reacciones cruzadas, principalmente entre las familias afines. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Tuberculina PPD Aviar y mamífero Solución Salina Fisiológica Método de Biuret o Kendall CONC. CANTIDAD 1 fco 5L 3.2 Equipos de laboratorio 1. Báscula 2. Centrífuga 3. Espectrofotómetro 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 20 Jeringas de tuberculina c/agujas cal. 25-27 5 Jeringas de 5 ml con aguja del 21 5 Vernier (pie de Rey, nonio, cutímetro) 6 Mortero estéril 6 Vasos de precipitado de 500 ml 6 Pistilo estéril 6 Cajas de petri 6 Pinzas de disección 15 Gasas 6 Embudo de cristal 12 Tubos para centrífuga 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 3.4 Material Biológico 1. Fasciolas vivas 2. Bovinos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO 4.1 ELABORACION DE ANTIGENO PARA DIAGNÓSTICO DE FASCIOLA Para la elaboración de un antígeno para el diagnóstico de una parasitosis, los parásitos frescos son lavados repetidas veces en SSF, hasta que se liberen de toda la materia orgánica que les rodea, se secan y taran, Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio luego son macerados y se suspende la papilla al 10% son SSF, centrifugar y titular la proteína del sobrenadante (SN) son un método apropiado ( Biuret y/o Kjelldal), ajustar a 0.3 % de proteína. Para conservarlo se congela a -20° C, liofiliza o refrigera a 4-6°C. 4.2 METODOLOGÍA DE LA PRUEBA DE INTRADERMOREACCION Se realiza antisepsia en el pliegue caudal del bovino sospechoso (base de la cola) y se aplica INTRADERMICAMENTE 0.1 ml de la tuberculina (PPD). Ser positivo (reactor) cualquier manifestación inflamatoria que se observe en las próximas 72 horas. Si un animal resulta reactor se le deber realizar una prueba doble comparativa en la tabla del cuello, en donde se le rasurará y medirá el grosor de la piel previo a la aplicación y se le aplicarán sendas dosis de PPD aviar y mamífero, (siendo el PPD aviar en la parte anterior del sitio afeitado), leyéndose a las 72 horas. Para realizar la interpretación final se deber restar la medida de los pliegues cutáneos de las 72 horas a la medida inicial de ellos. 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS 5.1 REGISTRO DE RESULTADOS Prueba caudal Bovino No. Sexo Edad Raza RESULTADO Observaciones Prueba doble comparativa Bovino No. Sexo Edad Raza Lectura Inicial final Mam Av Mam Av RESULTADO Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio Parasitosis Bovino No. Sexo Edad Raza RESULTADO Observaciones RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6. BIBLIOGRAFIA BENJAMÍN M. M. Manual de Patología Clínica Veterinaria. 4ª Edición. Ed. Limusa. México. 1990 COLES, E. H. Diagnóstico y Patología Veterinaria. 5ª Edición. Ed. Interamericana. México. 1998 El Manual Merck de Veterinaria. Merck &CO. Centrum España 1988 CARTER, G. R. Bacteriología y Microbiología Veterinaria. Ed. M.M.M. México. 1990 MERCHAT, I. A. y PARCKER, R. A. Bacteriología y Virología Veterinaria. Ed. Acribia. México. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio DETERMINACION DE COPTOANTIGENOS 1. INTRODUCCION El objetivo de la práctica es determinar mediante reacciones de precipitación la identidad de productos cárnicos en los cuales se haya podido sospechar algún fraude. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACION En el área de la chacinería es frecuente encontrar que los embutidos no correspondan sus contenidos a lo especificado en la etiqueta, o que en la carnicería nos entreguen una carne de una especie animal diferente a la solicitada. Los copto anticuerpos se emplean para la identificación de estos productos, para ello se pueden preparar los antisueros como lo realizado en la práctica 1, y obtener antisueros específicos y muy potentes que sean capaces de dar resultados positivos aún en diluciones ó a 1: 10,000. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Solución salina fisiológica Merthiolate Azida sódica Melox Cloroformo Ketamina Xilacina CONC. 1:100 000 0.02 % 50% 5% CANTIDAD 5 L 1 fco 1 Fco 1 Fco 1 fco 1 fco 1 fco 3.2 Equipos de laboratorio 1. Báscula 2. Centrífuga 3.3 Materiales de laboratorio NUM. CANTIDAD Laboratorio Clínico Veterinario DESCRIPCION Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6 6 6 6 25 12 30 6 6 20 6 3.4 Material biológico 1. 2. 3. 4. Morteros estériles Pistilos estériles Tijeras Pinzas de disección Gasas estériles Tubos para centrífuga Tubos de ensaye de 13 x 100 Pipetas pasteur de 1 ml 250 gr. carne de Jeringas de 3ml Jeringas de 5 ml Muestras cárnicas:250 gr. carne de bovino 250 gr. carne de pollo 250 gr. carne de caballo 250 gr. carne de cerdo 5. 250 gr. de Embutido (salchicha, jamón, etc) 6. 6 Conejos adultos 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO Se pesan unos cuantos gramos de la muestra cárnica y se maceran en el mortero, luego se diluyen hasta quedar en una concentración del 20% con SSF; enseguida se filtran por gasa y se centrifuga a 2000 rpm por diez minutos. Posteriormente el sobrenadante se debe enfrentar a los diferentes antisueros para as¡ poder identificar al producto. Para hacerlo se colocar un ml del antígeno en el fondo de un tubo de ensayo y el suero de conejo diluido (10, 100, 1000, 10000, 100000 veces) se resbalar suavemente por la pared del tubo con una pipeta, intentando formar dos fases y una interfase (no deben mezclarse), en dicha interfase se deber formar un anillo de precipitación en unos minutos a horas. También puede hacerse utilizando gel. 5. PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS ANTISUERO MUESTRA NÚMERO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 EQUINO______________________________________________________ Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio CERDO ______________________________________________________ PERRO ______________________________________________________ BOVINO______________________________________________________ ______________________________________________________ MUESTRA 1. _________________ 2. _________________ 3._________________ 4. _________________ 5. _________________ 6._________________ 7. _________________ 8. _________________ 9._________________ 10. ________________ 11. _________________ 12.________________ RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6. BIBLIOGRAFIA CARPENTER, P.H. Inmunología y Serología. Prensa Médica. México HERNANDEZ-BELTRAN, A. y LOPEZ-YÁNEZ, B. Reacciones serológicas en la inspección de carnes y embutidos. 1977. Tesis recepcional. FMVZ-UV. NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-023-ZOO-1995 identificación de especie animal en músculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y aves, por la prueba de inmuno difusión en gel. Diario Oficial de la Federación el 14 de septiembre de 1995. edición a cargo de la "Comisión Nacional de Sanidad Agropecuaria". México, DF. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio REACCIONES DE AGLUTINACIÓN PRUEBAS SEROLOGICAS Y LACTEAS PARA LA DETERMINACION DE BRUCELOSIS. 1. INTRODUCCION Las pruebas de aglutinación son la base del conocimiento sero epidemiológico de las campañas de control y erradicación de diversos problemas sanitarios de los animales, como: brucelosis y salmonelosis aviar. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGIA DE LA DETERMINACIÓN Las reacciones de aglutinación, al igual que las de precipitación, tienen como componentes: antígeno, anticuerpo y electrolitos; pero en la aglutinación el antígeno es forme, esto quiere decir que son células o partículas de éstas. El fenómeno de aglutinación se lleva a cabo en dos etapas, siendo la primera la formación de complejos inmunes, o sea la unión de antígenos y anticuerpos, conformando lo que se conoce como complejos primarios, esta parte es inmediata, específica e invisible; luego pasa a conformar los denominados complejos secundarios, o sean las uniones de los complejos primarios entre sí, esta fase es mediata, específica y visible. La brucelosis es una zoonosis que incapacita al humano y causa mermas económicas considerables en la ganadería nacional mediante abortos, esterilidad, decomisos y muerte. Existe cierta dificultad para diferenciarla clínicamente de otras afecciones del aparato reproductor de los bovinos como son: vibriosis (campylobacteriosis), tricomoniasis, desnutrición, disfunciones hormonales, etc. Esto ha originado la creación de diversos métodos de laboratorio para diagnosticarla en los animales sospechosos. Estos métodos utilizan suero sanguíneo, leche, líquido seminal, desde el punto de vista sero epidemiológico, además de que dichas pruebas difieren en sensibilidad y especificidad. Desde el punto de vista bacteriológico se intentará el aislamiento a partir del moco vaginal, cotiledones, contenido gástrico del producto abortado, etc. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio Las pruebas sero epidemiológicas son: Especie 1.- Huddleson (placa) Bovino, cerdo y hombre 2.- Lenta en tubo (SAT) Bovino 3.- Tarjeta (Ag tamponado y con rosa de bengala)Bovino y hombre 4.- Anillo en leche (Bang). Bovino 5.- Fijación del complemento. Bovino 6.- 2-∝-Mercapto-etanol * Bovino 7.- Rivanol * Bovino 8.- Inactivación por calor (56 °C por 30 minutos) Bovino, cerdo 9.- Coombs. Bovino, cerdo * Estas dos pruebas son capaces de detectar anticuerpos no vacunales (IgG), destruyendo o precipitando a los anticuerpos de origen vacunal (IgM). Para funciones de campaña para el control y erradición de la brucelosis se están empleando las pruebas de tarjeta, rivanol y fijación del complemento, como rutina y para el control permanente de los hatos lecheros libres de la enfermedad se está empleando la prueba de anillo en leche (Bang); así como el aislamiento bacteriológico para la confirmación de los casos. 3. LISTA DE REQUERIMINETOS 3.1 Reactivos NUM. CLAVE NOMBRE DEL REACTIVO Antígeno Brucella abortus aba-test-tarjeta coloreado con rosa de bengala Antígeno Brucella abortus aba-test-rivanol Antígeno Brucella abortus aba-test-leche CONC. pH 3.65 1% CANTIDAD 1 fco 1 fco 1 fco 3.2 Equipos de Laboratorio 1. Caja de iluminación o Negatoscopio 2. Estufa de cultivo 3.3 Materiales de Laboratorio NUM. CANTIDAD DESCRIPCION 15 Agujas para punción calibre 18 o 20 15 Tubos vacutainers 1 Marcador Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 5 5 1 caja 5 5 5 1 5 1 10 Placas de vidrio con cuadrícula 2.5 x 2.5 cm Gradilla Palillos de dientes Pipetas de Bang .02 ml Pipetas serológicas de 0.2 mL Pipetas automáticas graduables Caja aislante con refrigerantes frascos de vidrio con tapa Lámpara de alcohol Tubos de ensaye de 13 x 100 3.4 Material Biológico 1. Bovinos hembras sin vacunaciones contra Brucella 2. Leche de vaca de reciente ordeño 4. TECNICA O PROCEDIMIENTO Para la obtención de la sangre se deberá hacer una punción en la vena caudal colectándose esta en el tubo al vacío (vacutainer), rotularlo (identificación definitiva del animal) y dejarlo en posición HORIZONTAL hasta que alcance la perfecta coagulación, posteriormente colocarlo en forma vertical en la gradilla, así cuando el coágulo se retraiga soltará mayor cantidad de suero. es importante que la colección de las muestras se hagan con DIFERENTE aguja (siempre estéril). La muestra de leche puede ser individual o colectiva, esta se utilizará para la prueba de Bang, aunque es preferible como muestra de hato pues es capaz de detectar a una vaca reactor entre la leche de 60 animales. 4.1 PRUEBA DEL ANTIGENO TAMPONADO (tarjeta).- (Pietz 1968). La prueba es cualitativa, se utilizan 30 µL (microlitros, 0.03 ml) de suero sanguíneo y la misma cantidad del Abatest-tarjeta, coloreado con rosa de bengala y un pH de 3.65. Se colocan los reactivos sobre una placa de vidrio , de plástico o cartón satinado y mezclar con palillos de dientes, rotar la mezcla y esperar hasta 4 cuatro minutos a la aparición de la reacción. Debido al pH bajo, las IgM muchas veces no establecen perfectamente la aglutinación, mientras que en presencia de IgG, esta sí se realiza mejor. 4.2 PRUEBA DE ANILLO EN LECHE (prueba de Bang).- (Fleishaver 1937). Esta prueba detecta aglutininas en la leche, se utiliza para inspeccionar hatos que han sido declarados libres de la infección. Se debe homogeneizar Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio la leche (perol, tanque de enfriamiento, bote, etc.), se toman unos mililitros y se lleva al laboratorio en donde se deberá refrigerar de 12-72 horas. Luego calentar al ambiente por 30-60 minutos los reactivos (antígeno y muestras), colocar en tubos de ensaye un ml de la muestra y agregarle 30 µL de antígeno, mezclarlo e incubar en estufa de laboratorio a 37 °C durante 30-60 minutos, la lectura se hará según el cuadro anexo en resultados: 4.3 RIVANOL.- (Anderson, 1964). El rivanol (lactato 2-etoxi-6,9 diaminoacridina) es un colorante derivado de la acridina y tiene la particularidad de precipitar a proteínas del suero de los bovinos. Mediante el uso de cantidades iguales de suero y una solución de rivanol al 1%, queda un precipitado y un sobrenadante después de 30 minutos de incubación y centrifugación a 2000 rpm por 10 minutos en este sobrenadante se detectan exclusivamente las IgG. Además debe emplearse un antígeno especialmente elaborado para esta prueba con un pH de 5.8-6.2, pues debe compensarse el efecto de la dilución de los anticuerpos. Se requiere una placa de vidrio cuadriculada, pipetas de Bang o de 0.02 ml, en donde se colocarán formando una columna, diversas cantidades de la muestra (0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml que significarán títulos de 1.25, 1:50, 1:100, 1.200 y 1.400 respectivamente), luego se les añadirán 30 µL de antígeno a cada cuadro y se agitarán con un palillo de dientes, desde la mayor hasta la menor dilución del suero sanguíneo, aglutinación igual o mayor que el título de 1:50 se considera positivo. Para la elaboración de cada uno de los reactivos se utiliza la misma semilla de B. abortus cepa 1119-3 que Cepanzoo proporciona al laboratorio productor. estas bacterias se cultivan en cubas de fermentación en PBS, peptona y dextrosa, adicionado un perfecto aireado para obtener un adecuado incremento celular; manteniendo el control de calidad en cuanto se refiere a la: Disociación: mantenimiento de la cepa en su fase lisa Pureza: contener solamente B. abortus Esterilidad: que no haya contaminación con hongos, virus y otras bacterias. Las diferencias entre los reactivos además de la coloración, estriba en la concentración celular bacteriana: Placa 10-12% Tubo 4.5% Leche 4.0% Tarjeta 8.0% Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio Rivanol 4.0% RELACIONES ANTIGENICAS ENTRE BRUCELAS BACTERIA SUERO MONOESPECIFICO AGLUTINACION Br. abortus anti-abortus si Br. abortus anti-melitensis no Br. melitensis anti-melitensis si Br. melitensis anti- abortus no Br. suis anti-abortus si Br. suis anti.suis si Br. suis anti-melitensis no También se detectado reactividad cruzada entre bacterias del género Brucella y Pasteurella, Campylobacter y Yersinia. 5. PROCESAMIENTO DE RESULTADOS RESULTADOS Y OBSERVACIONES CONCLUSIONES Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio 6. BIBLIOGRAFIA AGUIRRE, M. R. A. Brucelosis bovina, diagnóstico comparativo por medio de las pruebas serológicas de fijación de superficie, aglutinación en placa y en tubo. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1969. GONZALEZ, P.V. Porciente de reactores serológicos positivos a brucelosis. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1971. LOPEZ, A. C. Investigación serológica de brucelosis canina por los métodos de Huddleson y Brewer diagnostic kits (card test) en la ciudad de Veracruz. Tesis recepcional. FMVZ-UV. 1971. MORILLA, G.A. y cols. Manual de inmunología. 1a. Ed. México. TIZARD. Inmunología Veterinaria. 1998 Ed. Diana-técnico. 1986. Laboratorio Clínico Veterinario Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Procedimientos de Laboratorio MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO CLINICO VETERINARIO Elaborado por: MVZ Elsa Ariadna Villanueva Jiménez Laboratorio Clínico Veterinario
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