Manual de Microbiologia Cuba UNAM

Manual de Técnicas Microbiológicas Para la Evaluación de la Calidad Ambiental de Ecosistemas Marino costeros HONORABLE AYUNTAMIENTO DE SOLIDARIDAD 2008-2011 Eduardo Román Quian Alcocer Presidente Dirección General de Ordenamiento Ambiental y Urbano Arq. Nuria Joseph Montero Lic. en C.CRÉDITOS COMITÉ EDITORIAL Honorable Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad C. Jorge Alonso Durán Rodríguez Director General Dirección de Medio Ambiente M. María Cristina Capó de Paz Técnico Francisca Rodríguez Acosta . en C. Tecnología y Medio Ambiente Instituto de Oceanología. en C. Cuba Departamento de Microbiología-Necton Dra. Margarita Lugioyo Gallardo Universidad Nacional Autónoma de México Instituto de Biología Departamento de Botánica Dra. María del Carmen González Villaseñor Colaboradores Dirección de Medio Ambiente M. Gladys Pérez de la Fuente Directora MANUAL DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PARA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS Ministerio de Ciencia. Diana Iris Enríquez Lavandera Dra. en C. Gladys Pérez de la Fuente Directora M. María Elena Miravet Regalado M. se incluyen técnicas para aislar microorganismos de peces. para los estudiantes que se inician en esta línea. parámetros microbiológicos útiles en estudios de factibilidad para situar granjas para cultivo de organismos marinos. • Además de los indicadores de calidad ambiental. Editores . manglares. Ayuntamiento del Municipio de Solidaridad. El presente Manual. y de interés biotecnológico como: • • técnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias biológicamente activas (tensoactivos. en aquellos donde se sitúen plataformas petroleras u otras industrias. y constituye un basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbiólogos y biólogos marinos. crustáceos. en el cual participa el H. desde el punto de vista higiénico sanitario. Se merece destacar que es una importante contribución para el Programa Integral de Playas Limpias en México. como por la presencia hidrocarburos. pastos marinos. algas y otros organismos marinos con diversos fines. playas). resume las técnicas y metodologías de microbiología marinas más utilizadas para abordar los aspectos siguientes: • • • • • • evaluación de la calidad del agua de uso recreativo. El Manual ofrece también detalles explícitos y recomendaciones prácticas para facilitar el montaje de las técnicas e interpretación de los resultados. ya que brindan los detalles necesarios para determinar la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores microbiológicos. velocidad de autodepuración de las aguas marinas (importante para inferir la capacidad de recuperación). y arrecifes. evaluación de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los diferentes ecosistemas marinos (arrecifes. determinación de microorganismos indicadores del grado de contaminación tanto orgánica. a través del Comité Local de Playas Limpias de la Zona Norte del Estado de Quintana Roo. indicadores microbiológicos necesarios para hacer “líneas bases” en sitios de desarrollo turístico. manglares. permite tomar medidas inmediatas para la protección y/o recuperación de las condiciones naturales.PREFACIO Estamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso. en la zona costera marina. técnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas. polisacáridos y luciferasa). que como es conocido. contribuyendo a la regeneración de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos. productoras de polisacáridos. y a los jóvenes graduados que se inician en los trabajos de ecología microbiana marina. los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes tróficas de los ecosistemas marinos. que se encuentran dispersas en diferentes publicaciones en otros idiomas. lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en un único documento. etc. y hongos asociados a gorgónidos. Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos de carbono. En el primero se abordan aspectos teóricos generales sobre la distribución e importancia de los microorganismos marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que caracterizan nuestra región. sulfatoreductoras y coliformes. docentes y especialistas de América Latina que se proponen a estudiar e investigar diferentes aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema marino. la determinación de bimasa a partir del . bacterias luminicentes. brindando referencias que permiten profundizar en detalles específicos para cada caso. El manual se ha conformado dividido en seis capítulos. En el capítulo quinto se describen las técnicas de conteo total de mecroorganismos empleando microscopía de epifluorescencia.PRÓLOGO La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 mil 500 millones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio marino. y bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas. bacterias asociadas a peces invertebrados marinos. Otro aspecto importante de este documento. está dirigido a estudiantes. el fósforo. alimenticia. el nitrógeno. así como las técnicas de aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos. el hierro y los metales trazas. Su principal ventaja es que en él se han recopilado técnicas y metodologías de trabajo muy utilizadas en esta especialidad. el azufre. En el tercer capítulo se describen técnicas y metodologías de aislamiento de hongos marinos de playas. El segundo capítulo reune algunas de las técnicas más utilizadas de enumeración de bacterias heterótrofas. haciéndose referencia a las claves más actualizadas de identeificación de estos microorganismos. es que sirve de apoyo a los profesores en la preparación y desarrollo de los programas dre educación superior relacionados con las ciencias marinas. petrolera. de suma importancia en estudios de contaminación orgánica y fecal en aguas marino costeras. Desde entonces. con una gran abundancia y biomasa. manglares. El cuarto capítulo explica los métodos que se utilizan para la conservación de bacterias y hongos en el laboratorio. Este Manual de Técnicas de Microbiología Marina. pero además constituyen nuevas fuentes de producción de sustancias biológicamente activas de interés para las industrias médico-farmacéutica. pastos marinos. Tecnología y Medio Ambiente de Cuba . Resulta meritorio el empeño colectivo de las autoras de poner a disponer del alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento del mundo marino.volumen celular y el conteo total y varios métodos para determinar la productividad bacteriana. Lina Domínguez Acosta Viceministro Ministerio de Ciencia . Esperamos que el noble propósito de las autoras les permita a los lectores seguir los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo más sano y mejor. También. se presentan las técnicas para determinar la productividad bacteriana. se presentan las técnicas para determ. empleando métodos que no requieren de una infraestructura compleja y recursos sofisticados. Dra. se describen las técnicas para determinar la intensidad de los procesos de descomposición aerobia y anaerobia de la materia orgánica. El capítulo sexto y final.inar la fotosíntesis. respectivamente. aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento del medio marino. Las técnicas que se describen en este manual han sido probadas con éxito en el Laboratorio de Microbiología Marina del Instituto de Oceanía de Cuba y en el Laboratorio de Ascomicetos del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de México. También. producción primaria y respiración. brinda la composición de los medios de cultivo que se han citado en los capítulos dos y tres. y por último. lo que permite disponer de toda la información técnica necesaria para realizar las técnicas descritas. . J. 2002.“Hay más microorganismos en el mar que estrellas en el universo” Copley. . Nature 415: 572-574. All at sea. . ........1......4........... 1.....5........... 5.....3................................2............3....................................... Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas ............................................................ 3.....................................................6...................... 21 28 32 40 46 51 56 60 64 73 79 84 88 92 CAPÍTULO 4................. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaerobia de la materia orgánica en los sedimentos ........ Bacterias .............. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas................................... Aislamiento de hongos asociados al mangle .......................................... 6 1.. 2............. 405 CAPÍTULO 5..... 160 ............1.................... 3........................... 4........... Técnicas y Métodos en Ecología microbiana.............................................................................................................. Aislamiento de hongos en las playas .. 6........ Características de los Ecosistemas marinos ...............2.............................................. 2....... 5.......................... Aislamiento de bacterias luminiscentes ................. Determinación de biomasa ..1...3...2......................... 5.........................................1..... Técnicas Micológicas............................................................ Importancia de los microorganismos marinos .. la Producción primaria y la Respiración .1........................................... CAPÍTULO 3................................. Hongos .. Aislamiento de bacterias productoras de polisacáridos extracelulares ... 2............9........................8...........ÍNDICE PREFACIO PRÓLOGO CAPÍTULO 1..... Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de la materia orgánica ... 5....4.. Introducción............................... 9 CAPÍTULO 2.............................................. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos ................. Enumeración de Estreptococos fecales ......7.. Distribución de los microorganismos en el mar ........................ Determinación de la Productividad bacteriana ................................................................ 111 117 123 131 137 142 CAPÍTULO 6.............. 2.............................. 147 6.................2.. 2......5................2................. Aislamiento de hongos de los pastos marinos .................................................. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ....6....... Hongos ................ Medios de Cultivo............................. 2.... 2............. 4 1................ Métodos de Conservación...................1..................................3..... 3.................... 2........ 5............................. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas . 3........................................4................ Determinación de la Fotosíntesis..........10... Enumeración de bacterias sulfatoreductoras ............................ 2................... Enumeración de Coliformes totales y fecales .......... Bacterias .......... Conteo Directo del Número Total de microorganismos ........................... 5..................... 2... 99 4..............2....................... Técnicas de Bacteriología.......... Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ..................... . Capítulo 1 Introducción . . En: Microbial Ecology of the Oceans. dentro del ámbito de estudio de la Microbiología se incluyen los virus y otros agentes subvíricos que no presentan estructura celular (López y Zaballos. Categoría Femtoplancton Picoplancton Grupo Microbiano Viruses Procariotes Bacterias Fotoautótrofos Proclorofitas Cianobacterias cocoides Cianobacteriasfilamentosas Quimioautótrofas Heterótrofas Archaea Picoalgas Flagelados picoheterótrofos Tamaño (µm) 0. 2000). tanto autótrofos como heterótrofos. B. Diferentes categorías en que se agrupan los microorganismos de acuerdo a su tamaño (Tomado de Sherr. Dentro de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos. New York. 2000.0 – 2. Recientemente. Marine microbes: an overview. D.0 7-10 ancho <= 100 longitud 0.5 – 2. Archaea. Wiley-Liss.0-20 Nanoplancton Nanoalgas Nanoheterotróficos(flagelados) Microalgas Protistas microheterótrofas Ciliados Dinoflagelados heterótrofos Microplancton 20-200 Página 3 . Asimismo. Ed. clases. Bacteria y Eukarya (Woese et al. Tabla 1.0 1.2 0.INTRODUCCIÓN Microorganismo es un término que incluye distintas formas de vida que comparten la característica común de tener un tamaño menor de 200 µm (Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres dominios de la vida que existen en nuestro planeta.0 0. géneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst.0 0. 13-46).0 2.L.5 – 1. y Sherr.3-1.0 1. y una organización en phyla. se ha propuesto un nuevo dominio biológico denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst. 1990). 2005). 2000).3-1. e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta eucariotas (algas y protistas fagotrofos).0-2. Kirchman.01-0. órdenes. Euviria (virus verdaderos) y Viroidia (viroides y virusoides). E. • Gradiente nerítico-oceánico. Ambos habitats pueden corresponder a zonas de plataformas insulares o continentales conocidas como neríticas (desde la costa 4 . Fig. p. en el cual varía la cantidad y calidad de la luz. afloramientos y corrientes en el océano. la concentración de nutrientes. tres gradientes: • Gradiente de profundidad. Bacteria. ocupando una gran variedad de habitats. Una primera subdivisión se hizo entre las aguas (hábitat pelágico) y los sedimentos (hábitat béntico). de manera general. Distribución de los microorganismos en el mar. En el mar. 1992. es decir. creándose vientos que causan mezclas.1. el ecosistema marino se ha dividido de manera empírica (Fig. las bajas latitudes reciben más energía por m2 que las altas latitudes. En la distribución y abundancia de los microorganismos marinos en el océano se reconoce que influyen.3. la temperatura y la presión. Para facilitar su estudio. B. y desde la superficie hasta profundidades abismales. que ocurre debido a las variaciones en la energía solar. los microorganismos se encuentran distribuidos en toda su extensión: desde la costa hasta zonas oceánicas muy distantes. Enciclopedia of Microbiology. y • Gradiente latitudinal. Habitats marinos (Tomado de Taylor. Marine Habitats.F.1). en el cual varía la disponibilidad de materia orgánica teniendo en cuenta que en las aguas costerasneríticas hay mayor influencia del escurrimiento terrígeno y el aporte de los ríos.INTRODUCCIÓN 1. Vol.1.29-44). algunos de estos compuestos son degradados por los microorganismos en la columna de agua y otros menos asequibles a la actividad microbiana (refractarios) se depositan en el fondo donde ocurre su descomposición final. o a zonas oceánicas de mas de 100 m de profundidad. constituyen también superficies inanimadas que promueven el crecimiento microbiano en el medio marino. En estos agregados se han registrado elevadas tasas de producción primaria (Gotschalk y Alldredge. Página 5 . produciendo la liberación de carbono orgánico al medio circundante (Smith et al. Los restos de plantas y animales (detritus) y en general. Otro hábitat lo constituyen los vegetales y organismos marinos vertebrados o invertebrados que proveen a los microorganismos de sus propios cuerpos como superficies sobre las cuales pueden formar sus colonias. Los compuestos de bajo peso molecular solubilizados pueden ser entonces utilizados por la comunidad de bacterias pelágicas oligotróficas. 1992). La composición química de los agregados es heterogénea. aunque también se ha constatado que las células que forman parte de los agregados son responsables de la solubilización de las partículas de detritos mediante actividad exohidrolasa. la celulosa es el componente predominante del detritus. Los agregados constituyen reservorios de nutrientes para las bacterias de vida libre. En la zona costera. 1992). polisacáridos (incluyendo quitina) y lípidos. También la interfase superficie del mar-atmósfera constituye un hábitat especializado donde habitan organismos llamados “neuston”. Proviene tanto de la vegetación costera como de la submarina. 1989) y se ha comprobado que las bacterias que se desarrollan en ellos suelen ser fácilmente cultivables y de tamaño mayor que las de vida libre (Eguchi y Kawai. Las partículas de materia orgánica están formadas por proteínas. establecer relaciones de interacción muchas veces de beneficio mutuo. contienen cantidades significativas de carbohidratos y proteínas por lo que constituyen un micro hábitat rico en nutrientes con concentraciones de carbono y nitrógeno varios órdenes de magnitud mayor que la encontrada en las aguas circundantes (Alldredge y Silver. las partículas fecales e inorgánicas. los agregados de materia orgánica (“nieve marina”). 1988). así como las estructuras sumergidas construidas por el hombre.INTRODUCCIÓN hasta 100 m de profundidad). e incluso. que pueden tomar su alimento directamente de ellos. hasta profundidades abismales. esqueletos y conchas de organismos marinos. o adheridos a organismos o sustratos inanimados. la materia orgánica es escasa. haciéndolo accesible para otros invertebrados que pueden así devorarlo. las bacterias y los hongos juegan un papel predominante. así como por otros organismos. 6 . Un ejemplo importante es la capacidad de los hongos de despolimerizar la celulosa y la pectina en la materia vegetal residual. En aguas oceánicas profundas donde la presión hidrostática es como promedio. los microorganismos pueden encontrarse libres en la columna de agua formando parte del plancton. ya que se ocupan de descomponer la materia orgánica presente en el mar dando lugar a compuestos menos complejos asequibles a otros organismos de la trama alimentaria. existen bacterias barotolerantes y barófilas adaptadas a la escasez de materia orgánica (oligotróficas) y a las bajas temperaturas (psicrófilas) que juegan un papel preponderante en la descomposición de los restos fecales producidos por los organismos (Taylor. Desde entonces. y por lo general. 1. Azam. queda disponible para ser consumida como alimento por protozoos y flagelados.INTRODUCCIÓN Las partículas inorgánicas llegan al mar a través del escurrimiento terrígeno y los ríos y también. en los sedimentos. Paralelo al proceso de descomposición. Importancia de los microorganismos marinos. 2005). con lo cual ablandan y ayudan a la descomposición de dicho material. Esta vía microbiana de reincorporación de materia orgánica a la trama alimentaria se conoce como “lazo microbiano” (“microbial loop”. provienen de dientes. la que a su vez. las bacterias y los hongos asimilan los compuestos orgánicos disueltos para formar su propia biomasa. Dentro de la diversidad de microorganismos que habitan en el medio marino. 400 veces mayor que en la superficie. contribuyendo a la regeneración de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos (López y Zaballo. 1998) y es de suma importancia en el funcionamiento del ecosistema marino. con una gran abundancia y biomasa. La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 500 millones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio marino. 1992). los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes tróficas de los ecosistemas marinos. la temperatura es baja. En resumen.2. En los pastos marinos. el fósforo.INTRODUCCIÓN También. ya que estos se nutren de los productos de excreción de los simbiontes y de las células muertas de los mismos. el nitrógeno. existen bacterias que viven en el intestino de anfípodos de aguas profundas proveyéndolos de nutrientes que no pueden absorber por otras vías. en los rizomas y en los sedimentos. a la forma orgánica. que se encuentra en abundancia en el agua de mar en forma de CO32. el azufre. 1999). Un descubrimiento de gran impacto fue conocer que determinados microorganismos quimiolitotrófos viven en asociación directa con invertebrados (gusanos tubícolas) que habitan en fuentes hidrotermales submarinas que expulsan fluidos a 270-380°C. Los microorganismos juegan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos del carbono. e incorporan dióxido de carbono. Estos microorganismos quimiolitotrófos proporcionan alimento a los animales. la oxidación de la materia orgánica ocurre a partir del uso de diferentes aceptores de electrones en la medida que aumenta la profundidad y cambia la disponibilidad de estos compuestos (Fig. Estos invertebrados dependen de la actividad de los microorganismos que crecen a expensas de las fuentes de energía inorgánicas procedentes de las propias fuentes hidrotermales.2). Distribución típica de los compuestos aceptores de electrones que utilizan las bacterias en los sedimentos (Tomado de Taylor. 1992). el nitrógeno es eficientemente reciclado debido a la actividad descomponedora de los microorganismos que da lugar a formas inorgánicas como nitratos o amonio. Página 7 . el nitrógeno es fijado por las cianobacterias que viven en las hojas y por las bacterias anaerobias que viven en las raíces.y HCO3-. Fig. En los sedimentos. En la mayoría de los ecosistemas.2. el hierro y los metales trazas. por lo que se consideran la base de la corta trama alimentaria en la que se encuentran los organismos que viven junto a las fuentes hidrotermales (Madigan et al. Desde el punto de vista biotecnológico. se reconoce la importancia de los microorganismos marinos como potenciales productores de sustancias biológicamente activas para la industria médicofarmaceútica. 2008). lo cual es de gran utilidad para el saneamiento del medio ambiente. y por tanto. 1993. y también. se conoce que existen hongos y bacterias capaces de degradar compuestos químicos sintéticos (xenobióticos) como los plaguicidas y herbicidas. La oxidación bacteriana de este compuesto tiene gran importancia para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y en los drenajes mineros. 1999). De la Rosa y Gamboa. tiene un significado evolutivo. Hoy en día es posible también abordar el estudio de la dinámica de un ecosistema natural a nivel genómico. las cuales llevan a cabo este proceso a partir de la reducción de sulfatos en condiciones anaerobias. De la Rosa y Gamboa. más del 50% de la mineralización de la materia orgánica ocurre gracias a la actividad de las bacterias sulfatoreductoras. Existen numerosas publicaciones de diferentes autores que refieren la detección de microorganismos productores de antibióticos. sin embargo. además de la bioremediación. 2003. 2002. las bacterias y los hongos marinos (Fenical y Jensen. la cual forma una estructura cristalina altamente insoluble. se desconozca qué papel ecológico juegan de manera individual. Los grupos de microorganismos más estudiados con estos fines son las microalgas. pero además. agentes antitumorales. o después de crecer. antivirales y enzimas (Atlas y Bartha. También. 2003). aún existen microorganismos que no crecen en los medios de cultivo tradicionales. Otra actividad de importancia económica y ambiental donde participan los microorganismos es la descomposición del petróleo y sus derivados. Entre los ciclos del azufre y el hierro se producen interacciones complejas en muchos ambientes. ya que estos compuestos no existían en la Tierra hasta hace poco más de 50 años (Madigan et al. pierden la capacidad de producir determinado compuesto. en el proceso de lixiviación de los metales.INTRODUCCIÓN Cuando se agota el oxígeno. La eliminación del petróleo o de otros contaminantes mediante el uso de microorganismos se conoce como “bioremediación” y ha sido ampliamente utilizado para descontaminar zonas donde se han producido vertidos de crudos. Nishihara et al. Una de las formas más corrientes del hierro y el azufre es la pirita (FeS2). Mediante el análisis de los genomas com8 . El hecho de que las condiciones que prevalecen en el medio marino sean difíciles de reproducir en laboratorio provoca que un elevadísimo porcentaje de estas bacterias (hasta un 99%) no haya podido ser cultivado. vegetales e invertebrados portadores de sustancias biológicamente activas. 2006). los arrecifes coralinos albergan la cuarta parte de las especies marinas del mundo (Alcolado. y con formas variadas. las esponjas. Spalding et al. los corales pétreos. además de una alta diversidad biológica. una rica fauna de peces e invertebrados. que se emplean o constituyen recursos potenciales como fármacos y reactivos de interés bioquímico. estas dos cifras arrojan un estimado grueso de ingresos de 1 319 millones de USD/año por km2 de arrecife (Alcolado 2006). 1. Además de constituir un extraordinario atractivo para el turismo de buceo. En el Gran Caribe. Más del 25% de las capturas comerciales de los países en desarrollo provienen de especies que habitan o guardan alguna relación de dependencia con ese biotopo (Jameson et al. 1995).INTRODUCCIÓN pletos se puede intentar reconstruir el funcionamiento de los microorganismos. los octocorales. y relacionarlo con los compuestos existentes en el ambiente en el que se desarrollan (López y Zaballos. (1997) los arrecifes del mundo en conjunto proveen bienes y servicios por valor de cerca de 375 000 millones de USD/año.3. científico y ético. Éstos crecen hacia la superficie y son creados por organismos fijos al fondo que forman esqueletos pétreos de carbonato de calcio. Página 9 . Arrecifes coralinos. Según Alcolado (2006) también son indicadores de la calidad de las aguas marinas y de los efectos de los cambios climáticos globales. En los arrecifes habita una gran diversidad de microorganismos. Los arrecifes coralinos. 2008). Tienen gran valor intrínseco por su carácter único. Amann y Fuchs. A pesar de su muy limitada extensión sobre el océano. masivas. las ascidias y las algas. que cubren la matriz rocosa de algunos fondos marinos tropicales y subtropicales. Características de los ecosistemas marinos. Según Costanza et al. los arrecifes coralinos poseen un gran valor educacional. y los móviles. así como su potencial fisiológico y metabólico. principal recurso turístico de la mayoría de los países caribeños. (2001) estimaron un total mundial de 284 300 km2 de arrecifes. Muchas de sus especies se utilizan para la elaboración de objetos de artesanía y bisutería. Sus barreras o crestas brindan protección a las costas contra la erosión producida por el oleaje y también protegen poblados y edificaciones de las costas. 2005. de origen biológico. los organismos fijos que los conforman son principalmente. poseen grandes valores naturales y socio-económicos. Los arrecifes coralinos son estructuras geológicas sólidas. Los arrecifes constituyen una de las principales fábricas de la arena blanca que nutre las playas. por tanto. y pH). A diferencia de los arrecifes sus aguas son menos transparentes por la mayor concentración de fitoplancton. 2006). Su existencia se debe a la relativa inestabilidad producida por un fuerte hidrodinamismo (oleaje y corrientes) que limitan la deposición de sedimentos de fango o cieno y de materia orgánica particulada. lo que lo hace portador de una notable diversidad de especies. y a menudo. También aparecen en bajos de muy escasa profundidad formando crestas que actúan como rompientes. ya que algunas enfermedades de los corales se han atribuido a la acción de microorganismos patógenos específicos (Borneman. 1959). En Cuba la composición de la arena tiende a estar dominada por restos de algas calcáreas. El biotopo arenoso o arenal puede ser: desde puramente arenoso hasta areno-fangoso. existe escasa información. en comparación con la que corresponde a los biotopos componentes. típicamente del género Solenastrea o pequeños cabezos coralinos y gorgóneas de los géneros Pterogorgia y Pseudopterogorgia entre otros. aunque en lugares específicos está compuesta mayormente por oolita (granos de arena casi esféricos que se forman por deposición de carbonato de calcio bajo condiciones físicas específicas de temperatura. fuera de las zonas pre-arrecifales y arrecifales. Algunos sitios pueden resultar de interés contemplativo para el turismo de naturaleza y la recreación (Alcolado.INTRODUCCIÓN Sobre la diversidad de bacterias y hongos en arrecifes de coral. No deben confundirse con los fondos de cabezos o de arrecifes de parche. salinidad. de moluscos y de corales. según la proporción de fango o cieno (partículas más finas). 10 . pavimento rocoso o explanada abrasiva. Se caracterizan por poseer básicamente un fondo rocoso cubierto por una capa de arena predominantemente delgada o localmente ausente. por parches de pastos marinos o de pequeños depósitos de arena. Los fondos duros no arrecifales. ni con los que algunos denominan fondos duros no colonizados o “comunidades de corales”. conocida como zona de Pseudopterogorgia (Goreau. Tiende a ser un biotopo más bien mixto a manera de mosaico. langostas y varias especies de peces. 2008). Alberga especies de corales que son muy raras en los arrecifes coralinos. el mayor énfasis se ha puesto en el estudio del efecto de los microorganismos sobre la “salud” de los arrecifes. Los fondos duros no arrecifales se localizan en las macrolagunas. Fondos de sedimentos no consolidados. Estos aparecen comúnmente dentro del perfil de los arrecifes a poca profundidad (generalmente a menos de 6 m de profundidad) y se corresponden con la terraza somera o superior. Este biotopo sostiene una pesca que incluye esponjas. Con frecuencia suelen presentar corales aislados. ya que no son arrecifes porque el cubrimiento de corales es inferior al 10%. Biotopo arenoso y de playa. e impiden el desarrollo de yerbas marinas. Estos despliegan una alta productividad neta que es exportada a los arrecifes y explotada por el hombre. En lugares afectados por altas salinidades o en médanos muy bajos sometidos a altas temperaturas suele dominar H.) o delgados tapices de microfitobentos. telestáceos. Los fangos “líquidos” son menos propicios para el desarrollo del bentos que los más compactos y estables. su productividad neta (explotable) puede ser localmente alta.INTRODUCCIÓN Debido a su inestabilidad. algunas esponjas. Syringodium filiformis y Halodule wrighti. 2006). Como su nombre lo indica. Si bien su diversidad de especies es comparativamente baja. llegando a ser casi “líquidos” cuando son pelíticos. Es típico de ambientes eutrofizados y también. son fondos de sedimentos no consolidados con desarrollo de yerbas marinas (fanerógamas) y algas. wrighti. donde la luz que llega al fondo es insuficiente para el desarrollo de pastos marinos. Su ambiente como regla es fluctuante e impredecible.0625 mm. la sedimentación excesiva y la “liquidez” del fondo suelen ser las causas que impiden el desarrollo de las yerbas marinas en ellos. el diámetro promedio de las partículas es menor de 0. Página 11 . proporciona arena para las playas y construcciones y contribuye a la formación y mantenimiento de las dunas de las playas y las cuencas arenosas. erizos irregulares y peces. Los fondos fangosos saludables son altamente productivos y constituyen una fuente de importantes recursos pesqueros como camarones.). holoturias. cangilones de arrecifes y algunas terrazas arrecifales. Ejemplos de este tipo de fondo son las playas. depósitos en lechos rocosos. mediante la descomposición de materia orgánica que produce e importa. está formado por sedimentos en que predomina la fracción fangosa o cieno. Rhipocephalus. Penicillus. genera y exporta nutrientes a otros ecosistemas marinos (Alcolado. Este biotopo. Udotea. algunos peces teleósteos. los fangos pueden ser más o menos blandos o compactos. Pastos marinos (vegetación sumergida). este biotopo se caracteriza por su relativamente baja diversidad de especies y poca productividad. moluscos y peces. En él pueden habitar macroalgas (comúnmente algas verdes calcáreas como Halimeda. Como fauna típica pueden mencionarse camarones. conocidos como seibadales. y además se caracteriza por un régimen hidrodinámico comparativamente débil. Las yerbas son principalmente Thalassia testudinum. el fondo fangoso o fanguizal. La falta de luz. es decir. de plataformas profundas protegidas. poliquetos. Los pastos marinos. Biotopo fangoso. brinda refugio y alimento a algunas especies que se entierran en la arena (rayas. Constituye un hábitat de especies especializadas. etc. médanos. etc. De acuerdo a la granulometría y la hidrodinámica local. bancos. poco profundos (menos de 2 m). Generalmente. lo que determina en parte su alta productividad biológica. Las lagunas costeras constituyen el hábitat de diferentes fases de la vida (larvas. en su mayoría.. 2006). tomando como referencia solamente su importancia en el reciclaje de nutrientes (Constanza et al. regulan la concentración de oxígeno y gas carbónico en el mar. El sedimento principal es el fango o cieno de color oscuro. Por otra parte. Las lagunas y estuarios son los ecosistemas marinos de mayor productividad pesquera. están bordeadas por bosques de mangle y pueden abundar los pastos marinos sobre todo. lisas. hacia las orillas. Poseen. sedimentos. como el manatí. corvinas. róbalos. nutrientes y materia orgánica procedentes de tierra. En ellas y su entorno suelen habitar de forma permanente o temporal numerosas especies de aves y otros organismos silvestres. principalmente Halimeda (Alcolado.INTRODUCCIÓN Los pastos marinos son la principal vía de entrada de la energía que garantiza la productividad biológica y pesquera en la plataforma cubana y constituyen una fuerte reserva ecológica de materia y energía en forma de biomasa. algunos en peligro de extinción. Las lagunas costeras y estuarios Las lagunas costeras son cuerpos de agua relativamente pequeños. 1997). permanente o temporal con el mar. considerable aporte de agua dulce. al retenerlos (efecto amortiguador). Cerca de las desembocaduras puede haber sustrato rocoso a causa de las corrientes de marea que impiden la acumulación de sedimentos. y son zonas potenciales para el desarrollo del maricultivo. Se ha estimado el valor de los bienes y servicios de los pastos marinos en unos 19 000 USD/ha año. y condicionan fuertemente los procesos biogeoquímicos locales. previniendo su erosión y la afectación de los arrecifes y de las playas colindantes. juveniles y adultos) de muchos recursos pesqueros como camarones. su degradación. y en muchos casos de la propia biota. parte de la cual es exportada a los arrecifes y al océano lo que en cierta medida aumenta la productividad de éstos biotopos. En cierta medida las lagunas costeras protegen a los ecosistemas exteriores contra pulsos de excesivos nutrientes y de sedimentos suspendidos. etc. recreativo y turístico. casi siempre con penetrante olor a sulfuro de hidrógeno. son áreas de reproducción y cría de camarones y de otras especies comerciales (Alcolado 2006). Muchas poseen gran valor paisajístico. o en caso de exceso de los dos últimos. sábalos. Se caracterizan por sufrir fluctuaciones relativamente grandes en la salinidad y temperatura. 12 . ostiones. También actúan como estabilizadores del fondo. Muchos pastos marinos son formadores de gran parte de las arenas de las playas gracias al desarrollo de algas calcáreas. con conexión limitada. y productos apícolas como miel. corvinas (Sciaenidae) y algunas especies arrecifales altamente tolerantes a diferentes salinidades como algunos pargos (Lutjanus griseus. habitan peces típicos de ese biotopo más algunas poco comunes en estos. Asociados a los manglares estuarinos prodominan los peces típicos de las lagunas costeras: robalos (Centropomidae). ramas y raíces (y su microbiota asociada). En los manglares de los cayos. apodus y L. Los bosques de manglar pueden ser monodominantes o mixtos (Menéndez-Cabrera y Priego-Santander. Entre los primeros prevalecen los crustáceos y moluscos. Asociados al bosque de manglar habita una rica fauna. como las sardinas (Clupeidae). Se localizan en las costas de origen biológico. etc. aunque también en ambientes salinos como por ejemplo. se fijan al mangle escaramujos. anémonas. donde prevalecen aguas con salinidad y transparencia más parecidas a las de los arrecifes coralinos. los cayos que bordean la plataforma submarina cubana. las cuales pasan a formar parte del detrito acumulado en los sedimentos. algunos de forma permanente (esponjas. habita una gran diversidad de organismos. mojarras. leña. Página 13 . achaparrados o enanos. otros de tránsito como peces en etapas juveniles y crustáceos. mojarras y pataos (Gerridae). taninos para curtir pieles. acumulativas.INTRODUCCIÓN Manglares. muchos de ellos formados por los propios manglares. y muchas son migratorias. ascidias. Además. La composición de la ictiofauna del manglar depende de las características ambientales de cada sitio. algunas de las cuales lo utilizan como área de anidamiento y/o refugio. La mayoría de los peces del manglar forman parte de las pesquerías que se realizan en el complejo seibadalarrecife. cera y propóleos. Sobre las raíces de los mangles y alrededor de estos. peces.). crustáceos. 1994). En la parte aérea los manglares proveen madera. como los ascidiáceos coloniales y los celenterados. Las raíces de los mangles sirven de refugio a las etapas juveniles de langostas y peces. briosos. En zonas con aportes de aguas dulces y nutrientes los bosques de mangle alcanzan 20-25 m de altura y una alta densidad. mientras que en aguas muy saladas y pobres en nutrientes pueden ser de pequeña talla. cenagosas y en esteros con escurrimientos de agua dulce. Además. jocu) o sus etapas juveniles. hidrozoos. Los manglares aportan energía al ecosistema acuático. L. lisas (Mugilidae). carbón. Las raíces de los manglares sirven de sustrato a numerosos invertebrados y peces. pataos y otros. mediante sus hojas. destacándose las aves endémicas o de hábitat reducidos. varias algas epífitas y esponjas que son hospederos de numerosos organismos. De vital importancia es la protección que brindan a la población e infraestructuras costeras contra las violentas penetraciones del mar y el efecto de los huracanes. El ambiente a que está sometida la biota en estos sitios es harto severo. fracturas. La costa rocosa baja y la costa acantilada. golpes de olas. gran diversidad de moluscos como quitones. lluvias. gozan de una gran solidez. puntas y crestas afiladas. aunque el batir constante del oleaje y el intemperismo tallan el complicado microrelieve (mezcla de grietas. están generalmente distribuidas a manera de cinturones sucesivos perpendiculares al gradiente de influencia marina y de la altura de la costa. mareas. algunas de cuyas especies resisten altas salinidades (Alcolado 2006). charcas. el viento y las corrientes costeras y filtran los contaminantes y los sedimentos evitando que lleguen a los arrecifes coralinos y otros biotopos. buzamientos. litorinas. eleótridos. y el régimen de desecación. la estación del año.INTRODUCCIÓN los manglares protegen las costas de la erosión provocada por el oleaje. Costa rocosa baja y costa acantilada.) que los caracteriza. etc. siguas. desprendimientos. Las algas en el estrato más bañado por el mar son variadas y las especies dominantes dependen mayormente del grado de eutrofización y agitación del agua. por su constitución rocosa predominantemente cársica.). etc. góbidos y ciprinodontidos. rociamiento. La flora y la fauna. En los lugares con aguas extremadamente eutrofizadas suelen ser abundantes las algas del género Ulva. Estos últimos son peces de agua dulce. En estas costas son típicos los cangrejos grápsidos. mejillones. inundación. concavidades) y macrorelieve (cavernas. neritas. este último determinado en gran medida por la inclinación y la distancia del sitio al nivel medio de las mareas. 14 . con una mezcla casi constante (pero con pulsos extremos de insolación. desecación. etc. En las charcas suelen estar presentes de manera casi siempre temporal peces clínidos. (Ed) D. J. Nature Reviews.. M. p. R. 2002. Attaway y O. España. Addison Wesley Person Education. M.R. F.L. http://www. S. Borneman. 1992. P y van . 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Capítulo 2 Técnicas de Bacteriología . . 1997) y la producción secundaria de carbono (Azam et al. Las bacterias heterótrofas contribuyen a los ciclos de carbono y nutrientes por dos vías principales: a través de la producción de biomasa bacteriana (producción secundaria) y mediante la remineralización del carbono orgánico y los nutrientes (del Giorgio y Cole. Objetivo: Determinar la concentración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas en muestras de agua y sedimentos marinos. Buffer Fosfato. Jeringuilla despuntada. reactivos. 1998). Espátulas de vidrio estériles. después de los virus.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. Placas Petri. Materiales. son capaces de utilizar la materia orgánica disuelta (MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la actividad metabólica de otros organismos heterótrofos de mayores dimensiones presentes en el ambiente pelágico (López y Zaballos. 1999) en los ecosistemas acuáticos. Tubo plástico para la toma de muestra de sedimento (“corer”). Además. Erlenmeyers. Frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. Tubos de ensayo con tapones de algodón. Este grupo de bacterias comprende una amplia diversidad de géneros y en términos numéricos de abundancia. 1952). Frascos de vidrio estériles de 50 mL de capacidad. constituyen el componente biológico más importante involucrado en la transformación y mineralización de la materia orgánica en la biosfera (Cho y Azam. Soluciones para ajustar el pH del medio. Materiales. Pipetas de 10 y de 1 mL. 2005). la población más numerosa (Marie et al. Página 21 . Reactivos y medios de cultivo. ya que controlan los flujos de nutrientes en el sistema a través de la mineralización de la materia orgánica (Schut et al. medios de cultivo y equipos empleados. 1983). Medio 2216E para bacterias marinas (Oppenheimer y ZoBell. Papel de pH. Gradillas. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas Dentro de las comunidades microbianas las bacterias heterótrofas constituyen. 1988).1. subterráneas).2 para el caso de siembra de muestras marinas. Posteriormente. Si se emplea el método de siembra en superficie (“spread plates”) se vierte el agar en las placas y se deja secar en una estufa a 45°C toda la noche antes de usarlas. 1988). (1952) está muy cargado en nutrientes e inhibe el crecimiento de bacterias oligotróficas. se puede utilizar agua destilada o agua corriente. y hasta 6. Cuando la temperatura del medio al verterlo en las placas es superior a 50°C generalmente el vapor de agua que desprende se condensa en la tapa de la caja Petri y si no se elimina esta agua puede causar un crecimiento continuo o mezclado de colonias sobre el medio. Después de esterilizar el medio a 121°C 15 min el pH debe ajustarse hasta 7. Actualmente se considera que el Agar marino comercial desarrollado a partir de Oppenheimer y ZoBell. Autoclave. Detalles experimentales.1 mL de la dilución apropiada. 1982). Austing y Allen.9 para muestras de aguas interiores. utilizando una espátula de vidrio estéril. Medio 6 (Gorbienko. 1961). se extiende por toda la superficie del medio un volumen no mayor a 0. 1952). En la preparación del medio de cultivo cuando se va a trabajar con muestras de aguas marinas se puede emplear agua de mar sin diluir (salinidad promedio entre 32 y 35 °/oo). Cuando se trata de bacterias aisladas de aguas interiores (lagos. por lo que se han desarrollado una variedad de medios con bajas concentraciones de nutrientes para aislar este tipo de bacterias (Weiner et al. ríos. Para el recuento y aislamiento de bacterias heterótrofas se pueden utilizar varios medios de cultivo: 2216E (Oppenheimer y ZoBell.0-7. etc. lo que impide el recuento de colonias individuales y/o el aislamiento de cultivos puros (Schneider y Rheinheimer. o diluida con agua corriente (750 mL agua de mar y 250 mL de agua corriente). 22 . Agar marino. 1980. Baño termostatado. Cuando se siembra una porción o dilución de la muestra por vertido en placa (“pour plates”) se debe tener en cuenta que el medio de cultivo tenga la temperatura apropiada (entre 42°C y 45°C) para evitar la muerte de las células por exceso de temperatura. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Equipos. en dependencia de la salinidad del lugar de aislamiento. Incubadora bacteriológica. es decir. según el tipo de agua (Tabla 2). Muestras de agua de mar. 1986). Tabla 2. es decir. y se deja solidificar. en agua de mar estéril. y se realiza el conteo de colonias a las 24. 10-7 siduales sin tratamiento Nota: Dilución 10-1 es igual a 1/10. 10-5 nadas o aguas residuales tratadas Aguas contaminadas o aguas re10-4. en este caso). Página 23 . 1 mL de muestra en 9 mL de diluyente (agua de mar estéril. 1 mL de muestra en 99 mL de diluyente. 10-5. De cada muestra o dilución se vierte 1 mL en placas Petri (Colwell y Grigorova. A partir de cada muestra de agua se hacen las diluciones a conveniencia. 10-6. se añaden de 12 a 15 mL del Medio 2216E para bacterias marinas heterótrofas (Oppenheimer y ZoBell. 10-3. 1952) previamente fundido y mantenido en un baño de María a una temperatura de 43-45°C. Método de siembra por vertido en placa (“pour plates”). teniendo en cuenta el rango óptimo de temperatura para el crecimiento de bacterias mesófilas (entre 25 y 40°C) y la temperatura del agua en el lugar donde se tomó la muestra.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Procedimiento. Seguidamente. 10-4 Aguas moderadamente contami10-2. Se debe preparar una placa “control” conteniendo únicamente el medio de cultivo y una segunda placa “control” conteniendo el medio de cultivo y el agua de dilución. Las placas se incuban a la temperatura seleccionada. Se mezcla los volúmenes de muestra (o dilución) añadidos con el medio de cultivo mediante movimientos suaves y rotatorios de la placa. Diluciones recomendadas según el tipo de muestra Tipo de muestra Aguas superficiales limpias Diluciones 10-1. dilución 10-2 es igual a 1/100. y así sucesivamente. excepto en el caso de que el medio inoculado con 1 mL de agua no diluida contenga menos de 30 colonias. 10-4. Las muestras de agua se colectan preferiblemente por triplicado utilizando frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. 10-2. 10-3. 48 y 72 h de incubación con ayuda de un contador de colonias o empleado un microscopio estereoscópico. Se recomienda contar las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias. hasta 10-6 u otra dilución mayor si se cree conveniente. sino también del medio de cultivo empleado. Es importante que la superficie esté bien seca para que el líquido que se extiende por la superficie empape rápidamente el medio. y se procede igual que se describió para la siembra de muestras de agua anteriormente. El conteo de viables se expresa como “unidades formadoras de colonias”. sobre el medio ya solidificado y se riega sobre la superficie con la ayuda de una espátula de vidrio estéril (espátula Drygalski). Muestras de sedimentos. Durante esta operación. También se puede emplear ultrasonido para la separación de las células adheridas a las partículas (Torreton. se cuentan las colonias crecidas en las placas. Para el cálculo del número de unidades formadoras de colonia por mililitro. o directamente de la capa superficial. 1991). No todas las células desarrollarán las colonias al mismo tiempo ni del mismo tamaño. si hay interés en seleccionar una profundidad específica. o de la dilución. las placas se pueden conservar en refrigeración hasta que se efectúe el conteo siempre que este período no exceda las 24 h. 24 . por lo que deben establecerse bien estos requisitos para evitar errores. se calcula la media aritmética entre las réplicas y se multiplica el promedio del número de colonias por el reciproco de la dilución usada. El número de colonias obtenido en un conteo de viables depende no sólo del tamaño del inóculo. Se agita por unos minutos el tubo en un “vortex” para propiciar la separación de las células de las partículas de sedimento y se deja reposar por 2 o 3 min. la temperatura y el tiempo de incubación. Si la siembra es “en superficie” se vierte 0. Método de siembra en superficie (“spread plate”). A partir del sobrenadante se hacen diluciones seriadas en agua de mar estéril o Buffer Fosfato. en lugar de células viables. ya que una unidad de colonia puede contener más de una célula. Conteo y cálculos. Los sedimentos se colectan con un tubo plástico o “corer”. se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 50 mL de capacidad. De cada muestra se toma 1 cm3 con una jeringuilla despuntada estéril y se añade a un tubo conteniendo 10 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato. debe tenerse cuidado de no romper la superficie del agar.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Si el conteo no se realiza inmediatamente después del tiempo de incubación. Los resultados se reportan en Unidades Formadoras de Colonias por mililitros (UFC/mL) para las muestras de agua.1 mL de la muestra. Página 25 .110°C. para lo cual: 1g UFC/g (peso seco) = UFC/g (peso húmedo) x ------------------------------Peso seco de la muestra (g) El procedimiento habitual es determinar el peso seco después de secar las muestras durante una noche a 90 .TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA En el caso de las muestras de sedimentos se puede dar el resultado en UFC/g de peso húmedo o de peso seco. La masa seca de las células bacterianas es aproximadamente. entre el 10 y el 20% de la masa húmeda. H. 1961. 1988. 345-360. Marine Sciences.T. 26 . Brussaard. y Allen. Meyer-Reil. Cho.C. A. Methods in Microbiology. y Grigorova. Major role of bacteria in biogeochemical fluxes in the ocean´s interior. Aquaculture. J. http://www. Acad.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA Austin. y ZoBell. The growth and viability of sixty three species of marine bacteria as influenced by hydrostatic pressure. Fashman (ed. 1999.M. 2005/2.. R. Azam. 1983. R. 26:369-383. J. Zaballos M. 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Enumeración de bacterias sulfatoreductoras Las bacterias sulfatoreductoras (BSR) son una de las formas de vida mas antigüas del planeta. Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad. agrupadas por la característica común que tienen de usar el sulfato como aceptor terminal de electrones durante la respiración anaerobia. por tanto. Tubos con tapas de rosca. 1985). 2003). 1988). el hecho de poseer enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa les permite sobrevivir en agua de mar oxigenada hasta niveles de tolerancia específicos de cada cepa (Cypionka et al. 2004). >2mM SO42-). Objetivo: Determinar el número de bacterias sulfatoreductoras en muestras de aguas y sedimentos marinos por el método de Número Más Probable. Sin embargo. toxicidad y pérdidas en las industrias del petróleo y gas donde se utilizan grandes volúmenes de agua de mar como lastre y para el mantenimiento de la presión (Battersby et al. en estos sedimentos los sulfatos no son limitantes (aproximadamente. predomina la respiración anaerobia mediante sulfatos como aceptor de electrones. para poder crecer. La ubicuidad de las BSR en el agua de mar ha producido problemas de corrosión. Pipetas estériles de 10 y 1 mL. medio de cultivo y equipos empleados. Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el océano removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega al mar cada año por el aporte de los ríos debido al escurrimiento terrígeno (Battersby. Las BSR son anaerobias y requieren un potencial redox bajo (alrededor de -100 mV). 1985). reactivos. Constituyen un grupo diverso de bacterias con capacidades metabólicas diferentes.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. Materiales. pudiendo llegar a representar el 50% de la mineralización de carbono orgánico.2. Materiales. datan de al menos 2. Las BSR son abundantes en fondos fangosos con o sin vegetación (Smith et al.72 mil millones de años (NAI. siendo mas activas en los 20 cm superiores de los sedimentos costeros donde hay abundantes sulfatos y condiciones reducidas de potencial redox. Generalmente. y se emplea la metodología de diluciones seriadas en tubos múltiples para determinar el Número Mas Probable (NMP). Buffer Fosfato. se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio API. Jarra mezcladora estéril. se le añade 10 mL de medio API a la primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes de tubos (diluciones 1/10 y 1/100. En este acápite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute) recomendado por Overzil.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Reactivos y medio de cultivo. por tanto. o en zaranda por 15 min. Medio API (Overzil.1g. 1:1000. 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de cinco tubos estériles y posteriormente. se toman 50g de muestra del horizonte seleccionado. se preparan las restantes diluciones decimales: se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato. Zaranda. éstos constituyen las porciones de 0. Detalles experimentales. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución. así sucesivamente. Se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min.001g. Posteriormente.01g. Equipos. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos a los cuales se les añaden 10 mL de medio API. El sustrato es el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR procedente de aguas marinas o de otro medio en particular. La mayoría de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35°C. (1970). Se cierra cada tubo con tapa de rosca y después de rotularlos convenientemente. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100. 1970). Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilución 1:10 se les añaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. respectivamente). aunque usualmente se cultivan a una temperatura de incubación de 30°C. 1:10000. Se incuban los tubos a 30°C Página 29 . y se suspenden en 450 mL de agua de mar estéril o en Buffer Fosfato. existen varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR. 1 y 0. Incubadora bacteriológica. se incuban a 30°C de 2 a 4 semanas. En el caso de que sean muestras de sedimento. Se inoculan 10. Procedimiento.0001g y demás respectivamente. Debe prepararse un tubo “control” sin inóculo. obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. A partir de esta dilución. Se consideran positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro. hasta la última dilución empleada y se inocularán en tubos que se llenan con el medio API. se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. 0. éstos constituyen las porciones de 0. .1g + + + . Resultado del peso seco obtenido = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x ----------------------Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.2. La Tabla de NMP también puede ser utilizada cuando volúmenes mayores y menores de la muestra son inoculados. se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo de peso húmedo.. inoculado seleccionado para conformar el código Ejemplo: Porciones en los tubos inoculados NMP del Código 530 80 A B C D E Cálculo NMP/100g 1g + + + + + 5 0. un cambio de coloración del medio de rojo a negro se considera positivo.0 80x10/1 = 800 + : tubos con cambio de color de rojo a negro . 30 . y en el caso de los sedimentos. verificándose el valor de NMP correspondiente a el..TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua.. En este caso se procesa un código formado por los números de tubos con resultados positivos para BSR obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas.3 0. Para el cálculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimentos.01g . NMP/ g (peso húmedo) = 8. Conteo y cálculos La densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra. el NMP/100g será dada a través de la siguiente fórmula: NMP correspondiente al código x 10 NMP/100g (peso seco)= ----------------------------------------------------Mayor vol.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se expresará como <0.: tubos que no muestran cambio de color del medio NMP/100g (peso húmedo) = 800. 37. .J. D. 269-297. En: Methods in Aquatic Bacteriology. Journal of Applied Bacteriology. Quantitative erfassung sulatre-duzlerender. NAI (NASA Astrobiology Institute). Aquatic microbial ecology. Survival of sulfate-reducing bacteria after oxygen stress. http://ciencia. y Yates. Symposium Supplement.org/nasa. D. N. (11) 124: 91-96. p. Sulphate-Reducing Bacteria. W 1970. Seasonal composition and activity of sulfate-reducing prokaryotic communities in seagrass bed sediments. 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Las bacterias coliformes son un grupo grande y heterogéneo de bacilos gram negativos.2°C en las primeras 48 h de incubación. dentro de él. por lo que su presencia puede tomarse. exposición a la penicilina) aparecen formas filamentosas largas. Sin embargo. están formados por Escherichia coli y ciertas especies del género Klebsiella. Indican que hubo fallas en el tratamiento. las vías biliares. CYTED. en la distribución o en las propias fuentes domiciliarias de agua. Cuando están suficientemente diluidas en una gran masa de agua las bacterias coliformes fecales sobreviven sólo por lapsos cortos de tiempo. pero en adición. Debido a que los coliformes fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de animales de sangre caliente. provocando inflamaciones en estos sitios (Jawetz. estos son capaces de crecer y fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 ± 0. cumplen todos los criterios usados para definir los coliformes totales. particularmente las vías urinarias. Son bacilos cortos que pueden formar cadenas y en condiciones de cultivo desfavorables (por ejemplo. Estas bacterias se transforman en patógenas cuando alcanzan tejidos fuera del intestino. e intensifica la vigilancia en las redes de distribución (CYTED. Dentro de los coliformes se agrupan: Escherichia coli. el peritoneo o las meninges. Las bacterias coliformes constituyen una gran parte de la microbiota normal aerobia del intestino. estos microorganismos por lo general no provocan enfermedades y pueden incluso contribuir al funcionamiento normal y a la nutrición. En las aguas la presencia de coliformes totales funciona como una alerta de que ocurrió contaminación. Su presencia acciona los mecanismos de control de calidad y de procesamiento dentro de las plantas de tratamientos de agua. 1985). Enumeración de bacterias coliformes totales y fecales. en algunos ríos y puertos que están muy 32 . 2002). Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en heces fecales. 2002). anaerobios facultativos y asporógenos que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. sin identificar el origen. Edwarsiella y Citrobacter. se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal (WHO. los pulmones. Por otra parte. por lo general. como evidencia de contaminación reciente.3. Klebsiella y Enterobacter. Actualmente dicha agrupación incluye a los integrantes llamados organismos paracólicos: Serratia. los coliformes fecales. 1999. Por esta razón. reactivos. Agua de mar estéril. Materiales. Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad estériles. Baño termostatado. Tubos Durham. Reactivos y Medios de Cultivo. medios de cultivo y equipos empleados. Equipos Jarra mezcladora. Gradillas. Objetivo: Determinar el número de bacterias coliformes totales y fecales en muestras de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones seriadas en Tubos Múltiples. Buffer Fosfato. al cual se ha añadido un indicador de pH. Materiales. entre otras. 1985). riverinas. residuales. Norma mexicana. Caldo Bilis Verde Brillante (Brilliant Green Lactose Broth). Caldo EC (EC Broth). Frascos de vidrio de 250 mL de capacidad estériles. las bacterias coliformes no sólo sobreviven. Se utiliza el método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio líquido y el cálculo del Número Más probable (NMP). Este procedimiento se puede aplicar para muestras de agua de diferentes fuentes: marinas. solución salina o agua peptonada. Tubos de cultivo con tapón de algodón. a una temperatura de 35 ± 2°C. En la actualidad muchos países consideran las bacterias coliformes como indicadores de la calidad higiénico sanitaria en las aguas costeras que se usan para el baño. potables. sino que mantienen una población significativa mediante multiplicación lenta a partir de substancias orgánicas (Jawetz. El método se basa en el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Lactosado. 2004).TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA contaminados con las aguas del desagüe urbano. Detalles experimentales. Incubadora bacteriológica. Caldo Lactosado (Lactose Lauryl Tryptose Broth). aunque las concentraciones permisibles para estos microorganismos varían ligeramente de un lugar a otro (Norma cubana NC: 22-1999. Pipetas de 10 y 1 mL estériles. donde el cambio Página 33 . obteniéndose una dilución de 1:10. Posteriormente. 10-3.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA de color del medio evidencia la presencia de microorganismos del grupo coliformes.D-glucoronido (MUG). el ONPG es metabolizado. 2000). 10-5. 10-3. Actualmente. Preparación de las diluciones decimales. pero sólo puede considerarse una información preliminar (presencia-ausencia). Tabla 3. Diluciones recomendadas según el tipo de agua a analizar Tipo de muestra Aguas superficiales limpias 0 -1 Diluciones 10 . 10-4. 10-6 nadas o aguas residuales tratadas Aguas contaminadas o aguas re10-3. De ser necesarias más diluciones se seguirá el mismo procedimiento (Se utilizará una pipeta para cada dilución). Si los coliformes están presentes.10 . resultando un color amarillo. 10-4 Aguas moderadamente contami10-2. Este primer paso se conoce como “prueba presuntiva”. se hace una “prueba confirmativa” de la presencia de coliformes mediante la siembra de una asada tomada de los tubos que dieron positivos en la prueba anterior. Las diluciones se harán en dependencia del tipo de agua a analizar. en tubos con Caldo Bilis Verde Brillante. será degradado el MUG a un producto fluorescente que puede detectarse por observación en luz UV de larga longitud de onda. y se obtiene una dilución 1:100. 10-2. se mezcla grandes volúmenes de muestra de agua (100 mL) en una botella de cultivo con Caldo Lactosa Lauril Triptosa (LLTB) triple fuerza. En estas pruebas. Si hay presencia de E. se toma 1 mL y se lleva a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de la dilución. coli. puede usarse la prueba del Colilert que consiste en mezclar 100 mL de muestra de agua con un medio que contiene como únicos nutrientes orto-nitrofenilβ. 34 . fermentan la lactosa produciendo ácido y gas y cambiando de color el medio de púrpura a amarillo. 10-4.D-galactosido (ONPG) y 4-metil umbeliferil-β. Procedimiento Determinación del Número Más Probable de Coliformes totales en muestras de agua por el método de diluciones seriadas en tubos múltiples. se homogeniza. Como indicador de pH se añade bromocresol púrpura. Para detectar coliformes y Escherichia coli. La turbidez y presencia de gas confirma la existencia de coliformes totales en la muestra analizada (González et al. 10-6. 10-7 siduales sin tratamiento Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un tubo de ensayo con 9 mL de agua de mar estéril. para detectar la presencia de coliformes existen algunos ensayos menos complejos que permiten obtener los resultados más rápidos. Si los coliformes están presentes. Se homogeniza. solución salina o agua peptonada. 10-5. Para agua de mar se realiza además lo siguiente: se toman 5 mL de agua y se añade 1 mL en cada uno de los tubos con medio a simple concentración de la segunda hilera y se toman 0.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Prueba presuntiva.5 mL de muestra y se añade 0. Cuando descargue las porciones de muestra. Se repite cinco veces este procedimiento. Página 35 . Tome precauciones cuando retire la pipeta del pipetero. se inoculan porciones de la muestra y sus diluciones respectivas. para evitar contaminaciones.48 h. utilice un inoculo de 0. Cuando se analiza agua no tratada. • 1.1 mL de la muestra original o prepare una dilución adecuada. La producción de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido Durham dentro de las 48 ± 3 h es considerada una fase confirmativa positiva. • 2. La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una reacción presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa.1 mL en cada tubo de la tercera hilera con medio Caldo Lactosado de simple concentración. Prueba confirmativa. Se incuban los tubos entre 35 ± 0.5°C durante 24 . Si la pipeta se contamina antes de que la transferencia se haya completado. Se incuban de 35 ± 0. A partir de cada uno de los tubos presumiblemente positivo en Caldo Lactosado. Recomendaciones importantes. se reincuban y se examinan nuevamente después de otras 24 h (48 en total). Cuando remueva la muestra.5 cm por debajo de la superficie de la muestra.5°C por 48 h y se observa la producción de gas. Se toman 10 mL de muestra empleando una pipeta estéril graduada de 10 mL y se transfieren a un tubo de ensayo que contenga 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentración y se mezcla el contenido. se inoculan con un asa de platino tubos que contengan Caldo Bilis Verde Brillante y tubos de fermentación Durham invertidos. • 3. En el examen de residuales o de agua turbia. reemplace con otra pipeta estéril. Utilice una pipeta estéril para la inoculación de cada tubo. sostenga la pipeta en un ángulo de aproximadamente 4°C. con la punta tocando el cuello del tubo de ensayo. no inserte las pipetas mas de 2. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido algún cambio de color y turbidez. No arrastre la punta de la pipeta sobre la parte final expuesta de las otras pipetas del pipetero o sobre los bordes y cuellos de los tubos de la dilución. Para formar el código se seleccionan las diluciones según los números de tubos positivos y negativos obtenidos en las tres series de diluciones consecutivas inoculadas. La producción de gas en un tubo de fermentación Durham dentro de 24 h o menos se considera una reacción positiva. en un baño termostatado a 44.0 520 50 Se selecciona la serie donde los tubos sean positivos en su mayoría y las dos diluciones siguientes para formar el código.5 + 0.. La densidad de coliformes (totales y fecales) se expresa como el NMP de coliformes totales o fecales. a un nivel por encima del medio de cultivo.. según se trate..1°C durante 24 .. por 100 mL de la muestra de agua.2 0.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA • 4. que el tiempo entre la inoculación de la primera muestra y la última no excedan los 20 min (Preferiblemente 10 min).48 h.. Se incubaran a 44.. Límite del número de muestras a ser analizadas de forma tal.1mL + + . Antes de la inoculación los tubos se mantendrán sumergidos. 36 . se inoculan con un asa tubos que contengan caldo EC y tubos de fermentación Durham. Cálculos y expresión de los resultados.5 oC durante 30 min.01mL . Determinación del Número Más Probable de Coliformes fecales. A partir de cada uno de los tubos gas positivos en Caldo Bilis Verde Brillante. El NMP/100 mL de agua se obtendrá a través de la siguiente fórmula: NMP correspondiente al código de la tabla x 10 -----------------------------------------------------------------Mayor volumen inoculado seleccionado para formar el código NMP/100 mL = Ejemplo 1: Volúmenes de agua inoculados Tubos A B C D E Cálculo NMP/100mL 50x10/1 = 500 Código NMP 1mL + + + + + 5 0. TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Ejemplo2: Volúmenes Tubos de agua A B C D E inoculados 10 mL 1 mL 0.1 mL 0.01 mL +++ +++ + - + - + + 5 - 3 - 1 - 1 Cálculo NMP/100mL 140x10/10 = 140 Código NMP }2 532 140 En este ejemplo el resultado positivo de la última dilución se adiciona al de la serie anterior para formar el código. Determinación de Coliformes totales y fecales en muestras de sedimentos Preparación de las diluciones decimales. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminación de la muestra. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución. Prueba presuntiva. Se inoculan series de cinco tubos (a, b, c, d, e) de Caldo Lactosado con tubos de fermentación de Durham invertidos. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilución 1:10 contienen 10 mL de Caldo Lactosado de doble concentración y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos que contienen 10 mL de Caldo Lactosado de simple concentración, éstos constituyen las porciones de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100, 1:1000, 1:10000, así sucesivamente hasta la última dilución empleada y se inocularán respectivamente en tubos con Caldo Lactosado de simple concentración y con tubos de Durham invertidos, éstos constituyen las porciones de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente. Se incuba a 35 ± 0.5°C. Después de 24 ± 2 h se observará si hay presencia de ácido o gas en los tubos invertidos, si no hay, se reincuban hasta las 48 ± 3 h. La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una reacción presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa. Página 37 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Prueba confirmativa De todos los tubos que resultaron positivos en la fase presuntiva se toma muestra con asa de platino y se inoculan tubos conteniendo Caldo Bilis Verde Brillante. Se incuban los tubos a 35 ± 0.5°C por 48 ± 3 h. La producción de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido de Caldo Bilis Verde Brillante dentro de las 48 ± 3 h es considerada una fase confirmativa positiva. Se calcula el valor NMP del número de tubos positivos de Caldo Bilis Verde Brillante. Cálculos y expresión de los resultados La densidad de coliformes totales se expresa como el NMP de coliformes totales por g de peso seco. NMP correspondiente al código x 10 NMP/100g (peso seco) = -----------------------------------------------------Mayor volumen inoculado seleccionado para conformar el código Ejemplo 1: Volúmenes de agua inoculados Tubos A B C D E Cálculo NMP/100g 80x10/1 = 800 Código NMP 1g + + + + + 5 0.1g + + + - - 3 0.01g - - - - - 0 530 80 + presencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante - ausencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante NMP/100g (peso húmedo) = 800 NMP/ g (peso húmedo) = 8 Resultado del peso seco obtenido (ejemplo) = 0.4g 1g (peso seco) NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x ----------------------Peso seco (g) Por tanto: NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se expresará como <0.2. 38 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA Clark, J.A. 1990. The presence- absence test for monitoring water quality. En: Drinking Water Microbiology. [Ed] G.A. McFeters. Springer- Verlag, New York, 369-411. CYTED. 2002. Indicadores de Contaminación fecal. Agua potable para comunidades rurales, rehúso y tratamientos de aguas residuales domésticas. Red Iberoamericana de Potabilización del Agua. 224-229. González M.I., Suárez M., Torres V Cisneros E., Sentmanat L.H. y Leyva .T., Y. 2000. Manual de técnicas microbiológicas para el control sanitario de aguas mineromedicinales y peloides. Ciudad de la Habana, INHEM, 122 pp. ISO 9308-2:1990. Water quality-Detection and enumeration of coliform organisms, termotolerant coliform organisms and presumptive Escherichia coli - Part 2: Multiple tube (most probable number) method. 4 pp. Jawetz, E. 1985. Microbiología de ambientes especiales. En: Manual de Microbiología médica. p. 90-92. Norma Cubana NC: 22:99. 1999. Lugares de Baño en costas y en masas de aguas interiores. Requisitos Higiénicos-Sanitarios. Norma Mexicana. 2004. Lineamientos para determinar la Calidad de agua de Mar para uso recreativo con contacto primario. Secretaría de Salud, Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. 15 pp. Rojas, N. y Coto, O. 1989. Familia Enterobacteriaceae. En: Temas de Microbiología Clínica. T. I. p.38-40. World Health Organization. 1998. Guidelines for Safe Recreational-water Environments: Coastal and Freshwaters. Consultation Draft. Geneva. World Health Organization. 1999. Health-based Monitoring of Recreational Waters: The Feasibility of a New Approach (The “Annapolis Protocol”). Protection of the Human Environment Water, Sanitation and Health Series. Geneva. 50 pp. Página 39 Enumeración de estreptococos fecales. Los enterococos fecales son un subgrupo de los estreptococos fecales. Los estreptococos fecales son cocos Gram positivos. anaerobios facultativos que se agrupan en cadenas cortas. aunque con frecuencia se encuentran en infecciones urinarias. carnes. las transfieren a placas de Agar Bilis-Esculina-Azida e incuban a 35 °C entre 1 y 4 h. catalasa negativa.6. catalasa negativos y que hidrolizan la esculina. 2002). Para la detección y enumeración de estos microorganismos se utiliza el método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio líquido y el cálculo del Número Más Probable (NMP). que generalmente se usa para referirse a las especies Enterococcus faecalis y sus variedades. Tejedor et al.5% de cloruro de sodio y a pH 9. Aunque este grupo de microorganismos ha sido utilizado por las autoridades sanitarias de diferentes países para evaluar la calidad sanitaria de sus aguas costeras. Hidrolizan la esculina y algunas especies resisten calentamiento a 60 °C por 30 min. los consideran estreptococos fecales. productos lácteos. en concentraciones de azida de sodio inhibitorias para organismos coliformes y otras bacterias Gram negativas y a temperatura de 45 °C. crecen en Caldo Nutriente conteniendo 6. El hábitat de los estreptococos fecales es el intestino de humanos y muchos animales de sangre caliente. Según Suárez (2002) se ha propuesto que sea adoptado el término “enterococos y estreptococos intestinales”. las cuales tienen mucha importancia clínica. leche. Las colonias crecidas formadas por cocos gram positivos. ya que las especies de origen fecal o intestinal pertenecen principalmente a los géneros Enterococcus y Streptococcus.4. 2004). aguas y suelos (Suárez. 40 . pares y células simples. aunque también puede emplearse la técnica de Filtro de Membrana y por vertido en placa. (2005) incuban las membranas en Agar Slanetz a 37 °C por 24 h. Pueden crecer en presencia de sales biliares. y a E. El método de Tubos Múltiples se basa en el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Azida-Dextrosa donde el cambio de color del medio de púrpura a amarillo evidencia la presencia de este tipo de microorganismo. no móviles. en los últimos años se ha incrementado la utilización de los enterococos fecales en lugar de los estreptococos (Secretaria de Salud. faecium. en dependencia del tipo de muestra a analizar.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. Si no se procesa inmediatamente. Incubadora bacteriológica. Procedimiento . Buffer Fosfato. para minimizar los cambios en la población microbiana y si la muestra ha sido mantenida en frío. el tiempo máximo recomendado es de 24 h. Reactivos y medios de cultivo. Pipeta de 0. Agar Slanetz-Bartley . El análisis debe realizarse tan pronto como sea posible. Frascos de vidrio estériles de 250 mL . Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un tubo de ensayo con 9 mL de solución salina. Placas Petri.1 mL. Caldo KF 1. Caldo Azida-Dextrosa a simple concentración. Gradillas. Pipeta de 10 mL.5 concentrado y de simple concentración. La colecta de las muestras de aguas se debe realizar con frascos de vidrio estériles. Agar Tristona Soya (ATS). la muestra deberá permanecer refrigerada (sin llegar nunca a la congelación) hasta el momento de su procesamiento. Colecta de las muestras de aguas. medios de cultivo y equipos empleados Materiales.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Objetivo: Determinar el número de estreptococos fecales en muestras de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones seriadas en Tubos Múltiples. Determinación del Número Más Probable de estreptococos fecales en muestras de aguas marinas. Equipos. Tubos de ensayo. Caldo Azida-Dextrosa a doble concentración. reactivos. agua de mar estéril o agua peptoPágina 41 . Materiales. preferiblemente durante el horario de marea baja. Caldo Corazón. Caldo Etil Violeta Azida o Medio selectivo para enterococos Pfizer (PSE). Preparación de las diluciones decimales. según el número de tubos utilizados como réplicas. se toman otros 0. Se homogeniza. se toman 5 mL de la muestra y se añade 1 mL a cada uno de los tubos de la segunda hilera con medio de simple concentración y a continuación. Se recomienda marcar cada tubo de la serie con el número de la muestra y dilución. Seguidamente. A partir de la muestra de agua se toman 5 porciones de 10 mL cada una. para evitar confusiones entre diluciones. se homogeniza. se re-incuban y se examinan nuevamente después de otras 24 h (48 en total). El cambio de color de amarillo a púrpura dentro de las 48 h del ensayo. A partir de los tubos considerados positivos se conforma el código y se consulta la tabla de Número Más Probable (NMP) que corresponda. Se homogeniza el contenido. Al cabo de 24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido cambio de color.5 mL de muestra y se añade 0. empleando pipetas estériles graduadas de 10 mL. constituye una prueba presuntiva positiva. 42 . se toma 1 mL y se añade a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de disolución. obteniéndose una dilución 1:10. Cálculos. cuidando utilizar una pipeta para cada dilución.5 °C . Prueba presuntiva. y se obtiene una dilución 1:100. De ser necesaria mas diluciones se seguirá el mismo procedimiento. En el caldo la respuesta positiva se manifiesta por presencia de turbidez y un botón color púrpura en el fondo del tubo y en el medio PSE por la presencia de colonias marrón con halos marrones. y se transfieren a tubos de ensayo que contienen 10 mL de Caldo Azida-Dextrosa de doble concentración. Los tubos se incuban a 35 oC durante 48 h y las placas con medio PSE durante 24 ± 2 h.durante 48 h. Se incuban todos los tubos a 35 ± 0. Prueba confirmativa Se toma con un asa muestra de los tubos que dieron positivos en la fase presuntiva y se siembra en Caldo Etil Violeta Azida o en medio selectivo para enterococos Pfizer (PSE). Dicho rotulo deberá hacerse en dirección vertical.1 mL de la misma en cada tubo de la tercera hilera con medio de simple concentración.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA nada. 01 mL. Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min. se homogeniza el contenido obteniéndose así la dilución 1:100. Se incuban a 37 °C por 24 h y a partir de cada colonia crecida en Caldo Corazón realizar las siguientes pruebas: • Coloración de Gram (cocos Gram +.01 y 0. 0. pero el medio utilizado es Caldo KF 1. Las placas se incuban a 37 °C 48 h. Si se usaron para la siembra porciones de 1.001 mL la cifra de la tabla se multiplica por 100. el NMP se calcula por la tabla y se registra multiplicando por 10 la cifra correspondiente. Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de contaminación de la muestra.5 concentrado y de simple concentración. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato.0. Fase presuntiva. Preparación de las diluciones decimales.1 y 0. Se incuba a 37 °C por 48 h. De las colonias crecidas. se seleccionan al menos tres colonias y se siembran cada una en Caldo Corazón. De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva se toma muestra con un asa y se siembra por estrías en placas de Agar Slanetz-Bartley. Se procede de igual forma que se explica para las muestras de agua. obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. La aparición de una coloración amarilla en los tubos de Caldo KF debido a la producción de ácido indica una reacción positiva. o en zaranda por 15 min. Fase confirmativa. Página 43 . 0. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Los resultados del NMP de estreptococos fecales se expresan en NMP por 100 mL. o si se usó una combinación en porciones de 0. • Siembra en placas de Agar Nutriente para la prueba de Catalasa (-).1. Determinación del Número Más Probable de Estreptococos fecales en muestras de sedimentos. mayormente en pares ó cadenas cortas). TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA • Crecimiento en Agar Bilis Esculina (+).5% de cloruro de sodio (+ o -).2. 44 . Cálculos La densidad de estreptococos fecales se expresa como el NMP de estreptococos fecales por gramo de peso seco. El cálculo se realiza de acuerdo al resultado de la fase confirmativa y se expresa según se explica en el Cap. • Crecimiento a 45 oC (+).3 para muestras de sedimentos. • Crecimiento en medio con 6. . Morín. 2005. M. C. M. y Martín. M. M..L. Norma Cubana NC: 22-1999.. Lineamientos para determinar la calidad de agua de mar para uso recreativo con contacto primario.T. Cisneros. Higiene. Suárez. T. 2002. Revista Cubana de Higiene y Epidemiología 40 (1): 38-43. España). C. Nac. Torres. Tejedor M. Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA González. México. y Senmanat. Fernández. Manual de técnicas microbiológicas para el control sanitario de aguas mineromedicinales y peloides. Tendencia actual del Estretococo como indicador de contaminación fecal. Secretaría de Salud.. Cuba. M. Higiene y Sanidad Ambiental. Pita. 5:120-122 Página 45 .. Lugares de Baño en costas y en masas de aguas interiores. González. 2004. L. Requisitos Higiénicos-Sanitarios. Inst.. Suárez.. Calidad bacteriológica de las aguas de playas en Gran Canarias (Islas Canarias. L. Viera. 1996. Epidemiología y Microbiología. 13pp. M. E. I. cicloparafinas. Corynebacterium y Mycobacterium. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos. así como. 2000). ésta solo se corresponde con el 1 % de la población heterótrofa total en ecosistemas no contaminados y puede alcanzar hasta un 10 % cuando ocurre un derrame de petróleo (Venosa et al. entre las levaduras los géneros Candida y Rhodotorula son los más representativos. 1993). Acinetobacter. seguido por los aromáticos. agua y biomasa microbiana. efectivo y económico para la eliminación final de los hidrocarburos no volátiles del petróleo presentes en el medio marino. Achromabacter. está ampliamente representada en diversos géneros. es el mecanismo más importante. y policíclicos aromáticos de cadenas largas (Prince. Penicillium y Aspergillus. Cuando se trata de petróleos pesados se mantiene esta secuencia de degradación incluidas las resinas y los asfaltenos. mientras que entre los hongos filamentosos los más frecuentes son Cladosporium. La capacidad de los microorganismos biodegradadores de petróleo y sus derivados tiene implicación práctica para el saneamiento de ambientes impactados por petróleo. Entre las bacterias hidrocarbonoclastas marinas que refiere la literatura especializada se incluyen los géneros Pseudomonas. Bajo su acción se ponen en juego múltiples reacciones de oxidación que conducen a la formación de hidrocarburos de menor peso molecular. Las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en el petróleo determinan una alta especificidad en el proceso de oxidación microbiana (Jackson y Pardue. en la transformación de esteroides. en la obtención de biomasa microbiana y solventes. La biodegradación o bioxidación. En el ambiente marino las n-parafinas son degradadas más rápidamente. Bacillus. La microbiota marina capaz de utilizar los crudos o fracciones refinadas del petróleo como única fuente de carbono y energía. 1999). compuestos de alto peso molecular (Haines et al.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. 46 . en la industria de extracción de crudos (donde se emplean directamente o sus metabolitos). Flavobacterium. 1996). Sin embargo. isoalcanos. Rhodococcus.5. tanto en aguas marinas como interiores. además de la formación de dióxido de carbono. 1968) y en agar –petróleo (Finnerty y Singer. y se incuban todas las placas a 28º C ± 2 por 72 h. Luego de 15 días de incubación. Procedimiento. Equipos. se hacen diluciones seriadas en agua de mar estéril hasta 1:100 y se siembra 1 mL de cada dilución en erlenmeyers conteniendo cada uno 100 mL del mismo medio salino citado anteriormente. medios de cultivo y equipos Materiales Frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. tanto de agua como de sedimentos superficiales.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Objetivo: Aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de muestras de agua y sedimentos marinos. Replicador. con la fuente de carbono seleccionada. En el caso de las muestras de sedimentos. ºC. se inoculan diluciones seriadas de los subcultivos en placas Petri conteniendo medio para bacterias heterótrofas (Gorvienko. Página 47 . y por tres veces sucesivas. 1961). Reactivos y medios de cultivo. se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. se puede sembrar directamente 1 mL de la muestra en un erlenmeyer conteniendo 100 mL de medio salino descrito por Vela y Ralston (1978) empleando como fuente de carbono petróleo pesado. respectivamente. Petróleo ligero. Placas Petri. Pipetas. Petróleo pesado. Para la colecta de muestras. al 2%. Los erlenmeyers inoculados se colocan en zaranda termostatada a 28 Cada cinco días. Incubadora bacteriológica. 1984). deben conservarse en refrigeración por un máximo de 4 h. Si las muestras no pueden procesarse de inmediato. Materiales. petróleo ligero o combustible Diesel indistintamente. en agar GELP (Van Uden y Fell. se hacen subcultivos empleando el mismo medio de cultivo (estático) y se incuba a 28ºC ± 2 ºC. Combustible Diesel. En el caso de las muestras de agua. reactivos. previamente se aplican. sobre el medio salino agarizado. se conservan en tubos de cultivo con estos mismos medios. Para la siembra con replicador.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Una vez crecidas las colonias. Para detectar la capacidad de cada cepa de degradar hidrocarburos aromáticos. 1983). Se deben preparar controles utilizando el medio salino agarizado con la fuente de carbono seleccionada sin inocular. cíclicos y combustible diesel se siembra en placas Petri conteniendo medio Vela y Ralston (1978) agarizado. conservándolos después del enriquecimiento en medio líquido con pases mensuales a medio salino fresco con petróleo como única fuente de carbono. utilizando un replicador múltiple (Shiaris y Cooney. soluciones al 0. Para el caso de los hidrocarburos aromáticos y cíclicos. El replicador múltiple estéril se aplica sobre los pocitos que contienen las suspensiones celulares y luego se aplica sobre el medio salino agarizado contenido en placas Petri. Los cultivos mixtos capaces de degradar petróleo se aíslan.5% P/V de estos sustratos en acetona. mientras que para los cíclicos volátiles se conservan las placas inoculadas dentro de un recipiente en atmósfera del compuesto volátil. se preparan suspensiones de cultivos jóvenes (24h) de cada cepa en agua de mar estéril y se añade una gota de cada suspensión celular en una placa estéril de porcelana con pocitos. 48 . R. . R. Willis. Petch. W A. y Lepo. Swannell. 19(1): 28-34. E. Holder. y Fell.C 1993. D. R. E.D. R. Impact of bioremediation treatments on the biodegradation of buried oil predominant bacterial populations.M.E... N. A. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology. Microbiol. P y Cooney. 1:167-201. Development Industrial Microbiology. Herrington. . . A. Shiaris.. B. 45 (2):706-710. . Wrenn. Prince.T.J.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA Finnerty. 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Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas Los biotensioactivos son moléculas con una parte polar (hidrófila) y una parte apolar (hidrófoba) producidos durante el crecimiento de una gran variedad de microorganismos sobre sustratos de diferente naturaleza (Lang y Wullbrandt. en el tratamiento de asfaltos. metales. medios de cultivo y equipos empleados Materiales. floculantes. La amplia variedad de estructura posibilita diversas aplicaciones en la industria como emulgentes. 1997). 1998. 1999. Estos compuestos pueden ser utilizados en procesos de polimerización. El uso de tensioactivos de origen biológico. no tóxicos y biodegradables. reactivos. 2000. 1999).TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. Numerosos autores han referido la producción de agentes con actividad superficial a partir de la degradación microbiana de sustratos hidrófobos. para pinturas y cubiertas de papel. constituye una alternativa atractiva de aplicación en la industria teniendo en cuenta su eficacia y la tendencia actual de disminuir el uso de productos obtenidos por síntesis química (Aynechi. entre otras. Kenneth et al. Tubos de cultivo. textiles y fibras. Iwabuchi et al. 1993. mediante emulsiones. 2000. Objetivo: Detectar bacterias productoras de tensioactivos entre aislados provenientes de muestras de agua y sedimentos marinos Materiales. espumantes. aminolípidos. lipoproteínas y lipopéptidos (Lang y Wullbrandt. detergentes. no han sido totalmente aclaradas. aunque las funciones fisiológicas de su producción en presencia de estas fuentes. 2000). cemento. Desai y Banat. La producción de biotensioactivos a partir de fuentes de carbono hidrosolubles se utiliza con frecuencia por la simplicidad del proceso fermentativo y su fácil comercialización. Durante este proceso aumenta la superficie de contacto entre las fases inmiscibles favoreciéndose el transporte del sustrato hacia la célula necesario para llevar a cabo los procesos metabólicos que conducen a la multiplicación celular (Köhler et al. Placas Petri.6. Los biotensoactivos se clasifican atendiendo a su naturaleza química en: glicolípidos. lipopolisacáridos. ácidos grasos. Banat et al. 2002). fosfolípidos. Banat et al. 2001). humectantes. Papel de filtro Whatman. Zaranda termostatada. etc. 1989). Para la determinación de la actividad superficial se procede a obtener el caldo libre de células por centrifugación a 7 025 x g a 4 °C durante 20 min. El sobrenadante se filtra primero por papel de filtro Whatman para separar la capa oleosa y después. Este método se basa en la actividad hemolítica que presentan estos compuestos. Debe prepararse un tubo control con medio de cultivo estéril. Centrífuga. Equipos. arabinosa. lactosa. a partir de estos caldos inoculados se siembra un volumen tal que contenga 108 celulas/mL en erlenmeyers conteniendo 200 mL de un medio basal (Finnerty. La actividad superficial del sobrenadante se evalúa a partir de la tensión superficial y tensión interfacial las cuales se determinan por el método de anillo de Du Noüy (Lin.).TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Reactivos y medios de cultivo. Tensiómetro. Posteriormente.22 μm de diámetro de poro para eliminar las células. Medio salino. se procede a evaluar los cultivos en cuanto a crecimiento celular y actividad superficial con respecto al medio de cultivo estéril. 1996) utilizando para esto un tensiómetro. Agitador magnético. Hexadecano.8 % y se incuban a temperatura ambiente por 18-24 h. por filtros de membrana de acetato de celulosa de 0. La determinación de tensión interfacial del caldo fermentado puede ser realizada utilizando como fase oleosa keroseno. Glóbulos rojos de carnero.96 h de incubación a 28-30 ºC en zaranda termostatada. 52 . Luego de 72 . se realiza una primera selección de aquellos aislados potencialmente productores de tensioactivos por el método de lisis de los glóbulos rojos (Mulligan et al. A partir de cultivos axénicos de bacterias aisladas de aguas o sedimentos marinos. hexadecano u otro hidrocarburo. Una vez seleccionados los aislados que provocaron la hemólisis de los glóbulos rojos. Incubadora bacteriológica. se siembra una asada de cada cultivo. Procedimiento. 1994). que provocan zonas claras de hemólisis (ß hemólisis) alrededor de las colonias de microorganismos potencialmente productores de agentes con actividad superficial. en tubos conteniendo caldo nutriente al 0. glucosa. conteniendo hexadecano al 2% como única fuente de carbono y energía (pueden usarse tambien almidón. 1996). Según ese criterio. etc. 2000. han sido obtenidos a partir de microorganismos (Inczédy. También la determinación del número de saponificación permite conocer la concentración de tensioactivos aniónicos. fundamentalmente. 1981). Según proponen Finnerty y Singer (1984) las clases generales se pueden considerar como un método válido para reconocer y seleccionar microorganismos capaces de sintetizar productos con actividad superficial. El valor absoluto de este índice está dado. Transcurridas 24 h de reposo. los microorganismos se clasifican en tres grupos: • Aquellos que disminuyen la tensión superficial del medio de cultivo. 2001). El cociente de ambos valores multiplicado por 100 representa el índice de emulsión. La CMC es una medida de la eficiencia y concentración de los tensioactivos ya que representa la concentración a partir de la cual. por las características del tensioactivo (concentración. 1998. estructura. La concentración micelar crítica (CMC) se determina gráficamente a partir de la bisectriz del ángulo que forman las dos partes rectas de la curva característica de un gráfico de Tensión Superficial vs. muchos de los cuales. Ábalos. al saturarse la superficie y comenzar el proceso de formación de micelas. 1987). La actividad emulsionante se determina mezclando volúmenes iguales del medio de cultivo fermentado y keroseno. balance hidrófilo lipófílo. Página 53 . • Los que no modifican la tensión superficial del medio de cultivo. se miden la altura de la capa emulsionada y la altura total.). La determinación de la concentración micelar crítica (CMC) se define como la concentración de tensioactivo necesaria para iniciar la formación de micelas (Kim et al. 2001). • Los que aumentan la tensión superficial del medio. no se produce una disminución significativa de la tensión superficial (Songh y Rosen.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Los valores de tensión superficial y tensión interfacial que determinan las características tensiométricas de los caldos de cultivo fermentados permiten clasificar los microorganismos como productores o no de estas sustancias. diluciones de tensioactivos en agua destilada (Kim y Vipulanandan. Deben realizarse tres repeticiones de cada prueba. Ábalos. con un agitador magnético a alta velocidad por 10 min (Cooper y Goldenberg. Jonge. Finnerty. . 1998.. A. Biosurfactants in enviromental Biotechnology. Iwabuchi N.G. y Goldenberg. Anzai. España. 495-508. N. S.. J. 61(1):47-64. Banat.M.. M. Tesis de Doctorado. http://darwin. 68 (5): 2337-43. J y Reisz.bio. B. 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Purification and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. de cosméticos (Sutherland. contribuya a la sobrevivencia de las comunidades microbianas ante las condiciones extremas de temperatura.) y comienzan a formar el biofilm. ya que sobre las superficies suelen concentrarse nutrientes que son utilizados por estos microorganismos. Aislamiento de bacterias extracelulares productoras de polisacáridos Para mantener la estructura celular los microorganismos sintetizan polisacáridos o macromoléculas con componentes sacarídicos como constituyentes de la pared celular. 56 . 2004). que impide la desecación. 1989) y en la industrial petrolera . y disponibilidad de nutrientes. etc. por su aplicación como aditivo en la industria alimenticia. Muchos polisacáridos producidos por bacterias han sido caracterizados y comercializados. válvulas cardiacas artificiales. lo que posiblemente. sin embargo. Miles y Morris. Entre las especies de bacterias que más se estudian actualmente por su capacidad de producir biofilm y ser causa de múltiples enfermedades se encuentran el Staphylococcus epidermidis y otras del género Staphylococcus. A veces estos compuestos extracelulares pueden observarse con el microscopio óptico formando una especie de cápsula alrededor de las células y otras veces.2. caracterizadas por la existencia de altas presiones. (1989). los exopolisacáridos microbianos son abundantes en el ecosistema marino de la Antártica. los exopolisacáridos producidos por los microorganismos que ahí habitan son inusuales y pueden tener un elevado valor comercial. temperaturas extremas y presencia de metales pesados. muchas especies también excretan polisacáridos al medio circundante. como el alginato. donde quedan atrapadas numerosas células. salinidad. se observa una matriz viscosa y amorfa conocida como biofilm o biopelícula. Estos autores también refieren que en las aguas hidrotermales profundas. incluyendo S. marcapasos. la acción de fagocitos y anticuerpos que tratan de eliminarlos.7. (2005). farmacéutica (Colliec-Jouault et al.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Cap. En ambientes marinos oligotróficos el crecimiento de bacterias adheridas a superficies se considera una estrategia nutricional. En cultivos puros de estas bacterias se ha encontrado que las moléculas de antibióticos no logran atravesar la estrecha red de glicoproteínas del biofilm para llegar a su sitio de acción (Diemond y Miranda. animales y humanos. 2007). afirman que estos polisacáridos extracelulares protegen a las bacterias contra la desecación y el ataque de bacteriófagos. Según Mancuso et al. La composición química de los exopolímeros ha sido ampliamente estudiada ya que se consideran inmunógenos y antígenos bacterianos importantes relacionados con infecciones en plantas. Estas bacterias patógenas se adhieren a dispositivos plásticos (prótesis ortopédicas. aureus. el xantano y el curdlano. Zaranda rotatoria. medios de cultivo y equipos empleados. Reactivos y medios de Cultivo. Reactivos. Cámara de Newbauer. Etanol absoluto (99%).22 micras de diámetro de poro. Detalles experimentales. 1976) demostraron que el medio de cultivo con anilina azul es muy útil para la detección de colonias que tienen la capacidad de producir curdlano porque éste forma un complejo con el colorante y se observan las colonias azules. Erlenmeyers de 500 mL. Tubos de cultivo. Harada et al. Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Objetivo: Aislar bacterias productoras de polisacáridos de sedimentos marinos o de portaobjetos químicamente limpios sumergidos en el mar. Membrana de diálisis de 12 000 cutoff. (1974. sucrosa. Roto evaporador. Agua destilada. asociados a diferentes fases de crecimiento (Christensen et al. galactosa u otro azúcar. 1985). Varilla de vidrio. Materiales. Página 57 . En todos los casos el denominador común es que en el medio de cultivo se emplea como fuente de carbono glucosa. Portaobjetos. Existen diferentes medios de cultivo para la producción microbiana de polisacáridos o glicoproteinas extracelulares. Liofilizadora. Materiales. se han encontrado bacterias capaces de producir dos tipos diferentes de polisacáridos durante una misma fermentación. Papel de filtro Whatman GF/F. Pipetas estériles. En ocasiones. Agua de mar estéril. Cámara fría. Centrifuga refrigerada. (1987) refieren que Nakanishi et al. Equipos. El erlenmeyer con el medio inoculado se coloca en zaranda rotatoria (150 rpm) a 25 °C por cinco días. y se dializa exhaustivamente por membrana de 12 000 cutoff durante 24 h contra agua destilada. para eliminar restos de glucosa que no hayan sido consumidos. De esta suspensión se inocula un volumen tal que al añadir en 200 mL del medio seleccionado (medio PS o medio Okami. se recoge el precipitado obtenido con una varilla de vidrio. Los 200 mL del medio de cultivo deben estar contenidos en un erlenmeyer de 500 mL o 1 L de capacidad con tapón de gasa que permita una adecuada aireación.22 µm de diámetro de poro. de las cuales nos interesa conocer cuáles son capaces de producir polisacáridos extracelulares. El filtrado se concentra en un rotoevaporador a temperatura ambiente hasta la mitad de su volumen. de etanol (99%) frío. En algunos casos. preferiblemente en cámara fría. primero por papel Whatman GF/F y después por membrana de acetato de celulosa de 0. se mantienen en tubos con medio Agar marino. Al filtrado dializado se le añade 2 vol.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Procedimiento. en dependencia de los objetivos de la investigación. En este procedimiento se parte de cultivos puros de bacterias heterótrofas aisladas de sedimentos marinos o de portaobjetos (químicamente limpios) que se encontraron sumergidos en el mar por 72 h. Se centrifuga a 4 800 x g a 4 °C por 20 min para remover las células. se prepara una suspensión celular con agua de mar estéril. En ocasiones se liofiliza para su conservación a largo plazo. Las colonias aisladas. De cada cultivo a evaluar. se deja reposar por unas h. que brindan una superficie donde las células pueden adherirse. de organismos. también se le mide su viscosidad específica y sus propiedades reológicas. y se cuenta el número de células en cámara de Newbauer. y el sobrenadante resultante se filtra. 58 . Al polímero obtenido se le determina sus propiedades físicas y su composición química. y posteriormente. u objetos sumergidos. u otro) la concentración final resulte 108 células/mL. Los cultivos de bacterias que producen polisacáridos extracelulares por lo regular son mucosos y con frecuencia provienen de muestras de sedimentos. C. y Miranda.. Partial chemical and physical characterization of two extracellular polysaccharides produced by marine. Harada. 2004. y Guezennec. S. Sutherland. 403-416.A comparison with eukaryotic polymers. 2005. Marine Biotechnology. Vol. Enfermedades Infecciosas y Microbiología. Applied and Environmental Microbiology. Biol. y Morris.A. Gran Bretaña ©. Microbial polysaccharides of marine origin and their potential in human therapeutics.. and Deep-Sea Hydrothermal Vents: A Review. Bacterial Exopolysaccharides from Extreme Marine Environments with Special Consideration of the Southern Ocean. Miles. J.P 2005. 1989. E. Kjosbakken. Naturally-evolved changes in bacterial polysaccharides. Sea Ice. V J. B. G. Sinquin. B. J. J. Ratiskol. 20:143-164. Diemond. A. D. Vol. S. . 27 (1).. . vol.50 (4):837-845. Fischer. I. A. 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Aunque no contribuyen a la fosforescencia del océano, (la cual es causada por algunos dinoflagelados, hidrozoos, poliquetos, moluscos, crustáceos y peces), participan en el reciclaje de nutrientes y muchas de ellas, forman parte de la flora intestinal de los peces (Goto, 1980). Las bacterias luminiscentes emiten luz continuamente, sólo que a diferentes intensidades, en dependencia del contenido celular específico de enzima y sustratos que participan en la reacción. Estos niveles de enzima y sustratos son diferentes de acuerdo a una variedad de factores que inducen o reprimen la biosíntesis (Nealson, 1977). Los mecanismos que intervienen en el control de la luminiscencia indican que la síntesis de luciferasa, al igual que la represión de esta enzima, ocurre en determinadas condiciones y que la luminiscencia no significa una ventaja selectiva para las bacterias. La luz es emitida como resultado de una reacción de oxidación de luciferina donde interviene como catalizadora la enzima luciferasa y como oxidante el oxígeno. Se conoce que en bajas concentraciones (menores de 0.5%) el oxígeno resulta limitante y en condiciones de anaerobiosis estricta, cesa la luminiscencia (Hasting, 1978). El uso de bacterias luminiscentes para detectar la presencia de oxígeno en bajas concentraciones fue probado por Beijerinck en 1902 en experimentos para detectar el oxígeno formado por la fotosíntesis en un extracto de hojas de trébol machacadas (Hasting, 1978). Entre las aplicaciones de las bacterias luminiscentes se encuentran la detección de micotoxinas en productos agrícolas (Yates y Porter, 1982), la detección de antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas (Naven et al. 1984), y la detección de compuestos de bajo peso molecular con actividad antitumoral potencial (Steinberg et al. 1985). Actualmente también existen sistemas de ensayos que utilizan las bacterias luminiscentes liofilizadas o desecadas para determinar toxicidad del agua como el BioFix ® Lumi y el producto Microtox® desarrollado por AZUR Environment, (Strategic Diagnostics, Inc. Neware, DE, USA), recomendado para medir la toxicidad aguda de efluentes industriales líquidos por su rapidez, alta sensibilidad y reproducibilidad y según Doherty (2001), el Microtox® también se puede utilizar para medir la toxicidad en suelos y sedimentos. 60 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Objetivo: Aislar bacterias luminiscentes de muestras de agua de mar. Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados. Materiales. Tubos de cultivo con tapón de algodón. Pipetas estériles. Placas Petri. Reactivos y medios de cultivo. Medio líquido LM (Baumann y Baumann, 1981). Equipos. Incubadora bacteriológica. Luminómetro, Bioluminómetro o Fotómetro. Detalles experimentales. Cuando se realiza el aislamiento de bacterias luminiscentes a partir de muestras de aguas se recomienda utilizar cultivos enriquecidos en medio líquido LM (Baumann y Baumann, 1981). Procedimiento. Se preparan tubos de cultivo con 9 mL de medio líquido LM (Baumann y Baumann, 1981), a los cuales se les añade 1 mL de muestra, y se incuban a 25 oC hasta siete días. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se realizan diluciones seriadas hasta 10-8 empleando el mismo medio de cultivo y se siembra superficialmente 0.1 mL de cada dilución en placas Petri con el medio LM agarizado. Las placas sembradas se incuban a determinada temperatura, en dependencia de la especie que nos interese aislar, y se revisan cada 24 h hasta tres días. Las placas deben chequearse en la oscuridad, esperando unos segundos que la visión del observador se adapte para captar si es visible la luminiscencia. Cuando el crecimiento es positivo, se observará una luminiscencia característica (Foto 1) que puede cuantificarse empleando un luminómetro, un bioiluminómetro o un fotómetro (Foto 2). Página 61 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Foto 1. Apariencia de un cultivo de bacteria luminiscente en erlenmeyer con medio líquido. Foto 2. Fotómetro modelo 500 Analyzer 62 Alteromonas. L. Steinberg. Berlin. y Maiese. . 125-135.13021331. . Yates. Bacterial Bioluminiscence: An Overview.. 1977... White R. En: The Procaryotes. J. Press. . F.P .. Vol. y Porter. Bacterial Bioluminiscence as a Bioassay for Mycotoxins. Press p.10:1401-1407. Heidelberg. H. Journal of Applied Bacteriology 56:457-463. Bassan. mechanism and significance. G. The marine Gram negative Eubacteria: genera Photobacterium. Doherty. 1982. vol. 179-222. pp. A. 1981. Applied and Environmental Microbiology. Naven. Vol. Bioluminiscence of Marine Organisms. Autoinduction of bacterial luciferasa: Occurrence. Vol LVII Acad.W 1978. 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I.5:1072-1075. pertenecientes a 21 géneros. 1985). debido al interés que existe por evitar o controlar las enfermedades en los organismos que son consumidos por el hombre. la flora bacteriana de invertebrados acuáticos constituye un componente significativo de los microorganismos que contribuyen. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos. se conoce más sobre las patógenas. existen evidencias de que algunas bacterias son consumidas por el fitoplancton (Bird y Kalff. Pinzas. Desde el punto de vista ecológico.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. Objetivo: Aislar bacterias de peces e invertebrados marinos. de manera global. asociadas a peces enfermos. a la productividad en lagos y océanos (Tietjen. sin embargo. Las bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados marinos pueden ser patógenas o formar parte de su microbiota normal. así como por invertebrados de niveles tróficos superiores. Jeringuilla estéril. Las infecciones causadas por bacterias en peces e invertebrados marinos son más frecuentes entre los organismos en cultivo que entre los de vida libre. Placas Petri estériles. 1986). reactivos. 64 . Aplicador estéril. Materiales. medios de cultivo y equipos empleados. Según Sanders y Fryer (1988) a nivel mundial se han aislado aproximadamente. Materiales. Pipetas estériles. También. lo que puede influir en el flujo de energía en la trama alimenticia (Jannach. 1980).9. y es uno de los aspectos que se le presta mayor atención en la acuicultura. Tijeras quirúrgicas estériles o bisturí. 35 especies de bacterias. Otro aspecto de interés es la capacidad de algunas bacterias que viven asociadas a peces e invertebrados de producir antibióticos y enzimas de interés médico farmacéutico (Nishihara et al. 2008). Incubadora bacteriológica. Equipos. Agar sangre. Agar Marino. Agar Cytophaga. Cámara húmeda. Agar feniletil (BBL). Homogenizador. se recomienda primeramente. Agua destilada estéril. No existe un solo método para aislar todos los microorganismos que pueden encontrarse en un organismo. Agar nutriente. Tintura de yodo o etanol 10 70%. Si trata de peces enfermos. Medio Löwenstein-Jensen. Peces.peptona. Procedimiento. Agar infusión cerebro-corazón (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%). Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS). realizar una detallada descripción de la lesión (superficial o interna) y consultar la literatura existente para orientarse sobre el posible agente causante de la enfermedad. es recomendable obtener información sobre las características biológicas básicas del organismo con que vamos a trabajar. Página 65 . Medio Ogawa o Medio Sauton para mico bacterias. ya que existe bastante información sobre las especies microbianas patógenas en peces.1% de L-cisteína. Tanto los peces como los invertebrados colectados deben analizarse tan pronto como sea posible para evitar cambios en la microbiota durante el almacenamiento. pero en todos los casos. Tinción Gram.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Reactivos y medios de cultivo. Caldo tioglicolato. Detalles experimentales.glucosa. ya que esta información puede resultar de utilidad a la hora de escoger el método de aislamiento y el medio de cultivo a emplear. Medio líquido tripticasa. Agar KDM-2. Mueller -Hinton suplementado con 0. 5% de NaCl y temperatura de incubación entre 17 y 31°C. aunque algunas causan vibriosis. furunculosis y septicemias. se consideran. ictaluri crecen en medio BHI o 66 . de bordes circulares y entero.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA En general. En Agar nutriente después de 24 a 48 h de incubación a 25 °C aparecerán colonias blancas. este último es selectivo para vibrios enteropatógenos como el V. E. ictaluri y Y. 0. Las cepas típicas producen un pigmento carmelita soluble en agua que se difunde al medio alrededor de la colonia. convexas. tarda. Todos los géneros de la familia Enterobacteriaceae. Después de incubar a 25 °C de 2 a 3 días. sobria pueden aislarse de la superficie externa o de los intestinos de los peces usando medio BHI y TSA o Agar nutriente. aparecerán colonias circulares. Otra bacteria aislada de peces es la especie Plesiomonas shigelloides que puede crecer en los medios BHI y TSA. Una vez se observe que la muestra está uniformemente desintegrada. se emplea BHI y TSA. excepto Erwinia. pueden considerarse aislamientos potenciales de peces y como grupo. Pasteurella piscicida es una especie patógena de peces que fue descrita en 1963 a partir de una mortandad masiva de perchas blancas (Roccus americanus) y lubinas (R. patógenos oportunistas. para el aislamiento se desinfecta el área donde vayamos a trabajar con tintura de yodo o etanol al 70%. se deja reposar por unos min y se siembra una porción del sobrenadante en el medio seleccionado. caviae y A. saxatilis) que tuvo lugar en la costa este de Estados Unidos. parahaemolyticus. ruckeri. Esta bacteria crece en los medios BHI y TSA con al menos. elevadas y traslúcidas. Aeromonas hydrophila. cholerae y el V. se toma una muestra directamente de la lesión con un aplicador estéril o se corta parte del tejido con tijeras quirúrgicas estériles y se homogeniza en una pequeña cantidad de agua destilada estéril. la especie patógena de peces más ampliamente distribuida en el mundo. Especies de los géneros Vibrio y Aeromonas se consideran constituyentes de la flora normal de peces de aguas marinas y dulces. Tres especies de los géneros Edwardsiella y Yersinia son reconocidos como importantes patógenos de peces: E. Para el aislamiento de vibrios se pueden emplear el Agar infusión cerebro-corazón (BHI) o el Agar triptona soya (TSA) suplementado con NaCl (1-3%) o preparado con agua de mar estéril. Para el aislamiento de Aeromonas salmonicida. Edwardsiella tarda y E. A. También se puede usar Agar Marino y el Agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa (TCBS). De la Familia Cytophagaceae. TSA o Agar nutriente. Después de cinco días de incubación a 18 °C crecerán colonias redondas. brillosas y produce un pigmento amarillo-verdoso que se difunde en el medio y es soluble en agua. También se puede favorecer el aislamiento de E. Las colonias de Y. Estas bacterias pueden aislarse sembrando tejido infectado directamente en Agar Cytophaga o en TSA muy diluido (20 veces). y temperatura de incubación entre 20 y 25 °C. También puede emplearse un medio de cultivo diferencial (Medio Shorts-Waltman). bordes rizoides y adheridos a la superficie del agar. circulares. Se pueden aislar bacterias de esta especie sembrando tejido homogenizado en Agar Cytophaga e incubando las placas a 25 °C de 3 a 5 días. tarda inoculando la muestra homogenizada de tejido lesionado en Caldo tioglicolato 4 días a temperatura de 22 °C previo al cultivo en BHI. La especie Yersinia ruckeri es causante de la enfermedad entérica “boca roja” en salmones. suaves y de color amarillo claro. fluorescens forma colonias redondas. Página 67 . algunas de las cuales. transparentes. Las colonias de estas dos especies fluorecen cuando se exponen a luz UV .TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA TSA. Flexibacter maritimus y Sporocytophaga se han descrito como patógenas de peces marinos. mientras que. elevadas y convexas. dos especies están consideradas patógenas potenciales de peces de agua dulce: Flexibacter columnaris y Citophaga psychrophila. se debe incubar de 2 a 3 días a una temperatura entre 22 y 26 °C. De la superficie externa de las agallas de salmones en cultivo que presentan signos de la enfermedad conocida como “bacterial gill” también se ha aislado bacterias pertenecientes al género Flavobacterium. circulares y elevadas después de 48 h de incubación a 20-25 °C. suaves. Flexibacter columnaris causa lesiones amarillentas externas en las agallas y sobre la superficie del cuerpo. muy conocida en el norte y sur de América. Europa y Australia. En ambos medios. pueden causar septicemias. Para aislar estas especies se pueden emplear los medios BHI. Las colonias son pequeñas. Con frecuencia. retorcido. ruckeri son verdes y están rodeadas de una zona clara producida por la hidrólisis. transparentes. Las colonias son amarillas con el centro extendido. Esta bacteria puede aislarse en los medios de cultivo BHI y en TSA donde crece formando colonias pequeñas. Pseudomonas chlororaphis crece en agar nutriente produciendo un pigmento verde que forma cristales semejantes a agujas y P. también se aíslan de peces especies de la Familia Pseudomonadaceae. balustinum) difieren de otras especies de este género por su incapacidad para crecer a 37 °C y su habilidad para hidrolizar almidón. rizoides con una apariencia de remolino. redondas y completas. de color blanco hasta amarillo crema.1%. Lactobacillus y Eubacterium. Para su aislamiento se pueden emplear los medios BHI o TSA. y una temperatura de incubación de 25 °C. visibles después de 48 h de incubación. aquatile y F. piscícola como patógena. Cuando se estudia la microbiota normal de los peces se encuentra una población significativa de bacterias no patógenas en formas de bacilos pleomórficos gram positivas que no forman esporas. planas. convexas. A los 2 días aparecerán colonias no pigmentadas con un diámetro menor a 2 mm.-Hinton suplementado con 0. Aunque los cultivos jóvenes son Gram positivos. reconociéndose sólo la especie L. aunque también se puede reemplazar el suero fetal bovino que contiene este medio por carbono activado al 0. Las colonias. pertenecientes a los géneros Renibacterium. Otro medio que se usa es el Mueller. La especie Eubacterium tarantellus ha sido aislada del cerebro de peces estuarinos empleando medio tioglicolato o Agar BHI e incubando anaerobicamente a 25 °C. Entre los cocos Gram positivos. tienen de 2 a 5 mm de diámetro. las células de esta bacteria forman largas cadenas o filamentos de bacilos pleomórficos.1% de L-cisteína o el Agar KDM-2 adicionándole antibióticos selectivos. Como parte de la flora normal de peces de agua dulce y marina también se han aislado especies del género Lactobacillus. Para aislarla se emplea el medio Agar KDM-2. con frecuencia después de 24 h se observan como Gram variables.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Las especies de Flavobacterium aisladas de peces (F. Esta especie forma colonias circulares. lisas y blancas o blanco-amarillentas en medio BHI después de incubar a 25 °C. En Agar KDM-2 las colonias son circulares. convexas. En placas con medio BHI con sangre de oveja ocurre ß hemólisis. La temperatura óptima de crecimiento es de 15 a 18 °C y requiere de cinco a seis semanas para que aparezcan las colonias. Renibacterium salmoninarum es una bacteria parásita obligada de peces que ha sido aislada de salmones de vida libre o de cultivo. Las colonias contaminantes que crecen rápido deben eliminarse asépticamente de las placas para lograr aislar posteriormente las de crecimiento más lento. son traslúcidas. el Staphylococcus epidermidis fue aislado e identificado en 1976 y 1977 de brotes de enfermedades en serviola y breca roja en Japón. 68 . Morfológicamente. botulinum causó la muerte en salmones en cultivo en Estados Unidos. tres especies han sido descritas como patógenas de peces: Mycobacterium marinum.glucosa. campachi. Se incuba en anaerobiosis estricta a 25-30 °C. Si no es posible transportarlos en agua de mar con adecuada oxigenación. Petrognani. También se ha aislado esta bacteria directamente a partir de muestras de sedimentos del estanque donde ha ocurrido la muerte de peces por la ingestión de la toxina tipo E. 1984). Invertebrados marinos.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Especies de Streptococcus también se han aislado de peces enfermos de aguas dulces y marinas. es preferible congelarlos. Dos especies de bacterias pertenecientes al género Nocardia se han aislado de peces: Nocardia asteroides y N. no se han identificado los nombres. Los crustáceos deben manipularse cuidadosamente para evitar daños en sus carapachos que pueden provocar que se contamine su hemolinfa. chelonei. Inglaterra y Dinamarca (Eklund et al. se han aislado especies no patógenas del género Bacillus de la superficie externa y del tracto digestivo de peces.peptona. Para mayor rapidez. Se han descrito cuatro formulaciones de medios de cultivo específicos para el aislamiento de estas bacterias: Löwenstein-Jensen. Para aislar esta especie del contenido intestinal y los tejidos de los peces se usa un medio enriquecido con yema de huevo. Ogawa y Sauton. Estas bacterias pueden aislarse empleando los medios BHI. Página 69 . sin embargo. Pueden aislarse de los órganos internos o de las lesiones (frecuentemente en las agallas) empleando medios bacteriológicos como el BHI. Entre las micobacterias. Del género Clostridium se conoce que la toxina tipo E de la especie C. TSA o Agar nutriente y temperatura de incubación de 20 a 25 °C. y transportarse en cámara húmeda para evitar la desecación. el TSA o el Agar Nutriente y temperatura de incubación de 20-30 °C. cuando se aíslan por primera vez se necesitan periodos de incubación de hasta 30 días. botulinum no es una especie invasiva y se considera que la muerte de los peces ocurre por el canibalismo de peces que se encuentran en descomposición en el fondo anóxico de los estanques y presentan la toxina. se ha determinado el antígeno del grupo Lancefield a que pertenecen. fortuitum y M. M. El crecimiento de estas bacterias requiere adicionar al medio de cultivo basal factores de crecimiento y generalmente. sin embargo el C. Del grupo de bacilos y cocos Gram positivos formadores de endosporas. Agar sangre y medio líquido tripticasa. La hemolinfa se extrae del seno cardiaco de los animales por punción a través de la membrana intersegmental usando una jeringuilla estéril de 5 mL. 1984) causante de la enfermedad conocida como Gaffkaemia en langostas se requiere del análisis de la hemolinfa. homogenizar en agua estéril y sembrar una alícuota. deben transportarse al laboratorio en cámara húmeda a una temperatura entre 8 y 10 °C. cuidando no tocar el hepatopancreas.5 mL de caldo y se incuba por 5 días a 28 °C. homari (Stewart.5 mL de hemolinfa en 4. homari están formadas por cocos gram positivos en tétradas y son catalasa negativa. el sitio donde se pinche debe desinfectarse con tintura de yodo o etanol al 70% antes de hacer la punción. ya que así se puede remover fácilmente el carapacho. Para evitar la contaminación. lo que puede alterar el conteo de su microbiota bacteriana en pocas horas. Esta membrana se localiza entre la parte posterior del carapacho y el abdomen. En cuanto a los moluscos. Se inocula 0. Las colonias de Aerococcus viridans Subs. 70 . Los moluscos bivalvos no deben introducirse en agua durante la transportación porque continuarán filtrando. cortarse las ataduras de sus músculos y retirar esta concha. para dejar los órganos internos en la concha más profunda. los moluscos deben abrirse con la concha plana o somera hacia arriba. Los tubos que muestren producción de ácido deben subcultivarse en Agar feniletil u otro medio nutriente no selectivo. Otra variante es obtener la hemolinfa del seno ventral pinchando en la membrana no calcificada en la base de las patas natatorias. o cortando una muestra de la parte infectada con un instrumento estéril. En general.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Para detectar la bacteria patógena Aerococcus viridans Subs. La hemolinfa se puede examinar directamente con una tinción Gram o se puede sembrar en medio de cultivo selectivo para el microorganismo patógeno como el Medio Gaffkya (Stewart et al. estos después de colectados deben lavarse con abundante agua para remover el fango de sus conchas y posteriormente. Es frecuente observar lesiones necróticas en los exoesqueletos de los crustáceos que pueden deberse a la acción de bacterias quitinolíticas que pueden aislarse directamente tomando muestra de la lesión y sembrando en un medio específico como el descrito por West y Colwell (1984). La extracción de los órganos internos de los crustáceos para su análisis es posible sólo con el animal muerto. 1966). como es agua filtrada y autoclaveada. Este líquido también puede ser extraído antes de extraer el órgano usando una pipeta estéril. En general. para el análisis de las bacterias presentes en los invertebrados debe desintegrase el organismo y homogenizar la víscera o el pedazo de tejido.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA En moluscos bibalvos grandes. Se puede batir a 12000 rev min -1 por hasta 2 min con intervalos de 15 seg. Homogenizar la muestra facilita la inoculación en medio de cultivo. Página 71 . Debe emplearse un diluyente adecuado. si es necesario colectar diferentes órganos internos para examen bacteriológico. Para erizos marinos se emplea un procedimiento que es aplicable a los invertebrados grandes. pero debe emplearse con cuidado para evitar la destrucción de las células bacterianas durante el tratamiento. Allongi (1985) describió un procedimiento usando ultrasonido para la separación de bacterias de la superficie de poliquetos. respectivamente. si se quiere contar el número de células. que asegure la sobrevivencia de las bacterias hasta que se realice la siembra. usando jeringuillas y agujas y lavando repetidamente las superficies. Se abre la testa del erizo con unas tijeras estériles y se toman muestras del fluido intestinal y de varias membranas internas por disección y aspiración. para evitar el calentamiento de la muestra. También se puede usar un digestor (“Stomacher”) por un tiempo de hasta 10 min o hasta que se visualice que la muestra se desintegró completamente. la víscera entera del animal debe ser enjuagada con agua estéril pera remover las bacterias de la superficie y el fluido asociado con el órgano. sobretodo. preferiblemente tomada del lugar donde se colectó el organismo. . Helgolander Meeresunters uchungen..1984. (Ed.115-142.5. p. M. W y Brunson. .. 1984. E. and bacterial productivity on tubes constructed by the polychaete Capitella capitata. B. Austin. Bird. 23:207-208. H. W . y Yazawa. R. Jannach. Koyama.A. Bacteria of Fish. No. P A. L. D. . p.) D.10. 72 . (Ed) R. 1986. H. New York. M. Peck. y Kalff. y Fryer. B. Deep sea life on the basis of chemical synthesis.D. En: Vibrios in the Enrvironment. 2008. W Poysky. E. W 1985.4:382-387. T.M. Walkman. A medium for the isolation and differentiation of Yersinia ruckeri. J. Kamata.E. 1980. West. 1988. p. L. J. 1984. (Ed) Springer New York. meiofauna. West. 41: 804-806.D. Bacterial grazing by planktonic lake algae. (Ed. D. En: Microbiology-1980. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. En: Methods in Aquatic Bacteriology. ASM.) pp. P 1988. Marine Progress Series. Science. Lobster diseases. Vol. Schlessinger.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA Allongi.1985. K. Microbes. 72: 85290. T. Eklund. Stewart. . Naturwissenshaften. Peterson. . J. Nishihara. W y Shorts. Type E botulism in salmonids and conditions contributing to outbreaks. Washigton DC.. M. .R. 335-338. . Colwell Wiley. Tietjen. Austin (Ed. 37:243-254.. New York. E. En: Methods in Aquatic Bacteriology. Sanders. y Colwell. M. New Phospholipase A1-producing Bacteria from a Marine Fish. F. 285-363.143-170. 231:493-495. Microbial-meiofaunal interrelationship: a review. Cap. Identification and classification of Vibrionaceae-An overview. R. J. 41:293-309. Marine Biotechnology. 1984. Bacteria of Aquatic Invertebrates. Aquaculture.) B. J. El macrofitobentos sirve de refugio y alimento a una fauna muy diversa y constituye la base de la producción primaria en la zona nerítica. mientras que de las fanerógamas. También. en biotopos de fondos duros y pastizales (Suárez. De muchas especies del macrofitobentos se obtiene alimento humano y pienso animal. que forman parte de muchos medicamentos. entre otras (Suárez.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA 2. En zonas templadas las macroalgas pueden formar densos bosques submarinos de más de 20 m de alto. pueden ser indicadoras de impacto ambiental. las fanerógamas (Magnoliophyta) son plantas superiores con flores. Las macroalgas se caracterizan por tener organización celular. reactivos. y además. existen alrededor de 15 000 especies de algas. antinflamatorios. alginatos y carragenanos) utilizados en varias industrias. sin tallo desarrollado. La zona de mayor diversidad es el Indo-Pacífico. Objetivo: Observación y aislamiento de bacterias de macroalgas y fanerógamas marinas. Ochrophyta (algas pardas) y Chlorophyta (algas verdes). Por su parte. Se conocen tres filos de macroalgas: Rhodophyta (algas rojas). Página 73 . antioxidantes y otros. Entre los productos más tradicionales obtenidos de las algas están sus ficocoloides (agar. como la alimenticia y la de cosméticos. que forman los pastizales marinos en las plataformas continentales e insulares. se han registrado 45 especies. adheridas al sustrato por rizoides y con una morfología adecuada para soportar la presión hidrostática. de las cuales más del 50 % son macroalgas marinas. 2006). Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas. medios de cultivo y equipos empleados. 2006). A nivel mundial. Materiales.10. De algunas algas se han obtenido sustancias bioactivas como: antitumorales. Bolsas de plástico estériles Tijeras estériles Pinzas Cristalizadora Cubreobjetos Placas Petri Pipetas. denominándose “talo” el vegetal completo. ya que su aparición masiva puede ser la respuesta a la eutrofización del medio o a la desaparición masiva de herbívoros por causas naturales o antrópicas. Materiales. se ha utilizado para la recuperación de los suelos. Metanol. Esta observación directa es sencilla y puede brindarnos información sobre las diferentes formas de bacterias que ahí se encuentran. Si las muestras colectadas no se pueden observar inmediatamente. Aunque el objetivo que se persiga sea el aislamiento de bacterias epífitas de macroalgas y fanerógamas marinas. se requiere decolorar la muestra antes de teñirla. Si el material presenta una pigmentación muy oscura y se hace difícil la observación a la luz del microscopio. 0.3.100 mL Esta solución se debe pasar por un filtro Whatman No. Procedimiento. Se corta con un bisturí o unas tijeras estériles la parte de la planta que se va a estudiar. Equipos. Digestor (“Stomacher”) o Sonicador Microscopio biológico. Homogenizador. Fenol……………………………………….05g Ácido acético 20% (v/v)………………….TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Reactivos y medios de cultivo. se recomienda teñir con una solución fenólica de azul de anilina. Una vez teñido el material por unos 2 a 3 min. se cubre con un cubreobjeto. Se colectan las muestras en bolsas plásticas conteniendo agua del lugar de la colecta y se trasladan al laboratorio donde se limpian de otros organismos.. Observación directa. Para realizar observaciones empleando microscopía de campo claro. Glicerina o barniz de uñas. se pueden conservar en una solución acuosa de thiomersal (BDH. se recomienda ante todo hacer una observación directa sobre la parte de la planta que se vaya a estudiar.2g/L). se coloca una gota de aceite de inmersión y se observan las bacterias al microscopio biológico.2g/L). Incubadora bacteriológica. Solución de eosina amarilla (BDH. Solución fenólica de azul de anilina. Aceite de inmersión. y se coloca en una placa Petri estéril. La preparación puede guardarse sellada con glicerina o con barniz de uñas. Detalles experimentales. 0.75g Azul de anilina soluble en agua…………0. 74 .1 antes de usarse. Es estable a temperatura ambiente por un período de 3 meses. obteniéndose entonces un cultivo de una sub población. se debe evaluar la eficiencia del tratamiento. aunque también se puede emplear cloroformo o cloro gaseoso. por lo que se puede hacer una pretinción. Después se procede a la tinción con la solución fenólica de azul de anilina. Para la identificación de bacterias aisladas de plantas vasculares y algas macrófitas se utilizan los mismos esquemas que se emplean para bacterias acuáticas. Existen otros procedimientos para observar bacterias epífitas como son microscopia de fluorescencia o electrónica. por lo que no las tendremos en cuenta. debiendo tenerse en cuenta que la composición de especies también varía con la edad de la planta y la especie. 0.2g/L) por 1 h. y se observarán las bacterias epífitas de color rojo oscuro sobre un fondo naranja claro. el metanol es un buen decolorante. Cuando la planta absorbe la solución fenólica de azul de anilina. que la cantidad de bacterias difiere de una parte de la planta a otra y de una especie a otra. La pretinción se hace tiñendo primero la planta con una solución de eosina amarilla (BDH. Aislamiento. digestión o ultrasonido pero en todos los casos debe tenerse sumo cuidado de no dañar las células. para separar las bacterias de la superficie de la planta se emplean procedimientos de homogenización. Tradicionalmente. y además. Este tratamiento tiene el inconveniente que algunas bacterias pueden ser lavadas de la planta. Una vez que las bacterias son removidas de la planta por el tratamiento que se haya aplicado. Para aislar bacterias de plantas de agua dulce Fry y Humphrey (1978) describieron el Medio Caseína-peptona-almidón. se dificulta la observación de las bacterias epífitas. No existe un medio donde puedan crecer todas las bacterias de una población.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA Para macrófitas acuáticas. La planta se sumerge en una cristalizadota con metanol durante toda una noche. se trata la suspensión como cualquier otra. Para el aislamiento debe emplearse un medio de cultivo acorde con las bacterias que se quieren aislar. a los que no se harán referencias. Página 75 . se escoge un atributo específico y se prepara el medio acorde con estos requerimientos. procediéndose a la siembra en el medio de cultivo seleccionado. por lo que a veces. Debe tenerse en cuenta que las hojas más viejas tiene mayor cantidad de bacterias que las hojas más jóvenes y también. (Ed. Davis. C. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. Techniques for the studies of bacteria epiphytyc on aquatic macrophytes. En: Tecniques for the Study of Mixed Populations. p. C. 2006.) B. En: Methods in Aquatic Bacteriology. W Lovelook y R.) D. y Humphrey. 171-191. J. Claro. H. (Eds.18-21. El macrofitobentos. B. Suárez. A.) R. Epiphytic Bacteria. Fry. Instituto de Oceanología. Reino VEGETAL. Austin. Soporte Electrónico. 1978. 1-29. (Ed. P . J. 76 . London. Academic Press.TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA BIBLIOGRAFIA Baker. . N. p. Capítulo 3 Técnicas Micológicas . TÉCNICAS MICOLÓGICAS 3.1. Aislamiento de hongos en las playas. Aislamiento de hongos arenícolas. El espacio que media entre los granos de arena de las playas, alberga una gran variedad de animales y plantas microscópicas, donde también están incluidos los hongos marinos. Los hongos marinos que habitan entre los granos de arena de las playas se conocen como “hongos arenícolas”. Este grupo posee una importancia ecológica relevante porque juegan un papel primordial como descomponedores primarios de la mayoría de los sustratos orgánicos que se encuentran en la playa, principalmente lignocelulósicos, por lo que contribuyen a remineralizar y reciclar los nutrientes en ese ambiente (Hyde et al. 1998). A escala internacional, el ambiente marino arenícola ha sido poco explorado desde el punto de vista micológico, por lo que la biodiversidad de hongos presentes en este medio aún ofrece la posibilidad de descubrir nuevas especies. Objetivos: Aislar e identificar hongos arenícolas a partir de restos vegetales cubiertos de arena. Materiales, reactivos y equipos empleados. Materiales. Pinzas y agujas de disección. Portaobjetos. Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm. Bolsas de polietileno con cierre hermético. Lupa. Reactivos. Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes. Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones. Equipos Microscopio estereoscópico. Microscopio biológico. Procedimiento. La colecta de muestras debe realizarse a lo largo de la zona intermareal o anteplaya, durante la marea baja. Se toman 30 unidades de muestra formadas por restos orgánicos (restos de madera, algas, etc.) cubiertos ligeramente con arena húmeda y se colocan de manera individual, en bolsas de polietileno cerradas herméticamente (Foto 3). Página 79 TÉCNICAS MICOLÓGICAS Foto.3. Bolsa de polietileno con restos vegetales cubiertos de arena. Las muestras se incuban por un período de cuatro meses, a temperatura ambiente, siguiendo el método de incubación de restos vegetales en cámara húmeda (Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1993; González y Herrera, 1993). Después de incubadas, las muestras se revisan al microscopio estereoscópico para localizar las estructuras de reproducción de los hongos sobre los diferentes restos vegetales (Foto 4). Foto.4. Ascocarpos de Corollospora maritima sobre granos de arena después de cuatro meses de incubación. 80 1983. Frascos estériles de boca ancha de 250 mL. Materiales. Las esporas fúngicas encontradas en la espuma de mar pueden caracterizar la micobiota de una playa en particular (Kirk.TÉCNICAS MICOLÓGICAS Las estructuras fúngicas encontradas se prepararan en fresco para ser identificadas al microscopio óptico mediante la Clave de identificación que propone Hyde et al. 2000). Espumadera o beaker. (2000). quedando muchas atrapadas entre las burbujas de aire de la espuma de mar. Formalina al 45% Equipos Refrigerador Microscopio biológico.4). Materiales. Cubreobjetos 18 x 18 mm y de 24 x 24 mm. Procedimiento Página 81 . Vrijmoed. pueden encontrarse Dendryphiella arenaria y Lepthospaheria sp. reactivos y equipos empleados. 1986). entre los que se encuentran las especies Corollospora sp y Varicosporina ramulosa (Capó. Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones. (Vrijmoed. Portaobjetos. También. 2000). Reactivos. Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes 50 mL. En la espuma de mar los hongos más comunes son los arenícolas. La morfología de las ascosporas y conidios de los hongos marinos favorece su transporte a través del oleaje. Objetivos: Aislar e identificar hongos de la espuma de mar aplicando el método de incubación de restos vegetales en cámara húmeda. Pipeta estéril. La conservación de las especies identificadas se realiza mediante preparaciones microscópicas permanentes (Ver Cap. Aislamiento de hongos en la espuma de mar. Las esporas fúngicas se observan con un aumento de 40 x.5. Espuma de mar que arriba a la zona intermareal. Se toma parte del precipitado con una pipeta y se realiza una preparación en fresco para observar al microscopio biológico. Foto. se deja que la espuma se disuelva y las esporas precipiten. donde las esporas se distinguen por refracción de las partículas amorfas no refractarias. preferiblemente utilizando microscopía de campo oscuro o contraste de fase. Las muestras son refrigeradas por dos horas a 5 °C para evitar la germinación de las esporas. cuidando no colectar restos de arena o agua (Foto 5). La espuma se vierte en frascos estériles de 250 mL de boca ancha. 82 . Para esto puede utilizarse una espumadera convexa o un beaker. A continuación. se le adiciona formalina al 45% a la espuma disuelta hasta obtener una concentración final del 5%.TÉCNICAS MICOLÓGICAS La espuma de mar se colecta fácilmente a lo largo de la costa. Si las muestras no pueden ser analizadas inmediatamente. Hyde y S. y Vrijmoed. Fungal Diversity Press Series. 9: 19-33. S. y Volkamann-Kohlmeyer. 1996. Mycologia 75: 670. 50. Mycology 10: 107. 34: 1-69. Vrijmoed L. Pointing. Sarma. B. D.7: 1147-1161. Hong Kong. B. Micromicetes endopsamófilos de Barra Navidad. M. Hyde y S. M. Role of fungy in marine environment. Hong Kong: 1-20. 1993. In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. ... Volkmann-Kohlmeyer. E. 172-204. 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K. Ilustrated key to filamentous marine fungi. Praderas de Thalassia testudinum frecuentes en los fondos de la plataforma submarina cubana. Las hojas de angiospermas marinas frecuentemente son trasladadas por las corrientes hasta los manglares o las orillas de las playas cercanas a los mismos. Aislamiento de hongos de los pastos marinos. En la región litoral del occidente de Cuba existe una arribazon casi constante de Thalassia testudinum (Foto 6). 84 . Thalassia testudium. Zostera marina. que es la especie predominante en los pastos marinos de la plataforma insular cubana (Suárez.2. Syringodium filiforme y Halodule wrightii. son fácilmente colonizados por hongos marinos (Kohlmeyer-Volkmann – Kohlmeyer. Foto 6. 2006). por lo que el intercambio puede ir en uno y otro sentido (Hemminga y Duarte. 2000). 2000). Las estructuras superiores no sumergidas de estas plantas pueden estar habitadas por hongos terrestres. Numerosas especies de estas como: Posidonia oceanica. donde se acumulan hasta su descomposición. Ruppia maritima. 1991).TÉCNICAS MICOLÓGICAS 3. Los pastos marinos son comunidades conformadas por angiospermas que se han adaptado a vivir en condiciones de inmersión permanente en el mar (Hemminga y Duarte. Materiales. lo que dificulta su visualización desde el exterior. Procedimiento. La colecta de los rizomas. Equipos. en este caso. Materiales.TÉCNICAS MICOLÓGICAS Objetivos: Determinar la abundancia de hongos marinos en los pastos marinos. las cuales están generalmente dispuestas en filas paralelas al axis largo del tallo. tallos y hojas de los vegetales que forman los pastos marinos se puede realizar directamente por un buzo o utilizando una draga. Reactivos. Las manchas carmelitas y blanquecinas en los extremos de las hojas indican el ataque de hongos. o desarrollarse después de incubar las hojas dañadas. Las muestras colectadas se colocan en bolsas de polietileno estériles con cierre hermético para su traslado al laboratorio. Cubres y portaobjetos. aproximadamente. Los cuerpos fructíferos pueden ser encontrados directamente sobre las hojas. Las manchas negras en los tallos y en la envoltura de las hojas indican la presencia de ascocarpos ocultos (Foto 7). Página 85 . Los ascocarpos y picnidios están casi siempre embebidos en el sustrato. Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones. También estas muestras pueden ser divididas longitudinalmente con el fin de hacer visibles las esporas. Microscopio biológico. Microscopio estereoscópico. Bolsas de polietileno estériles con cierre hermético. por un mes. la cutícula o las células de las capas externas de tallos y hojas deben cortarse tangencialmente con una cuchilla debajo del microscopio estereoscopio. reactivos y equipos empleados. Bisturí. Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes. por tanto. en los tallos y hojas. Una vez extraídas estas estructuras de reproducción se realiza una preparación en fresco para su identificación y posteriormente. se procede a la elaboración de la preparación microscópica permanente para mantener en colección. 1965). Si se quiere obtener cultivos puros de estos hongos se puede empler el medio de cultivo Thalassia agar (Meyer y Simms. 86 .TÉCNICAS MICOLÓGICAS Foto 7. Ascocarpos de Lindra marinera embebidos en una hoja de Thalassia testudinum. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. 2000. 298pp. y Duarte. 145 pp. Bot. Kohlmeyer. P .TÉCNICAS MICOLÓGICAS BIBLIOGRAFÍA Alcolado P García. . C. Soporte Electrónico. 1999. Protección de la Biodiversidad y Desarrollo Sostenible en el Ecosistema Sabana. Claro. El macrofitobentos. Seagrass Ecology. E. A. Página 87 . Hemminga M. Reino VEGETAL..Camaguey. 2006. Instituto de Oceanología. Mar. J. GEF-PNUD Sabana–Camaguey CUB/92/G31. M. (Ed. University Press. Ilustrated key to filamentous marine fungi. Suárez. 34: 1-69. y Volkamann-Kohlmeyer. B. 1991. y Espinosa N. A.18-21.) R. Cambridge. Allí se disponen entre las raíces donde son usadas como substrato. Los manglares juegan un papel importante en la productividad de las zonas costeras de diversas partes del mundo.. algunos de los cuales son fuentes potenciales de fármacos (Garateix y Ortiz. algas. el conocimiento integral del estado de conservación del ecosistema de manglar así como. Todo ello permite que estos fondos. sean ricos en nutrientes derivados de la descomposición de la materia orgánica generada por el bosque y los organismos que en él habitan (Bulte et al. 2000). además de contribuir al conocimiento y preservación de la biodiversidad marina. Por esto. Sin dudas. esponjas. refugio o ingeridas como alimento por disímiles organismos. Aislamiento de hongos asociados al mangle. 88 . Nieves–Rivera.TÉCNICAS MICOLÓGICAS 3. Los manglares son el medio ideal para el crecimiento y reproducción de los hongos. el estudio de su biota asociada adquiere una gran importancia. en especial los lignícolas (Hype y Sarma. y los que se extienden a continuación del manglar. 2005). no poseen un nivel de estudios que permita evaluar la riqueza biológica que alberga en toda su extensión. 2002. hasta ser completamente destruidas con la ayuda de los microorganismos. importancia ecológica y significación económica. ascidias etc.3. Los manglares del Caribe antillano acogen en sus raíces una gran diversidad de organismos como hongos. sin embargo. lo que se corrobora con la variedad de especies encontradas en estudios recientes (Besitulo et al. aunque la mayor diversidad de hongos está generalmente asociada al material que permanece sumergido por largos periodos de tiempo (Foto 8). este ecosistema aporta sustratos favorables para el crecimiento de los hongos. a pesar de su magnitud. De la parte sumergida del manglar han sido aislados ascomicetes. 2005). 2007). lo que ratifica la amplia distribución geográfica de este grupo. Las hojas secas y ramas de muchos de los árboles y arbustos que componen el bosque de manglar caen al agua espontáneamente o forzadas por las lluvias y el viento. desechándose las partes embebidas en el suelo. Refrigerador. Equipos. Porta y cubre objetos para preparaciones microscópicas permanentes. Bolsas de polietileno estériles con cierre hermético. Objetivos: Aislar e identificar hongos marinos asociados a hojas. reactivos y equipos empleados. Mangle sumergido. Microscopio biológico. Materiales. Barniz de uñas transparente para sellar las preparaciones. sustrato ideal para ser colonizado por los hongos marinos. Las muestras de las raíces y ramas de mangle sumergidas se cortan justo encima del sedimento. Bálsamo de Canadá para elaborar preparaciones microscópicas permanentes.TÉCNICAS MICOLÓGICAS Foto. Materiales. Tijeras. Bisturí. 8. Reactivos. Microscopio estereoscópico . Procedimiento. pues Página 89 . ramas y raíces de mangle sumergidos. Foto 9. pues aquí se desarrollan los cuerpos fructíferos y conidios de los hongos con mayor facilidad (Foto 9). (1988) y Hyde y Sarma. al menos. se realizan preparaciones microscópicas para examinar el material y se identifican las especies empleándose las claves Kohlmeyer y Kohlmeyer. (1979). Se toman pedazos de hojas. Hojas de Rhizophora mangle colonizada por el hongo mitospórico Cercospora sp. Las muestras se colocarán en bolsas de polietieno estériles y serán examinadas o conservadas a 5 °C en el laboratorio. pues estarán habitadas por hongos terrestres. (2000).TÉCNICAS MICOLÓGICAS generalmente carecen de oxígeno y están pobladas por bacterias anaerobias. nunca aquellas que se encuentren por encima de la superficie del agua. o que presenten manchas. raíces o ramas que hayan perdido la corteza. Jones y Hyde. Debe tenerse el cuidado de colectar solamente aquellas partes que están sumergidas. en algún momento del día. como lo indica el color negro y el fuerte olor a H2S. Posteriormente. 90 . P y Shearer. and mangrove fungi. Hyde y S.V land.M. A. 2005. 272 p. ISME. In: Fungi in Marine Environments (ed. Divers. K. Pointing). C. K. 7:247-265.A. . R. Asian Marine Biology 7: 93-107. Ecoservices: Assessing the impacts of biodiversity changes on ecosystem functioning and services. . Okinawa. Página 91 . K. D.1. K. A. Japón. Hyde. No. 205-270. A. Usos y Servicios de la Biodiversidad.D. A checklist of mangrove.M. Claro (ed). Res. A comparison of the intertidal mycota of five mangrove tree species.. Cap. Mycotaxon 85: 423. Tesis Doctoral. Conservation and Sustainable Utilization of Mangrove Forest in Latin America and Africa Regions: Part 1 – Latin America. A pictorial key to higher marine fungi In: Marine Mycology -A practical Approach (Eds. ISME. 2007. 2002.y Hyde. Besitulo. B. 1993. Fungal Diversity Research Series 7:267-283..D. D. 2003.TÉCNICAS MICOLÓGICAS BIBLIOGRAFIA Abdel-Wahab. Hong Kong. Fungal Diversity Press Series. Mangrove Ecosystems Technical Reports. their geographical distribution and knows host plant. 40 p..D. . A. Ecology of subtropical mangrove fungi with emphasis on Kandelia randel mycota. Nieves – Rivera. H. 2002 Mangrove fungi from Siargio Is. p. Schmit. En: La Biodiversidad Marina de Cuba. Fung. Vol. Instituto de Oceanología. Universidad de Puerto Rico Mayaguez -Campos. K.associated fungi. 2.D. E. 2005. Diversitas Rep. y Larigauderie. Hyde).A.(ed). Coastal mycology of Puerto Rico: a survey and Biological aspects of marine estuarine. Héctor. Vol.M. En: Hyde. Garateix. J. E.477.D. A. Sarma V . K. 1990. 3. Fungi in marine environment. ISBN 978-959-298-001-3 Hyde. Bulte. y Ortiz. Philippines. y Sarma V V 2000. y El-Sharouny. son aún insuficientes (Morrison-Gardiner. Caldo Extracto de Malta. Aislamientos de hongos asociados a organismos marinos. fragmentos de corales y moluscos. Estos autores identificaron 22 especies de ascomicetes y hongos anamórficos asociados a esponjas costrosas.agar (J8V).Kohlmeyer (1987. así como sobre las interacciones de los hongos con los organismos que viven en los arrecifes. Reactivos y medios de cultivo. 2002). 2000).06%. Bolsas Ziploc estériles. sin embargo. Tubos de cultivo. medios de cultivo y equipos empleados. 1989.6 mL. y sus síntomas en varios hospederos. reactivos. Jugo de ocho verduras. Las investigaciones acerca de los hongos asociados a los arrecifes coralinos se han dirigido principalmente.TÉCNICAS MICOLÓGICAS 3. Objetivo: Aislamiento e identificación de hongos marinos asociados a gorgónidos. algas coralinas. usualmente en forma de necrosis del tejido o biomineralizacion (Rand et al.5 mL).4. Papel de filtro. 2003). Pinzas. Borneman. pasa inadvertida. al estudio de enfermedades en corales blandos como los abanicos de mar (Gorgoniidae) (Geriser et al. penicilina 1mL y cloranfenicol 2. Solución de hipoclorito de sodio al 0. 1992). Nevera o hielera (4oC de temperatura). La presencia de hongos filamentosos en sustratos calcáreos sumergidos por lo general. 2008). la presencia de estos microorganismos en los arrecifes coralinos ha sido descrita por Kohlmeyer y Volkmann. Materiales. Cajas Petri. Datos recientes señalan la especie Aspergillus sydowii como responsable de la destrucción masiva de corales en el mar Caribe (Harwksworth. los estudios sobre la biodiversidad de hongos marinos. Materiales. Harina de maíz agua de mar con antibióticos (estreptomicina 0. 1998. 92 . A pesar del interés del tema. El procedimiento que se describe a continuación es el método de Morrison-Gardier (2002) modificado (Medina. Microscopio biológico. penicilina 1mL y cloranfenicol 2. Las bolsas con las submuestras se cierran convenientemente y se transportan al laboratorio en una nevera o hielera a 4 °C aproximadamente. Procesamiento. para obtener 120 pedazos pequeños (aproximadamente de 5 cm2 del tejido del organismo). se procesan las submuestras restantes. para su procesamiento antes de las 2 h de colectadas.06 % y agua de mar estéril. ayudándose de unas pinzas estériles. Este control demuestra la esterilidad del material y del proceso al no obtener crecimiento de ningún hongo al final del procedimiento. 2005). Sobre la superficie de cinco placas Petri conteniendo medio de cultivo harina de maíz-agua de mar (HMA) con antibióticos (estreptomicina 0. Microscopio estereoscópico. y se desinfectan superficialmente con solución de hipoclorito de sodio al 0. El tubo con el caldo inoculado se vierte sobre los pedazos de papel de filtro contenidos en una bolsa Ziploc estéril. se colocan 20 pedazos de papel de filtro embebido con el agua destilada estéril en cinco cajas Petri con medio HMA y para el control positivo. Para preparar el control positivo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de caldo extracto de malta y se inocula con Aspergillus fumigatus. se colocan cuatro pedacitos separados del tejido del organismo (inóculos) y de la misma forma. Debe preparase un control negativo y otro positivo. en bolsas Ziploc estériles. Esto demuestra que el método es efectivo si al obtener al final del proceso solamente el hongo que se inocula inicialmente. de manera individual. Para el control negativo se toma un tubo de cultivo con 10 mL de agua destilada estéril y se vierte en una bolsa Ziploc estéril con pedazos de papel de filtro. Nevera portátil o hielera. Procesamiento de los controles: Del control negativo.6 mL. En el laboratorio.5 mL para 1 L de medio). las submuestras del gorgónido o coral blando se cortan con tijeras flameadas y estériles. se colocan Página 93 .TÉCNICAS MICOLÓGICAS Equipos. se toma una muestra del gorgónido o coral blando y se divide en seis submuestras que se colocan inmediatamente. de igual manera. En el área de muestreo. Kohlmeyer y Volkmann-Kohlmeyer (1991) y Hyde y Pointing (2000). se consultan las claves taxonómicas especializadas como Barnett y Hunter (1998). las colonias se pasan a tubo con este mismo medio. Todas las cajas Petri (muestras y controles) se incuban a temperatura ambiente por 25 días y se revisan diariamente. Posteriormente.TÉCNICAS MICOLÓGICAS 20 pedazos de papel de filtro inoculados con A. Todas las colonias de hongos obtenidas que crecen con diferente morfología. fumigatus en cinco cajas Petri con medio HMA. 94 . Para la identificación de los hongos obtenidos. se transfirieren a cajas de Petri con medio de cultivo jugo de ocho verduras agar (V8A) y se valora su incidencia. .. Hyde y S. y Volkmann-Kohlmeyer. E. 1991..TÉCNICAS MICOLÓGICAS BIBLIOGRAFÍA Barnett. death in the West Indies. Tesis de Licenciatura. Crypt. J. W Ritchie. Página 95 . Koralionastetaceae Fam Nov. Hong Kong: 205-270. J. 2000. Mycologia 79: 764-778. y Volkamann. . Aspergillosis in sea fans. Kohlmeyer. B. V V 2000. B. 4th ed. del arrecife de las Islas Marietas. associated with wasting disease in two species of Tilapia from Puerto Rico. B. Medina Ortíz. Ilustrated key to filamentous marine fungi. 34: 1-69. T. Kohlmeyer. Wlliams.. Borneman. Mycologia 81: 289-292. J. D. B. W 1998.B. M. USA: APS Press. . Nayarit.Kohlmeyer. L. B. K.M. Rand. Fungal Diversity 9: 105-121.arecifevivo. Mycological Research 107: 129-130. A new Lulworthia (Ascomycotina) fron corals. H. 2005. Illustrated genera of imperfect fungi. J. y Volkmann.12. B. 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Conservación por congelación. que durante el tiempo de conservación sobrevivan. lo que evita la congelación y descongelación sucesiva de las cepas. También. No obstante esta ventaja. al menos. Los métodos de conservación a largo plazo son los mejores porque garantizan al máximo la estabilidad genética ya que se paraliza el crecimiento de las células microbianas. que se cierran herméticamente conocidos como “criotubos”. debe determinarse cual es el más apropiado para cada caso particular. se pueden preparar tubos con “criobolas” impregnadas con la solución celular a congelar. y que estas células permanezcan genéticamente estables (García y Uruburu. las posibilidades técnicas del laboratorio y la disponibilidad de recursos. Los tubos cerrados o sellados se guardan a temperatura inferior a cero grado celsius (-195 °C) en nitrógeno líquido. los requerimientos del microorganismo a conservar. que se utilizan según el objetivo del trabajo. Existen varios métodos de conservación. Para conservar correctamente las cepas de microorganismos en los laboratorios deben cumplirse tres requisitos: que el cultivo esté puro. A este grupo pertenecen dos métodos: la congelación y la liofilización. 2001).1. no se puede descartar que ocurra algún cambio originado en la etapa de preparación de las condiciones para la aplicación del método. Teniendo en cuenta que no existe un método general para la conservación de microorganismos. de los cuales los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de -70 °C. o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido con una temperatura de -140 °C. Se recomienda preparar varios lotes de tubos por cepa y utilizar uno para cada ocasión necesaria. Conservación de Bacterias. Estos métodos pueden dividirse en tres grupos: • Métodos de conservación a largo plazo • Métodos alternativos • Métodos restringidos Métodos de conservación a largo plazo. lo que evita la aparición de generaciones sucesivas. el 70-80 % de las células. Para conservan las cepas en estos armarios se utilizan unos tubos plásticos esterilizables resistentes a la congelación.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN 4. sin que las células mueran. Consiste en la congelación de las células en suspensión en un líquido conteniendo un agente crioprotector. Página 99 . Consiste en la sublimación del hielo en las células. por tanto. En este caso. sean rápidas y se recomienda descongelar las células a una temperatura de 37 °C. Para realizar este proceso se utilizan los liofilizadores. primero hay que congelar el agua libre en las células y luego eliminarla mediante el vacío. como el dimetilsulfóxido. se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos. Estos métodos se utilizan cuando la cepa no resiste los métodos anteriores o cuando carecemos de los equipos y recursos necesarios. Este es un método muy recomendado por la comodidad que tiene el almacenamiento y el envío de los liofilizados. hay un mayor contacto con el oxígeno y puede afectarse la viabilidad. entre estos. Métodos alternativos de conservación. Conservación por liofilización. 100 . aunque existen muchos compuestos que se pueden usar. la leche descremada y algunos azúcares. porque es algo tóxico y al concentrarse puede dañar las células. Las suspensiones celulares para liofilizar deben tener una concentración de 108 -109 células/mL y la temperatura durante la sublimación debe ser lo más baja posible. Para liofilizar no debe utilizarse glicerol como agente crioprotector. ya que al estar las células adheridas a una superficie. el agente más utilizado es el glicerol a una concentración del 15 al 20%. Hay algunos microorganismos que no resisten la liofilización. que requiere equipos especializados y que algún fallo en el sistema puede producir una subida de temperatura durante el almacenamiento. para congelar o descongelar. y entonces hay que recurrir a otros métodos. En cuanto a los agentes crioprotectores. Se recomienda que las variaciones de temperatura. solo se tiene que incubar nuevamente a una mayor temperatura. Tampoco debe utilizarse dimeltilsulfóxido. debido a su elevado punto de evaporación y su higroscopicidad que provoca que los liofilizados queden muy viscosos. Para trabajar con células que están conservadas por congelación. El almacenamiento puede hacerse a temperatura ambiente (18 °C -20 °C). Este método tiene algunos inconvenientes.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN El método de las criobolas no debe emplearse con microorganismos anaerobios. pues las células excretan productos tóxicos del propio metabolismo que se acumulan y provocan envejecimiento y muerte celular. Este método ha mostrado altos porcentajes de viabilidad en periodos hasta de 5 años. ya que al cabo del tiempo. se recomienda disminuir la cantidad de inóculo. y también. no se ha comprobado la estabilidad de caracteres específicos como virulencia. las células que se están guardando son descendientes lejanas de las que se tenían originalmente y es posible que ya no conserven algunas de sus características. por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio fresco. etc. Este método consiste en guardar la cepa en un tubo con el mismo medio de cultivo en el que ha crecido. teniendo en cuenta que requieren de una manipulación más seguida. no puede permanecer por tiempo indefinido en el mismo tubo. Si se preparan las suspensiones en criotubos. la concentración celular (para bacterias y levaduras) no debe ser mayor a 104-105 células/mL. Para evitar la desecación del medio de cultivo. inocular en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos. Consiste en suspender en agua estéril o en agua de mar al 75% estéril. se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Este método es el peor para mantener la estabilidad genética. Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. poder fermentativo. • Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Sin embargo. o rebajar la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN Pueden ser: • Conservación por transferencia periódica. células del cultivo que se quiere conservar. Página 101 . Con el fin de alargar los periodos entre las resiembras. Conservación por transferencia periódica. almacenar los cultivos a 4-8 °C. La transferencia periódica también facilita la contaminación de los cultivos. pero aunque la estabilidad para caracteres morfológicos y fisiológicos es buena. Consiste en esterilizar en autoclave pequeñas porciones de suelo o arena. por dos días sucesivos. y colocar los tubos con las tapas cerradas suavemente. silicagel. Debe evitarse que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas entre 4 y 18 °C. 102 . Los discos se secan y mantienen igual que se describió antes. Se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células. e incluso a -80 °C debido al bajo contenido de agua y la protección que ofrece el alginato. Se utiliza papel Whatman No. Para revivir las células se toma un disco o una tira con una pinza estéril y se coloca en otro tubo con medio adecuado. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. en tubos con tapas de rosca.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN Métodos restringidos Los métodos restringidos son aquellos que no se emplean habitualmente. También puede utilizarse el procedimiento de “desecación líquida” (L-Dry) en el cual. sacar los tubos. pueden emplearse discos o tiras de papel embebidos en una suspensión del cultivo que se quiere conservar. en una desecadora con sílica gel cerrando la tapa de la desecadora firmemente. y posteriormente.3 (bastante absorbente) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire en condiciones estériles. También. Desecación en bolitas de alginato. en tubos con tapa de rosca. etc. Luego. se usa el liofilizador pero sin que se haya hecho una congelación previa de las células. cerrar las tapas fuertemente y colocarlos en otra desecadora que puede mantenerse en el refrigerador a temperatura entre 5 y 8 °C. añadirle a cada tubo 1 mL de la suspensión de células del microorganismo (o suspensión de esporas). Ese método es muy bueno para microorganismos productores de esporas. con cuidado no contaminar el stock. arena. pero que pueden usarse cuando hay que conservar microorganismos que no resisten la liofilización o la congelación. ocasionando la congelación descontrolada de las células. Desecación en papel de filtro. Desecación en suelo. Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán de desecar. pero las células dejan de multiplicarse por insuficiencia de agua disponible. Página 103 . Se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN Desecación en sal gruesa para halobacterias. En este método. la desecación no es total debido a la higroscopicidad de la sal. es/cect Hunter-Cevera. Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Belt (eds.uv.G. F. J. García.D. 104 . London. New Jersey. Acad. 1996.).C. y M. y Uruburu. M. Press.1995.R. Cryopreservation and freeze-drying protocols. J.). y A. http://www. Maintaining cultures for biotechnology and industry. Humana Press.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN BIBLIOGRAFIA Day. Totowa. McLellan (eds. deshidratados.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN 4. Conservación de Hongos. La aplicación de las técnicas de deshidratación depende del sustrato en que ha sido encontrado el hongo. Los materiales duros o gruesos como la madera.5%) en la tapa de la placa y se pone a flotar el cultivo en el agar caliente hasta que este se solidifique. la identifiPágina 105 . el tejido intersticial y los apéndices de las esporas son estructuras muy delicadas y pueden encogerse. Los ascomycetes y deuteromycetes permanecen morfológicamente inalterables aún después de repetidos procesos de congelación y descongelación. citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer. aunque no siempre se obtienen buenos resultados. rizomas o algas calcáreas se pueden secar al aire libre y a la sombra. evitando la ruptura de los cuerpos fructíferos que tiende a ocurrir con el secado al aire libre. se vierten 15 mL de Agar glicerol caliente (2. Las ascas. Para remover el agar seco de la placa Petri.2. por tanto. congelados. Conservación en líquidos. Luego se destapa con la placa invertida. 1979). este se guarda en bolsas plásticas con agua salada. la liofilización y las preparaciones permanentes sean los más acertados. pero probablemente. Este método garantiza una mejor conservación del material. entre estas se encuentran: conservación en cultivos puros. en líquidos o en preparaciones permanentes. Con los sustratos secos se hacen cultivos puros según el método descrito por Pollack (1967). Hay varias formas de preservar los hongos. Deshidratación. corteza. Los hongos que viven en la madera y en las algas se conservan muy bien mantenidos a temperaturas cercanas a los -18 °C (Kohlmeyer y Kohlmeyer. la congelación. 1967. 1979). Congelación. Los líquidos que más se usan en la preservación de los hongos marinos son las soluciones de etanol (70%) y de formol (5%) preparadas con agua de mar. Las algas más blandas se secan prensando entre pedazos de tela (Dawson. Los hongos almacenados de esta forma pueden permanecer así indefinidamente sin que varíe su morfología. se separa y se seca completamente. La liofilización de los hongos marinos se recomienda cuando se dispone de buenos equipos. citado por Kohlmeyer y Kohlmeyer (1979). No existen reglas que establezcan la superioridad de un método con respecto a otro. perdiendo su utilidad para trabajos futuros. Para evitar la deshidratación del sustrato durante la refrigeración. La técnica del doble cubreobjetos descrita por Volkmann-Kohlmeyer y Kohlmeyer (1996) es una de las más utilizadas. Preparaciones microscópicas permanentes. hacer las observaciones microscópicas del material vivo para asegurarnos que se encuentra la estructura que deseamos conservar. cubrir con un cubreobjeto más pequeño (de 18 mm x 18 mm) e inmediatamente. Separar el cubreobjeto grande del portaobjetos y colocar una gota grande de Bálsamo de Canadá sobre el cubreobjeto pequeño. Seguidamente. Limpiar los residuos y sellar la preparación por los bordes con esmalte de uñas. El uso de estos compuestos como fijadores es conveniente si el material se secciona después de la deshidratación y es embebido en cera. lugar de colecta y fecha. Las preparaciones microscópicas permanentes se realizan con el objetivo de conservar los materiales observados y protegerlos de la deshidratación para que puedan ser utilizados en futuras investigaciones. se guardan en cajas apropiadas. Los líquidos que contengan esporas deben examinarse lo más rápido posible después de la colecta. Después. Pueden conservarse añadiendo formalina hasta obtener una solución al 5%. Después de las observaciones. además de que son constancia de la existencia de las especies descritas. adicionar una gota de glicerina al agua por uno de los lados y guardar el cubreobjetos en una atmósfera seca para que el agua se evapore. Después de rotuladas convenientemente las preparaciones con los datos de la especie. 106 . y en ella el material. Colocar un cubreobjeto (de 22 mm x 22 mm) sobre un portaobjetos (de 26 mm x 76 mm) y hacer que este se adhiera al porta añadiendo unas gotas de agua destilada a ambos lados del cubreobjetos. colocar una gota grande de agua destilada en el centro del cubre.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN cación de especies conservadas en etanol o formol es dudosa. pero siempre es mejor conservar el sustrato vivo en un criostato. se cubre permanentemente el anillo de esmalte de uñas. Virar la preparación sobre la gota de montaje y colocar sobre el portaobjetos. sustrato. Procedimiento. La gota de Bálsamo de Canadá sale hacia los bordes y rodea las terminaciones del cubreobjetos pequeño y de esta forma. Academic Press.108. Mycologia 10:107. Volkmann-Kohlmeyer. J. J.1996. y Kohlmeyer. E. y Kohlmeyer.MÉTODOS DE CONSERVACIÓN BIBLIOGRAFIA Kohlmeyer. New York. Página 107 . 1979.The higher marine fungi. B. Marine mycology. How to prepare truly permanent microscope slides. . Capítulo 5 Técnicas y Métodos en Ecología Microbiana . . 6-bis[dimetilamino]acridinium cloruro) y el DAPI (4´. Este método tiene la ventaja de que permite un estimado más exacto del número total de bacterias.2 µ de diámetro de poro. Preservativos. Kepner y Pratt (1994) hicieron un detallado análisis de las ventajas e inconvenientes del método e incluyen recomendaciones para que se generalice un único procedimiento y se brinde mayor información sobre los detalles técnicos en las publicaciones. Conteo directo del número total de microorganismos. reactivos y equipos empleados. El número total de microorganismos es una información importante para entender el papel ecológico de las bacterias en cualquier ecosistema. de manera que los resultados obtenidos por diferentes autores puedan ser comparados. ya que incluye el conteo de células vivas.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5. Los colorantes más empleados en esta técnica son la naranja de acridina (3. por su forma y tamaño. los cuales permiten identificar las bacterias no sólo por su color.40 g de NaH2PO4. Materiales. En general. Reactivos a.1. lo cual es de mucho interés para la elaboración de modelos tróficos. activas e inactivas y viables no cultivables. Materiales. Objetivo: Determinar el número total de microorganismos en una muestra de agua de mar. Página 111 . El conteo directo del número total de microorganismos empleando microscopía epifluorescente se considera el mejor método disponible en la actualidad para la enumeración de bacterias en muestras naturales. Filtros de membrana de policarbonato de 0. 0. A partir de este valor se pueden calcular la biomasa y la productividad bacteriana en el medio marino. 80 mL de agua destilada.6-diamidino-2fenilindol). muertas. Glutaraldehído buffereado 10% (w/v). sino también. 20 mL de 50% (w/w) glutaraldehído. Formalina.23 g de Na2HPO4. el método se basa en la filtración de la muestra a través de un filtro de membrana que es sometido posteriormente a tinción con el colorante seleccionado. 1. Las muestras para conteo directo de bacterias deben preservarse enseguida.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA b. 10 H2O. la formalina (solución acuosa de formaldehído al 40% vol/vol). 44. las partículas de sedimento. Después se lavan en agua previamente esterilizada por filtración. por tanto. Dispersantes. con la agitación mecánica de la muestra. Equipos. 1L de agua destilada. Portafiltros.1 M tetrazolium Ppi. Detalles experimentales. 0. ultrasonido. Membranas de filtración. El colorante más usado es el Irgalán negro (2g/L en solución de ácido acético al 2%) en el cual se sumergen las membranas de 2 hasta 24 h. Desagregación y dispersión de las partículas en muestras de sedimentos. Aunque se use un preservativo químico. el glutaraldehído al 4% congelado. es recomendable que se guarden en frío (4 o 5 °C) y en oscuridad hasta su procesamiento. algas u otras partículas de materia no viva pueden interferir en la visualización de los microorganismos. Bomba de vacío. Para esto se puede usar agitación. Las membranas de policarbonato deben teñirse antes de la filtración para reducir la fluorescencia del fondo y aumentar el contraste. Microscopio epifluorescente. si no van a ser procesadas inmediatamente después tomadas. es mejor hacerlo lo más rápido posible después de colectada la muestra. la mezcla lugol-formalina-tiosulfato. y una combinación de glutaraldehído y paraformaldehído. Los preservativos más utilizados son el formaldehído al 4%. Fluorocromo: solución patrón de naranja de acridina al 1%. digestiones. En las muestras de sedimentos. lo que favorece el conteo. c. es necesario separar las bacterias adheridas a partículas y detritus. el glutaraldehído al 1%. que en cualquier caso.61 g de Na4P2O7. u otros tratamientos que combinan dispersantes químicos como el Tween 80 o el Tritón X-100. y se secan a temperatura ambiente 112 . el tamaño y hasta en la forma celular de las bacterias en las muestras. ya que en menos de 24 h pueden ocurrir cambios en el número. antes de la filtración. Preservación de las muestras. El tiempo de la tinción varía de acuerdo con el colorante y el tipo de muestra (Tabla 4) pero generalmente.) Suelos/ Agua dulce Agua marina Superficies sedimentos 3. Tiempo de exposición (min) (promedio+ D. recomendándose un volumen mínimo de 2 mL para membranas de 25 mm de diámetro.6 + 6.5 9.0 5. generalmente se usan volúmenes desde 0.0 + 5.2 10. Para el conteo se usa una rejilla ocular cuadriculada y un aumento de 1250 X. Tomado de Kepner y Pratt.5 + 6. Asumiendo que las bacterias se distribuyen en la membrana siguiendo una distribución de Poisson y para reducir el 95 % de intervalo de confianza al 10 % de la media.8 3.5 hasta 15 mL. La precisión del conteo depende del número de bacterias contadas.5 15 12 7 1 Colorante NA DAPI n Cuando es de interés del técnico el conteo de fototrofos.fenilindol (DAPI). Página 113 .4 + 6. es menor el tiempo que se requiere cuando se usa naranja de acridina que el colorante 4´6 –diamino-2. Se recomienda aplicar una presión menor de 30 mm Hg (<4 kPa) y membranas de policarbonato con un diámetro de poro de 0. se recomienda usar DAPI como colorante en lugar de naranja de acridina porque éste último puede enmascarar la autofluorescencia roja de la clorofila. Tabla 4. El volumen de muestra a filtrar también es importante.8 +2-5 8.1+ 1.2 µm. Tiempo de exposición empleado para tinciones usando como colorantes naranja de acridina (NA) o 4´6 –diamino-2. La presión de vacío que se aplique para la filtración debe ser mínima para evitar el rompimiento de las células y su penetración en la membrana.fenilindol (DAPI).8 4. la mayoría de los investigadores cuentan por lo menos. Para aumentar la exactitud del conteo.1 2.5 + 3. se recomienda hacer réplicas al nivel de submuestras y filtros. (1994). n: número de muestras comparadas.S. lo que facilita las operaciones. 400 células por filtro.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA En el mercado se pueden adquirir membranas ya teñidas (Black policarbonate membrane). Método de conteo. el volumen requerido es menor.2 µm de diámetro de poro. pudiendo variar desde 0. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión no fluorescente sobre un portaobjeto limpio y rotulado. 1%) o con formalina (concentración final. Lavar la membrana con agua (esterilizada previamente por filtración). Añadirle la naranja de acridina teniendo en cuenta que la concentración final debe ser 0. para remover el exceso de colorante que pueda quedar. El volumen de agua a filtrar puede determinarse por prueba y error. de acuerdo a las características del lugar. Procedimiento. pero es recomendable contar el mismo día. de 10 a 15 mL será suficiente. y en aguas eutróficas o mesotróficas (con mayor cantidad de células). Colectar las muestras de agua con frascos estériles de 200 mL de capacidad y preservar con glutaraldehído bufereado (concentración final. Si se requiere filtrar mayores cantidades. 2 %). 114 . Desconectar el vacío. como las oceánicas. Presione el cubreobjeto para eliminar las burbujas de aire si fuera necesario. y se procede a la filtración por membrana de policarbonato de 0. Este error no puede evitarse pero sí disminuye cuando la persona que cuenta gana en experiencia en el reconocimiento de la morfología de las bacterias. Si son aguas oligotróficas. cuidando ejercer una presión homogénea. safar el portafiltro y retirar la membrana con unas pinzas.5 hasta 15 mL. Si no puede contarse inmediatamente.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA No puede dejar de considerarse el error que introduce cada observador. Asegúrese que quede hacia arriba el lado correcto de la membrana. el portaobjeto puede guardarse en refrigeración (4 °C) y oscuridad hasta 1 mes. puede usarse una bomba de vacío y <4 kPa de presión. Si se filtran pequeñas cantidades de agua puede usarse una jeringuilla estéril. Se tiñe por 3 min si son muestras de aguas y por 4 min si son de sedimentos. Coloque otra gota de aceite de inmersión sobre la membrana y cúbrala con un cubreobjeto.01% (W/V). empleando igual volumen que el de la muestra filtrada. Si se trata de bacterias asociadas a superficies. después de puesta la membrana en el portafiltro es menor. Cuando se usa naranja de acridina las células pueden verse de color naranja. Para calcular el número total de bacterias en la muestra original se utiliza la siguiente fórmula: NTB = (N x At) / (d x Vf x G x Ag) donde. NTB: número total de bacterias (células/mL) N: número de células contadas (células) At: área efectiva del filtro (mm2 o micras cuadradas) Vf: volumen de la muestra diluida (mL) d: factor de dilución. El conteo se hace mejor en un cuarto oscuro. teniendo en cuenta que el área que queda disponible para el paso del agua.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Conteo y cálculos Determine el área efectiva de filtración. (Vfinal/Vmuestra) (mL) final. garantizar un 95% de intervalo de confiabilidad. que incluye el preservativo y el dispersante si se añadió también. se expresa en número de células por unidad de área (mm2). Determine el área del campo del ocular (o de la rejilla que utilizará) con el aumento que usará para el conteo y una regla micrométrica. rojizo o verdes. Página 115 . Se puede hacer un “blanco” y restarle la densidad de células del cálculo En el caso de muestras de suelos o sedimentos. Cuente un mínimo de 400 células por filtro. el número total de bacterias se reporta por volumen de sedimento (cm3) o por gramo (peso seco). y Jasper. Daley. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microscopy. 116 . y Pratt. Kepner. Applied Environmental Microbiology 33:1225-1228. J. R. Use of Fluorochromes for Direct Enumeration of Total Bacteria in Environment Samples: Past and Present. S. L. 1994.1977. R. J. E.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA Hobbie. Microbial Review vol. R.58.. 4:603-615. J. 1969). 1975). representa una parte significativa del pool de carbono orgánico que existe en la biosfera. el cual. Determinación de biomasa. 1993). Página 117 . se puede evaluar su disponibilidad como alimento para otros organismos de la trama alimentaria (Bratbak. • A partir de las mediciones del ácido murámico como un componente de la pared de las células procarióticas (Morearty. 1993. Fukuda et al. 1994). 1988. 1992. • A partir de la determinación de lipopolisacáridos (Dobbs y Findlay.2. y constituye uno de los parámetros más importantes en los estudios de Ecología Microbiana ya que a partir de este valor. Bratbak. independientemente de que se encuentre viva o muerta. Norland. Las bacterias marinas son las principales consumidores del carbono orgánico disuelto (COD) que existe en el océano. activa o inactiva.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5. Dos de los coeficientes más usados para convertir las densidades bacterianas en unidades de concentración de carbono son: 2. 16 moles C/L. 1984). La biomasa bacteriana puede considerarse como el carbono celular asociado a la célula intacta. ya que en dependencia de las condiciones ambientales varía.2 x 1013 gC/µm3 = 18 mol C/L-volumen celular (Bratbak y Dundas. Heinanen. Para expresar la biomasa en unidades de carbono se debe utilizar un coeficiente de conversión. Ducklow. En la literatura especializada están reportados diferentes coeficientes que también pueden ser utilizados según las condiciones y tipo de ecosistema (Tabla 5). • A partir de la determinación del trifosfato de adenosina (ATP) (Holm-Hansen. el cual debe ser determinado para el lugar donde se está investigando. 1993). la cual es consumida a su vez por los organismos de niveles tróficos superiores. • En la actualidad la determinación de la biomasa bacteriana a partir del conteo total y el cálculo del biovolumen es uno de los métodos más empleados ya que es fácil y rápido. 2000).volumen celular (Christian y Karl. Para la estimación de la biomasa microbiana existen varios métodos entre los cuales se encuentran: • A partir del número total de microorganismos y el cálculo del biovolumen promedio (Alongi. 1993. 1998. Paralelamente al consumo de COD las bacterias llevan a cabo el proceso de mineralización mediante el cual el COD se convierte en CO2 con la consiguiente producción de biomasa (materia orgánica particulada). 30. Methods in Microbiology Vol.17 – 1.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Tabla 5.09 – 0.52 – 2.253 0. Valores de volumen celular y factores de conversión expresados en unidades de carbono a partir de diferentes metodologías y condiciones de cultivo (Tomado de Marine Microbiology.08 – 0.71 567 238-964 MicroscoMedio pia epifluoAguas de n a t u r a l rescencia y estuario no enrianálisis de quecido imágenes MicroscoMedio pia epifluoA g u a natural rescencia y dulce no enrirejilla ocuquecido lar Cultivo puro de agua de mar Medio Contador natural de enriquepartículas cido 0.53 186 84-353 0.163 0.290 0. John H.34 351 178–728 0.75 136 59–252 118 .545 0. Biovolumen (BV) (µm3) Factor de conversión (FC) (fgC/µm3) FC variación Fuente Tipo de cultivo Método de determinación del biovolumen BVmedio variación Cultivo puro de agua de mar Medio natural enriquecido Microscopio electrónico y fotomicrografía epifluorescente 0.11 – 0. Academic Press. 2001).376 0. Ed. Paul.02 209 155–292 Medio Contador Agua de n a t u r a l de mar no enripartículas quecido Medio A g u a natural dulce enriquecido Fotomicrografía epifluorescente 0.26 106 39– 188 1.195 0.17 – 0. de imágenes. Reactivos. Materiales. tanto de aguas como de sedimentos. se realiza el conteo total de microorganismos utilizando el método de conteo directo con el empleo de un colorante fluorescente (naranja de acridina) y microscopía de epifluorescencia. Las muestras colectadas. Equipo de refrigeración (15 – 20 °C). En el caso de los cocos.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Objetivo: Determinar la biomasa bacteriana en una muestra de agua de mar a partir del número total de microorganismos y el biovolumen celular. utilizando una solución acuosa de formaldehído a una concentración final del 4 % vol/vol. Las mediciones se pueden realizar directamente en el microscopio Página 119 . Naranja de acridina.2 µm. Bomba de vacío. se determina el volumen de las diferentes formas celulares. a. Sistema computadorizado para la captación y procesamiento. reactivos y equipos empleados Materiales. Microscopio de epifluorescencia. Balanza analítica. 5. estériles. Preservativos (Ver Cap. se preservan inmediatamente después de tomadas. formas bacilares (cilindro y elipsoide promediando ambos). Autoanalizador de carbono.5. Desecadora. Frascos de vidrio. Estufa. Posteriormente. Membranas de acetato de celulosa de diámetro de poro de 0. Equipos. Filtros GF/F de 47 mm. Cálculo del biovolumen Para el cálculo del biovolumen. Procedimiento. tomando como base la forma geométrica que más se asemeja: cocos (esfera). los frascos deben ser guardados en refrigeración (15 – 20 °C) hasta su procesamiento.1). Una vez en el laboratorio.1). se determina su diámetro y para los bacilos se tiene en cuenta el largo y el ancho. (Ver Cap. de 250 mL de capacidad. De cada muestra se realizan mediciones de no menos de 30 células. Tomar alrededor de 50 muestras de agua en estaciones con diferentes características (costeras. El biovolumen medio se obtiene por la suma del volumen medio de las diferentes formas celulares de la muestra. se pueden obtener las imágenes utilizando un sistema digitalizado de imágenes de video el cual es capaz de captar las células teñidas con un fluorocromo en un campo del microscopio. Filtrar un volumen entre 250 – 300 mL a través de una membrana de acetato de celulosa de diámetro de poro de 1 µm con el fin de eliminar la mayor cantidad de los organismos consumidores de bacterias. L: largo del elipsoide.1416 L: largo del bacilo A: ancho del bacilo Volumen para forma bacilares2 (elipsoide) = π A 2 L / 6 donde: A: ancho del elipsoide. Finalmente. los cuales se colocarán en una estufa a 60 °C durante 24 h. se filtran los diferentes cultivos a través de filtros GF/F de 47 mm (previamente pesados en balanza analítica). editada y analizada. Posteriormente. A continuación.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA biológico.1416 r: radio de la esfera Volumen para forma bacilares1 = π A 2 / 4 (L – A / 3) donde: π: 3. Esta metodología presenta una notable ventaja ya que la imagen digitalizada puede ser almacenada. Volumen esfera = 4 π r 3 / 3 donde: π: 3. oceánicas). 120 . se pesan los filtros y se conservan en desecadora hasta su procesamiento. inocular los frascos con agua filtrada de cada estación hasta obtener una concentración de inóculo del 10% e incubar durante 24 h en agitación a temperatura ambiente. Cálculos. Biovolumen medio = ∑ (Volumen medio cocos + Volumen medio bacilos). Para la determinación de la concentración de carbono celular se emplea un analizador de carbono. Determinación del coeficiente de conversión. o también. a partir de una tinción y empleando regla micrométrica. El procedimiento de cada muestra se realiza por triplicado. 33:1225-1228.. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. . 85-120. p. J. En: Microbial Ecology of the Oceans. I. E. R. Hobbie. Página 121 . Heinanen. Applied Environmental Microbiology.W 2000. Direct determination of carbon and nitrogen contents of natural bacterial assemblages in marine environments. Daley. New York. Ducklow. Bacterial Production and Biomass in the Oceans (Chapter 4). D. 359-368. Dobbs. Measuring thymidine incorporation in the open Baltic Sea. 1993. T. 1993. S. Bratbak. R. Paul F. Finnish Marine Research No. Kirchman. Bacterial productivity and microbial biomass in Tropical mangrove sediments. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by epifluorescence microscopy. Lewis Publishers. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. y Pearl. 347-358. The application of ATP determination for estimation of microbial biomass and metabolic activity.Triphosphate. D. H. H. Nagata. Sherr (eds. Lewis Publisher. Applied Environmental Microbiology 64: 3352-3358. a brackish water estuary: comments in saturation level of thymidine 1-2. Fukuda. 1977. y Findlay.). Holm-Hansen. R. Sherr. 1988.H. Cole (eds. A. En Bacterioplankton in the open Baltic Sea. Ogawa. Microbial Ecology 15:59-79. Analysis of microbial lipids to determinative biomass and detect the response of sedimentary microorganisms to disturbance. Wiley-Liss. p. Microscope methods for measuring bacterial biovolumen: epifluorescence microscopy Scanning Electron microscopy and Trasmission electron microscopy. Sherr y J. p. F.W 1972. Karl. Ed.L. p. Memories Instituto Italiano Hidrobiologia 29:149-168. B. 260. y Jasper.. Sherr. . 1993. . Evelyn B. Microbial biomass estimation determined from the measurement of particulate Adenosine-5. 303-307.M. New York.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA Alongi. F. G. J. H.C.. P Kemp. Barry. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. 1998. E. 1992. D.). O. Kemp. y Koike. Norland. Paul. Lewis Publisher. Sherr. P Kemp. (ed. The relationship between biomass and volume of bacteria. Sherr y J.W 1975. Acad. En: Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. J. S.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Morearty. Cole . Marine Microbiology. D. E. 30.J. B. . Press 122 . Methods in Microbiology. Oecologia 20: 219-230. (eds. 1993. p. A method for estimating the biomass of bacteria in aquatic sediments and its applications to trophic studies.). H. 303-307. Vol.) 2001. entre estos se encuentran: • A partir del conteo directo del número total de microorganismos. las muestras se pre filtran por mallas de diámetro de poro desde 1 hasta 3.3. Se conoce tambien como “producción secundaria” porque se refiere a la síntesis de biomasa bacteriana a partir de precursores orgánicos y algunos nutrientes inorgánicos. La pre filtración también puede causar lesiones al fitoplancton y éste expulsar Página 123 . Para minimizar las interferencias que provoca la manipulación de las muestras en la veracidad de los resultados. se recomiendan tomar algunas medidas desde el momento en que se colectan las muestras. Si la transportación de los frascos con muestras hasta el laboratorio es demorada. por tanto. lo cual. • A partir de la incorporación de compuestos radioisotópicos como 3H-timidina o 3H-leucina . debe tenerse en cuenta en el análisis de los resultados el “efecto botella” que provoca un aumento del número y la actividad celular de hasta tres órdenes en magnitud. 1984). aún manteniéndolas a bajas temperaturas (Ferguson et al. la temperatura de incubación de las muestras debe ser igual a la del lugar de donde se tomó la muestra. por unidad de volumen o peso y por unidad de tiempo. expresada en términos de número de células o biomasa.0 µm. pero también el hecho de que estos organismos no estén presentes. puede alterar en cierto sentido. La producción bacteriana es un proceso clave que origina el flujo de materia orgánica disuelta a travéz del lazo microbiano (“microbial loop”). Este inconveniente sólo se elimina reduciendo el tiempo entre la colecta y el procesamiento o tomando grandes volúmenes de muestra. La producción bacteriana es una medida de la síntesis de materia orgánica por las bacterias. por lo que su estimación establece la importancia de la trama alimentaria vía microorganismos en el ecosistema marino. Para excluirlos. no resulta práctico. si no se puede incubar “in situ”. la temperatura es un factor de suma importancia en las reacciones enzimáticas a nivel celular. Determinación de la Productividad bacteriana (Pb). Existen varios métodos para determinar la producción bacteriana. como los protozoos.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5. Otro aspecto que interfiere es la presencia de depredadores. la actividad de las bacterias. Por ejemplo. Objetivo: Determinar la productividad bacteriana en una muestra de agua de mar Detalles experimentales. durante 6. Método a partir del Conteo Directo del Número Total de microorganismos. donde: t P: Producción bacteriana (mgC.d-1). Después del período de incubación. Procedimiento En cada estación de muestreo. m-3. 124 . Materiales Los mismos que se usan para el Conteo Directo del Número Total de microorganismos (Ver Cap. Reactivos Los mismos que se usan para el Conteo Directo del Número Total de microorganismos. reactivos y equipos empleados. se rotulan y se incuban. pueden provocar un aumento en el número y actividad de las células (Ferguson et al. Bo: Conteo total de microorganismos al inicio del experimentoen la muestra sin pre filtrar por malla (cél/mL).1). filtrados y sin filtrar.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA al medio aminas primarias. 1984).8 h.Bo ________ . Se reconoce que es imposible llevar a cabo un experimento sin determinada influencia de la manipulación.).1). todas las muestras se tratan según el procedimiento descrito para el conteo directo del número total de microorganismos empleando colorantes fluorescentes y microscopía de epifluorescencia (Ver Cap. (Ver Cap. Bf : Conteo total de microorganismos al final del experimentoen la muestra sin pre filtrar por malla (cél/mL). evitando así las pérdidas de biomasa bacteriana por el efecto de depredación. preferiblemente “in situ”. Materiales.1. Cálculos: Bo P = ____ + g Bf . colectar cuatro muestras de agua con frascos estériles de 200 mL de capacidad.5.5. Dos de las muestras prefiltrarlas por malla de 3 µm de diámetro para eliminar el microzooplancton presente en la muestra. las que a su vez. Ambos grupos de pomos. tenerlos en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos. debe realizarse un esfuerzo para que sean mínimos los efectos y en todo caso. 5. pero aún así. ln Bof : logaritmo natural del número total de microorganismosal inicio del experimento en la muestra pre filtrada pormalla (cél/mL). Página 125 . ln Bf : logaritmo natural del número total de microorganismosal final del experimento en la muestra pre filtrada por malla(cél/mL)...693 g =_____________ ln Bf – ln Bof donde: g : Tiempo de generación* (horas). teniendo en cuenta que en unapoblación mixta de bacterias no todas las células seduplican al mismo tiempo. g = ________________ log Bff .8: Es un valor empírico.8 g: Tiempo de generación* (horas).... t : Tiempo de incubación (horas). mediante la siguiente fórmula: µ = 0. Con el valor del tiempo de generación.logBof t: Tiempo de incubación (horas). Método a partir de la incorporación de 3 H-thymidine La utilización de timidina exógena es exclusiva de los organismos procariontes.. 0.693: ln 2.. donde: µ: velocidad de crecimiento (cél/horas). g: tiempo de generación (horas)... También el tiempo de generación puede calcularse por la siguiente fórmula: t x 0.. se puede calcular la velocidad de crecimiento de las células en la muestra evaluada. por tanto.....TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA t x log 1. Bff : Conteo total de microorganismos al final del experimentoen la muestra pre filtrada por malla (cél/mL). Bof: Conteo total de microorganismos al inicio del experimentoen la muestra pre filtrada por malla (cél/mL).693/g. log 1. su detección en el ADN bacteriano es un método muy utilizado para evaluar la actividad bacteriana. Materiales. Contenedor de desechos radioactivos. Aspergillus nidulans y Saccharomyces cerevisiae. ácido tricloroacético 10% w/v (mantenido a 4°C). Detalles experimentales Se recomienda filtrar por malla de 3 µm a gravedad las muestras para excluir las pérdidas de biomasa debidas a la depredación (Azam.3H-thymidina (40-60 Ci/mmol) Amersham. 1980). 1984). 1985). Equipos. los hongos Neurospora crassa. Reactivos. aguas lacustres (Riemann y Søndergaard. Líquido de centelleo Aquasol-2. Tubos de microcentrífuga de 2.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA La timidina (timidina-2-deoxiribosa. Debe tenerse en cuenta que una cantidad significativa de timidina puede ser incorporada al ARN. considerándose uno de los más precisos. Acetato de etilo. Metil. 126 . Incubadora regulada a la misma temperatura del lugar de dondese toma la muestra. 2500 µl Viales para líquido de centelleo (Fisher 03-337-26). y aguas oceánicas (Ducklow y Hill. reactivos y equipos empleados. ácido tricloroacético 5% w/v (mantenido a 4°C). Tdr) es un nucleótido cuya única función en la célula es participar en la síntesis del ADN.0 mL con tapas de rosca (Fisher 02-681-344 y 02-681-360). Este método se ha aplicado con éxito en aguas costeras (Fuhrman y Azam. la cual está presente en la mayoría de los organismos. 1980. por lo que es importante purificar la fracción de ADN antes de medir la radioactividad.kinasa. Etanol 100%. Pipetas y puntas estériles de: 10 µl. aunque hay algunas excepciones como son algunas especies de Pseudomonas. Riemann y Søndergaard. Aspiradora. Contador de partículas ß. Membranas de filtro de acetato de celulosa de 0. 1984). 100 µl. y en un grupo de cianobacterias (Moriarty. Materiales Guantes de nitrilo.45 mµ (Millipore). 1984). En esta reacción interviene la enzima timidina. se puede utilizar el coeficiente 1. Después de la incubación. 1981. los conteos de los controles para corregir la interferencia por adsorción y determinarse la eficiencia de las mediciones (quenching) con el fin de corregir los resultados. Amersham) a la misma temperatura del lugar donde se colectaron las muestras.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Para determinar la producción bacteriana por este método se emplea una relación empírica entre la incorporación de timidina y la producción de células (células producidas/Timidina incorporada) y se refiere en unidades de células/mL /h. El tiempo de incubación dependerá de las muestras utilizadas. se recomienda que sea tan corto como sea posible. Moriarty y Pollard. para convertir el número de células a unidades de carbono. 1982). el más utilizado es 1. debiendo chequearse durante el mismo si está ocurriendo la fijación de timidina de forma lineal. También. Debe restarse a los conteos de la muestra. Procedimiento.7 x 10-15 g propuesto por Watson et al. Se han reportado diferentes factores de conversión para convertir los moles de timidina incorporada a número de células producidas (Fuhrman y Azam. Después de incubar en hielo 5 min más. Cálculos. Se añade entonces 10 mL de líquido de centelleo Aquasol-2 y se determina la radioactividad en un contador Beckman LS-100C. Página 127 . 1980.3 x 1018 bacterias producidas/ mol de timidina incorporada (Fuhrman y Azam. la membrana se coloca en el interior de un vial de centelleo y se le agrega 1 mL de etil acetato para disolverla (esto demora alrededor de 10 min). Se toman réplicas de las muestras (10 mL) y se incuban con 2-20 nM de metil-3Htimidina (40-60 Ci/ mmol. la mezcla se filtra por membrana de acetato de celulosa 0. El procedimiento que se describe aquí es una modificación que propusieron Riemann y Søndergaard (1984) al método de Fuhrman y Azam (1980). Es importante preparar “blancos” usando formalina (concentración final de 1% v/v formaldehído) la cual se añade junto con la timidina a una muestra antes de la incubación. 1982. 1982. se toman submuestras de 3 mL y se colocan en un baño de hielo por 1 min y se les añade igual volumen de ácido tricloroacético 10% (w/v) frío. El tiempo de incubación puede ser desde 30 hasta 120 min. (1977) y Furhman (1981).45 µm de diámetro de poro (25 mm HA Millipore) y se lava 2 veces con 3 mL de ácido tricloroacético 5 % (w/v) frío. Kirchman et al. Posteriormente. 1980). Los incrementos en el número de células se plotean contra la cantidad total de timidina incorporada durante la incubación (Kirchman et al.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA El factor de conversión puede determinarse directamente midiendo la tasa de crecimiento de las bacterias en la muestra prefiltradas por malla e incubada en un tiempo “t”. y paralelamente. 128 . utilizando conteo total por microscopia de epifluorescencia. 1982). determinando la tasa de incorporación de timidina titriada al ADN. Kirchman. A. Bacterioplankton secondary production estimates for coastal waters of British Columbia. 47:49-55. 1982. 1981.M. R. J. Marine Ecology Progress Series. F..J. Applied and Environmental Microbiology. y Azam. . D. J. In: Heterotrophic Activity in the Sea. W y Mitchel. 1982. 39:1085-1095. Página 129 . R. 72:165-173. Diel variation of bacterial productivity in seagrass (Zostera capricorni) beds measured by rat of thymidine incorporation into DNA.1980. Moriarty. P C. A. J. . F. . A. Furhman. . Ducklow. 44: 1296-1307. Applied and Environmental Microbiology. Response of marine bacterioplankton to differential filtration and confinement. 5:151-156. y Palumbo. L. Marine Biology. . Marine Ecology Progress Series. S. A. V 1984. Tritiated thymidine incorporation and the growth of heterotrophic bacteria in warm core rings. D. Fuhrman.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFÍA.. Hobbie y P LeB Williams (eds. 1985. 1982. Moriarty.E. J. y Azam. Buckley. 66:109-120. Duckow. Thymidine incorporation as a measure of heterotrophic bacterioplankton production in marine surface waters: evaluation and field results. 1981. Measurement of bacterial growth rates in some marine systems using the incorporation of tritiated thymidine into DNA. J. H. Moriarty. W y Pollard. DNA synthesis as a measure of bacterial productivity in segrass sediments. 5: 103-106. Applied and Environmental Microbiology. H. . 217-231 . Influence of method on the apparent size distribution of bacterioplankton cells: epifluorescence microscopy compared to scanning electron microscopy. W y Pollard. P C. D. Fuhrman. Estimates of bacterial growth from changes in uptake rates and biomasa. Ferguson.). W y Hill. D. J. E. Limnology and Oceanography. Marine Biology. 30:260-272. J. N. . W 1984. Antarctica and California. . Romanenko.1984. S.).TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA O´Carroll K. y Azam. economical method for measuring bacterial production synthesis rates in seawater.I.. Appl. Assessment of Bacterial Activity. Novitsky. 47: 632-638. /En ruso/Ed. Watson. y Valois. Marine Microbial Food Webs. F. y Søndergaard. 189 p. 33: 940-946 130 . Austin (ed. En: Methods in Aquatic bacteriology. Smith. M. B. D. Microbiol. Riemann. Determination of bacterial number and biomass in the marine environment. A simple. Applied and Environmental Microbiology. Manual de laboratorio. B.I. I. 1977. V y Kuznetsov. Quinby. . Measurement of diel rates of bacterial secondary production in aquatic environments. Nauka. 1974. 6:107-114. C. 347-366. 1992.. Environ. S. 1988. T. Ecología de microorganismos de aguas interiores. F. la Producción primaria neta y la Respiración. La producción primaria neta es la cantidad de carbono fijado por la fotosíntesis que excede la demanda de la respiración. es posible conocer la cantidad de materia orgánica sintetizada. es decir. principalmente. A escala local. la eficiencia de este proceso depende fundamentalmente de la intensidad de la radiación solar. Por consiguiente. • Mediante el empleo de Na2H14CO3 Página 131 . según la ecuación global: 6CO2 + 6H2O+ energía solar = C6H12O6 +6O2 Para determinar la intensidad de la fotosíntesis puede medirse el consumo de dióxido de carbono o la formación de glucosa o de oxígeno. si se determina la cantidad de oxígeno liberado durante el proceso de fotosíntesis. se refiere al consumo de materia orgánica y oxígeno produciéndose CO2 y H2O. En el océano la productividad primaria no es uniforme ya que se encuentra limitada. asumiendo que el proceso en las muestras transcurre sin restricciones. la abundancia y distribución vertical de los organismos fotosintéticos y la profundidad. Por cada gramo de oxigeno liberado por los organismos fotosintéticos se sintetizan 1. Determinar el consumo de agua no es razonable. Este proceso puede representarse mediante la siguiente ecuación: C6H12O6 + 6 O2 = 6CO2 + 6H2O+ energía Entre los métodos más conocidos para determinar fotosíntesis están: • A partir de la determinación de oxígeno disuelto en muestras incubadas de agua de mar (conocido como “botellas claras y oscuras”). ya que es infinitesimal en proporción al promedio total de agua en la célula. ya que como resultado de esta actividad se produce oxígeno y materia orgánica. por la intensidad de la luz solar y la disponibilidad de nutrientes. Determinación de la Fotosíntesis. La fotosíntesis es uno de los procesos más importantes que tiene lugar en el océano.4.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5.43 g de CH2O. La respiración es el proceso contrario a la fotosíntesis. cuidando forrar uno de los frascos con nylon de polietileno negro o con papel de aluminio para garantizar que no reciba luz. Bolsas de polietileno negro. Cristalería necesaria para la determinación del oxígeno disueltopor el método de Winkler. donde: F: Fotosíntesis (mgO2 / L . d-1). Reactivos. se determina el oxígeno disuelto en las muestras incubadas. a la misma profundidad de donde se tomó la muestra con la botella. d-1). Método de “las botellas claras y oscuras” Este método es sencillo y su empleo sólo resulta válido en zonas que no sean oligotróficas ya que no detecta cuando ocurren diferencias muy pequeñas entre la producción y el consumo de oxígeno.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de fotosíntesis. reactivos y equipos empleados Materiales Botella oceanográfica Nansen o Niskin. Los que requiere la técnica para determinar oxígeno disuelto por el método de Winkler. En estas condiciones se aconseja usar microelectrodos o emplear el método radioisotópico . Se colecta la muestra de agua de la profundidad fijada previamente. preferiblemente. Cálculos. A partir de esta muestra. Frascos de Winkler estériles. Transcurrido el tiempo de incubación (de 6-8 o hasta 12 h). empleando para ello una botella Nansen. F = Pn – R. Dos de los frascos se utilizan para medir el oxígeno disuelto inmediatamente (control) y los otros dos frascos se incuban. producción primaria neta y respiración en una muestra de agua de mar. se rellenan cuatro frascos Winkler de 50 mL. d-1). Pn: Producción primaria neta (mgO2 / L . Niskin u otro muestreador adecuado. y se tapan herméticamente. 132 . cuidando que no queden burbujas de aire. Procedimiento. R: Respiración (mgO2 / L . Materiales. Oo: valor promedio de oxígeno disuelto en el frasco oscuroal final del tiempo de incubación (mg O2 / L). Equipos. Placas Petri medianas. Formol 40%. reactivos y equipos empleados Frascos de vidrio de 100 mL de capacidad limpios y estérilescon tapas de goma y retapas metálicas. t: tiempo de incubación (h). Jeringuillas y agujas. Método radioisotópico (Na2H14CO3).45 µ dediámetro de poro. Líquido de centelleo. Ok: valor promedio de oxígeno disuelto en la muestra quese midió al inicio (Control) (mg O2/ L). Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0. Viales con líquido de centelleo. Botella oceanográfica Nansen o Niskin. HCl concentrado. NaOH 1 N. Na2H14CO3 actividad 10 µ Cu/mL Agua destilada. Bolsas de polietileno negro. Pipetas de 1 mL. Materiales. Contador de partículas ß. Ampulas de 5 mL de capacidad. HCl 5%. Reactivos.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Pn = (Oc – Oo) x 24 t R = (Ok – Oo) x 24 t Oc: valor promedio de oxígeno disuelto en el frasco claroal final del tiempo de incubación (mgO2 / L). Campana de extracción de gases. Página 133 . se distribuye en ámpulas para su mejor manejo posterior y se sellan cuidadosamente. cada membrana se toma con pinzas y se introduce en el vial que contiene 10 mL de líquido centellante. se colocan dos de ellos en una bolsa de polietileno negro y los otros dos se incuban a la luz. Ct = r x Ck x 24 .45 µ de diámetro de poro. El volumen de muestra a filtrar está en dependencia de la abundancia de fitoplancton. donde: Rxt Ct: Asimilación oscura del CO2 (µC/L . A partir de esta muestra.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Procedimiento. se rellenan seis frascos de vidrio de 100 mL de capacidad. se filtran 50 o 100 mL de muestra a través de una membrana de acetato de celulosa de 0. Después de filtrar. d-1). Se agita suavemente y se lee cada muestra en el contador de partículas ß Al inicio de la experiencia deben preparase viales con líquido centellante y membranas a modo de “control” para así determinar las interferencias (“quenching”) y corregir el valor final de cada lectura en los frascos con las membranas empleadas en la filtración de las muestras. las membranas se colocan en una placa Petri pequeña y se exponen destapadas en una atmósfera de HCl por 10 min en una campana de extracción de gases y posteriormente. Después de 8 a 12 h de incubación. Las ámpulas se esterilizan en autoclave a 110 °C durante 30 min y se conservan en refrigeración hasta su uso. 134 . En dos de estas submuestras se determina la concentración de carbonatos y de CO2 libre según la técnica de Parson et al. (1984). A los cuatro frascos restantes se les añade por separado 1 mL de la solución radioisotópica e inmediatamente. pueden colocarse en una cubeta adecuada con agua circulante tratando de mantener la temperatura constante y semejante a la temperatura del lugar de donde se tomó la muestra. Si no existen condiciones propicias para incubar los cuatro frascos “in situ” (a la misma profundidad a que se tomó la muestra). r: Diferencia de conteos entre muestras en los frascos incubadosen la luz y en la oscuridad (dpm). se le añade a cada frasco 1 mL de formol al 40% y seguidamente. El isótopo (Na2H14CO3) se diluye con agua destilada hasta obtener una actividad final de 10 µCu/mL ajustándose el pH hasta 7 con NaOH 1 N. Preparación de la solución isotópica. La muestra de agua se colecta con la botella oceanográfica a la profundidad seleccionada según el objetivo del estudio. Cálculos. Una vez diluido. si es poco abundante se filtran los 100 mL. Cálculos (Para muestras integradas). La muestra integrada se obtiene a partir de la unión de muestras de igual volumen colectadas en las diferentes profundidades. se requiere emplear un disco Secchi con el cual se medirá la transparencia. p: distancia de la superficie a la tercera parte de la visibilidad del disco Secchi.7 x p Donde.7: coeficiente que caracteriza la atenuación de la radiacióncon la profundidad. F = F1 x 0. de varios horizontes mezclados. se recomienda tomar muestras cada 1 m de profundidad. t: tiempo de incubación de las muestras (h). Página 135 . es decir. En el caso que se quiera medir la intensidad de la fotosíntesis en una muestra “integrada”. R: radioactividad real del isótopo utilizado (dpm). F: magnitud de la intensidad de la fotosíntesis (g C/m2). El procedimiento que se sigue es el mismo que el descrito anteriormente para muestras no mezcladas. Si la visibilidad del disco llega hasta 5 m. F1: intensidad de la fotosíntesis en la muestra integrada (mg C/L).TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Ck Valor promedio de concentración de carbonatos en lamuestra de aguas (µC/L). 0. 189 pp 136 . APHAAWWA-WPCF. A Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater Analysis. Nauka. Manual de laboratorio. /En ruso/Ed. . Maita. 18th Ed. y Llli.358-398. Y. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewaters. Romanenko. 1985. Biological Productivity in the Ocean. 1992. Parson. S. Pergamon Press. 1134 p. I.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA APHA. C.I..R. T. Web enhanced (ed. . 1974. Pinet P 1998. 175 pp. Ecología de microorganismos de aguas interiores. V y Kuznetsov.) p. M. En: Invitation to Oceanography. Los que requiere la técnica para determinar oxígeno disueltopor el método de Winkler. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de la materia orgánica. Sorokin. Es cierto que el proceso de mineralización no es una actividad exclusiva de los microorganismos. Objetivo: Determinar la intensidad del proceso de descomposición aerobia de la materia orgánica en muestras de aguas y sedimentos marinos. limpios y estériles. también intervienen los procesos químicos y fotoquímicos de oxidación de la materia orgánica. Tres tubos de vidrio o acrílico de 40 cm de longitud y 3.5. Materiales. Materiales. 2000). Cristalería para la determinación de oxígeno disuelto segúnel método de Winkler. Mediante esta actividad se mantiene el equilibrio entre el material vivo y el muerto. reactivos y equipos empleados.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5. Bolsas de polietileno negro. 1979. y que el 60 % del gasto total de oxígeno corresponde al consumo de los microorganismos (Vinberg y Shilo. por lo que constituye la clave del mecanismo de autodepuración (Kirchman y Williams. Frascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad. El proceso de degradación de la materia orgánica o mineralización se considera la actividad más importante de las bacterias heterótrofas en el océano. 2000). 1981). Página 137 . 1980).5 cmde diámetro interno. Para determinar la intensidad con que ocurre el proceso de descomposición aerobia de la materia orgánica en las aguas se asume que el oxígeno consumido por los organismos en una muestra incubada en la oscuridad durante un tiempo “t”. Tapones de goma para ambos extremos de cada tubo Manguera de goma fina Agitador de vidrio Reactivos. es directamente proporcional a la intensidad con que ocurre la destrucción de la materia orgánica (Romanenko y Kuznetsov. pero hasta el momento no se ha demostrado que estos procesos tengan una participación cuantitativamente importante (Williams. Botellas oceanográficas Nansen o Niskin. por tanto. Los otros dos frascos se ponen a incubar en la oscuridad. Muestras de aguas. Se entierran dos tubos plásticos de 40 cm de longitud y 3. o en condiciones lo más cercanas posible a las que existen en el lugar donde se colectaron. Muestras de sedimentos. y se tapan ambos extremos con tapones de goma para sacarlos cuidando no perder el sedimento. Otros dos tubos (controles) se rellenan sólo con agua del lugar. A partir de la muestra de agua colectada con la botella oceanográfica. preferiblemente “in situ”.5 cm de diámetro en el sedimento hasta 10 cm de profundidad aproximadamente. y posteriormente. Los frascos para la toma de muestras para llevar a cabo esta técnica deben ser los mismos que se usan para las determinaciones de oxígeno por la técnica de Winkler.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Equipos. que permita mantener la temperatura. y se colocan a la intemperie en la cubierta de la embarcación. deben estar debidamente limpios y las tapas esmeriladas deben cerrar correctamente. Se destapa uno de los extremos y se rellena con agua de la interfase agua-sedimento cuidando que no queden burbujas de aire en el agua. Los cuatro tubos se incuban en la oscuridad durante 4-8 h (en dependencia de las características de cada lugar). Para incubar las muestras “in situ” si no se cuenta con estructuras para incubar directamente en el mar. Pasado el tiempo de incubación (entre 8 y 24 h) se fija el oxígeno en estos frascos y se procede a la valoración del oxígeno disuelto siguiendo la técnica de Winkler. se rellenan cuatro frascos de Winkler y se tapan con tapas esmeriladas. Detalles experimentales. 138 . se sumergen los frascos forrados en nylon negro o papel de aluminio (para lograr oscuridad) en cubetas plásticas con un flujo de agua circulante continuo. Procedimiento. se destapan por el extremo superior contrario al tramo con sedimento y con una varilla de vidrio se revuelve suavemente la columna de agua para homogenizarla. Inmediatamente. cuidando que no queden burbujas de aire. se fijan dos de las muestras para la valoración del oxígeno disuelto siguiendo la técnica del Winkler. pr2: área interior del tubo (cm2). 8: peso del equivalente de oxígeno. d-1). O2i : Oxígeno disuelto determinado al inicio del tiempo de incubación (mgO2/mL). se multiplica por 0. Para muestras de sedimentos: O2= donde: O2 : oxígeno consumido (mgO2 / m2. N: normalidad de la solución de tiosulfato. Sorokin. 24 : horas que tiene un día. 1980). Para las muestras de aguas: (O2i-O2 f) x 24 O2 consumido = t donde: . La respiración debida al bacterioplancton representa el 60 % del total del gasto de oxígeno determinado en la destrucción de la materia orgánica en 24 h (Vinberg y Shilo.3750 mg C) obteniéndose mg C/mL.37 (1 mg O2 = 0.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Inmediatamente se determina el oxígeno disuelto en todos los tubos siguiendo la técnica de Winkler y se aplica la fórmula propuesta por Romanenko y Kuznetsov (1974). 50 x pr2 x t .d-1 y para expresarlo en peso de materia orgánica se multiplica por 0. t : tiempo de incubación (h). O2 consumido = Gasto total de oxígeno = Degradación aerobia (mgO2/mL. Para convertir el valor de oxígeno consumido en unidades de carbono. 1979. d-1).93 (1 mg O2 = 1 mg glucosa). Página 139 d x 8 x N x pr2 x L x 10000 x 24 ____________________________ . Cálculos. d: diferencia entre los volúmenes de tiosulfato consumidosen la valoración del control y las muestras (mL). O2f : Oxígeno disuelto determinado al final del tiempo de incubación (mgO2/mL). t: tiempo de incubación (h). 140 . 24: factor de conversión a horas (h). 10000: factor de conversión a m2. 50: volumen de agua a valorar (mL).TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA L: altura del agua sobre el sedimento (cm). L. D.L. Romanenko. y Williams. A Practical Handbook of Seawater Analysis. R. Williams. Vinberg. Heterotrophic bacteria and the dynamics of dissolved organic material En: Microbial Ecology of the Oceans. Bulletin of Fisheries Resources. . . 1981. Acad. D. 311p. Wiley-Liss Inc. Introduction. T. Microheterotrophic organisms in marine ecosystems. D. 293-342. P le B. /En ruso/Ed. 153. 1980. 189 p. Página 141 . J. New York. S. M. I. 21:401413. Bd. Ecología de microorganismos de aguas interiores.I. 2000. D. Can. Kirchman (ed. 2000. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. En: Analysis of Marine Ecosystems. Nauka. 18th Ed. Le B. V y Kuznetsov. Press. H. D. 167. y Shilo.C. Sorokin.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA American Public Health Association. Usp. Microbial Respiration. 1972.). En: Microbial Ecology of the Oceans. Kirchman. J. Ed. Y. y Pearson. Kirchman (eds. T. Washington. 1992. Biol. 542p. p. 1979.200. Souram. L. I. Stricklan.J.). Manual de laboratorio. 5. limpios y estériles. Agitador de vidrio. 142 . Procedimiento. Reactivos. segúnel método de Winkler. Tres tubos de vidrio o acrílico de 40 cm de longitud y 3. Romanenko y Kuznetsov (1981) describieron una técnica que se basa en la determinación del CO2 producido en la muestra de sedimento incubado en condiciones anóxicas al final de un tiempo “t” de incubación. se procede como se describió antes para la mineralización aerobia en los sedimentos sólo que. Cristalería para la determinación de oxígeno disuelto. Manguera de goma fina.02 N. etc. en muestras de agua ó sedimentos incubadas durante un tiempo prefijado y a la temperatura que se registre en el propio lugar. La intensidad del proceso anaerobio de mineralización se calcula a partir de la determinación del CO2 producido en una muestra de sedimento incubada durante 8 h (Romanenko y Kuznetsov. para la determinación del proceso de mineralización aeróbica en muestras de sedimentos. reactivos y equipos Materiales Frascos de vidrio de 50-100 mL de capacidad.6. Bolsas de polietileno negro. se traspasa el agua del tubo a un erlenmeyer estéril y se valora el ácido carbónico libre con carbonato de sodio 0. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaerobia de la materia orgánica en los sedimentos.02 N y fenolftaleína como indicador. Materiales. La muestra de sedimentos se colecta de la misma forma que se describe en el Cap.) ó 35S (sulfatoreducción). Erlenmeyer estéril. degradación de celulosa. Fenolftaleína. Para determinar el proceso anaerobio de degradación de la materia orgánica.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA 5. También es posible medir la actividad de descomposición anaeróbica a partir de sustratos marcados con 14C (metanogénesis.5. Carbonato de sodio 0.5 cmde diámetro interno. Para esto. Objetivo: Determinar la intensidad del proceso anaerobio de descomposición de la materia orgánica en una muestra de sedimentos marinos. Tapones de goma para ambos extremos de cada tubo. 1981). n: diferencia entre los mL de carbonato de sodio gastadosal valorar 100 mL de muestra y del control (mL).85 (Romanenko y Kuznetsov. 1981). C/CO2 = (n x N x L x 1200 x 24) / t donde: C/CO2: cantidad de ácido carbónico producido por la descomposición (aerobia + anaerobia) de la materia orgánica (mg/m2 d-1). la intensidad del proceso anaerobio de destrucción de la materia orgánica se calcula finalmente según la expresión: DMOana = C/CO2 . L: longitud del tubo que quedó relleno de agua por encimadel sedimento (cm). 24: para convertir el valor a un día (h).44: destrucción aerobia determinada por el oxígeno consumido en el tubo control (O2 al inicio .TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA Al agua del tubo “control” se le determina la concentración de oxígeno disuelto al final del tiempo de incubación por el método de Winkler y entonces se calcula la relación C/CO2 según la expresión de Romanenko y Kuznetsov (1981).44) donde. O2 x 0.(O2 x 0. DMOana: intensidad del proceso de destrucción anaerobio de lamateria orgánica (mg/m-2 d-1). C/CO2: cantidad de ácido carbónico producido por ladescomposición (aerobia + anaerobia) de la materia orgánica(mg/m2 d-1). Cálculos. Página 143 . t: tiempo de incubación (h). N: normalidad de la solución de carbonato de sodio.O2 al final) y convertida a unidades de carbono mediante el coeficiente de conversión 0. 1200: coeficiente de conversión a cm2. Entonces. Williams. D.J. /En ruso/Ed. Washington. 1981. p. 1992. 2000. 144 . S.I.C. Kirchman (ed. . I. V y Kuznetsov. 189 p. 153. Ecología de microorganismos de aguas interiores. Nauka. Romanenko. Manual de laboratorio. D. Heterotrophic bacteria and the dynamics of dissolved organic material En: Microbial Ecology of the Oceans.TÉCNICAS Y MÉTODOS EN ECOLOGÍA MICROBIANA BIBLIOGRAFIA American Public Health Association. 18th Ed. P le B.200.L. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.). . Capítulo 6 Medios de Cultivo . . 1g Página 147 . 20 min. 1970). 20 min.2 Hacer hervir la mezcla por 1 min.3 (Oxoid)----------------------------12g Agua de mar filtrada y envejecida--------750 mL Agua corriente---------------------------------250 mL pH : 7.3g Extracto de levadura-----------5g Peptona bacteriológica----.2 Esterilizar a 1atm.0 ± 0.1g Sulfato de Magnesio………………. 15 min. • Medio 2216E (Oppenheimer y ZoBell. 1980).0..2g Acido ascórbico……………………. 1982). • Agar agua de mar (Austin y Allen. 1961). Lab-Lemco power (Oxoid)------------------8g Peptona bacteriologica---------------------10g Agar No. Lactato de sodio…………………….0 ± 0.250 mL pH : 7. Esterilizar a 1atm. Peptona-----------------------5g Extracto de Levadura------1g FeSO4-------------------------0.4g Extracto de levadura……………….5g Agar agar No 3 --------------.2 Esterilizar a 1atm.2± 0. Bacterias..750mL Agua destilada---------------.22g Agar bacteriológico-------------------15g Agua desionizada---------------------1000 mL pH : 7. • Medio API para bacterias sulfatoreductoras (Overzil. 20 min. 1952).2 Esterilizar a 1atm.20 g Agua de mar -----------------.MEDIOS DE CULTIVO 6.1g Agar----------------------------15g Agua destilada---------------250 mL Agua de mar------------------750 mL pH: 7.0. Caldo marino Difco-------------------11. • Agar estuarino (Weiner et al.1. Extracto de carne-------------. • Medio para bacterias heterótrofas (Gorbienko.0 ± 0. Extracto de carne ----------------------------------.0..5.0 g Agua destilada ---------------------------------------1000 mL pH : 6. • Caldo Lactosado.9 ± 0. se mezclan vigorosamente y se calientan hasta disolverlos.2 ± 0.20. • Caldo Bilis Verde Brillante.MEDIOS DE CULTIVO Hidrógeno fosfato dipotasico………0.2 Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua. 20 min. Peptona-------------------------------------. Para preparar el Caldo Lactosado de doble concentración se duplican los ingredientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 x 180 mm.2g Resazorina………………………….0.10.0 g Lactosa-------------------------------------. Triptosa ------------------------------------------.0 g Peptona -----------------------------------------------.0.1000 mL pH : 7.0 g 148 .5.0 g Bilis de buey-------------------------------. El medio se distribuye en tubos de fermentación de tal dimensión que el líquido cubra el tubo Durham invertido al menos.0 g Verde brillante-----------------------------.001g Cloruro de sodio……………………10g Agua destilada………………………1 L pH : 7.2 Los ingredientes deshidratados se adicionan al agua. • Caldo Lactosa Lauril Triptosa.0133 g Agua destilada---------------------------.0 g Lactosa -----------------------------------------.20. Se esteriliza a 121 °C por 15 min.5. se mezclan vigorosamente y se calientan para disolverlos. El medio se distribuye en tubos de fermentación de tal dimensión que el líquido en el tubo cubra el vial invertido al menos parcialmente después de la esterilización a 121°C por 15 min.3-7. parcialmente después de la esterilización.0 g Lactosa -----------------------------------------------.01g Sulfato de amonio………………….8 Esterilizar a 1atm.3.10. 9 ± 0.75 g Cloruro de sodio ------------------------------.1 Se disuelven los componentes en el agua y se agitan hasta su completa disolución.0 g Cloruro de sodio ----------------------------------------5. como indicador de la producción de ácido y la confirmación de crecimiento (este paso es opcional).1000 mL pH : 6.MEDIOS DE CULTIVO Fosfato dipotásico ----------------------------.10. Se distribuyen según los volúmenes deseados en frascos de capacidad adecuada de acuerdo a las porciones de muestra a adicionar para la prueba. se suministra calor.4.2 ± 0.5.0 g Agua destilada-------------------------------------------------1000 mL pH : 6.20.5 g Fosfato hidrógeno dipotásico------------------------------. Si es necesario. • Caldo EC Triptosa o Tripticasa---------------------------------------.75 g Fosfato monopotásico-------------------------2.0 g Fosfato dihidrogenado de potasio-----------------------.01 g/L de púrpura de bromocresol al medio.5.0 g Sales biliares mezcladas ó sales biliares No 3------. después de la esterilización a 121 °C durante 15 min.0.1.5 g Fosfato dihidrogenado de potasio ------------------1.2 Se disuelven los componentes en el agua destilada.1.0 g Lauril sulfato de sodio -----------------------. al menos parcialmente.1 g Agua destilada---------------------------------.0 g Lactosa--------------------------------------------------------. La preparación de la solución de doble concentración es similar sólo que la composición de cada reactivo se debe multiplicar por el factor 2.8 ± 0.0 g Fosfato monohidrogenado de sodio ---------------3. Se puede adicionar 0.2 Página 149 . Antes de la esterilización el medio se distribuye en tubos de fermentación con tubos Durham invertidos y suficiente medio de cultivo para cubrirlo.5.2.5 g Cloruro de sodio----------------------------------------------.5 g Agua destilada ----------------------------------------1000 mL pH : 7. • Agua Peptonada buffereada Peptona------------------------------------------------. Se almacena a temperatura ambiente por un período máximo de 4 semanas. Esterilizar a 121 °C durante 15 min. 5.1g de MgCl2.34.---------.8 ± 0. Solución de Stock de Buffer Fosfato: Fosfato dihidrogenizado de potasio ---------------.7 g Fosfato monopotásico --------------.MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes se adicionan al agua.1000 mL pH : 6.5 g Triptona o polipeptona ----------------------------15.1000 mL Se distribuyen las cantidades deseadas y se esteriliza en autoclave a 121 °C por 15 min.l000 mL pH : 7.2 ± 0.500 mL pH : 7.5.5.7 g Azida de sodio ------------------------.2 g Agua destilada ------------------------------------.0 g Glucosa -------------------------------------------. Triptona ------------------------------------------. Solución de Agua Bufferada: Solución de stock de buffer fosfato -------------------1.0 g Agua destilada ------------------------------------------.2 ± 0.0 mL (81.0 g Cloruro de sodio --------------------------------. Extracto de carne --------------------------------. • Caldo Etil Violeta Azida.00083g Agua destilada -----------------------------------. • Caldo Azida.2 Se disuelven 35 o 70 g/L en dependencia de si es simple o doble concentración.6H2O/L de agua destilada) Agua destilada ----------------------------------------. El medio se distribuye en tubos de fermentación cada uno con un tubo Durham invertido de forma tal que quede cubierto el vial al menos parcialmente después de la esterilización a 121 °C por 15 min.5 Se ajusta el pH con solución 1N de hidróxido de sodio y se diluye a 1 litro con agua destilada.0.0.0 g Glucosa ----------------------------------------------7.0.5 g Cloruro de sodio ----------------------------------. se mezclan vigorosamente y se calientan para disolverlos.4 g Etil violeta -----------------------------------------.5 g Azida de sodio ------------------------------------.7.4.0 g Fosfato dipotásico ------------------------------.-----------2.Dextrosa.25 mL Solución de cloruro de magnesio --------------------.2 150 .2. • Buffer Fosfato.20. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. 1000 mL pH : 6. Se calienta hasta disolver.0 g Bilis bacteriológico --------------------------------10.0 g Citrato de sodio -----------------------------------.0 g Agua destilada --------------------------------.4g 2.1 Se disuelven los ingredientes en el agua destilada y se esteriliza a 121 °C durante 15 min.MEDIOS DE CULTIVO Se adicionan 35.0 g Agua destilada ----------------------------------.0 g Esculina --------------------------------------------.0 g Extracto de carne -------------------------------.0 g Agar ----------------------------------------------.0.0 g Citrato férrico de amonio -----------------------. Peptona C -----------------------------------------.2 + 0. El medio debe mantenerse por no más de 4 h a 45-50 °C.3.7 g a un litro de agua destilada.15.0 g Cloruro de sodio ----------------------------------.2 Página 151 . Triptosa --------------------------------------------20g Extracto de Levadura---------------------------5g D (+) Glucosa-------------------------------------2g Fosfato hidrógeno dipotasio------------------4g Azida de sodio-----------------------------------0.1g Agar-agar-----------------------------------------10g Agua destilada-----------------------------------1000 mL pH : 7.5 g Azida de sodio ------------------------------------.1.5.17.1.0. Se siembran las placas a partir de los tubos positivos de Caldo Dextrosa Azida. antes de verterlo en las placas.3.0 g Extracto de levadura -----------------------------.8 ± 0. • Medio Pfizer (PSE). Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min.2 Esterilizar 20 min en calor (autoclave sin exceso de presión).25 g Agar --------------------------------------------------. • Agar Nutriente Peptona ------------------------------------------.0 g Peptona B ------------------------------------------.15.5 trifeniltetrazolium cloruro--------------0. • Agar Slanetz-Bartley (Selectivo para Enterococos).5.3.1000 mL pH : 7.5. Enfriar rápidamente. 5 g Fosfato de potasio dibásico ------------------2. Se inoculan aproximadamente 0. Si más de la mitad del plano inclinado se ennegrece en 24 ó 48 h.17.2 Se disuelven los tres primeros ingredientes en 400 mL de agua destilada. Se disuelve el citrato férrico en 100 mL de agua destilada. El medio se distribuye en los tubos e inmediatamente después de la esterilización a 121 °C por 15 min. se mezclan vigorosamente y se calientan hasta disolverlos. Se incuba a 35 ± 0.0 g Dextrosa -----------------------------------------. Se agregan asépticamente 100 mL de agua destilada conteniendo un gramo de esculina.2 152 . la prueba es negativa.0 g Peptona-------------------------------------------. la prueba se considera positiva.40.0.2 mL del cultivo en Caldo corazón con pipeta Pasteur.6 ± 0.MEDIOS DE CULTIVO Se adicionan los ingredientes al agua. Se combinan las soluciones y se mezclan bien.0 g Fitona --------------------------------------------.5 °C por 48 h.0 g Agar------------------------------------------------.0g Agua destilada -----------------------------------1000 mL pH : 7. Se calientan hasta 100 °C durante 10 min.5. Se vierten 15 mL del medio enfriado a 50 oC en placas Petri. Enfriar hasta 50 °C.0 g Citrato férrico-----------------------------------. y esterilizada por filtración.5 g Agar-------------------------------------------------15. después de la esterilización.0 g Bilis vacuna-------------------------------------. Se distribuye en tubos con tapa de rosca estériles de 15 mm x 125 mm y se enfría en posición de plano inclinado.5 g Agua destilada-----------------------------------1000 mL pH : 6. se colocan en posición inclinada para que el agar solidifique con una superficie pendiente. Control positivo: Enterococcus faecalis Control negativo: Streptococcus pyogenes • Agar Triptona-Soya (TSA) Casitona -----------------------------------------. Se disuelve la bilis vacuna en 400 mL de agua destilada.3.3 ± 0.2.15.5. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min.3. Si menos de la mitad de la superficie se ennegrece ó no hay ennegrecimiento en 24 ó 48 h. • Agar Bilis Esculina Extracto de carne--------------------------------.0 g Cloruro de sodio ------------------------------. si va a utilizarse de esta forma. previamente calentada suavemente para obtener una solución. 5.2 ± 0. La esterilización es a 121 °C por 10 min.1000 mL pH : 7.10.0 g Maltosa-----------------------------------------------.1.5 g ZnSO4 -------------------.35 g NaHCO3 --------.0 g Glicerolfosfato de sodio--------------------------.015 g Agua destilada-------------------------------------. 1978).3.0 g Extracto de levadura------------------------------. Una reacción positiva es indicada por la aparición de una coloración amarilla en los tubos debido a la producción de ácido.5 g MnCl2.0.75 g Disolver en 1000 mL de H2O destilada.5 concentrado se realizan las pesadas correspondientes en igual volumen de agua y se distribuye en tubos de 20 mm x 180 mm.62. Para preparar el Caldo KF 1. Se mezclan bien y se distribuye.0.4 g Púrpura de bromocresol------------------------.20. Solución B: FeSO4.0 g Azida de sodio------------------------------------.10. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 15 min. Utilizar 2 mL por litroPágina 153 . 7 H2O ----------.MEDIOS DE CULTIVO Se disuelven los ingredientes en el agua destilada por calentamiento durante 1 a 2 min. Se incuba a 37 °C durante 48 h. Utilizar 4 mL por litro de medio.30 g KNO3 ---------.2 Se disuelven los ingredientes en el agua destilada.0.10.5 g Disolver en 2000 mL de H2O destilada. Control positivo: Streptococcus pneumoniae Control negativo: medio no inoculado • Caldo KF Proteosa peptona----------------------------------. H2O -----------. Control positivo: Enterococcus faecalis Control negativo: Escherichia coli • Medio salino Vela (Vela y Ralston. Se inoculan volúmenes decrecientes de la muestra en los caldos 1.0 g Lactosa-----------------------------------------------.5 concentrados y de simple concentración.0 g Cloruro de sodio----------------------------------. Solución A: Ca (NO3)2 ---------. 01g FeSO4 7H2O----------------------0. Esterilizar por separado. arabinosa.01g EDTA-NaOH-----------------------0. Ajustar pH a 7. Mezclar y distribuir en placas de Petri.3g MgSO4 7H2O---------------------0.2 Esterilizar a 115 °C 20 min • Agar Petróleo (Finnerty y Singer. 1994) (NH4)2SO4-------------------------5. lactosa.1000 mL pH : 5 ± 0. Solución C: KH2PO4 -------.0014g Extracto de levadura-------------1g KH2PO4------------------------------4g Na2HPO4----------------------------6g Agua destilada---------------------1 L pH : 7 ± 0.10g Disolver en 100mL de agua destilada.. 20 min). 1 mL de la solución C en 99 mL de agua. sonicación a 60W. enfriar a 50 °C antes de mezclar. también al 2%. Utilizar 1mL por litro de medio Se añaden 4 mL de solución A y 2 mL de la solución B en 900 mL de agua destilada y aparte.1968) Glucosa ----------------------20g Peptona_----------------------10g Extracto de levadura -------5g Agua de mar-----------------. etc.5% 154 . como almidón. • Agar GELP (Van Uden y Fell.2g CaCl2 2H2O-----------------------0.2 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.MEDIOS DE CULTIVO de medio. Pueden emplearse otras fuentes (previamente esterilizadas). 1984) El agar petróleo se prepara por separado: 900 mL de Medio salino agarizado estéril y 100 mL de una emulsión de petróleo crudo estéril (10g de crudo / 100 mL de agua destilada. • Medio PS (para bacterias productoras de polisacaridos) Glucosa------------------1% Peptona------------------0. glucosa. Suplementar con keroseno al 2% como única fuente de carbono y energía. Esterilizar a 121°C 15 min • Medio basal (Finerty. Agua de mar----------------------------------750 mL. CaCO2--------------------------------------------1g.5 ± 0. extracto decorazón y peptona)-------------------------------27.5g. pH : 7. Glicerol-----------------------------------------3 mL. Citrato de sodio----------------------.2 Esterilzar a 115 °C por 15 min. Glucosa o sucrosa-------------.MEDIOS DE CULTIVO Agua de mar------------75% Agua destilada----------25% pH : 7.5 ± 0.2 Esterilizar a 1 atm. • Medio Okami (1986).2 a 25 °C. Peptona de carne--------------------------------------5g. Agua destilada--------------------------------250 mL.100 mL pH : 7. Sucrosa------------------------------------------------20g. Página 155 . Estracto de levadura------------------------------5g. D (+) Glucosa---------------------------------------2g. pH : 7± 0.5g.0.5% Extracto de levadura-----------. Tiosulfato de sodio-----------------------------------10g. Cloruro de sodio-------------------------------------5g. • Agar Tiosulfato-citrato-bilis-sucrosa (TCBS Agar). Tristona--------------------------------------------5g. 15 min. Peptona de caseina------------------------------------5g. Extracto de levadura----------------------------------5g. • Medio LM (Baumann y Baumann.--------------10g.0. 15 min. Agua destilada---------------------------------1000 mL. Hidrógeno fosfato disódico-----------------------2. Ox bilis-------------------------------------------------5g.6% Polypeptona---------------------. Carbonato de sodio -----------------------------------3g. • Agar Infusión Cerebro-Corazón (BHI) Sustrato nutritivo (extracto de cerebro.4 + 0. Esterilizar en autoclave a 1 atm. 1981). Agar--------------------------------------------------15g.0.2 Esterilzar a 115 °C por 15 min.1% Agua de mar---------------------. 001g Agar-agar----------------------------------0.75g Agua destilada----------------------------1000 mL pH : 7.1+ 0. Esterilizar a 1 atm 20 min. Esterilizar a 1 atm 20 min Después de estéril y enfriado a 50 °C.04g Bromotimol azul----------------------------0.MEDIOS DE CULTIVO Cloruro de sodio----------------------------10g Citrato de Fe (III)----------------------------1g Azul timol-------------------------------------0. • Caldo Tioglicolato Peptona de caseina----------------------15g Extracto de levadura---------------------5g D (+) Glucosa------------------------------5. 1984) Tristona------------------------------------2g Extracto de levadura-------------------2g Tween 80------------------------------------10 mL NaCl------------------------------------------5g Cloruro de Calcio (CaCo2.2 a 25 °C.5g Extracto de levadura---------------------0.1g Bromotimol azul----------------------------0. • Agar Cytophaga (Pacha y Ordal.5g L-cistina-------------------------------------0.003g Agar-------------------------------------------15g Agua destilada------------------------------980 mL pH : 7.04g Agar-agar-------------------------------------14g Agua destilada-------------------------------1000 mL pH : 8.2H2O)-----0.5g Acetato de sodio--------------------------0.5g Cloruro de sodio--------------------------2.2g Extracto de carne-------------------------0.2 a 25 °C No se esteriliza en autoclave.6+ 0. Debe usarse siempre acabado de preparar.4.2g Agar------------------------------------------9-11g Agua destilada----------------------------1000 mL 156 . añadirle al medio 10 mL de una solución de sucrosa (0. 1967).5g Resarzurina sódica----------------------0.5g Thioglicolato de sodio-------------------0. Triptona-------------------------------------0.5g/mL) esterilizada por filtración. • Medio Waltman-Shorts (Waltman y Shorts. MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes del medio se disuelven en calor y el pH se ajusta a 7.27.4 antes de autoclavearlo 1 atm. 15 min. • Agar KDM-2 (Evelyn, 1977). Peptona----------------------------------------10g Extracto Levadura---------------------------0.5g Cisteina-HCl----------------------------------1g Agar---------------------------------------------15g Agua destilada-------------------------------800 mL La peptona, el extracto de levadura y la cisteina se disuelven en el agua destilada y se ajusta el pH a 6.5 con NaOH. Se añade el agar, se disuelve con calor y este medio base se esteriliza a 1 atm. 15 min. Inmediatamente ante de usar el medio, se le añade 20% (v/v) suero de feto de ternero frío (45 °C). El medio basal no debe guardarse más de 3 meses. Como Renibacterium salmoninarum crece muy lento, es necesario que las placas inoculadas sean envueltas de forma ajustada, para asegurar la adecuada humedad durante el tiempo de incubación. • Medio Mueller-Hinton con 0.1% L-cisteina. Infusión de carne----------------------------------2g Hidrolizado de caseína---------------------------17.5g Almidón-----------------------------------------------1.5g L-cisteina---------------------------------------------0.1% Agar-agar---------------------------------------------13g pH : 7.4 + 0.2 a 25 °C Esterilizar en autoclave a 115 °C 10 min Mantener en lugar seco a temperatura entre +15 y +25 oC y protegido de la luz. Se usa para siembra a profundidad o placa vertida y se incuba aeróbicamente. • Emulsión Egg Yolk. (Esta emulsión se usa como aditivo). A 500 mL de emulsión Egg Yolk se le añaden 4.25g de cloruro de sodio y se completa hasta 1L con agua destilada. Se mantiene en refrigeración de 2 a 8 °C. Cuando se vaya a usar, se agita para disolver el precipitado, se toman 100 mL y se mezclan con 900 mL de medio de cultivo estéril y enfriado a 45-50 °C. Se usa para siembra a profundidad. • Agar sangre A una base de Caldo Corazón, se agrega agar de forma que quede al 1.2%. Se esteriliza en autoclave a 121 °C por 15 min. Posteriormente, se funde la base esterilizada y se enfría en baño de agua a 50 °C, se agrega sangre de Página 157 MEDIOS DE CULTIVO carnero desfibrinada o heparinizada estéril atemperada en la cantidad necesaria para que la concentración final sea de 7.5%. Se mezcla suave para evitar la formación de burbujas. Se distribuye de 12 a 15 mL en placas Petri. Control positivo: Staphylococcus aureus (hemólisis alpha). Streptococcus pneumoniae (hemólisis betha). Control negativo: Streptococcus agalactiae. • Medio Löwenstein-Jensen. Asparagina…………………………….3.6g. Fosfato Monopotásico………………..2.4g. Sulfato de magnesio………………….0.24g. Citrato de magnesio…………………..0.6g. Harina de Papa……………..…………30g Verde malaquita……………………….0.4g. Agua destilada…………………………600.0 mL. • Medio Ogawa (Tsukamura, 1967). Glutamato de sodio……………………1g. KH2PO4…………………………………..1g. Agua destilada………………………….100 mL. Huevos enteros…………………………200 mL. Glicerol…………………………………...6 mL. Verde malaquita…………………………6 mL de una solución al 2% (W/V). Se disuelve el glutamato de sodio y el KH2PO4 en agua destilada y se mezclan el resto de los ingredientes. El consumo de hierro se demuestra por el crecimiento de colonias naranja-rojizas en medio basal conteniendo citrato de amonio férrico 2% (w/v). Ajustar el pH a 6.8, repartir el medio en tubos de cultivo, esterilizar a 90 °C por 1 h y poner en forma que se hagan planos inclinados. • Medio Sauton (Tsukamura, 1965). Glicerol………………………………50 mL. Glutamato de sodio………………...4g. KH2PO4……………………………....0.5g. MgSO4.7 H2O……………………….0.5g. Citrato de sodio……………………..2g. Citrato de amonio férrico.................0.05g. Agar.................................................30g. Agua destilada.................................950 mL. 158 MEDIOS DE CULTIVO Los ingredientes se disuelven en agua destilada y se ajusta el pH a 7.0 con KOH al 10% (W/v). Se esteriliza en autoclave a 0.5 atm por 30 min. • Medio Gaffkya (Steward et al. 1966). • Glucosa………………………6.5g Extracto Bacto levadura…….4.5g Tryptona………………………15g NaCl…………………………..6.4g Alcohol feniletil……………….2.5g Bromocreso púrpua………….0.008g Agua destilada………………..1 L pH : 7.4 Esterilizar en autoclave a 0.5 atm. 15 min. Se inocula 0.5 mL de hemolinfa en 4.5 mL de caldo y se incuba por 5 días a 28 °C. • Agar quitina (West y Colwell, 1984). La quitina cruda, powder (Sigma Chemical Co.) debe lavarse por 24 h alternando con 1M NaOH y 1M HCl por 5 veces. Seguidamente, el material se lava cuatro veces con etanol 95% y se deja secar completamente. Posteriormente, se disuelven con cuidado 20g de quitina en 600 mL de ácido sulfúrico 50% a temperatura ambiente y se filtra a través de un wool de vidrio. La quitina precipita adicionando lentamente la solución acidificada a 10 L de agua fría desionizada y neutralizando la mezcla con 10M NaOH. La suspensión así obtenida debe mantenerse 24 h a 4 °C antes de centrifugar y lavar el precipitado varias veces con agua desionizada. La pasta coloidal de quitina debe suspenderse hasta una concentración final de 10% (w/v) y esterilizarse en autoclave. Para usarla, se añade 1 mL de la suspensión de quitina coloidal a 9 mL de agar bacteriológico fundido y añadido como una sobrecapa sobre un medio agar nutriente apropiado. Página 159 ............... Extracto de Malta.1g.............................................. penicilina 1mL y cloranfenicol 2..... Concentrado de Czapek......agar........... Zn SO4…………………………………….... Agua destilada................0g............ K2HPO4......... Hongos • Harina de maíz.... 160 ...........................5 atm 15 min..........................................0g..15.........................30......10.....2.....................1................................................. pH:7........30..............0. Concentrado de Czapek... Glucosa.. Mg SO4......0g..17 g...0g........... Cu SO4……………………………………......................... Oxoid cornmeal agar………………………............................1 L....6 mL.... Suplementar antibióticos: estreptomicina 0.........0g........... Agua de mar filtrada…………………………1 L..5 atm 30 min.20g. por litro de medio................................ Agar. NaNO3.........0................0g.5 mL. Peptona.. • MEA o EMA (Agar Extracto de malta)............... pH:7.... Extracto de levadura.MEDIOS DE CULTIVO 6......... pH:7.....1 L.1.........5......0g............05g...............0g.0g.....0g...........5. KCl............. Agua destilada.................2 Esterilizar a 0..........2 Esterilizar a 0........................5.. • CYA 25 y CYA (Agar Extracto de levadura Czapek)........ Fe SO4.... Agar............................0...............20.........agua de mar (HMA) con antibióticos........1g..20g......7H2O...........2 Esterilizar a 1 atm 15 min.................................... Sacarosa........ . pH: 7...1 L......................... pH: 7 Esterilizar a 1 atm 15 min.....................1 L.......2 Esterilizar a 1 atm 15 min................... Página 161 ...... Extracto de levadura................ • Medio YSWA (Meyer y Simms..20g.......2 Esterilizar a 1 atm 15 min...... • Medio Thalassia Agar (Meyer y Simms.....MEDIOS DE CULTIVO Agua destilada……………………………1 L.....................18g...1 g.......1g....... pH: 7. 1965).............................. Agua de mar. Hojas de Thalassia maceradas.......................... 1967). Extracto de levadura..... Agua de mar.................. Agar.