UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍAELABORO: M. EN D. JESÚS ALARCÓN BONILLA Q.B.P. BEATRIZ ORTEGA ESCAMILLA I.B.Q. MÓNICA ARACELI CAMACHO GONZÁLEZ ÍNDICE PRACTICA No. 1 HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN PRACTICA No. 2 CINÉTICA ENZIMÁTICA PRACTICA No. 3 DETERMINACIÓN DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICIÓN PRACTICA No. 4 PRODUCCIÓN DE AMILASAS Y CELULASAS MICROBIANAS PRACTICA No. 5 OBTENCIÓN DE AMILASAS VEGETALES PRACTICA No. 6 OBTENCIÓN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A PARTIR DE TEJIDO ANIMAL PRACTICA NO. 7 INMOVILIZACIÓN DE UNA PROTEASA VEGETAL EN RESINAS DE INTERCAMBIO IONICO Y DE ADSORCIÓN 2 4 8 13 15 17 20 ENE - ABR 2013 PRÁCTICA No. 1 HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN INTRODUCCIÓN OBJETIVO (S) • • • Recordar los conceptos de hidrólisis Identificar la estructura del almidón Reconocer por reacciones de identificación, los compuestos resultantes de la hidrólisis ácida y enzimática del almidón. MARCO TEÓRICO. Fundamento de reacciones MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 10 ml con agua destilada Solución de almidón al 2% HCl concentrado Lugol Solución de glucosa al 2% Solución de maltosa al 2% Reactivo de Benedict o Reactivo de Fehling Vaso de precipitados de 50 ml Vidrios de reloj Parrilla eléctrica (o mechero/tripie/malla de asbesto) Baño maría a 37°C Agitador de vidrio Pipetas Pasteur Pipetas de vidrio de 1 ml Pipetas de vidrio de 5 ml Pipeta de vidrio de 10 ml Termómetro 50 ml 1 frasco 1 frasco 50 ml 50 ml 1 frasco 1 pza 3 pza 1 pza 1 pza 1 pza 6 pza 6 pza 2 pza 2 pza 1 pza METODOLOGÍA Hidrólisis Ácida 1. Agregar 20 ml de almidón al 2% en un vaso de precipitados. 2. Agregar 1 ml de HCl concentrado. 3. Agitar con una varilla de vidrio y llevar a un baño de Maria hirviendo, el vaso de precipitados debe permanecer en el baño durante cada determinación. 2 Continuar haciendo la reacción con Lugol cada 5 minutos hasta los 30 minutos.5 ml de las siguientes soluciones: Sol. realizar la reacción de Benedict. incluidos los hidrolizados ácido y enzimático (15´y 30´). 3.5 ml 10. En un tubo de ensayo 16x100 medir 4 ml de almidón al 2% Colocar dicho tubo en un baño maría a 37ºC por 5 minutos.5 ml del hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (15´). Almidón al 2 % ----------------------. 1 ml de la solución de Fehling A y 1 ml de la solución de Fehling B. Hacer la reacción hasta que ya no haya cambio de coloración (la reacción da el mismo color del lugol). ¿Cuántos tipos de cofactores existen? 4. 5. retirar los tubos y observar. 5. Tomar 0. retirar el tubo del baño maría y tomar 0. En base a la utilización o no de un cofactor en la forma activa de la enzima. Registrar en el siguiente cuadro el resultado de la reacción de hidrólisis Reactivo Almidón al 2% Glucosa al 2% Maltosa al 2% Hidrolizado ácido Hidrolizado enzimático (15´) Hidrolizado enzimático (30´) Reacción de Benedict (+/–) Grado de hidrólisis CUESTIONARIO 1. A los 15 minutos sin sacar el tubo de ensayo del baño maría tomar 0. Colocar todos los tubos al mismo tiempo en un baño maría de agua hirviendo por 5 minutos. Cada 5 minutos hacer una reacción con lugol en una placa de porcelana (vidrio de reloj en fondo blanco). 7. En caso de realizar la reacción de Fehling adicionar a cada tubo respectivamente. Describir los tipos de especificidad que presentan las enzimas 2.5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye rotulado como (“ácida”) Hidrólisis Enzimática 1. 8. 11. su nombre sistemático y su número de clasificación internacional (cuatro digitos) CONCLUSIONES Y REFERENCIAS 3 . Completados los 30 minutos. Agitar la mezcla por golpeteo y anotar el tiempo de inicio de la hidrólisis Cada 5 minutos hacer la reacción con lugol hasta completar 15 minutos. 2. 9.5 ml Glucosa al 2% -----------------------------.0. Previamente preparar tubos de ensaye con 0.0.5 ml Maltosa al 2% ------------------------------.0. 6. 6. Para conocer el grado de hidrólisis. ¿Cómo se clasifican las enzimas? 3. 7. 2. RESULTADOS Y ANÁLISIS 1.4.5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (30´). adicionando a cada tubo. Anotar el tiempo de la hidrólisis.5 ml del Reactivo de Benedict. 4. ¿Cuál es la función de las coenzimas? 5. ¿Cuál es la enzima empleada en la práctica? Escriba su nombre común. Agregar 2 ml de la solución de la enzima. Anotar el tiempo de inicio de la hidrólisis. 2 CINÉTICA ENZIMÁTICA INTRODUCCION. placa de porcelana con excavaduras.1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml de disolución de almidón al 0.5 %. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima al último tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento. 6.0. 20 ml 20 ml 100 ml 20 ml 12 pza 1 pza 3 pza 2 pza 1 pza 5 pza 2 pza 1pza Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.5 %.3 y 0. OBJETIVO (S) • • Evaluar el efecto del pH y la temperatura sobre la transformación de un sustrato en una reacción mediada por una enzima. Añada a cada tubo 0.2. REACTIVOS Y EQUIPOS. Añada primero el agua y luego la disolución del enzima. (vidrio de reloj fondo blanco) vasos de precipitados de 50 ml Baño maría a 40 y 50 ºC o baños termostatado. Disolución de almidón al 0.8 y 8. 0. pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. 4 . y complete hasta un volumen de 0. Goteros Pipetas de 2 ml Termómetro METODOLOGÍA Estudio de la influencia de la [E].PRÁCTICA No. Evaluar el efecto del a concentración de la enzima y de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción mediada por una enzima. 2. Tubos de ensayo.5 ml con agua. 0. MARCO TEÓRICO MATERIALES. Solución de Lugol Disoluciones tampón de pH 5.4 ml de disolución del enzima respectivamente. 1. Cronómetro.0. 0. TUBO Volumen de sustrato (ml) Tiempo total de reacción (min) Velocidad de reacción (volumen/min) 1 2 3 4 5 . Adicione a cada tubo 0. Incube a 40ºC y ensaye la reacción con el Lugol según se indica en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E]. 1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de las soluciones tampones de pH 5. Estudio de la influencia del pH. enjuague el mismo en agua destilada contenida en un vaso de precipitados. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidón mediante la reacción con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E]. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: 5. 5. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad óptima.0 ml con agua destilada.0. la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol.3. Complete el volumen de cada tubo hasta 2. Estudio de la influencia de [S]. 2.5 ml de disolución del enzima Alfa amilasa e incúbelos a 40 ºC. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción (volumen / tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento).5 y 2. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol.5% y 2 ml de la solución del enzima. 1. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. Con estos datos construya un gráfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad de reacción (1/t) en el eje de abscisas. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: TUBO 1 2 3 4 Volumen de la enzima (ml) Tiempo total de reacción (min) Velocidad de reacción (1/min) 6. 6.8 y 8. 3. 1. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control. 4. 1.0. Añada a cada tubo 2 ml de la solución del almidón al 0. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 0. 4. 2. 3.0 ml de solución de almidón.5. En cada toma de muestra con el gotero. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol. 5. 9. 2.5% y 1 ml de solución de enzima. Un cuarto tubo incúbelo en un baño de hielo y ensaye también la reacción con Lugol. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de reacción del enzima alfa-Amilasa. y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón. 4. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloración azul. Ponga a hervir uno de los tubos durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por evaporación. Analice el gráfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso. 2. 6. Anexe la tabla y el gráfico elaborados según las indicaciones del trabajo práctico. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. ¿Por qué no se debe emplear el término de temperatura óptima? CUESTIONARIO: 6 . Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados de éste experimento. Incúbelo a 40 ºC y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidón en él a diferentes intervalos de tiempo. Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de reacción contra [E]. ¿A qué conclusión llega acerca del pH óptimo de este enzima? 5. En 5 tubos de ensayo añada 5 ml de disolución de almidón al 0. tomando como concentración del enzima el volumen de la solución utilizado en cada tubo. 1. Incube un segundo tubo a 40 ºC y un tercero a 50 ºC. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento del efecto de la temperatura según las indicaciones del trabajo práctico.Estudio de la influencia de la temperatura. 8. El último tubo déjelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparición de la reacción positiva en intervalos de 1 minuto. tomando como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla. y ensaye en ellos la reacción con Lugol a intervalos de 1 minuto. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo. y extraiga sus conclusiones: Color observado a diferentes tiempos (min) TUBOS 1 2 3 4 5 5 10 15 20 25 30 RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS 1. Explique qué le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 ºC 10. 3. 4. ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo? 7. ¿Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la realización de este ensayo? 6. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de reacción el inverso del tiempo? 3. 4. CONCLUSIONES REFERENCIAS PRÁCTICA No. en la concentración del sustrato. 3 DETERMINACION DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICION 7 . ¿Cuáles son las características estructurales del almidón? ¿Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival? ¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón? Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración del enzima presente. 3.1. 2. el pH y la temperatura. 5 50.8 30.5 60. MARCO TEÓRICO. Interpretar los datos obtenidos y determinar lo que se pide. OBJETIVO: El alumno realizará los cálculos necesarios para la determinación del tipo de inhibición. MATERIALES Y EQUIPO. Tipo de enzima que cataliza la reacción y vía biosintética que incluye a cada reacción. determina el valor de Vmáx y la Km por cada método y compara los resultados. TIEMPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 VELOCIDAD (μmoles/min) 18.5 [SUSTRATO] (mM) 3 11 18 19 21 35 41 45 68 78 Ejercicio 2: La sintetasa de citrato mitocondrial del cerebro de rata es inhibida por el fenil-piruvato. Computadora (Excel) Listas de datos de velocidades y concentraciones de sustratos. Introducir los datos y las fórmulas necesarias para llevar a cabo los cálculos correspondientes. 4.8 23.5 35.6 29. METODOLOGÍA 1. Ecuación química de la reacción catalizada de cada ejemplo. La actividad de la enzima se midió a tres concentraciones diferentes de acetil-CoA en presencia de cinco concetraciones diferentes de fenil-piruvato.INTRODUCCIÓN.5 55.5 45. 3. Obtener las gráficas necesarias. DATOS Ejercicio 1: Utilizando los siguientes datos y haciendo uso del modelo de Lineweaver-Burk y el modelo de Eadie-Hofstee. Las velocidades iniciales de la reacción se 8 . Vmax y Km de diferentes series de datos. Entrar al programa Excel en la PC 2.5 40. en base a la cinética enzimática obtenida. Un ensayo en una muestra de sangre de un paciente que legó al hospital inconsciente dio los resultados que se indican a continuación: VELOCIDAD INICIAL SUSTRATO (M) 5.00 Determine: a) Km de la enzima el miocardio b) Km de la enzima del paciente c) ¿Se trata de un infarto al miocardio o de una distrofia muscular? ENZIMA DEL PACIENTE (μmoles/ml suero·min) 43 57 75 100 120 150 Ejercicio 4: Los eritrocitos embrionarios contienen una enzima que cataliza la reacción S → P Los eritrocitos adultos también poseen la actividad de dicha enzima para catalizar la reacción S → P.66 280.30 250.20 9.54 3.10 6.00 270.97 247.00 0.00 x 10–4 1.00 x 10–4 ENZIMA DEL MIOCARDIO (μmoles/mg·min) 2.00 233.37 101.00 6. es secretada al torrente sanguíneo y se puede diferenciar fácilmente por tener un distinto valor de Km.77 1.33 200.67 8.00 x 10–4 3. En el caso de una distrofia muscular una isoenzima que cataliza la misma reacción. (Km de la isoenzima de músculo esquelético = 2X10 –5 M). un enzima es secretado al torrente sanguíneo.86 3.50 x 10–4 2.00 x 10–5 7.78 5.03 142.30 12.00 181.00 157.00 10.4 μM 247.04 210.00 x 10–5 1.00 289. Algunos datos cinéticos se muestran en la tabla siguiente: 9 .06 a) Parámetros cinéticos sin inhibidor b) Tipo de inhibición c) El valor de Ki Ejercicio 3: Cuando se produce un infarto al miocardio.20 Determine: 300.expresan en nmoles de acetil-CoA incorporados/min·mg de proteína mitocondrial y aparecen expuestos en la siguiente tabla: Acetil-CoA 6.2 μM Fenil piruvato (mM) 0.3 μM VELOCIDAD (nmoles/min·mg) 276. 33 4.00 14.52 18.54 6.14 62.00 11.92 80.78 11.05 5.33 +A (5 µ m) 6.29 16.00 x 10–4 1.98 33.00 x 10–5 7.00 13.00 x 10–4 VELOCIDAD INICIAL (Μmoles/mg·min) Eritrocito adulto Eritrocito embrionario 1.00 7.81 13. Para determinar el efecto del NH3 sobre la reacción se realizaron dos series de experiencias: a) En una primera serie de experimentos se fijó la concentración de O 2 (0.00 CONTROL 16.67 71.00 45.40 8.00 2.40 76.00 83.78 54.00 Determine: a) Parámetros cinéticos de la enzima en el eritrocito adulto b) Parámetros cinéticos de la enzima en el eritrocito embrionario c) ¿Qué conclusiones puede obtener referente a la identidad de los dos enzimas? Ejercicio 5: Se obtuvieron los datos experimentales de la velocidad de una reacción enzimática en ausencia y en presencia de varios inhibidores (A.00 5.77 +C (2 mM) 10.67 20.50 x 10–5 3.15 15.33 6.89 10.77 44.00 16. B.67 27.98 8.00 2.25 7.64 26.33 11. C y D).86 10.00 2.87 19.00 1. cuyos resultados se muestran en la siguiente tabla: [SUSTRATO] (mM) 0.00 24.25 0.67 5.44 48.1 mM) 8.23 +D (0.67 18.00 x 10–5 1.11 16.00 19.05 30.67 22.50 1.67 15.50 +B (20 µ m) 5.14 60.50 14.50 3.33 x 10–5 5. el NH3.29 25.23 mM) y se trabajó variando la concentración de benzilamina en presencia de 10 .11 12.18 18.45 52.67 x 10–4 2.67 8.[S] (M) 1.78 19.00 40.68 x 10–5 2.66 1.00 3.00 57.33 50.00 66.20 0.69 10.63 57.60 Determine: a) La naturaleza de cada inhibidor (tipo de inhibición) b) El valor de Ki para cada inhibidor Ejercicio 6: La mono-amino-oxidasa mitocondrial de hígado de rata es inhibida por uno de los productos de la reacción.22 23.33 0.81 25.56 6.50 x 10–4 1. 741 0.952 1. ¿Cuáles son los parámetros cinéticos que caracterizan el estudio de la cinética de una enzima? 3.926 150. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla.250 0.130 1.813 0.351 100.5 1.2 0.794 0.3 0. Inhibidor NO competitivo c. Inhibidor competitivo b.093 1. los parámetros cinéticos se ven alterados en presencia de: a. en la que las velocidades iniciales de la reacción siguen expresándose en unidades arbitrarias: VELOCIDAD INICIAL OXÍGENO (mM) 0. Explique cómo durante el estudio de una cinética enzimática.0 0.026 1.124 1.100 0.480 1.015 RESULTADOS Y DISCUSIÓN CUESTIONARIO 1.787 200.0 2.962 1.858 0.627 0.000 1.0 0.220 1.0 0.081 NH3 (mM) 100.627 0.543 0. Inhibidor Acompetitivo 11 .0 0.175 0.858 1.0 0.387 0.725 0.531 0.0 0.300 1.0 0.136 0. ¿Qué tipo de tratamiento matemático debe dársele a los datos obtenidos de una cinética enzimática para obtener los parámetros cinéticos? 4. donde las velocidades iniciales de la reacción se expresan en unidades arbitrarias: VELOCIDAD INICIAL BENZILAMINA (mM) 0.876 Determine: a) El valor de los parámetros cinéticos en ambos casos.687 b) En una segunda serie de experiencias.212 150.538 1.909 1.274 1.149 1.866 0.676 0.342 50. incluida la Ki del NH3.149 1.637 0.957 1. Indique la importancia del estudio de la cinética enzimática.444 0. b) Tipo de inhibición ejercida por el NH3 sobre ambos sustratos 50.844 0.342 1.528 0. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla.0 mM) y se varió la concentración de O2 en presencia de concentraciones fijas del inhibidor.778 0. 2.concentraciones fijas del inhibidor.966 1.743 0.0 0.754 1.0 0. se mantuvo constante la concentración de benzilamina (1.627 0.282 1.587 NH3 (mM) 75.0 0.0 0.462 0. 5. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA PRÁCTICA No. 4 PRODUCCIÓN DE AMILASAS Y CELULASAS POR MICROORGANISMOS DEL SUELO INTRODUCCIÓN. Mencione 5 sustancias (fármacos) que actúen como: inhibidores competitivos. ¿Cuál es el significado del número de recambio (“turnover number”)? ¿Cómo se mide la eficiencia catalítica? 6. no competitivos y acompetitivos. 12 . Incubar la placa a 28 ºC durante 48 a 72 hr. Contar el número de colonias que presenten una zona de hidrólisis a su alrededor. A. Incubar la placa a 28 ºC durante 48 a 72 hr. 2. REACTIVOS Y EQUIPOS. Preparación de la suspensión: 1. 3. Tomar la suspensión con un hisópo estéril y sembrar por estría masiva en la placa con agar celulosa rojo congo. Homogenizar la suspensión y dejar sedimentar B. Tomar la suspensión con un hisópo estéril y sembrar por estría masiva en la placa con agar almidón 2. Pesar 10 g de muestra y realizar una dilución en 90 mL de solución salina estéril 2. C. Inundar con lugol las cajas y contar el número de colonias que presenten una zona clara de hidrólisis a su alrededor .OBJETIVO (S) • Analizar la actividad de enzimas producidas por los microorganismos del suelo MARCO TEÓRICO MATERIALES. 3. Aislamiento de microorganismos amilolíticos 1. balanza Incubadora a 28 ºC Solución de lugol Pipeta pasteur METODOLOGÍA. Aislamiento de microorganismos celulolíticos 1. EQUIPO 1 2 3 4 5 6 AMILOLÍTICOS CELULOLÍTICOS 13 . RESULTADOS Y ANÁLISIS Reporte en la siguiente tabla la presencia (+) o ausencia(-) de los grupos de microorganismos que se detallan. 1 pza 1 pza 1 pza 1 frasco 1 pza 1 pza 1 pza 10 gr 1 1 1 frasco 1 pza Placa con agar celolosa rojo congo Placa con agar almidón Hisopo estéril o asa bacteriológica Solución de benzal 100 ml esponja Mechero o 2 lámparas de alcohol Frasco con 90 mL de solución salina estéril Muestra de de suelo. 2.7 8 Registrar la morfología colonial de los microorganismos observados. Escriba las reacciones enzimáticas realizadas por cada uno de los grupos microbianos aislados. CUESTIONARIO 1. CONCLUSIONES REFERENCIAS. discuta sus resultados. 14 . Explique las aplicaciones industriales o ambientales de las amilasas y las celulasas 6. indicando sustratos. Explique la forma de identificar las colonias productoras de amilasas por tinción con lugol. Mencione tres microorganismos productores de amilasa y 3 productores de celulasas 5. Indique los sitios de corte de las alfa amilasas. beta amilasas.C. enzimas y productos. Investigue la clasificación de las enzimas de acuerdo con la E. amiloglucosidasas y pululanasas 7. 4.. Comparar el número de organismos amilolíticos y celulolíticos obtenidos por cada equipo. ¿A que grupo de enzimas pertenecen las estudiadas en esta práctica? 3. Termostato. 2.PRÁCTICA No. MARCO TEÓRICO MATERIALES.20 minutos de 30 . Añada 5 gotas de glicerina para extraer lo más posible los enzimas. Solución de Lugol Solución de reactivo de Fehling o Tollens o Benedict Glicerina pura Solución de almidón al 5% Mechero. Deje reposar de 15 . REACTIVOS Y EQUIPO 10 gr 1 pza 2 pza 1 pza 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 pza 5 pza 1 pza 1 pza 2 pza 5 pza 1 pza 1 pza 1 pza Semillas de gramíneas en germinación Mortero con pistilo Vaso de precipitados. Goteros Embudo / Papel filtro Termómetro Pipetas de 2 y 5 ml Tubos de ensaye Placa de porcelana con excavaduras Baño maría a 45 ºC Gradilla METODOLOGÍA 1. 15 . Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de gramíneas germinadas teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 ºC).45 ºC y filtre el extracto. 5 OBTENCIÓN DE AMILASAS DE SEMILLAS DE GRAMÍNEAS INTRODUCCION OBJETIVO (S) • Aplicar los diferentes métodos de extracción para la obtención de una enzima a partir de una fuente vegetal. comprobar la degradación del almidón por las amilasas ensayando una muestra del sistema de reacción en una placa con excavaduras con el reactivo de Lugol.3. 1.2 ml del extracto. A intervalos de 5 minutos. introduzca 5 ml de disolución de almidón y de 1 . RESULTADOS Y ANÁLISIS 1. Para reconocer la presencia de azúcares reductores (maltosa y glucosa). Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema Internacional. Represente a través de una ecuación la acción hidrolítica de las amilasas del almidón (amilosa). Nota : Utilice las estructuras químicas. CONCLUSIONES REFERENCIAS 16 .2 ml del sistema de reacción. 2. ¿Qué objetivo persigue realizar al final del experimento la reacción con el reactivo de Fehling? Represente la ecuación. ¿Qué objetivo persigue realizar la reacción con el reactivo de Lugol cada cierto intervalo de tiempo? 3. En un tubo de ensayo. Tollens o Benedict de una muestra de 1 . realizar la reacción con los reactivos de Fehling. 01% Solución de Lactato de sodio al 1% Solución deAzul de metileno 0. MARCO TEÓRICO MATERIALES. 6 OBTENCIÓN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A PARTIR DE TEJIDOS ANIMALES INTRODUCCIÓN OBJETIVO (S) • Obtener una enzima oxidorreductasa a partir de fuentes animales y observar su actividad.06M Cloroformo Nujol Arena lavada Tubos de ensaye de 18 x 150 mm Pipetas de 2.9 % Solución de Cianuro de potasio al 0.002M Solución de Fosfato dibásico de sodio 0.5% y al 0. 5 y 10 ml Bureta de 25 ml Vasos de precipitados Mortero con pistilo Matraz erlenmeyer de 125 ml Baño maría a 37 ºC termostatado Centrífuga Cronometro Termómetro Gradilla Tijeras METODOLOGIA Preparación del sistema Deshidrogenasa Láctica–NAD + a) Preparación de la coenzima NAD+ 17 . REACTIVOS Y EQUIPOS 1 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 5g 5 pza 2 pza 1 pza 3 pza 2 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza Rata de laboratorio o conejo pequeño Solución de Cloruro de sodio al 0.PRÁCTICA No. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.0 4 1. Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1. 4. Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlos en agua a ebullición por 5 min en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (en proporción de 6 ml de agua por gramo de músculo) 3.0 1.0 ml de Nujol.0 0. Mencione otros tipos de oxidorreductasas importantes. 2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 min.0 1.0 0.3 1.0 1. Centrifugar a 3000 rpm por 15 min. NO agitar el contenido del tubo. 5.0 0.0 0.002M (ml) Agua (ml) Sobrenadante “Coenzima” (ml) Sobrenadante “LDH” (ml) Lectura inicial Lectura 15 min. no se debe de utilizar pipeta. Tubo No.0 1.0 1. Interprete el objetivo de cada tubo y el global del esquema 3.0 2 1. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como “Deshidrogenasa Láctica. Lectura 30 min. Incubar en baño maría a 37°C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro los grados de “decoloración” con signos “+” y con “0” la falta de la misma. Matar una rata con éter. 1 1.3 1. ya que es una sustancia altamente peligrosa. Escriba los resultados de decoloración en la tabla anterior. 2. b) Preparación de la enzima LDH 1. ¿Qué aplicación industrial podría dársele a las oxidorreductasas? 6.0 2. 2. Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos. 1. RESULTADOS Y ANÁLISIS 1.9% (en proporción de 8 ml/g de músculo).0 1. abrirla y obtener 4g de fragmentos de músculo de las patas traseras. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena (± 1 g) y triturar bien el músculo.0 1. c) Determinación de actividad enzimática. manipular dicha sustancia con bureta y lavarse PERFECTAMENTE las manos.0 1.0 0. el precipitado se desecha en el bote de la basura.0 0.3 1.0 1. El precipitado se desecha.3 0. preparar las 3 series siguientes en tubos de ensaye etiquetados como se indica a continuación. 3. NOTA: Trabajar las soluciones de CIANURO DE POTASIO con MUCHA PRECAUCION.0 0. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como “Coenzima NAD+. KCN al 0. ¿Por qué es importante las condiciones de reacción del experimento? 18 .5 % (ml) Lactato al 1% (ml) Azul de metileno 0. Colocar 4 g de músculo de las patas traseras en un mortero previamente sumergido en hielo y adicionar cloruro de sodio al 0.1.0 3 1. agregar un poco de arena (± 1 g) y triturar perfectamente. 4. NOTA: después de haber agregado el Nujol. LDH”. Diga cuales son las funciones de cada ingrediente adicionado. Lectura 60 min. ¿Por qué se debe de manejar con PRECAUCION el cianuro de potasio? 7. CONCLUSIONES REFERENCIAS 19 . 7 INMOVILIZACIÓN DE UNA PROTEASA EN RESINAS DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE ADSORCIÓN INTRODUCCIÓN OBJETIVO • Evaluar la efectividad del intercambio iónico como método de inmovilización de enzimas. Varilla de vidrio 1 frasco 1 pza 1 frasco 1 frasco 1 frasco 10 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza METODOLOGÍA a) Preparación de la columna de intercambio iónico 1. 2. Pipetas de 1 y 5 ml.1 N Solución reguladora de acetatos Agua destilada Solución de ovo albúmina al 2% (a partir de huevo) Tubos de ensaye 15 x 150 mm Gradilla Espectrofotómetro Baño maría. MARCO TEÓRICO MATERIALES. 4.1N Enjuagar el exceso de ácido con agua destilada hasta obtener un pH de 4 – 5 20 . REACTIVOS Y EQUIPO Resina catiónica Amberlite Papaína (ablandador de carne) o Mexicaína (extracto) Columna de empaquetamiento o Bureta Fibra de vidrio (pelo de ángel) Solución ácido clorhídrico 0. la solución regenerante de HCl 0. 3. Lavar con agua destilada la resina de intercambio catiónico Colocar en el fondo de la columna una malla de fibra de vidrio Empaquetar la resina utilizando como acarreador agua destilada Adicionar lentamente (10 min aproximadamente). 5.PRÁCTICA No. Explique cual es la función de la solución de ácido clorhídrico 0. ¿Qué tipo de aminoácidos absorben a esa longitud de onda? 5.b) Preparación de la proteasa 1. Ir colectando los eluídos en tubos de ensaye 3. Explique por que es importante verter siempre con lentitud 7.) 2. ¿Por qué se lee a dicha longitud de onda? 4. 1. Hacer una solución al 0. Adicionar la solución de ovo albúmina al 2% lentamente (aproximadamente 10 min. c) Hidrólisis de la albúmina. Graficar tubo eluído contra Absorbancia a 280 nm 3. Vaciar la solución de la enzima lentamente (aproximadamente 10 min) 3. Explique el mecanismo de reacción llevado a cabo por la enzima REFERENCIAS 21 .1N 6. 2.01% de mexicaína o papaina (ablandador de carne) en solución reguladora de acetatos. Leer la absorbancia de los eluídos en el espectrofotómetro a 280 nm. Enjuagar con solución reguladora de acetatos. Graficar tubo eluído contra Absorbancia a 280 nm CUESTIONARIO 2. RESULTADOS Y ANÁLISIS 1.