PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA NORMAS QUE EL ALUMNO DEBERÁ CUMPLIR EN EL AMBIENTE DEL LABORATORIO 1. Uso de la bata, el descuido por olvido de la misma tendrá como consecuencia el retiro de la práctica. 2. La práctica comenzará a la hora fijada según horario. El retraso por más de diez (10) minutos impedirá su entrada a la misma. 3. El alumno deberá traer estudiada la guía correspondiente, debido a que el profesor realizará un examen corto, calificado acumulativo, el cual tendrá una ponderación del 65% de la nota práctica. 4. El estudiante entregará, en el lapso previsto por el docente, un informe sobre el trabajo realizado durante la actividad práctica, el cual constará de introducción, metodología, resultados, discusión y bibliografía. Este informe tendrá una ponderación del 25% de la nota práctica. 5. El estudiante mantendrá un comportamiento cortés para con sus compañeros, responsabilidad para con la muestra a analizar y mística de trabajo durante su actividad práctica. Esta conducta, destreza y aptitud ante la actividad tendrá una ponderación del 10% de la nota práctica denominándose nota apreciativa. 6. El estudiante estará en la obligación de entregar, al finalizar la práctica, los resultados obtenidos. 7. Al terminar de trabajar deberá apagar los equipos, lavar y secar el material de vidrio utilizado y dejar el laboratorio en completo orden. 8. No se permitirá comer, beber ni fumar en el ambiente del laboratorio. 9. El material que se rompa, durante el ejercicio práctico, el alumno deberá reponerlo en un periodo no mayor a 45 días. 10. La inasistencia a tres (3) actividades prácticas conducen a la pérdida de la asignatura. 2 11. El alumno que pierda una (1) actividad práctica, durante todo el semestre, tendrá derecho a recuperarla al finalizar el contenido programático práctico de la asignatura. El siguiente manual práctico recoge los protocolos de las actividades prácticas desarrolladas, durante el periodo académico II-99, en la asignatura Bioquímica Clínica.Estas prácticas se han venido desarrollando desde que se abrió el séptimo semestre de la carrera Licenciatura en Bioanálisis. Sin embargo, a partir del II semestre de 1998 surgió la necesidad de actualizar los protocolos de trabajo, adaptar las actividades prácticas a la realidad de los centros asistenciales y ampliar el contenido programático práctico con el objetivo de mejorar el proceso enseñanza-aprendizaje de los estudiantes del curso. Fue en el II semestre de 1999 en el cual este trabajo fue culminado. Los nuevos métodos y técnicas que actualmente están en el mercado son los descritos en este manual, lo cual les brinda a nuestros estudiantes, facilidad para la manipulación de las mismas y por ende dar un diagnóstico rápido y preciso sobre la patología que pueda estar presentando el paciente en estudio. 3 PRÁCTICA Nº 1. CURVA DE CALIBRACIÓN. 1. Objetivo Terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de construir de una curva de calibración para la obtención del factor de calibración y con ello la concentración de la muestra problema. 2. Objetivos Específicos: 2.1.-Conocer la definición y las diferencias entre solución blanco, patrón o estándar y control. 2.2.- Conocer como se prepara una solución madre y a partir de ella las soluciones patrones usando regla de tres o ecuaciones matemáticas. 2.3.- Definir curva de calibración. 2.4.- Conocer los pasos a seguir para la construcción de una curva de calibración. 2.5.- Armar la curva da calibración y a partir de ella calcular el factor de calibración 2.6.- Explicar la importancia del factor de calibración. INTRODUCCIÓN 4 La calibración consiste en someter las diluciones de concentraciones conocidas al mismo procedimiento al cual fue sometida la muestra problema. Es la relación entre la concentración y la tramitancia o absorbancia, para un procedimiento analítico determinado.La calibración se puede realizar a través de la preparación de patrones obteniendo las respectivas lecturas, mediante la realización de una curva de calibración, o bien, hallando el factor de calibración. Para ello se requieren de patrones y blanco. El patrón o solución patrón de trabajo: es una solución química de concentración conocida. Puede ser elaborado en el laboratorio o adquirirse en casas comerciales especializadas, en las cuales se conocen como calibrador. Actualmente las casas comerciales ofrecen en el mercado los multicalibradores, los cuales son patrones que reportan concentraciones conocidas de un gran número de analitos diferentes. El blanco, es una muestra de concentración cero, a la cual se le aplica el mismo tratamiento dado a la muestra patrón. Está formada por el solvente y los reactivos usados en la determinación analítica. Esta muestra se utiliza con la finalidad de ajustar a cero la densidad óptica, es decir se sustrae toda absorbancia producida por el solvente, compuestos secundarios y los reactivos. La curva de calibración, es la relación representada gráficamente entre la absorbancia y la concentración de la solución patrón de trabajo colocando las absorbancias en el eje de las ordenadas (Y) y las concentraciones en el eje de las abscisas (X). Si las lecturas se obtienen en tramitancia, la curva se debe construir en papel semilogarítmico partiendo del 100% T. Si las lecturas se obtienen en absorbancia, la curva se construye en papel milimetrado partiendo de cero (0). En ambos casos el resultado será una línea recta indicando la conformidad con la ley de Beer, en otras palabras respeta la proporcionalidad. Absorban Concentra Las curvas de calibración se construyen con el fin de poder calcular la concentración de la muestra problema. Dicho cálculo puede ser realizado de dos (2) maneras: - Una vez aplicada la técnica se realiza la lectura de la muestra problema en el 5 aparato, previo ajuste con el blanco en la longitud de onda requerida. Obtenida la lectura se busca este valor en la curva y se traza una línea hasta cortar la recta y, de aquí se prolonga hasta el eje de las abscisas donde se ubican las concentraciones. El punto de corte será el correspondiente a la concentración de la muestra problema. Esta técnica se conoce como extrapolación de la lectura CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA POR EXTRAPOLACIÓN DE LA LECTURA Absorbanci as Punto de Lectura de la muestra corte Concentra ción de la Concentracio nes El otro tipo de cálculo se realiza por: - Factor de Calibración, el cual se define como la relación entre la concentración de la solución patrón y su lectura respectiva. Posteriormente la multiplicación de dicho factor por la absorbancia de la muestra problema nos da la concentración de ésta. A continuación se presenta un caso a manera de ejemplo: Se tienen cuatro (4) patrones, cuyas concentraciones y lecturas son las siguientes: PATRÓN CONCENTRACIÓN LECTURA 1 2 3 4 1 mg/dl 2 mg/dl 4 mg/dl 6 mg/dl 0,023 0,046 0,093 0,140 6 Fuente: Arevalo, E; Becerra, G y Araujo, J.F. Análisis Instrumental. 1994. Lectura de la muestra problema....... 0,120. Fc1 = 1/ 0,023 = 43,478 Fc2 = 2/0,046 = 43,478 Fc3 = 4/0,093 = 43,011 Fc4 = 6/0,140 = 42,85 Factor promedio = 43,478 + 43,478 + 43,011 + 42,85 = 43,20 4 Concentración problema = 43,20 x 0,120 = 5,18 CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA GLUCOSA. (METODO GLUCOSA OXIDASA) Antes de preparar la solución patrón de trabajo, es necesario conocer los valores de referencia del analito y la técnica a utilizar. - Se preparan patrones cuyas concentraciones varíen por debajo, entre y por Conociendo que la glucosa varía entre 70 – 110 mg/dl, se prepararan patrones encima del valor normal partiendo de cero. de 200, 150, 100, 75, 50 y 0 mg/dl tomando la concentración de 200 mg/dl como solución madre (2g en 1l de agua destilada); a partir de ella se prepararán los demás patrones. TUBO SOLUCIÓN MADRE (ml) AGUA DESTILADA (ml) CONCENTRACIÓN (mg/dl) 200 150 100 75 50 0 0 0,5 1,0 1,25 1,5 2 1 2,0 2 1,5 1,0 3 0,75 4 0,5 5 0 6 NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor - Una vez preparado los patrones, se aplicará la técnica de la Glucosa Oxidasa, la cual se Fundamenta en: La B-D-Glucosa es oxidada específicamente por la Glucosa Oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual oxida al cromógeno (4- 7 AAp/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. 1. 2. Técnica: Tome 20 µl de cada patrón preparado Añada 2,0 ml del reactivo de trabajo Incube por 30 minutos a temperatura ambiente Lea en un espectronic 20 a una longitud de onda de 510 nm Anote los resultados y grafíquelos en un papel milimetrado. 3. 4. 5. CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA CREATININA (MÉTODO: Jaffé) Antes de preparar la solución patrón de trabajo, es necesario conocer los valores de referencia del analito y la técnica a utilizar. - Se preparan patrones cuyas concentraciones varíen por debajo, entre y por Conociendo que la creatinina varía entre 0,5 – 1,5 mg/dl, se prepararán encima del valor normal partiendo de cero. patrones de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,25 y 0 mg/dl tomando la concentración de 2,0 mg/dl como solución madre (2mg en 100 ml de agua destilada); a partir de ella se prepararán los demás patrones. TUBO SOLUCIÓN MADRE (ml) 1 2,0 0 2,0 1,5 0,5 1,5 2 1,0 1,0 1,0 3 0,5 1,5 0,5 4 5 0,25 1,75 0,25 6 0 2 0 AGUA DESTILADA (ml) CONCENTRACIÓN (mg/dl) NOTA: Es recomendable iniciar con el tubo de menor Una vez preparado los patrones, se aplicará la técnica de Jaffé, la cual se fundamenta en: La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas reacciona con el picrato alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido de sodio), formándose un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentración de la muestra. 8 1. sodio). 2. Técnica: Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de Preparar siete (7) tubos de ensayos rotulados como: 0 0,25 mg/dl 0,5 mg/dl 1,0 mg/dl 1,5 mg/dl 2,0 mg/dl Blanco mg/dl 100 100 2 2 Agua destilada ( µl ) Patrón ( µl ) Picrato Alcalino (ml) 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm. Realizar los cálculos en este espacio 9 PRÁCTICA N. 2. CONTROL DE CALIDAD 1.-Objetivo terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de armar e interpretar una curva de control de calidad para establecer los límites de precisión y exactitud.. 2.- Objetivos específicos: 2.1.-Definir control de calidad 2.2.-Definir pool de suero y explicar cómo se colecta y se procesa. 2.3.-Conocer los pasos a seguir para la construcción de una curva de control de calidad. 2.4.- Calcular, armar y aplicar la curva de control de calidad para analizar la precisión y exactitud del trabajo. INTRODUCCIÓN El control de calidad se podría definir como un método estadístico que permite determinar la precisión y exactitud del análisis realizado. La precisión se refiere al hecho de que los repetidos análisis con la misma muestra deberán dar resultados similares, es decir los resultados deben ser reproducibles. La exactitud nos indica la proximidad de una concentración al verdadero valor de la concentración de la muestra. La exactitud es difícil de determinar y se valora mejor por comparación con los resultados obtenidos con materiales de concentración conocida previamente analizados con métodos de referencia. La precisión se determina calculando la desviación estándar luego de un número de análisis repetidos. El propósito del control de calidad consiste en evaluar de forma real la capacidad funcional habitual de un laboratorio con respecto a otros laboratorios, con el fin de identificar problemas significativos a medida que surgen y de documentar su resolución. Se han empleado numerosas técnicas de control estadístico en laboratorios clínicos en su mayor parte de carácter manual. Sin embargo, los datos no revelan de forma eficaz los 10 sutiles cambios que puedan producirse en un método analítico. En consecuencia, se han aceptado los gráficos de control como método eficaz para regular la mayoría de las técnicas de control. Tales gráficas generalmente representan la observación de control (o una estadística calculada) en función del tiempo (días). La gráfica de Levey-jennings (1950) ha sido la técnica más ampliamente utilizada. Para realizar dicha gráfica es necesario preparar un pool de suero, el cual consiste en recoger en un envase estéril mantenido a 20°C, todos los sueros normales sobrantes del laboratorio. Tales sueros no deben estar hemolizados, lipémicos o ictéricos. Al obtenerse un volumen de suero relativamente elevado (litros) se descongela y con una varilla de vidrio se desfibrina. Este producto es centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante es guardado a 20°C en alícuotas de 5 a 10 ml contenidas en viales bien tapados y rotulados. Durante 30 días se realizarán lecturas de dicho pool una vez aplicada la técnica respectiva. Con los datos recogidos se calculará la media aritmética y la desviación estándar. Estos datos estadísticos servirán para construir la Curva de Control de Calidad, la cual será posteriormente utilizada para controlar la precisión del trabajo realizado en el laboratorio. CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA LA GLUCOSA Fundamento de la Técnica: la B-D-Glucosa es oxidada específicamente por la glucosa oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual oxida a un cromógeno, para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. Procedimiento: Prepare doce (12) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estándar (S) y los diez restantes, Muestra (M1, M2, ....M10) B Agua destilada ( µl ) Estándar ( µl ) Pool de suero ( µl ) Reactivo de Color (ml) • S 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9 M 10 M 20 2 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Dejar incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer en un espectronic 11 20 a una longitud de onda de 510 nm. Una vez obtenida las lecturas calcular la concentración de glucosa, en cada tubo, por factor de calibración estándar y Lp la lectura de dicho estándar. • • • • • Cp Lp , donde Cp es la concentración del Hallar la concentración promedio del Pool de suero Χ = ∑ concentraciones n°devalores Restar a cada concentración (X) la concentración promedio ( Χ )= ( Χ − Χ ) Elevar al cuadrado la resta anterior ( Χ − Χ ) 2 Calcular la desviación estándar Ds = n°devalores − 1 ∑ (Χ − Χ) 2 Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los días (10), y en las ordenadas (y) la concentración promedio ( Χ ) , la cual se proyectará en el centro de dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calculará una (1), dos (2) y tres (3) veces la desviación estándar. (Ver gráfica anexa) CURVA DE CONTROL DE CALIDAD PARA CREATININA Fundamento de la Técnica: La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas reacciona con el picrato alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido de sodio), formándose un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentración de la muestra. 1. sodio). 2. Técnica: Preparar el Picrato Alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de Preparar doce (12) tubos de ensayos rotulados blanco (B), estándar (S) y los B S 1 diez restantes como muestra (M1, M2, M3,….M10) M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7 M 8 M 9 M 10 M Agua destilada 100 ( µl ) Estándar ( µl ) Picrato 100 2 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 100 100 100 100 100 2 2 2 2 2 2 Alcalino (ml) Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm. 12 • Una vez obtenida las lecturas calcular la concentración de creatinina, en cada Cp Lp tubo, por factor de calibración de dicho estándar. • • , donde Cp es la concentración del estándar y Lp la lectura Hallar la concentración promedio del Pool de suero Χ = ∑ concentraciones n°devalores Restar a cada concentración (X) la concentración promedio ( Χ ), es decir, ( Elevar al cuadrado la resta anterior ( Χ − Χ ) 2 Calcular la desviación estándar Ds = Χ−Χ) • • • n°devalores − 1 ∑ (Χ − Χ) 2 Construir un eje de coordenadas ubicando en las abcisas (x) los días (10), y en las ordenadas (y) la concentración promedio ( Χ ) , la cual se proyectará en el centro de dicho eje. Por encima y por debajo de la media se calculará una (1), dos (2) y tres (3) veces la desviación estándar. (Ver gráfica anexa) Gráfica de Control de Levey-Jennings + + + Día 13 Realizar los cálculos en este espacio: Muestra Lectura Concentración ( χ − χ) (χ − χ) 2 14 PRÁCTICA N.3. ANÁLISIS DE ORINA 1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de realizar un uroanálisis como prueba de rutina para evaluar la función renal. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Conocer el método para la toma de muestra urinaria parcial 2.2.- Conocer la metodología para la realización del examen de orina: -Examen físico -Examen químico -Examen microscópico 2.3.- Conocer el uso y los fundamentos de la cinta reactiva y de los métodos confirmatorios. 2.4.- Establecer las diferencias entre los elementos organizados y no organizados de la orina con fines diagnósticos (leococitos, hematíes, cristales, cilindros, bacterias, levaduras, células epiteliales planas y redondas) 2.5.- Diferenciar y reconocer, según los resultados, las diferentes patologías renales (glomérulo nefritis, síndrome nefrótico, pielonefritis, infección bacteriana, infección micótica) 2.6.- Realizar el reporte de los resultados. 15 INTRODUCCION El análisis de orina constituye uno de los métodos más fieles para evaluar la función renal y para el diagnóstico y pronóstico de muchas patologías que afectan al riñón. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Técnica recomendada: chorro medio. Lavar los genitales con agua y jabón. Si es mujer separar los labios mayores o si es hombre retirar el prepucio. Después de haber comenzado la micción y haber descartado un poco de orina Debe ser la primera orina de la mañana. Utilizar un recipiente estéril. Llevarla lo antes posible al laboratorio. Una vez en el laboratorio: Procesarla de inmediato, de no ser así refrigerarla o tomar una muestra representativa. si se va a guardar por períodos más prolongados usar conservadores. ANALISIS: Examen físico: Color: de amarillo pálido a ámbar. Aspecto: Clara Ligeramente turbia. Turbia DENSIDAD: se refiere al número de solutos y al peso de estas sustancias en la orina. La densidad se mide con un refractómetro o urinómetro. VR: 1005 – 1030 g/ml. OLOR: la orina es inodora. Olor amoniacal: probable infección con bacterias. Olor a frutas: presencia de cetonas. Olor dulce: pus o posible infección. EXAMEN QUÍMICO: TIRAS REACTIVAS: el análisis químico se realiza a través de las tiras reactivas, el procedimiento para el uso de las tiras reactivas es el siguiente: 1) Sumergir la tira reactiva en la muestra de orina. 16 2) Remover el exceso de orina mediante golpes contra el borde del recipiente. 3) Comparar el color obtenido con la correspondiente carta de colores del envase. Los parámetros evaluados por las tiras reactivas son los siguientes: pH URINARIO: VR: 4,7 - 7,8. Viraje al naranja: ácido. Viraje al verde o azul: alcalino. PROTEÍNAS: Indicador : azul de tetrabromofenol. Presencia de proteínas: Azul – Verdoso. Ausencia de proteínas: amarillo. Prueba confirmatoria: Acido sulfosalicílico. AZÚCARES: Principio: Glucosa + O2 H2O2 + O-toluidina Acido glucónico + H2O2 O – toluidina oxidasa (azul) Prueba confirmatoria: reacción de Benedict. CETONAS: los cuerpos cetónicos se forman durante el catabolismo de los ácidos grasos. Principio: Acido acetoacético + Nitroprusiato de Na+ Confirmatoria: prueba del cloruro férrico. BILIRRUBINA: producto final de la degradación de los eritrocitos. Principio: Bilirrubina glucurónido + Sal de diazonio Prueba confirmatoria: Reactivo de fouchet. UROBILINÓGENO: se forma a partir de la reducción de la bilirrubina. Principio: Urobilinógeno + p – dimetilaminobenzaldehido pH ácido Prueba confirmatoria: Prueba de Erlich. 17 púrpura azobilirrubina (azul) Rojo. NITRITO: se encuentra presente en las infecciones bacterianas. Principio: Acido p-arsanílico + Nitritos Diazonio + N-1-Naftilendiamina Diazonio Color rosado SANGRE: la hematuria es la presencia de sangre en la orina, esta puede ser visible macroscópicamente o microscópicamente y puede ser debida a diversas causas a nivel renal: infecciones, glomerulonefritis, tumores, hipertensión, infarto renal, LES. Principio: Hemoglobina. H2O2 + 0 – toluidina Prueba confirmatoria: microscópicamente. ESTUDIO DEL SEDIMENTO URINARIO: Técnica: 1) 1.500 r.p.m. 2) 3) Descarte el sobrenadante y coloque el sedimento en una lámina portaobjeto Observar al microscopio con el objetivo seco. limpia, cubra la lámina con un cubreobjeto. Colocar 10 ml de orina en un tubo de ensayo, centrifugar por 10 minutos a O-toluidina oxidasa + H2O SEDIMENTO URINARIO: Organizado: Células epiteliales. Hematíes. Leucocitos. Cilindros. No organizado: Cristales Células: Eritrocitos, leucocitos. Células espiteliales, células del túbulo renal. 18 Cristales: orina ácida Acido úrico, oxalato de calcio, uratos amorfos, ácido hipúrico, uratos de sodio, Sulfato de calcio, cristales de cistina, Colesterol, tirosina, leucina, sulfamidas. Cristales: orina Alcalina Fosfato triple. Fosfato amorfo Carbonato de calcio Biurato. Biurato de amonio. Estructuras Diversas Bacterias Hongos Parásitos. Gotas de grasa y de aire. Cabellos y Fibras. 19 PRÁCTICA Nº 4. DEPURACIÓN DE CREATININA 1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de determinar la depuración de creatinina como prueba diagnóstica para la insuficiencia renal. 2.- Objetivos especificos: 2.1.- Definir depuración de creatinina. 2.2.- Conocer y fundamentar la técnica para la determinación de creatinina en suero y en orina de 24 horas (método de Jaffé). 2.3.- Conocer los interferentes de la prueba. 2.4.- Conocer y aplicar los pasos para el cálculo de la depuración de creatinina. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para el diagnóstico, junto a la clínica e historia del paciente, de insuficiencia renal. 20 INTRODUCCIÓN Es el riñón el órgano encargado de mantener el volumen y composición de los líquidos corporales dentro de los límites fisiológicos normales. Esta función del riñón es llevada a cabo por el acoplamiento de millones de nefronas que llevan a cabo la filtración, secreción y reabsorción de líquidos y solutos en el plasma. La filtración en el glomérulo ocurre por la elevada presión hidrostática de sus capilares, esta presión hace que el líquido filtrado en el glomérulo tenga la misma composición a la del plasma, excepto que no contiene proteínas de elevado peso molecular. La creatinina es un producto final de la creatina del hígado. El reservorio de energía del músculo es la unión fosfato de alta energía. Las enzimas creatina quinasa y miokinasa separan el grupo fosfato de la creatina para formar ATP. CK Creatina-fosfato + ADP ATP + Creatinina. La creatinina deriva de su interconversión no enzimática en el músculo esquelético y es liberada al plasma con una velocidad constante. La concentración de creatinina plasmática y urinaria depende de la masa magra muscular, por lo tanto se encuentra más elevada en los hombres que en las mujeres y sus concentraciones son independientes de la dieta o cualquier factor del medio ambiente. La determinación de la creatinina constituye uno de los principales parámetros para evaluar la función renal, más específicamente la filtración glomerular, ya que la creatinina es filtrada en el glomérulo y no se reabsorbe a nivel de los túbulos. Si el índice de filtración glomerular (IFG) disminuye ella aumenta en el plasma y disminuye en la orina o por si el contrario el IFG aumenta ella disminuye en el plasma y aumenta en la orina. Significado clínico: (Depuración de creatinina) Se encuentra aumentada en: todos los estados que conllevan a un volumen minuto cardíaco elevado: embarazo, estados hipercatabólicos (hipertiroidismo) Se encuentra disminuida: cuando existe un flujo sanguíneo renal disminuido: Shock, deshidratación, hemorragias, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome nefrótico, glomerulonefritis, pielonefritis, mieloma múltiple, insuficiencia hepática, paludismo, insuficiencia renal. 21 Procedimiento de laboratorio: Muestra: debe ser tomada en ayunas, no debe estar hemolizada o lipémica. Interferentes de la prueba: algunos medicamentos como: furosemidas, metil prednisona, carbinoxolona (aumentan los valores reales de la creatinina). Las tiacidas, diazóxido y drogas nefrotóxicas disminuyen la creatinina). Se debe evitar tomar té, café, evitar el ejercicio intenso, estar bien hidratado para obtener un flujo de orina superior a 2ml/minuto. Suspender el tratamiento con cortisona, tiroxina. La depuración de creatinina se define como el volumen plasmático en el que cierta cantidad de creatinina es eliminada en la orina por unidad de tiempo. Técnica a emplear: Método de jaffé. La creatinina existente en un filtrado libre de proteínas reacciona con el picrato alcalino (formado por reacción entre el ácido pícrico y el hidróxido de sodio), formándose un tautómero de color rojo, siendo proporcional la intensidad del color a la concentración de la muestra. Procedimiento: 1) 2) 3) Tomar la muestra de suero del paciente Medir el volumen de la orina de 24 horas con un cilindro graduado. Preparación de la muestra de orina: dilución 1/10. Determinación de Creatinina en orina de 24 horas y en suero Preparar el Picrato alcalino (partes iguales de ácido pícrico e hidróxido de 4) 5) sodio) Determinación de Creatinina en Suero y en orina. Blanco Standard Muestra de suero Muestra de orina (1/10) 100 Agua destilada ( µl ) 100 Standard ( µl ) Suero ( µl ) Orina 1/10 ( µl ) Picrato alcalino (ml) 2 2 Esperar 15 minutos a 37ªC y leer a 520 nm. 100 2 100 2 22 Cálculos: Concentración / de / creainina / en / orina = Concentración / de / creainina / en / suero = Concentración / patrón × Absorbancia / de / la / muestra Absorbancia / patrón Concentración / patrón × Absorbanci a / de / la / muestra Absorbanci a / patrón Convertir el volumen total de la orina (24 horas) en minutos: Volumen / orina (24horas ) , donde 1440 son los 1440 Volumen de orina en minutos = minutos en 24 horas. Depuración de creatinina = UxVm , donde U es la concentración de ceatinina en P orina, Vm volumen urinario minutado y P concentración de creatinina en suero. Intervalo de referencia: 90 – 140 ml/min. Realizar los cálculos en este espacio: 23 PRÁCTICA Nº 5. DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA 1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar la concentración, total, directa e indirecta, de bilirrubina sérica para el diagnóstico de ictericias. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Definir ictericia 2.2.- Clasificar la ictericia en : pre hepática, hepática y post hepática. 2.3.- Relacionar los niveles de bilirrubina total, directa e indirecta para el diagnóstico del tipo de ictericia. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación de bilirrubina sérica. 2.5.- Aplicar, sobre la muestra biológica, la técnica adecuada para determinar los niveles de bilirrubina. 2.6.- Reportar e interpretar los valores obtenidos con el fin de diagnosticar la ictericia presente. 24 INTRODUCCIÓN La bilirrubina proviene del grupo hem de la hemoglobina contenido en los eritrocitos. El 90% de estas células envejecidas son destruidas por los fagocitos del bazo, hígado y médula ósea, liberando hierro, globina y el grupo hem. En el interior del histiocito se produce la separación del hem, hierro y globina a nivel del puente α-metano por las enzimas hemoxigenasas microsómicas. El hierro y la globina son almacenados para ser reutilizados. El hierro se almacena como ferrtina o hemosiderina dentro del histiocito, pero la mayor parte es captado por la proteína de transporte transferrina. El hierro de la transferrina es liberado en la médula ósea para ser utilizado en los normoblastos en formación. La globina se degrada y pasa al fondo común de los aminoácidos. La porción restante del anillo de porfirina (biliverdina) es reducida por la enzima biliverdina reductasa a bilirrubina, ésta pasa a la sangre donde se combina con la albúmina para ser transportada al hígado. En el hígado por acción de la enzima UDPglucoroniltransferasa es conjugada a bilirrubina conjugada, la cual es polar e insoluble en lípidos. El glucurónido de bilirrubina se excreta en la bilis, una vez en el intestino por acción de las enzimas bacterianas es convertido a urobilinógeno, éste se excreta en las heces donde se oxida a urobilina o estercobilina. Parte del urobilinógeno reabsorbido se filtra por el riñón y aparece en la orina (urobilina urinaria). La determinación de la bilirrubina tiene gran importancia clínica ya que sirve para evaluar la función hepática, anemias autoinmunes y la eritroblastosis fetal entre otras. El aumento de la bilirrubina en el plasma conlleva a un estado patológico conocido como ictericia. La cual consiste en la coloración de la piel y membranas mucosas por el aumento de los pigmentos biliares en la sangre. La ictericia se divide en: ictericia prehepática, hepática y post-hepática. Ictericia pre-hepática: produce un aumento de la bilirrubina no conjugada debido a un aumento de la liberación y metabolismo de la hemoglobina después de la hemólisis. Ejemplo: Anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal. Ictericia hepática: aumento de la bilirrubina conjugada y no conjugada por problemas intrínsecos del hígado, ya sea por defectos en el transporte o metabolismo de la bilirrubina. 25 Entre las patologías incluidas en esta clasificación encontramos: el síndrome de Dubin-Johnson, la enfermedad de Crigler Najjar, hepatitis, cirrosis, ictericia fisiológica neonatal. Ictericia post-hepática: enfermedad biliar obstructiva, espasmos o constricciones del tracto biliar, oclusión de conductos por cálculos o de una compresión por la presencia de un tumor. En este caso aumenta la bilirrubina conjugada. Procedimiento de laboratorio: Muestra: suero o plasma. orina (proteger la muestra de la luz) Condiciones de la muestra: La muestra no debe estar hemolizada pues en este caso aparecen valores falsamente elevados. 1) Debe protegerse de la luz debido a que la luz degrada a la bilirrubina produciendo valores falsamente disminuidos. Fundamento de la prueba: La bilirrubina reacciona con el diazo reactivo de Erlich o P-benceno diazonio sulfonato, formando azobilirrubina compuesto de color rosado cuya intensidad se lee fotocolorimétricamente a 540 nm. Muestra: suero (dilución 1:10) 1 ml de suero + 9 ml de solución salina fisiológica. Blanco de Directa Blanco de Total Directa Total SSF (ml) 2,5 2,5 -----------Metanol (ml) ---------2,5 2,5 Diazo blanco (ml) 0,5 ----0,5 ---Diazo reactivo (ml) ----0,5 -----0,5 Suero 1:10 (ml) 2 2 2 2 Guardar los tubos en la oscuridad y leer a los 30 minutos con filtro verde de 540 nm. Cálculos: Bilirrubina directa (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33. Bilirrubina total (mg/dl): Absorbancia (M) x Factor 33 Bilirrubina indirecta (mg/dl): Bilirrubina total – Bilirrubina directa. Nota: el reactivo diazoico se prepara en el momento de su uso, de la siguiente forma: 26 Solución A: 20 ml ó 5 ml. Solución B: 0,6 ml ó 0,15 ml. Mezclar. Intervalo de referencia: Bilirrubina total: 0,3 – 1,0 mg/dl. Bilirrubina directa: 0,1 – 0,15 mg/dl. Bilirrubina indirecta: 0,2 – 0,8 mg/dl. Resumen Causas de hiperbilirrubinemia: 1) a) b) c) d) e) f) 2) a) b) c) d) e) No conjugada: Hemólisis aumentada: anemias autoinmunes, eritroblastosis fetal. Ictericia neonatal. Eritropoyesis ineficaz. Drogas que compiten por el glucurónido. Enfermedad de Gilbert. Enfermedad de Crigler Najjar. Conjugada: Obstrucción del árbol biliar. Colestasis. Lesiones hepatocelulares: cirrosis, hepatitis. Neoplasias hepáticas Cálculos o quistes. f) Síndrome de Dubin-Johnson y síndrome de Rotor. 27 PRÁCTICA Nº 6. PROTEÍNAS TOTALES Y FRACCIONADAS 1. Objetivo terminal: al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de determinar la concentración de proteínas totales, albúminas y globulinas presentes en el suero del paciente. Así mismo, interpretar los resultados con el fin de llegar a un diagnóstico clínico. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Definir, clasificar y diferenciar las funciones de las proteínas plasmáticas. 2.2.- Conocer las patologías y estados fisiológicos en los cuales las proteínas se pueden presentar alteradas. 2.3.- Conocer los fundamentos y metodologías de las pruebas para la determinación de proteínas totales y albúmina. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos. 28 INTRODUCCIÓN Las proteínas son sustancias de primordial importancia para la vida, ya que constituyen los elementos de las células en los que se realizan las funciones propiamente vitales. Al igual que los lípidos e hidratos de carbono, las proteínas pueden ser utilizadas por el organismo con fines energéticos. Pero además son elementos estructurales, que forman la armazón arquitectónica de las células. El plasma sanguíneo contiene en solución coloidal una gran cantidad de proteínas (alrededor de 7g/dl). Las proteínas plasmáticas constituyen complejos de sustancias de diferente composición y de diferente estado de hidratación, lo cual permite separarlas por distintos procedimientos, entre ellos electroforesis. Mediante la electroforesis se obtienen cuatro fracciones principales: la albúmina y las globulinas α , β • • • • y γ , cada una con funciones específicas. Sin embargo, las proteínas plasmáticas cumplen funciones generales, entre las cuales se encuentran: Intervienen en el metabolismo acuoso, principalmente manteniendo la presión Intervienen en el equilibrio electrolítico Participan en el transporte de sustancias liposolubles, entre ellas los lípidos. Actúan como hormonas, enzimas, antígenos y anticuerpos. coloidosmótica. Interpretación Clínica de las proteínas Totales: Se utilizan para evaluar el estado nutricional y en el estudio del edema. Causas de proteínas totales elevadas (> 9,0g/dl): deshidratación. Causas de proteínas totales disminuidas (<6,0 g/dl): gastroenteropatías, síndrome nefrótico. Descensos debidos a la disminución de la síntesis de proteínas como en: enfermedad hepática crónica, síndrome de malabsorción, malnutrición agammaglobulinemia. Causas de Albúmina elevada (>6,0 g/dl): procesos de deshidratación (Pseudohiperalbuminemia). hiperinmunoglobulinemia, gammapatías mono o policlonales. Se encuentra pseudohiperproteinemia en caso de 29 Causas de Albúmina disminuida (<3,0 g/dl): malabsorción, obstrucción intestinal, enfermedad hepática (cirrosis, hepatitis crónica activa), fiebre reumática, síndrome nefrótico. PROTEÍNAS TOTALES Método: Biuret Principio: Las proteínas por sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo de Biuret en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Muestra: Suero. Cuando se extraiga la muestra, y tras centrifugar, debe separase el suero de las células. Refrigerar, almacenar a 4ºC menos de 72 horas. A –20°C es estable durante 6 meses. Interferencias: Procedimiento BLANCO ESTÁNDAR MUESTRA 50 Agua destilada ( µl ) 50 Estándar ( µl ) 50 Muestra ( µl ) Reactivo de Biuret (ml) 3 3 3 Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a 540 nm. Valores Normales: 6,3 – 8,5 g/dl. ALBÚMINA Método: Verde de Bromocresol Principio: la albúmina se une al indicador Verde de Bomocresol a un pH adecuado para formar un complejo coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de albúmina en la muestra. Muestra: Suero, orina parcial, orina de 24 horas, líquido cefalorraquídeo. Interferencias: aumentados. 30 esteroides anabólicos, andrógenos, corticoides, insulina y progesterona producen valores elevados de proteínas totales. ampicilina, hemoglobina, heparina y lipemia dan valores Procedimiento: Blanco Estándar Muestra 20 Agua destilada ( µl ) 20 Estándar ( µl ) 20 Muestra ( µl ) Reactivo (ml) 5 5 5 Mezclar bien, dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente y leer a 630 nm. Valores refenciales: 3,5 – 5,1 g/dl. Realizar los cálculos en este espacio. 31 PRÁCTICA Nº 7. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE ÁCIDO ÚRICO 1. Objetivoterminal: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar los niveles séricos de ácido úrico como prueba diagnóstica del metebolismo de las purinas. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Conocer el origen del ácido úrico y su importancia clínica. 2.2.- Conocer las patologías y estados fisiológicos en los cuales el ácido úrico puede alterarse. 2.3.- Conocer los fundamentos y metodologías de las pruebas para la determinación de ácido úrico. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas y las condiciones de la muestra. 2.5.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos. 32 INTRODUCCIÓN El ácido úrico es el producto final más importante del metabolismo de las purinas, que son el producto de degradación de las nucleoproteínas contenidas en las células de los tejidos. La principal fuente de ácido úrico la constituyen las nucleoproteínas contenidas en las carnes, aunque también las purinas son sintetizadas en la médula ósea a partir de los precursores químicos sencillos como los componentes del ácido nucleico, en combinación con nucleótidos y proteínas. El ácido úrico en filtrado en el glomérulo renal pero casi en su totalidad (90%) es reabsorbido en los túbulos renales. El ácido úrico es ligeramente soluble en agua, pero forma sales solubles con alcálisis por eso precipita fácilmente en orinas ácidas si se les deja en reposo y tiene tendencia a formar cálculos renales en pacientes con gota. La gota es un tipo de artritis inflamatoria articular secundaria a la cristalización de urato monosódico en la articulación. En caso de una insuficiencia renal crónica avanzada existe un aumento progresivo del nivel plasmático de ácido úrico. Interpretación clínica: La cantidad total de ácido úrico circulante depende de la síntesis y catabolismo endógeno de las purinas, de la ingesta de purinas exógenas y del aclaramiento renal de los uratos. Hiperuricemia primaria: 1) Gota. Hiperuricemia secundaria: 1) Enfermedades mieloproliferativas, neoplasias, enfermedades renales, hipertiroidismo. Hipouricemia: enfermedades congénitas del metabolismo como la xantinuria. Carencia o defectos purino-nucleósido-fosforilasa. DETERMINACIÓN DE ACIDO ÚRICO: Fundamento de la prueba: La determinación enzimática del ácido úrico se realiza mediante las reacciones siguientes: Acido úrico + 2H2O + O2 Alantoina + CO2 + H2O2 33 H2O2 + 4-AF + DCFS 4-AF: Quinona rosada + 4H2O 4-aminofenazona, DCFS: 2,4 diclorofenolsulfonato .Muestra • • • suero o plasma. Orina de 24 horas. No utilizar muestras hemolizadas. El ácido úrico es estable en nevera por 3 días (2 ºC – 8 ºC), es estables en El ácido úrico es estable en orina a temperatura ambiente por varios días. congelación por seis meses. Interferentes de la prueba: 1) La bilirrubina y el ácido ascórbico pueden ocasionar valores falsamente bajos. 2) Muestras lipémicas producen valores falsamente elevados. Procedimiento de laboratorio: Blanco 60 60 3,0 3,0 60 3,0 Patrón Paciente Agua destilada ( ( µl ) Patrón ( µl ) Suero ( µl ) Reactivo (ml) Mezclar bien e incubar por 5 minutos a 37 ºC ó 10 minutos a temperatura ambiente y leer a una longitud de onda de 520nm. Cálculos: concentración = Valores de referencia: Suero o plasma = 2,5 – 7,7 mg/dl. Realizar los cálculos en este espacio Concentración / del / patón × Lectura / de / la / muestra Lectura / del / patrón 34 PRÁCTICA Nº 8. CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA. DIABETES MELLITUS 1. Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de construir una curva de tolerancia a la glucosa como prueba diagnóstica de la Diabetes Mellitus. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Conocer el tratamiento del paciente para realizarle una curva de tolerancia a la glucosa. 2.2.- Conocer los pasos para realizar una curva de tolerancia a la glucosa. 2.3.- Conocer el método adecuado y su fundamento para la determinación de glucosa sérica. 2.4.- Aplicar el método adecuado sobre la muestra correspondiente para la determinación de glucosa sérica. 2.5.- Armar la curva de tolerancia a la glucosa. 2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos para obtener un diagnóstico definitivo. 35 INTRODUCCION La glucosa es el azúcar principal de la sangre que sirve a los tejidos como principal combustible metabólico. La concentración de glucosa sanguínea está controlada por la insulina. Esta hormona facilita la entrada de la glucosa a los tejidos extrahepáticos que son impermeables a ella, en tanto que las células hepáticas parecen ser libremente permeables a la glucosa. La glucosa estimula al páncreas para la síntesis y secreción de insulina. Existen diversas patologías asociadas a niveles inadecuados de glucosa sanguínea entre la más común está la DIABETES. La diabetes es una enfermedad metabólica, crónica y generalizada que se manifiesta en hiperglicemia, cetosis, glucosuria, catabolismo proteico y acidosis. Esta enfermedad está asociada a trastornos del páncreas el cual es incapaz de producir insulina, produce insulina no funcional o niveles de ella insuficiente para los niveles de glucosa sanguínea. La etiología de la diabetes no está clara aún, algunos autores afirman que se deben a factores genéticos o ambientales, otros a que la diabetes se debe a mecanismos de autoinmunidad. Significado clínico: Hiperglicemia 1) menstrual. 2) 3) 4) 5) 6) Hiperglicemia febril: observada en las infecciones agudas: neumonía, Hiperglicemia encefalopática: observada en los traumatismos cerebrales. En el infarto al miocardio: transitoria, dos días después del ataque cardíaco. En la pancreatitis aguda. En el hipertiroidismo, síndrome de Cushing, acromegalia. tuberculosis y sepsis. Hiperglicemia fisiológica: aumento de la glucosa sanguínea sin glucosuria se observa en las excitaciones psíquicas, esfuerzos musculares y a veces en el período Hipoglicemia: 1) 2) 3) 4) En el hiperinsulinismo por insulinoma. Tratamiento excesivo con insulina. En la insuficiencia suprarrenal. Hipotiroidismo. 36 5) 6) Enfermedad hepática. En afecciones hipofisiarias. Determinación de la Tolerancia a la Glucosa: Esta prueba constituye un valioso auxiliar diagnóstico. La tolerancia a la glucosa (capacidad para utilizar los carbohidratos) se encuentra disminuida en la diabetes y aumentada en el hipopituitiarismo, hiperinsulinismo y en la hipofunción corticosuprarrenal. Descripción de la prueba: Después de un ayuno de 12 horas, se le administra al paciente segùn condiciòn fisiològica una soluciòn glucosada preparada de la siguiente manera (adulto 75g de glucosa disueltas en 350 ml de agua, niños < de 12 años 1,75g/kg de peso en 350 ml de agua y embarazadas 100g de glucosa en 350 ml de agua). Antes de administrar la glucosa se toma una muestra de sangre, a la cual se le determinará los niveles de glucosa y constituirá la glicemia basal. Posteriormente se administra la solución glucosada y se esperan 2 horas para la toma de la segunda muestra. A esta última se le determina los valores de glicemia para el diagnóstico. Durante la realización de la prueba el individuo debe permanecer en reposo y se abstendrá de beber café o fumar. En los individuos normales la glicemia en ayunas está comprendida entre 70 – 110 mg/dl, después de la administración del concentrado, la glicemia debe elevarse y retornar, antes de las 2 horas, a los niveles basales. En los diabéticos el retorno al nivel basal es más lento, es decir la curva de la tolerancia a la glucosa en estos pacientes es más prolongada y más elevada que la de los individuos normales. Procedimiento de laboratorio: Indicaciones: el día antes de la prueba se le explica al paciente que debe realizar un ayuno de 12 horas. Cenar temprano y ligero. Muestra: Suero Fundamento: La glucosa es oxidada específicamente por la glucosa oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno el cual oxida al cromógeno (4 – AAP/fenol), para producir un compuesto coloreado, mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. Glucosa oxidasa Glucosa + H20 + O2 H2O2 + 4 aminoantipirina + Fenol Acido glucónico + H2O2 Peroxidasa Compuesto coloreado 37 Procedimiento: 1) Haga la determinación de glucosa sérica basal (en ayunas). 2) Adminístrele el concentrado de glucosa al paciente. Este debe tomarlo en un lapso no mayor de 5 minutos y el tiempo cero lo marca el comienzo de la ingesta. 3) Realice las determinaciones a las 2 horas siguiendo el esquema de trabajo que a continuación se presenta: Agua destilada ( µl ) 20 Standard ( µl ) 20 Suero basal ( µl ) 20 Suero 2 horas ( µl ) Reactivo (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 Incube por 30 minutos a temperatura ambiente y lea en un espectronic a 510nm. Cálculos: GLUCOSA (mg/dl) = Valores normales: En ayunas (suero o plasma) = 70 – 100 mg/dl. A las 2 horas = Normal < 126 mg/dl, Tolerante >126 < 199 mg/dl, Diabético > 200 mg/dl Concentración / del / patrón xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrón Blanco 20 Estándar Muestra (hora 0) Muestra (2 h) 38 PRÁCTICA Nº 9. PERFIL LIPÍDICO 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de determinar el perfil lipídico con el fin de diagnosticar dislipoproteinemias y/o riesgo coronario. 2.- Objetivos específicos: 2.1.- Definir lípidos, colesterol, triglicéridos, HDL colesterol, LDL colesterol y VLDL. 2.2.- Conocer la importancia clínica del perfil lipídico para la clasificación de las dislipoproteinemias y diagnóstico de riesgo coronario. 2.3.- Conocer los métodos de rutina para la determinación del perfil lipídico y los fundamentos de cada uno. 2.4.- Aplicar sobre la muestra en estudio, las técnicas adecuadas para determinar los valores de lípidos en la misma e interpretar los resultados con fines diagnósticos de patologías en el metabolismo lipídico. 39 PRÁCTICA Nº 9. PERFIL LIPÍDICO Los lípidos son sustancias orgánicas insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos. Los principales lípidos del plasma humano son: el colesterol esterificado, el colesterol libre y los triglicéridos. El Colesterol es un alcohol esteroideo insaturado que se sintetiza en casi todas las células del cuerpo, representa el 75% del total y constituye en componente estructural importante de las membranas celulares, un precursor en la biosíntesis de los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. El colesterol libre, el cual representa el 25% del total, participa en los procesos patológicos como principal factor en la génesis de la ateroesclerosis de arterias vitales, causando enfermedad cerebrovascular, coronaria y vascular periférica. El colesterol puede tener variaciones fisiológicas relacionadas con el sexo, la edad, la dieta y el embarazo. Las variaciones patológicas coinciden a menudo con las de la lipemia, aunque pueden presentarse variaciones discordantes. Entre las condiciones patológicas que cursan con hipercolesterolemia están: ictericia obstructiva, cirrosis biliar, ateroesclerosis, síndrome nefrótico, Diábetes Mellitus, entre otras. Entre las condiciones patológicas que cursan con hipocolesterolemia están: insuficiencia hepática, hipertiroidismo, entre otras. Los triglicéridos son ésteres de glicerol, generalmente formados por tres ácidos grasos diferentes. Provienen de dos fuentes: una externa del intestino delgado llamado triglicérido exógeno y una interna del hígado llamado triglicérido endógeno. Los triglicéridos son almacenados en el tejido adiposo y constituyen una fuente potencial de energía. El nivel de triglicéridos en el plasma es bastante variable, dependiendo del estado de alimentación, cantidad de ejercicios y del estado metabólico general. Se observan valores elevados de triglicéridos en hiperlipoproteinemias fundamentalmente las de tipo I,III, IV y V, las cuales se caracterizan por: Tipo I: aumento de quilomicrones Tipo III: aumento de Pre Beta e intermedia Tipo IV: Aumento de Pre Beta lipoproteína Tipo V: Aumento de quilomicrones y Pre Beta lipoproteína. Los lípidos son transportados desde el intestino hasta los órganos donde se utilizan por partículas especializadas llamadas lipoproteínas, las cuales representan complejos 40 macromoleculares que permiten la permanencia y movilización de los lípidos en un medio que le es adverso, como lo es el medio acuoso del plasma sanguíneo. Estas lipoproteínas se han clasificado en cuatro clases principales basándose en el tamaño de la partícula, su composición química, características fisicoquímicas y de flotación y movilidad electroforética. De acuerdo a su densidad se han clasificado como quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL o LMBD), de baja densidad (LDL o LBD) y de alta densidad (HDL o LAD). La dosificación de cada lipoproteína, complementada con la determinación del colesterol y los triglicéridos, proporciona lo que se conoce como “Perfil Lipídico”. Determinación del perfil lipídico 1.- Triglicéridos Método de la glicerol fosfato oxidasa (GPO) Fundamento: Los triglicéridos son hidrolizados por acción de la lipasa microbial en glicerol y ácidos grasos libres (FFA). El glicerol es fosforilado por adenosina-5-trifosfato (ATP) en glicerol-3-fosfato (G3P) en una reacción catalizada por glicerol kinasa (GK). El G3P se oxida a fosfato dihidroxiacetona (DAP) con formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) en una reacción catalizada por la enzima glicerol fosfato oxidasa (GPO). El H2O2 oxida al cromógeno (4-AAP) por acción de la enzima peroxidasa para formar una coloración roja de quinoneimina, la cual es proporcional a la concentración de triglicéridos en la muestra. Procedimiento: Prepare cuatro (4) tubos de ensayos rotulados como blanco (B), estándar (S), Control (C) y muestra (M) Reactivo Agua destilada ( µl ) Estándar ( µl ) Muestra ( µl ) Reactivo de color (ml) Incubar por 15 a 20 minutos B 30 S 30 30 3 3 3 a temperatura ambiente y leer a 540 nm. M Para calcular la concentración de triglicéridos en la muestra se aplica la siguiente ecuación: 41 C x = Fc × Lx , donde Cx es la concentración del analito en la muestra, Fc el factor de calibración y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibración se calcula dividiendo la concentración del patrón (Cp) entre su lectura (Lp), es decir Fc = Valores Normales: 36 – 165 mg/dl. 2.- Colesterol Método de la Colesterol Esterasa: Fundamento: El colesterol esterificado es hidrolizado por acción de la enzima colesterol esterasa para producir colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol libre es oxidado por la colesterol oxidasa para formar colest-4eno-3-ona y peróxido de hidrógeno. En presencia de la peroxidasa, el peróxido de hidrógeno formado oxida al cromógeno (DEAHCL/AAP), el cual producirá un color proporcional a la cantidad de colesterol en la muestra. Procedimiento: Prepare cuatro (4) tubos de ensayo rotulados como blanco (B), estándar (S), control (C) y muestra (M). Reactivo Agua destilada ( µl ) B 30 S M Cp Lp . 30 Estándar( µl ) Muestra( µl ) Reactivo de color (ml) 3 3 Incubar por 15 a 20 minutos a temperatura ambiente y leer a 500 nm. ecuación: 30 3 Para calcular la concentración de colesterol en la muestra se aplica la siguiente C x = Fc × Lx , donde Cx es la concentración del analito en la muestra, Fc el factor de calibración y Lx la lectura de la muestra. Recuerde que el factor de calibración se calcula dividiendo la concentración del patrón (Cp) entre su lectura (Lp), es decir Fc = Valores Normales: Deseable: < 200 mg/dl Límite: 200-239 mg/dl Alto: > 240 mg/dl 42 Cp Lp . 3.- HDL Colesterol Método de Precipitación Fundamento: Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de muy baja (VLDL) son precipitadas selectivamente del suero sanguíneo a un pH de 5,7 por la adición del reactivo fosfotungstato amortiguado, dejando las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en el sobrenadante. La centrifugación del suero pretratado resulta en un sobrenadante aclarado que contiene HDL, el cual es analizado por el método enzimático de colesterol (Colesterol Esterasa). Procedimiento: 1. 2. 3. 4. En tubos de centrífuga pipetee sucesivamente 0,5 ml de suero y 1 ml de Agite enérgicamente durante 10 segundos y déjelo en reposo durante 10 Centrifugue a 3.500 r.p.m durante 15 minutos Tome 0,2 ml del sobrenadante claro para la determinación enzimática de solución precipitante. minutos a una temperatura menor de 25ºC. colesterol. (Ver procedimiento para la determinación del colesterol) Valores Normales Sexo Hombres (mg/dl) Mujeres (mg/dl) Pronóstico favorable > 55 > 65 Riesgo normal 35 - 55 45 - 65 Indicador de riesgo < 35 < 45 4.- LDL Colesterol Método indirecto; según Friedewald: Fundamento: Esta fórmula da resultados fiables siempre y cuando los quilomicrones no están presentes, el contenido de triglicéridos es inferior a 400 mg/dl y el paciente no padece de hiperlipoproteinemia del tipo III. LDLColesterol = Colesterol / total − Valores normales: Sospechoso: a partir de 150 mg/dl Elevado: a partir de 190 mg/dl 43 triglicéridos − HDLColesterol 5 5.- VLDL Método indirecto; según Rifking Fundamento: La relación entre los triglicéridos y la VLDL es constante (1:5), lo cual ha permitido desarrollar una ecuación que de manera indirecta cuantifica a la VLDL. VLDL= triglicéri dos 5 Valores normales: 10 – 36 mg/dl 6.- Marcadores de riesgo coronario Indice LDLColesterol HDLColesterol HDLColesterol Colesterol / total Valor deseable: < 3 Indice Valor deseable: > 0,23 Realizar los cálculo en este espacio 44 PRÁCTICA Nº 10. DETERMINACIÓN SÉRICA DE CALCIO Y FÓSFORO 1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar los niveles de calcio y fósforo séricos con fines diagnósticos de patologías óseas. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Conocer las fuentes principales de calcio y fósforo. 2.2.- Conocer la relación existente entre calcio y fósforo sérico. 2.3.- Conocer los fundamentos y técnicas de las pruebas de rutina para la determinación de calcio y fósforo séricos. 2.4.- Conocer los interferentes de las pruebas como también el tipo de muestra. 2.5.- Conocer las diversas patologías y estados fisiológicos que se presentan con niveles aumentados o disminuidos de calcio y fósforo. 2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada las técnicas correspondientes para establecer un diagnóstico definitivo a partir de la clínica del paciente y los niveles de calcio y fósforo encontrados en dicha muestra. 45 INTRODUCCIÓN El fósforo existe en todas las células del organismo, pero la mayor parte (el 80%) se encuentra combinado con el calcio en los huesos y en los dientes. Un 10% se halla en combinación con proteínas, con lípidos y carbohidratos, y en otros compuestos de la sangre y del músculo. El fósforo se encuentra en casi todos los alimentos de la dieta, por lo tanto no se conoce que ocurra una deficiencia dietética en el hombre. El consumo de fósforo debe ser de 1,5 g/día en los adultos y un poco mayor en los niños, en los lactantes el consumo de fósforo es aún mayor. El metabolismo del fósforo se encuentra, en gran parte, relacionado con la del calcio, la relación de estos dos elementos es 1:1 cuando el aporte de vitamina D es adecuado. Interpretación Clínica de los Valores de Fósforo Sérico: Hipofosfatemia: en general asintomática, pero si es marcada puede dar una serie de manifestaciones clínicas como: insuficiencia respiratoria, acidosis metabólica, fallo cardíaco y alteraciones hematológicas. Si es moderada ocasiona debilidad muscular. 1) 2) 3) Raquitismo: pueden llegar a ser tan bajos como 1 a 2 mg/100 ml. En el hiperparatiroidismo, en la enfermedad celíaca. Pacientes con defecto tubular renal (heredado o adquirido), en la reabsorción de los fosfatos: raquitismo familiar, el síndrome de Toni-Fanconi. En todos estos casos ocurre un aumento de la excreción del fosfato en la orina y este hallazgo permite diferenciar a estos pacientes de aquellos en los que la causa del fósforo sanguíneo disminuido es una deficiencia de vitamina D. 4) Por disminución de aporte: malabsorción intestinal, diarreas, fijación de fosfatos en el tubo digestivo por tratamiento con antiácidos, alimentación parenteral exclusiva con líquidos pobres en fosfatos, alcoholismo crónico, carencia de vitamina D. 5) Vómitos, diarreas. Hiperfosfatemia: determina hipocalcemia y tetania si es importante y aguda. Si es crónica conlleva a calcificaciones vasculares y tisulares especialmente a nivel del riñón. Se observa en: 1) 2) 3) Por aumento de ingresos: intoxicación por vitamina D, exceso consumo de En la IRC o en la IRA: por disminución del filtrado glomerular. En el hipoparatiroidismo y en la acromegalia. 46 productos lácteos, por administración continua de laxantes ricos en fosfatos. 4) 5) Pacientes con quemaduras extensas. Tumores, leucemias, linfomas. Procedimiento de Laboratorio: Muestra: Suero u Orina de 24 horas. Medir el volumen total de orina y realizar una dilución 1:50. Fundamento: La reacción de fósforo inorgánico con molibdato de amonio en presencia de ácido sulfúrico produce un complejo de fosfomolibdato no reducido que se lee a 340 nm. Procedimiento de Laboratorio: Blanco Estándar Reactivo enzimático (ml) 3 3 Suero (ul) -------Estándar (ul) --------60 Agua destilada (ul) 60 ---------Mezclar y leer la absorbancia a los 5 minutos a 340 nm. Cálculos: Concentración / de / fósforo = Intervalo de Referencia: Adultos: 4,0 –7,0 mg/dl. Niños: 0 – 1 año: 4,9 – 7.9 mg/dl. 1 a 15 años: 3,4 – 6,2 mg/dl. concentración / del / patrón xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrón Muestra 3 60 ----------------- 47 INTRODUCCIÓN El calcio es un mineral presente en el ser humano, éste existe en concentraciones mayores que cualquier otro mineral. El cuerpo de un hombre adulto de 70 Kg de peso contiene aproximadamente 1,200 g de calcio. El 90% de calcio en el organismo se encuentra en el esqueleto, donde es mantenido como depósitos de fosfato de calcio. También se encuentra en los líquidos corporales en forma no ionizada. Esta pequeña cantidad es importante para el proceso de la coagulación, el mantenimiento de la excitabilidad normal del corazón, de los músculos y nervios, y para los aspectos diferenciales de la permeabilidad de las membranas. El calcio se encuentra presente principalmente en la leche y sus derivados, mantequilla, quesos, natas. Se encuentra en menores cantidades en la yema de huevo, frijoles, lentejas, nueces, higos, coliflor. Los requerimientos diarios de calcio son los siguientes: Hombres y mujeres después de los 18 años de edad: 800 mg/día. 2do y 3er. Trimestre del embarazo: 1,2 mg/día. Lactantes y menores de 1 año: 360 – 540 mg/día. Niños de 1-18 años: 0,8 – 1,2 mg/día. El calcio proveniente de la dieta es absorbido por un proceso de transporte activo en la parte superior del intestino delgado. El proceso es regulado por el 1,25dihidroxicolecalciferol un metabolito de la vitamina D. La absorción de calcio es facilitada por la vitamina D, las proteínas y la lactosa. Mientras que la absorción se encuentra inhibida por el fitato (granos de cereales), el oxalato (las espinacas) y los fosfatos. Estados patológicos: A) Relación con las paratiroides: Hiperparatiroidismo: elevación del calcio sérico con disminución del fosfato. Hipoparatiroidismo: disminución del calcio sérico con aumento del fosfato. B) C) Osteoporosis: es la pérdida progresiva del tejido óseo y está relacionada con Raquitismo: consiste en una calcificación defectuosa de los huesos debido a un aporte inadecuado de calcio. un bajo contenido en el organismo de vitamina D, a una deficiencia de calcio y fósforo en la dieta o a una combinación de ambos factores. 48 D) E) Enfermedades renales: IRC, nefritis, nefrosis ocasionan disminución del calco Se encuentra aumentado en el mieloma múltiple y en enfermedades sérico por aumento de filtración del catión a nivel glomerular. neoplásicas de los huesos. Procedimiento de laboratorio: Muestra: 1) 2) 3) 4) entre 2-8 ºC. Interferencias: 1) 2) Sustancias que forman complejos con el calcio, dan resultados incorrectos. Hemólisis severa o lipemia puede causar resultados elevados. Suero fresco no hemolizado o plasma heparinizado. Remover el coágulo del suero tan rápido como sea posible, ya que los Muestras viejas de suero que contengan partículas visibles precipitadas no Calcio en suero es estable por 24 horas a temperatura ambiente, una semana glóbulos rojos pueden absorber calcio. deben utilizarse. Fundamento: El método utiliza O-Cresolftaleina complexona como cromógeno, el calcio reacciona con el cromógeno en un medio alcalino produciendo un color violeta. La intensidad del color es proporcional a la concentración del calcio en la muestra. Medio alcalino CALCIO + (CPC) (color violeta) complejo CPC - calcio Blanco Estándar Muestra 60 Agua destilada ( µl ) 60 Estándar ( µl ) 60 Suero ( µl ) Reactivo de color (ml) 3,0 3,0 3,0 Incubar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer en el espectrofotómetro a 570 nm. 49 Cálculos: Concentración / de / calcio = Concentración / del / patrón xLectura / de / la / muestra Lectura / del / patrón Valores esperados = 8,5 –10,4 mg/dl. Realizar los cálculos en este espacio 50 PRÁCTICA Nº 13. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE α AMILASA 1. Objetivo general: Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar los niveles séricos de amilasa con fines diagnósticos de pancreátitis aguda. 2.- Objetivos específicos: 2.1.- Definir y conocer la procedencia de la α amilasa y su función en el organismo. 2.2.- Relacionar los valores de la amilasa con diversas patologías que cursan con amilasemia. 2.3.- Distinguir entre una pancreatitis aguda y crónica. 2.4.- Conocer los interferentes y tipo de muestras utilizadas en la determinación de la amilasa sérica. 2.5.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas de rutina para la determinación de amilasa. 2.6.- Aplicar sobre la muestra adecuada la técnica correspondiente para el diagnóstico de pancreatitis aguda. 2.7.- Reportar e interpretar los resultados con fines diagnóstico de afección pancreática. 51 INTRODUCCIÓN La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en componentes más pequeños. Es producida por el páncreas exocrino y las glándulas salivales para ayudar a digerir el almidón. Se encuentra también en el hígado y en el revestimiento de las trompas de Falopio. La amilasa humana se denomina α amilasa por su capacidad para romper los enlaces polisacáridos α 1-4 al azar. El producto final de la acción de la α Amilasa sobre el polisacárido es la formación de maltosa y algunas moléculas de glucosa. La actividad de dicha enzima aumenta en el suero y en la orina de pacientes afectados de pancreatitis. Para la detección de esta condición se utiliza la determinación de la amilasa. La pancreatitis se presenta a menudo como una emergencia médica, por lo que la determinación de dicha enzima debe ser prueba "stat" o inmediata. Existen otras condiciones capaces de provocar aumento de la amilasa sérica, incluyendo paperas, parotiditis, abcesos tubáricos, derrame pleural, obstrucción intestinal, traumatismo abdominal, cirugía intrabdominal, trombosis mesentérica, peritonitis, úlceras gástricas, aneurisma de aorta, traumatismo cerebral y hemorragia esplénica. Interpretación Clínica: • Alrededor del 80% de los pacientes con pancreatitis aguda manifiestan La amilasa pancreática diferencia entre pancreatitis aguda y crónica. La mayor actividad de la amilasa se encuentra en las glándulas parótidas y el valores elevados de amilasa pancreática en las primeras 24 horas. • • páncreas, si bien hay actividad en ovarios e intestinos, los valores aumentados en ausencia de pancreatitis aguda se observan en parotiditis (isoenzima salival), en obstrucción o infarto intestinal, embarazo ectópico, enfermedad del tracto biliar de cualquier origen, en cetoacidosis diabética, quiste y pseudoquiste pancreático, peritonitis. • La macroamilasemia consiste en la presencia en suero de amilasa unida a imunoglobilina no filtrable por el glomérulo, lo cual provoca un aumento importante en suero, mientras que no existe eliminación urinaria de amilasa. • Se describen niveles elevados de amilasa en individuos alcohólicos y en algunos tumores de pulmón y ovario. Muestra: 52 - Suero. Orina de 24 horas. Orina de 2 horas. Líquido peritoneal. Líquido pleural. Interferentes de la Prueba: Se observan incrementos de la amilasa sérica en tratamientos con drogas que Se observan disminuciones en las muestras tratadas con oxalato o citrato. Las producen constricción del esfínter de ODDI y por la contaminación de la muestra con saliva. hipertrigliceridemias pueden inducir falsas disminuciones de amilasa. Procedimiento de laboratorio: En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra añadir: agua destilada. (ml) suero ( µl ) reactivo de color (ml) 3,0 Incubar por 1 minuto y leer a 405 nm. Cálculos α amilasa = lectura x 3.178 Valor Normal = 25 - 125 u/l. Blanco 75 Muestra 75 3,0 53 PRÁCTICA Nº 14. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE CREATINA QUINASA. 1. Objetivo terminal: al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar los niveles séricos de creatina quinasa como prueba de ayuda diagnóstica de afecciones cerebrales, musculares y cardíacas. 2. Objetivos específicos: 2.1.- Definir y conocer la distribución de la creatina quinasa y su función. 2.2.- Conocer las diferentes isoenzimas de la Creatina quinasa e interpretar los niveles séricos de cada una. 2.3.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación de la creatina quinasa. 2.4.- Aplicar sobre la muestra biológica respectiva la técnica adecuada para la obtención de resultados y reportar e interpretar los resultados obtenidos 54 INTRODUCCIÓN La creatina quinasa (CK) es una enzima celular, ampliamente distribuida en los tejidos del organismo, principalmente en el músculo esquelético, tejido cardíaco y cerebro. Su función está asociada con la generación de trifosfoadenosina (ATP) para sistemas contráctiles o de transporte. La CK cataliza la fosforilación reversible de la creatina; reacción en la cual el ATP actúa como dador del grupo fosfato. Creatina + ATP fosfocreatina + ADP. Existen tres isoenzimas la CK MM (músculo), la CK-MB (híbrida en el corazón y la CK-BB en el cerebro, músculo liso, tiroides, pulmones y próstata. Interpretación Clínica: los incrementos de CK-BB aparecen en determinados tipos de cáncer (próstata, vejiga, pulmón e intestino), cirugía cardíaca, traumatismos cardíacos y en enfermedades del tejido conectivo. Los aumentos de la CK-MM se producen predominantemente en la distrofia muscular, rabdomiólisis (destrucción o degeneración del tejido muscular debido a una o varias causas, en especial traumatismos), polimiositis (inflamación que produce debilidad de los músculos de los hombros, caderas y cuello, habitualmente asociada con dolor muscular y lasitud), infarto al miocardio, isquemia miocárdica, lesión cerebral, insuficiencia renal crónica, shock avanzado y atresia biliar. Los aumentos de CK-MB se presentan en enfermedades miopáticas y enfermedades inflamatorias del corazón. Tras un infarto al miocardio las CK-MM y CK-MB ingresan al sistema circulatorio como resultado de la lesión de la célula muscular cardíaca. El aumento de la concentración de estas isoenzimas se puede detectar a las 4 y seis horas después del infarto; las concentraciones máximas aparecen habitualmente a las 18 y 24 horas, y los valores normales se recuperan a las 36 y 72 horas. También se observan elevaciones de la CK-MB tras la cirugía cardíaca y en las extensiones de los infartos, la isquemia miocárdica, pericarditis, hipotiroidismo y en los corredores de maratón. Tipo de ensayo: cinético; Medir el cambio de absorbancia por 3 minutos. Longitud de onda = 340 nm. Fundamento: su procedimiento emplea un anticuerpo policlonal del monómero CKM para inhibir completamente la actividad del CK-MM y una mitad del CK-MB. Entonces la 55 actividad del monómero CK-B no es inhibida y puede ser medida. La actividad de la CK-B es medida usando la siguiente serie de reacciones: CK-B ADP + creatinafosfato HK ATP + glucosa G6PDH G-6-P + NAD Procedimiento de laboratorio: En dos (2) tubos de ensayo rotulados como blanco y muestra añadir: Agua destilada (ml) 150 Muestra ( µl ) Reactivo (ml) 3,0 Mezclar y leer al minuto, a los dos minutos y a los tres minutos Cálculos: CK total = ∆Abs/min (corregida) x VT x 1000 6,22 x LP x Vm VT = volumen total. VM = volumen de la muestra. 6,22 = coeficiente de extinción milimolar de NADH. 1000 = conversión de unidades de ml a l. LP = paso de la luz en cm (sí una celda de 1 cm es usada). Nota: El resultado debe ser multiplicarlo por 2. Valor de referencia: 0 - 22 U/l Blanco 3,0 Muestra 6-fosfogluconato + NADH + H+ ADP + glucosa - 6 – P Creatina + ATP 56 PRÁCTIVA Nº 12. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE FOSFATASA ALCALINA 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de determinar los niveles séricos de fosfatasa alcalina con el fin de diagnosticar procesos de obstructivos y óseos. 2.- Objetivos específicos: 2.1.- Definir y conocer la ubicación celular de la fosfatasa alcalina. 2.2.- Reconocer la interpretación clínica de la fosfatasa alcalina para la evaluación de procesos obstructivos. 2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación sérica de la fosfatasa alcalina. 2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la técnica respectiva, para la determinación sérica de la fosfatasa alcalina y reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos de procesos obstructivos y óseos. 57 INTRODUCCIÓN La fosfatasa alcalina es una hidrolasa con muy poca especificidad de sustrato. Se encuentra presente en casi todos los tejidos del cuerpo especialmente en el epitelio intestinal, túbulos renales, hueso, hígado y placenta. Su localización celular es la membrana. En el suero de individuos normales el origen, de la fosfatasa alcalina en el 50%, es hepático y óseo (aunque la contribución relativa de esas dos fracciones al total de actividad enzimática es marcadamente edad dependiente). Los individuos de los grupos sanguíneos B y O secretores tienen en sus sueros fosfatasa alcalina de origen intestinal. Existen 5 isoenzimas principales de esta enzima<. Hepática, ósea, intestinal, renal y placentaria. Se diferencian entre ellas por su estructura molecular y por sus propiedades físico-químicas, antigénicas y catalíticas. Aparte de esas formas moleculares, la fosfatasa alcalina puede presentar algunas formas atípicas: fracción biliar (también asociada como fracción hepática rápida o α hepática); formas de origen neoplásicos (isoformas Regan, Nagao y Kasahara) y formas de migración lenta (complejos moleculares de gran tamaño constituidos por la enzima y una molécula de IgG). La fracción biliar parece ser que es un complejo de la enzima con restos moleculares procedentes de la ruptura de las membranas de los hepatocitos o de las células del tracto biliar. Las fracciones de origen canceroso tienen algunas propiedades físicoquímicas muy semejantes a las de la función placentaria. Interpretación clínica: Como otras enzimas, la fosfatasa alcalina tiene muy poca especificidad y puede encontrarse elevada en múltiples situaciones. Sin embargo, tiene dos aplicaciones clínicas muy útiles: • • osteoblástica. En la enfermedad obstructiva hepática se produce una elevación sérica importante sobre todo, si la obstrucción es extrahepática. En la enfermedad parenquimatosa hepática la elevación es en general muy discreta. En la enfermedad obstructiva hepática. En la enfermedad metabólica ósea, asociada al incremento de la actividad 58 En las enfermedades metabólicas óseas, constituye prácticamente la única enzima que tiene utilidad diagnóstica. Se encuentra principalmente elevada en la enfermedad de Paget, en el raquitismo, osteomalacia (elevación muy discreta) y en el hiperparatiroidismo con implicación ósea. En las metástasis óseas sólo se produce elevación de la fosfatasa alcalina en aquellas metástasis que dan lugar a lesiones osteoescleróticas con formación ósea de novo y gran actividad osteoblástica. En las metástasis osteolíticas la fosfatasa alcalina permanece sin cambio. Procedimiento de laboratorio: Método: p-nitrofenilfosfato. Muestra: suero libre de hemólisis. Longitud de onda: 405 nm. Temperatura: 25 ºC, 30 ºC y 37 ºC. Blanco 3 Muestra 3 75 Agua destilada (ml) Reactivo (ml) Suero ( µl ) Mezclar bien e incubar por 1 minuto, leer a 405 nm. Llevar a cero el instrumento con agua destilada y anotar las absorbancias a intervalos de 1 minuto durante los próximos 3 minutos Cálculos: Fosfatasa alcalina en la muestra: ∆ A/min x 2187. 30 ºC 27-95 U/l 37ºC 35-123 U/l Valores esperados: 25 ºC 22-79 U/l 59 PRÁCTICA Nº 11. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES SÉRICOS DE TRANSAMINASAS (Alanina y Aspartato amino transferasa) 1.- Objetivo terminal: Al finalizar la práctica el alumno estará en capacidad de determinar los niveles séricos de las transaminasas con el fin de diagnosticar y evaluar pronósticos en alteraciones ubicadas en el hígado o en el corazón. 2.- Objetivos específicos: 2.1.- Definir y conocer la ubicación celular de las transaminasas. 2.2.- Reconocer la interpretación clínica de las transaminasas para la evaluación de afección hepática y cardíaca. 2.3.- Conocer los interferentes de las pruebas. 2.4.- Conocer y fundamentar las pruebas bioquímicas para la determinación sérica de las transamimasas. 2.5.- Aplicar sobre la muestra en estudio la técnica respectiva, para la determinación sérica de transaminasas. 2.6.- Reportar e interpretar los resultados obtenidos con fines diagnósticos de infartos al miocardio y afecciones hepáticas 60 INTRODUCCIÓN. Las transaminasas catalizan la transferencia de un grupo α amino desde un α aminoácido hacia un α cetoácido. Estas enzimas son la alanina aminotransferasa (ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST). Alanina Aminotransferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico Pirúvica (TGP). Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al ácido α cetoglutámico. ALT Alanina + ácido α cetoglutarato ácido pirúvico + ácido glutámico La alanina aminotransferasa se encuentra presente en los tejidos y su aparición en el suero es un índice de lesión tisular similar a la aparición de la aspartato aminotransferasa. Sin embargo, los valores séricos de ALT son más pronunciados en las lesiones hepáticas que en las lesiones miocárdicas siendo ésta enzima un indicador específico de daño hepático. Interpretación clínica: La máxima actividad de la ALT se manifiesta en el hígado, músculo esquelético, riñón y corazón. Elevación importante de la ALT se observa en necrosis del hepatocito, en traumatismo extenso del músculo esquelético, golpe de calor, miocarditis, cirrosis, ictericia obstructiva, infarto agudo del miocardio y en enfermedades hemolíticas. Otros casos: se han descrito niveles elevados de ALT en obesos, en niños con leucemias linfocíticas agudas y en el síndrome de Reye. Interferencias: La hemólisis interfiere aumentando los niveles de ALT. Se han descrito incrementos debido a drogas hepatotóxicas, así como a inyecciones musculares. Aspartato Aminotransferasa (AST) o Transaminasa Glutámico Oxalacética (TGO). Esta enzima cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al ácido cetoglutámico. Aspartato + ácido α cetoglutarato ácido oxalacético + ácido glutámico. Todos los tejidos contienen aspartato aminotransferasa, particularmente el corazón, el hígado y el músculo esquelético. Existen dos (2) isoenzimas una mitocondrial (mAST) y una citosólica (cAST). Estas dos isoenzimas difieren notablemente en cuanto a su estructura y a 61 α sus propiedades químicas y físicas. Sin embargo, ambas catalizan la misma reacción y solamente existen pequeñas diferencias en los pasos catalíticos. Interpretación clínica: Incremento de la AST se observan en hepatitis fulminantes, hepatitis virales, necrosis o daño del hepatocito por cualquier causa, ictericia colestásica, hepatitis crónica, tóxica o alcohólica. En esta última predomina la AST sobre la ALT. Mientras que en la hepatitis vírica la ALT predomina sobre la AST. En el síndrome de Reye aumenta la AST fundamentalmente. Otros casos: Niveles elevados se observan también en enfermedades de origen muscular, cardíaco, predominando en infarto agudo al miocardio la elevación de la AST sobre la ALT. En la cirrosis hepática puede estar normal o discretamente aumentada. Se han descrito valores disminuidos de la AST en pacientes urémicos y en tratamiento con metromidazol, así como en el déficit de vitamina B6 (piridoxal). Interferencias: La hemólisis interfiere aumentando la concentración de AST. Igualmente la isoniazida, fenotiazinas, eritromicina, esteroides anabólicos, opiáceos y salicilatos provocan aumentos de AST en suero. Fundamento de la AST (TGO): La aspartato aminotrnasferasa cataliza la transferencia del grupo amino del L-aspartato a α - ketoglutarato dando oxalacetato y Lglutamato. El oxalacetato se reduce a malato en una reacción catalizada por malato deshidrogenasa (MDH). En esta misma reacción un equivalente de NADH se oxida a NAD. La disminución en absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la AST. La lactato deshidrogenasa (LDH) se adiciona para reducir rápidamente cualquier piruvato presente en el suero de modo que no interfiera con el ensayo. AST L-aspartato + α-Ketoglutarato MDH Oxalacetato + NADH + H Procedimiento: Agua destilada (ml) Blanco 3 Muestra + Oxalacetato + L-glutamato. L- Malato + NAD+ + H2O 62 Reactivo (ml) 3 300 Suero ( µl ) Leer la disminución de la absorbancia cada minuto por 3 minutos, determinar el ∆ Abs/min y multiplicar por el factor 1768 para obtener los resultados UI/l. Cálculos: AST en la muestra = ∆ Abs/min x VT x 1000 6,22 x Vm x Pl donde, VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 es la constante, 1000 la conversión de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso de la luz en cm (1). Valores de referencia: 25 ºC. hasta 22 UI/l Fundamento de la GPT 30 ºC hasta 28 UI/l 37 ºC hasta 40 UI/l. (ALT): La ALT cataliza la transferencia de los aminogrupos de L- alanina a α ketoglutarato resultando en la formación de piruvato y Lglutamato. La lactato deshidrogenasa cataliza la reducción de piruvato y la oxidación simultánea de NADH a NAD. La disminución de absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la ALT. ALT L-alanina + α ketoglutarato Piruvato + NADH + H+ Procedimiento: Agua destilada (ml) Reactivo (ml) Blanco 3 Muestra 3 63 piruvato + L- glutamato. LDH L- Lactato + NAD+ + H20 300 Suero ( µl ) Leer la disminución de la absorbancia cada minuto por 3 minutos y determinar el ∆ Abs/min. Cálculos: ALT (GPT) = ∆ Abs/min x VT x 1000 6,22 x Vm x Pl donde VT es el volumen total del ensayo (3,3 ml), 6,22 una constante, 1000 el factor de conversión de unidades de ml a l, VM el volumen de la muestra en ml (0,3) y Pl el paso de la luz en cm (1). Valores de referencia: 25 ºC hasta 20 UI/l 30 ºC hasta 26 UI/l 37 ºC 38 UI/l 64
Report "Manual de Laboratorio de Bioquímica Clínica."