MANU UAL DE P PRÁCTICA DE LA AS ABORAT TORIO DE E FARMAC COGNOS SIAPrepa arado por: Luz Mariela Sorza S S. Gloria Amp G paro Valenc P. cia Rev visado y co omplementa por: ado Gloria Amp G paro Valenc P. cia Cristina L Lucía Mora A. UNIV VERSIDAD DE ANT D TIOQUIA FA ACULTAD DE QUÍMICA FA D ARMACÉU UTICA TEC CNOLOGÍA EN RE EGENCIA DE FARMACIA A 2 2009 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ CONTENIDO Programa de laboratorio de farmacognosia …………………………………………... Práctica N°2: Práctica N°3: Práctica N°4: Práctica N°5: Práctica N°6 y 7: Manejo de la información bibliográfica en farmacognosia …… Reconocimiento de la flora medicinal ………………………….. Morfología vegetal interna ………………………………………. Morfología vegetal externa ………………………………………. Reconocimiento de plantas medicinales aprobadas en Colombia……………………………………………………………. Identificación de metabolitos secundarios ……………………... Detección de adulteraciones y/o falsificaciones en drogas en polvo ………………………………………………………………... Extracción y separación de principios activos en plantas medicinales aprobadas en Colombia mediante cromatografía en capa fina ……………………………………………………….. Pág 4 5 6 8 14 18 21 Práctica N°8: Práctica N°9: 24 Práctica N°10: 30 33 Referencias bibliográficas ………………………………………………………………. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 3 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PROGRAMA DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA 1. Introducción y capacitación en normas de seguridad 2. Manejo de la información bibliográfica en farmacognosia 3. Reconocimiento de la flora medicinal del Jardín Botánico 4. Morfología vegetal interna 5. Morfología vegetal externa 6. Reconocimiento macroscópico de plantas medicinales aprobadas en Colombia y de algunas especies de plantas tóxicas. 7. Análisis microscópico de algunas drogas en polvo (Plantas medicinales aprobadas en Colombia o plantas de Farmacopeas oficiales). 8. Identificación de metabolitos secundarios. 9. Detección de Adulteraciones y/o falsificaciones en drogas en polvo mediante pruebas organolépticas, químicas y microscópicas. 10. Extracción y separación de principios activos en algunas plantas medicinales aprobadas en Colombia mediante cromatografía en capa fina 11. Práctica especial: presentación de alternativas de solución a la problemática relacionada con el uso inadecuado de las plantas medicinales, como proyección a la comunidad de los futuros profesionales en Tecnología en Regencia de Farmacia. a. b. c. d. Asesoría en la identificación de la problemática. Presentación del anteproyecto. Trabajo de campo y seguimiento por parte del profesor. Presentación del trabajo desarrollado ante la comunidad universitaria. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 4 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N° 2 MANEJO DE LA INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA EN FARMACOGNOSIA OBJETIVOS 1. Dar a conocer al estudiante el manejo de bases de datos y la información consignada en la Biblioteca Central. 2. Enseñar con ejemplos como se busca la información y así poder aplicarla en este curso. 3. Aprender a reportar adecuadamente las referencias bibliográficas. METODOLOGÍA Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones de la biblioteca central recibirá la información y capacitación impartida por los funcionarios de la misma, de no ser posible la consecución del espacio en la biblioteca central, el profesor orientará a los estudiantes en la búsqueda de información relacionada con el curso. Una vez recibida la capacitación el estudiante debe hacer entrega de un informe con el siguiente contenido: 1. Como reportar adecuadamente libros, artículos de revistas y documentos electrónicos. 2. Consultar la monografía de una planta medicinal asignada por el profesor, teniendo en cuenta los siguientes aspectos: nombre científico, descripción botánica, descripción microscópica, uso terapéutico aprobado, droga aprobada, reacciones adversas, advertencias y contraindicaciones. Sugerencias para la monografías de la OMS. búsqueda bibliográfica: farmacopeas oficiales, Nota: recuerde que todo informe debe llevar la bibliografía correctamente reportada. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 5 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N° 3 RECONOCIMIENTO DE LA FLORA MEDICINAL OBJETIVO Reconocimiento de algunos ejemplares cultivados en el huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico y/o en la flora universitaria. Nota: de no ser posible la consecución de la visita guiada se reconocerán algunos ejemplares adquiridos por los estudiantes según las muestras asignadas en los lugares de expendio. METODOLOGÍA Para el desarrollo de esta práctica el estudiante en visita guiada a las instalaciones del huerto de plantas medicinales del Jardín Botánico recibirá la información y capacitación brindada por los funcionarios del mismo, relacionada con las características de las plantas medicinales. Una vez recibida la capacitación el estudiante procederá a la realización y presentación del respectivo informe que debe contener un listado de las plantas observadas con el nombre científico, nombre común, uso terapéutico, droga aprobada y una pequeña descripción botánica. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 6 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICAS N° 3 y 4 MORFOLOGÍA VEGETAL INTERNA Y EXTERNA OBJETIVOS 1. Reconocer tejidos y estructuras vegetales internas utilizando el microscopio, sobre cortes histológicos previamente preparados, de raíz, tallo y hojas en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. 2. Diferenciar estructuras vegetales externas en: raíz, tallo, hojas y flores de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. DEFINICIÓN La morfología vegetal es la parte de la botánica que estudia las formas y estructuras de las diferentes partes del cuerpo de la planta teniendo en cuenta aspectos histológicos y fisiológicos en el proceso de modificación y transformación que experimentan. METODOLOGÍA Para el desarrollo de la práctica se divide el estudio en: 1. Aspectos internos ( Histología ) 2. Aspectos externos ( cuerpo de la planta) Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 7 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N° 3. ASPECTOS INTERNOS: HISTOLOGÍA ESTRUCTURA INTERNA DEL TALLO DE UNA PLANTA MONOCOTILEDONEA Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 8 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ ESTRUCTURA INTERNA DEL TALLO DE UNA PLANTA DICOTILEDONEA Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 9 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ DIAGRAMA DE LA ESTRUCTURA INTERNA DEL TALLO DE UNA PLANTA DICOTILEDÓNEA Tomado del Libro electrónico del profesor Frank Uribe A., y modificado por: Gloria Amparo Valencia P., y Cristina Lucía Mora A. ACTIVIDAD A DESARROLLAR El profesor pondrá a disposición de los estudiantes una serie de placas previamente preparadas en las cuales deben identificar utilizando el microscopio las estructuras internas de tallos de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Nota: dibujar las estructuras claramente diferenciadas de cada uno de los cortes observados para su evaluación. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 10 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ RAIZ MONOCOTILEDONEA RAIZ DICOTILEDONEA Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 11 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ ESTRUCTURA INTERNA DE RAÍZ DICOTILEDONEA ESTRUCTURA INTERNA DE RAÍZ MONOCOTILEDONEA ACTIVIDAD A DESARROLLAR Identificar bajo el microscopio las estructuras internas de la raíz de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, dibujar y anotar sus diferencias para posterior evaluación. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 12 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ MORFOLOGÍA INTERNA DE LA HOJA ACTIVIDAD A DESARROLLAR Identificar bajo el microscopio las estructuras internas en hojas de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, dibujar y anotar sus diferencias para posterior evaluación. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 13 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N°4. MORFOLOGIA EXTERNA Cuerpo de la planta El cuerpo de una planta está conformado por dos sistemas: 1. Sistema caulinar o de vástago, que comprende: tallos, ramas, hojas y flor. 2. Sistema radical: formado por raíces, generalmente subterráneas o terrestres y sumergidas ó acuáticas. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 14 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ Cuerpo de la planta 1. SISTEMA CAULINAR O DE VÁSTAGO MORFOLOGÍA EXTERNA DEL TALLO ACTIVIDAD A DESARROLLAR Consultar las diferentes clases de tallos que existen en la naturaleza y su clasificación. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 15 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ MORFOLOGÍA EXTERNA DE LA HOJA MORFOLOGÍA EXTERNA DE LA FLOR Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 16 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ SISTEMA RADICAL MORFOLOGÍA EXTERNA DE LA RAÍZ De acuerdo con las características morfológicas externas observadas en las plantas asignadas, clasificarlas y consignar la información correspondiente según el siguiente modelo de tabla para su evaluación. NOMBRES HOJAS TALLO RAIZ FLOR CLASIFICACION N. cien N. com Peciolo Compl. Filotax. Nerv. Herb. Leño Fibr. Pivot. No Verticilos Monocotiled. Dicotiled. BIBLIOGRAFIA Cortes y estructura. Cortesía libro electrónico, profesor Frank Uribe, Departamento de Biología U de A. 2000. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 17 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICAS Nº 6 y 7 PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA OBJETIVOS 1. Conocer el listado básico de las plantas de uso medicinal aprobadas en Colombia. 2. Del listado básico reconocer físicamente las plantas de uso medicinal aprobadas en Colombia de mayor comercialización. 3. Reconocimiento de las características macro y microscópicas de los ejemplares más representativos del listado básico de las plantas medicinales aceptadas en Colombia. DEFINICIÓN El conocimiento del listado básico de las plantas aceptadas en Colombia, conjugado con un buen reconocimiento de la morfología interna y externa son el criterio fundamental para la adquisición, producción y comercialización de estas plantas sin temor a falsificaciones o adulteraciones. METODOLOGÍA El desarrollo de esta práctica se divide en: 1. Estudio por parte del estudiante del listado básico de las plantas medicinales aprobadas en Colombia hasta la fecha. 2. Reconocimiento macroscópico de las características morfológicas externas de las plantas medicinales más comercializadas aprobadas en Colombia (Práctica N°6). 3. Reconocimiento bajo el microscopio de estructuras internas, en algunas de las plantas medicinales de mayor comercialización aprobadas en Colombia (Práctica N°7). Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 18 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ 1. Estudio por parte del estudiante del listado básico de las Plantas Aprobadas en Colombia a la fecha (120 ejemplares). Esta actividad es indispensable para el cumplimiento de los objetivos del curso y debe desarrollarse bajo la responsabilidad de cada estudiante. 2. Características morfológicas externas de algunas de las Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia de mayor comercialización N. VULGAR AJENJO ALBAHACA ALCACHOFA CALÉNDULA CIDRON HINOJO ENELDO MALVA MANZANILLA MARRUBIO BLANCO ORTIGA PENSAMIENTO ROMERO RUDA SAÚCO TORONJIL N. CIENTÍFICO COLOR OLOR TEXTURA TRICOMAS, PELOS O VELLOSIDADES Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 19 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ 3. Reconocimiento bajo el microscopio de estructuras internas en algunas de las Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia de mayor comercialización El estudiante debe consultar las estructuras internas a nivel microscópico de las siguientes drogas en polvo: canela, ruibarbo, jengibre, regaliz, sen y digital. Esta consulta será revisada y calificada antes de realizar la práctica. Bajo la asesoría y orientación del profesor el estudiante procederá a realizar las siguientes actividades: • Preparación de placas o montajes respectivos de las plantas medicinales secas y en polvo sobre porta objetos, utilizando según el caso agua, hidrato de cloral y floroglucina. Recuerde colocar el cubreobjetos antes de la observación. • Observar las estructuras presentes en los ejemplares seleccionados de las plantas medicinales; luego de la observación, dibujar las estructuras correspondientes a los elementos de valor diagnóstico más importantes en cada una de las plantas y presentarlas para su evaluación. NOTA: Se presentará un informe con los resultados obtenidos en las prácticas 6 y 7 correspondientes a Plantas Medicinales Aprobadas en Colombia. BIBLIOGRAFÍA Gattuso M.A.,Gattuso S.J. “Manual de procedimientos para el análisis de drogas en polvo”. Cooperación Iberoamericana Ciencia y Tecnología para el desarrollo. Universidad Nacional del Rosario. Argentina. 1999 . Trease and Evans. Farmacognosia. 13 Edición. Bailliere Tindall.Mexico.1989. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 20 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N° 8 IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS OBJETIVO Identificación de metabolitos secundarios mediante pruebas químicas rápidas de coloración y/o precipitación sobre muestras de plantas frescas recolectadas en la flora universitaria. DEFINICIÓN Los metabolitos secundarios cumplen una función específica para cada planta, algunos son responsables de olores y colores característicos, causticidad, y otros comunican sus virtudes medicinales o tóxicas a las plantas. Los siguientes metabolitos serán objeto de estudio en esta práctica: 1. 2. 3. 4. 5. 6. ALCALOIDES ESTEROIDES Y/O TRITERPENOIDES SAPONINAS TANINOS FLAVONOIDES QUINONAS METODOLOGÍA Sobre el extracto de la planta seleccionada, el estudiante realizara pruebas químicas de coloración y/o precipitación, para determinar la presencia del metabolito respectivo. RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES: Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus respectivas sales mediante la adición de un ácido diluido y formar precipitados al adicionar los llamados reactivos para alcaloides. En esta práctica utilizaremos los reactivos de: Mayer y Dragendorff, haciendo la aclaración de que existen otros reactivos para realizar esta prueba. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 21 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA EL RECONOCIMIENTO DE ALCALOIDES: Tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco (o seco en polvo), macerar en un mortero, pasar a un beaker o erlenmeyer, adicionar un volumen suficiente de ácido clorhídrico al 5% que cubra la muestra; calentar al baño maría durante 10 minutos, enfriar y filtrar. Colocar en dos tubos de ensayo aproximadamente 0.5 ml del filtrado ácido, agregar a cada uno de los tubos previamente rotulados con el respectivo nombre del reactivo, 2 gotas de los reactivos de: Dragendorff, Mayer. Si se observa turbidez o precipitado en los dos tubos se considera que la muestra contiene alcaloides (Prueba presuntiva). RECONOCIMIENTO DE ESTEROIDES Y/O TRITERPENOIDES: En un beaker limpio y seco, tomar una pequeña cantidad de muestra seca y molida, adicionar diclorometano en cantidad suficiente que cubra la muestra (realice esta prueba bajo campana extractora de gases) agitar con varilla de vidrio para realizar una mejor extracción, filtrar sobre sulfato de sodio anhidro. En un tubo de ensayo limpio y seco tomar 1 ml del filtrado orgánico y agregar por la pared del tubo 1 ml de anhídrido acético y con precaución 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva (+) para esteroides y/o triterpenoides en la muestra. RECONOCIMIENTO DE SAPONINAS: Tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco y macerar en un mortero, adicionar suficiente cantidad de agua que cubra la muestra, filtrar a través de gasa, pasar 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante un minuto, si se forma abundante espuma, estable aproximadamente 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. RECONOCIMIENTO DE TANINOS: Tomar aproximadamente 5 g del material vegetal fresco, macerar en un mortero hidratando la muestra para facilitar el rompimiento de los tejidos, pasar la muestra completamente macerada a un beaker y adicionar cantidad Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 22 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ suficiente de agua para cubrir la muestra, calentar en baño maría de 10 a 15 minutos, filtrar en caliente. Tomar 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar dos (2) gotas de solución de tricloruro férrico (FeCL3 al 1%). La aparición de un color verde, azul o negro es prueba positiva (+) para compuestos fenólicos; en un segundo tubo de ensayo tomar otro mililitro del filtrado y agregar unas gotas de gelatinasal, si hay turbidez o formación de precipitado es prueba positiva para taninos en la muestra. Las dos pruebas son necesarias para comprobar la presencia de taninos. RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES: Macerar en un mortero aproximadamente 5 g del material vegetal finamente picado, pasar a un beaker o erlenmeyer, adicionar suficiente cantidad de etanol que cubra la muestra; calentar al baño maría durante cinco minutos, enfriar y filtrar. Tomar un 1 ml del filtrado etanólico en un tubo de ensayo, agregar varias limaduras de magnesio y por la pared del tubo dejar caer lentamente HCl concentrado (37%) la aparición de colores: naranja, rojo, violeta ó rosado, indican que la prueba es positiva (+) para flavonoides. RECONOCIMIENTO DE QUINONAS: Pesar aproximadamente 0,5 g de material vegetal en polvo en un beaker de 100 ml, adicionar 20 ml de etanol al 95% y calentar en baño maría durante 5 minutos hasta ebullición para realizar la extracción de la muestra, filtrar en caliente, tomar 5ml del filtrado y adicionar aproximadamente 3 ml de H2SO4 al 10%, calentar en baño maría, durante 15 minutos hasta ebullición para producir la hidrólisis; enfriar la muestra y realizar la extracción de las quinonas con 5 ml de tolueno (usar el tolueno bajo campana extractora) agitar suavemente sin emulsionar, tomar 2ml de la fase orgánica en un segundo tubo de ensayo, adicionar aproximadamente 1 ml de hidróxido de sodio al 5% en amoníaco al 2%. Luego de agitar se obtiene un color rojo cereza en la capa acuosa, lo que indica presencia de quinonas en la muestra. BIBLIOGRAFÍA Dominguez X.A. Métodos de investigación fitoquímica.Ed.Limusa. México. 1.973. Trease and Evans.Farmacognosia. 13 Edición.Bailliere Tindall.Mexico.1989. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 23 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N°9 DETECCIÓN DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES EN DROGAS EN POLVO DEFINICIÓN La identificación de material vegetal utilizado como producto fitoterapéutico, no deja de ser un grave problema en el mundo de los productos naturales, uno de los tantos inconvenientes es el manejo de los nombres vulgares o regionales de las plantas, el desconocimiento del órgano o parte de la planta donde se encuentra el ó los principios activos y finalmente el reconocimiento de drogas en polvo objeto de esta práctica. OBJETIVO Reconocer una droga en polvo y / o una falsificación a través de una marcha que involucra pruebas organolépticas, microscópicas y químicas. METODOLOGÍA El estudiante tomará una droga en polvo desconocida y sobre ella realizará pruebas que lo conducirán a identificarla. Una prueba confirmativa involucra análisis fisicoquímicos y espectrofotométricos más especializados y de alta confiabilidad, pero con esta marcha se despejan dudas que generalmente conducen a descartar drogas y a dar un diagnostico aproximado que puede llegar a ser preciso contando con un patrón o estándar certificado. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 24 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. ANÁLISIS ORGANOLÉPTICOS COLOR: Blanco: goma arabiga y tragacanto Amarillo: regaliz, jengibre, escila. Marrón claro: ipecacuana. Opio, hinojo, genciana, cilantro, cardamomo. Castaño claro: canela Castaño oscuro: clavo, sábila Anaranjado: ruibarbo Verde: sen, digital, estramonio. OLOR: CARACTERÍSTICOS: jengibre, hinojo, genciana, cilantro, cardamomo, canela, clavo SABOR: Aromático: cilantro, cardamomo, canela, clavo. Aromático y picante: jengibre Amargo: cuasia, genciana. aloes, quina, escila, sen, ruibarbo. Dulce: regaliz. Muestra (s) presuntiva: _______________________________ Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 25 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ 2. PRUEBAS QUÍMICAS RÁPIDAS Solubilidad en agua: Tomar en un tubo de ensayo aproximadamente un gramo de muestra, adicionar agua en cantidad suficiente para cubrir la muestra; mezclar y dejar en reposo durante 15 min. Al cabo de este tiempo observar y sacar conclusiones. Nota: los extractos acuosos y jugos concentrados se disuelven casi completamente, y drogas como la goma arábiga, tragacanto y semillas de lino, ponen de manifiesto su naturaleza gomosa o mucilaginosa. Muestra presuntiva: _______________________________________________ Presencia de carbonato de calcio: Tomar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de la muestra adicionar unas gotas de ácido sulfúrico diluido, si hay presencia de carbonato de calcio como adulterante, tiene lugar una efervescencia seguida de disolución. Adulteración y/o falsificación: Muestra(s) con presencia de carbonato de calcio. Si ___ No ___ Presencia de aceites fijos y/o aceites esenciales: Aceites fijos: comprimir una pequeña cantidad de muestra en papel de filtro, si aparece una mancha oleosa que persiste luego de someterla a calentamiento (50°C), la muestra contiene aceite fijo. Ejemplo: lino, maní etc. Aceites esenciales: se reconocen por su olor aromático y a la temperatura de 50°C desaparece la mancha oleosa (la detección del aroma se puede apreciar al calentar la muestra en el baño maría). Muestra (s) Presuntiva: ____________________________________________ Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 26 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ Prueba para Saponinas, Taninos y Antraquinonas: En un tubo de ensayo tomar aproximadamente 0,5 g de muestra, adicionar aproximadamente 15 ml de agua, agitar durante un minuto. Si aparece espuma abundante sospechar la presencia de drogas que contienen saponinas, como: clavos, nuez moscada etc.; hervir suavemente y anotar si aparece desprendimiento de aceite esencial (por su olor aromático). Filtrar y dividir el filtrado en tres tubos de ensayo, dos para la prueba de taninos y uno para la prueba de antraquinonas. Filtrado 1: aproximadamente 1 ml. Filtrado 2: aproximadamente 1 ml. Filtrado 3: aproximadamente 5 ml. Ensayo para taninos: agregar al filtrado 1, dos gotas de cloruro férrico (FeCl3) al 1%, si aparece coloración de tonos azules a verdes pasando por el negro la prueba se considera positiva para compuestos fenólicos. Al filtrado 2 agregar unas gotas de gelatina sal, si hay formación de turbidez o precipitado la prueba se considera positiva para taninos. Ensayo para antraquinonas: agregar al filtrado 3, un mililitro de H2SO4 al 50%, calentar al baño maría durante 15 minutos para producir la hidrólisis; enfriar la muestra y realizar la extracción de las quinonas con 5 ml de tolueno (usar el tolueno bajo campana extractora) agitar suavemente sin emulsionar, tomar 2ml de la fase orgánica en un segundo tubo de ensayo, adicionar aproximadamente 1 ml de hidróxido de sodio al 5% en amoníaco al 2%. Luego de agitar se obtiene un color rojo cereza en la capa acuosa, lo que indica la presencia de quinonas en la muestra. Presencia de taninos: borraja, salvia, canela, quina, clavo y ruibarbo entre otros. Presencia de antraquinonas: áloes, ruibarbo, cáscara sagrada, sen. Muestra (s) Presuntiva: ____________________________________________ Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 27 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ 3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA ALMIDÓN: Prueba microscópica: montar placa (porta objetos y cubreobjetos) en agua, observar al microscopio, dibujar los gránulos que encuentre. Observación visual con lugol: después de la observación microscópica, adicionar a la placa una gota de lugol, colocarla sobre una superficie blanca y observar si los gránulos se tiñen de azul, lo cual confirma la presencia de almidón en la muestra. Ver estructuras en la consulta previamente realizada por el estudiante (Tratado de Farmacognosia. Trease-Evans. 12 Edición). Presencia de almidón. Si______ No_____ TRICOMAS EPIDÉRMICOS (PELOS) Y OXALATO DE CALCIO: Montar placa (porta objetos) en hidrato de cloral, que es un reactivo que disuelve: proteínas, almidón, resinas, aceites esenciales, y produce la expansión de células retraídas. Calentar suavemente y observar: Ver estructuras en la consulta previamente realizada por el estudiante (Tratado de Farmacognosia. Trease-Evans. 12 Edición). Presencia de oxalatos. Si______ No_____ PRESENCIA DE LIGNINA: Montar placa (portaobjetos) en solución alcohólica de floroglucina y dejar secar; agregar acido clorhídrico concentrado (HCl 37%), (usar el ácido clorhídrico bajo campana extractora) usar este reactivo con precaución puede quemar y sus vapores son tóxicos, colocar el cubreobjetos y observar; si los vasos no se tiñen de rojo sospechar presencia de: jengibre o ruibarbo. Presencia de lignina. Si____No____ Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 28 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ De acuerdo con la siguiente tabla y con lo observado durante la realización de la práctica identifique su muestra problema: DROGA LINO CLAVO DIGITAL JENGIBRE RUIBARBO SEN REGALIZ CANELA GENCIANA ALMIDON + + + + + PELOS EPIDERMICOS + + - OXALATO DE CALCIO + + + + + + LIGNINA + + + + + + Muestra problema: ________________________________________________ BIBLIOGRAFÍA Trease and Evans.Farmacognosia. 13 Edición.Bailliere Tindall.Mexico. 1989. Sorza Luz Mariela, Farmacognosia, 2000. Valencia Gloria Amparo. Notas del curso de Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 29 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ PRÁCTICA N° 10 EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PRINCIPIOS ACTIVOS EN PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA OBJETIVO Utilizando la parte de la planta aprobada por el INVIMA, se realizara la extracción y posterior identificación del metabolito secundario rutina presente en las plantas asignadas para la práctica, por medio de la técnica de cromatografía en capa fina. El metabolito separado sirve de indicador (marcador) para corroborar la autenticidad de la planta medicinal utilizada y no siempre es el responsable de la acción farmacológica. METODOLOGÍA Sobre el extracto de la planta asignada y/o una forma farmacéutica previamente establecida, el estudiante procederá a la extracción y posterior identificación del principio activo mediante la técnica de cromatografía en capa fina y de acuerdo al método de extracción especificado para cada muestra. A continuación se presenta un diagrama de un procedimiento cromatográfico, donde se ilustran los pasos a seguir en una separación cromatográfica. Tomado de: Manual de laboratorio de Farmacognosia y Fitoquímica 2008. Alejandro Martínez y colaboradores. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 30 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Muestra No 1 Flores de Pensamiento (Viola tricolor) MÉTODO DE EXTRACCIÓN: tomar 1 gramo del material vegetal seco y molido y extraer con etanol durante 10 minutos sobre un baño de agua a 60°C. Filtrar y concentrar el filtrado para la cromatografía. FASE ESTACIONARIA: Silica Gel GF-254 FASE MÓVIL: Acetato de etilo: Acido fórmico: Acido acético: Agua 100 : 11 : 11 : 26 REVELADOR QUÍMICO: revelador de productos naturales, ácido difenilbórico (solución 1) y polietilenglicol (solución 2). REVELADOR FÍSICO: luz UV 365nm. El extracto concentrado se siembra en placas cromatográficas, según instrucciones del profesor y utilizando RUTINA como el patrón. Luego de la siembra se introduce la placa en la cámara cromatográfica que contiene la fase MÓVIL y se deja hasta alcanzar el frente del solvente. Observar con luz ultra violeta a 365 nm y medir los Rf de cada componente. Rf 0.4 0.45 0.2 - 0.4 SUSTANCIA Rutina Ácido clorogénico Violantina (zona mayor) Scoparina Saponarina COLOR Amarillo - naranja Azul fluorescente Amarillo- verde (fluorescente) Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 31 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ Muestra N°2: Flores de caléndula (Calendula officinalis) Parte de la planta a utilizar: Flores Método de extracción: tal como se describió para el pensamiento. Rf 0.4 0.7 0.45 SUSTANCIAS Rutina Isorhamnetine Narcisina COLOR Amarillo-naranja Amarillo Verde fluorescente Muestra N°3 : Flores de saúco (Sambucus nigra) Parte de la planta a utilizar: flores (inflorescencia) Método de extracción: tal como se describió para el pensamiento. Rf 0.4 0.7 0.9 SUSTANCIAS Rutina Isoquercitrina Acido caféico COLOR Amarillo- naranja Amarillo Azul fluorescente BIBLIOGRAFÍA H. Wagner, S. Bladt, M. Zgainski. Plant Drug Analysis. Springer Verlag. 1984. Manual de Laboratorio de Farmacognsia y Fitoquímica. Alejandro Martínez y colaboradores. Universidad de Antioquia. 2008. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 32 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Cortes y estructura. Cortesía libro electrónico, profesor Frank Uribe, Departamento de Biología U de A. 2000. Gattuso M.A.,Gattuso S.J. “Manual de procedimientos para el análisis de drogas en polvo”. Cooperación Iberoamericana Ciencia y Tecnología para el desarrollo. Universidad Nacional del Rosario. Argentina. 1999 . Trease and Evans. Farmacognosia. 13 Edición. Bailliere Tindall.Mexico.1989. Dominguez X.A. Métodos de investigación fitoquímica. Ed.Limusa. México. 1973. Sorza Luz Mariela, Farmacognosia. 2000. Valencia Gloria Amparo. Notas del curso de H. Wagner, S. Bladt, M. Zgainski. Plant Drug Analysis. Springer Verlag. 1984. Manual de Laboratorio de Farmacognsia y Fitoquímica. Alejandro Martínez y colaboradores. Universidad de Antioquia. 2008. Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 33 Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia 2009 _____________________________________________________________________ Autor: Luz Mariela Sorza Z. / Gloria Amparo Valencia P. – Semestre 02/2000 Revisado y complementado: Gloria Amparo Valencia P. / Cristina Lucía Mora A. – Semestre 02/2009 34