Manual debiotecnología Coordinadoras: Claudia Segal Kischinevzky y Beatriz Rodarte Murguía Departamento de Biología Celular Facultad de Ciencias, UNAM Autores en orden alfabético: Luisa Alba Lois, Roberto Coria Ortega, Édgar Dantán González, María Isabel de la Cruz Laina, Juan Luis Chávez Pacheco, María Eugenia Muñiz Díaz de León, Ángela Victoria Forero Forero, Angélica González Oliver, Alejandra Abigaíl González Valdez, Laura Kawasaki Watanabe, Suri Martínez Yee, Beatriz Rodarte Murguía, Bibiana Rodríguez Ponce, María Isabel Saad Villegas, Claudia Andrea Segal Kischinevzky, Alfonso José Vilchis Peluyera, Beatriz Zúñiga Ruiz. Apoyado por PAPIME PE202707 “Hacia una enseñanza actual de la Biotecnología” 2011 Manual de biotecnología 1a edición. 2011 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias ISBN Impreso y hecho en México . Inteligencia tecnológica competitiva Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 3. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Cuestionario Bibliografía Mapas de los plásmidos empleados en la práctica 5 9 17 21 . Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 2.Contenido Práctica 1. utilizando Gluconacetobacter xylinum Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía 33 43 47 . Análisis de la actividad de catalasas Introducción Objetivo general Objetivo específico Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía Práctica 7. Sesión de bioinformática Objetivos Metodología Discusión de resultados Bibliografía Práctica 6. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas.Práctica 4. Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses 27 Introducción Objetivo general Material y equipo Metodología Resultados Agradecimientos Bibliografía 6 Práctica 5. Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes al petróleo Material y equipo Resultados Segunda parte. Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas Introducción Objetivo general Objetivos específicos Primera parte. Introducción Práctica 11. Fitorremediación con helechos Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía 51 55 7 61 65 67 . Actividad enzimática Material y equipo Resultados Bibliografía Cultivo de tejidos vegetales. gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Resultados Bibliografía Práctica 9. Metabolismo secundario Introducción Objetivos Material y equipo Metodología Resultados Discusión Bibliografía Práctica 10.Práctica 8. Emulsificación de diesel. Identificación de organismos genéticamente modificados 85 Introducción Objetivo Material y equipo Metodología Módulo i. Electroforesis en geles de agarosa Resultados Bibliografía Anexo 93 . Rizogénesis Resultados Análisis Bibliografía 73 79 Práctica 14. Extracción de dna Módulo ii. Germinación de semillas in vitro Parte ii. Organogénesis somática de Nicotiana glauca Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Introducción Objetivo general Objetivos específicos Material y equipo Metodología Parte i. Cultivo in vitro Parte iii. Amplificación de dna Módulo iii. Embriogénesis Resultados Análisis Bibliografía Práctica 13. Inducción de brotes Parte iv. Inducción de callo embriogénico Parte iii.8 Práctica 12. Germinación de semillas in vitro Parte ii. las levaduras que participan en el proceso atraviesan tres fases: 1. Otros microorganismos presentes son las bacterias acéticas. Lactobacillus spp. Los factores que determinan la calidad de un vino son el clima. el suelo. Microflora natural de la uva Las uvas están compuestas por el hollejo (cáscara). Las cuentas viables alcanzan casi la misma concentración máxima de las totales.. Pediococus parvulus. que se añaden al mosto para iniciar la fermentación. entre otras. así como a que el etanol ejerce un efecto tóxico y a una alteración de la permeabilidad de la membrana celular. que se encuentran presentes en las uvas. Las cuentas totales se incrementan todavía más y después permanecen constantes. Fermentación. Los azúcares que contiene el mosto de la uva se convierten en alcohol (etanol). En dos días las cuentas totales (medida directa de la división celular) y las viables alcanzan 107 células por mililitro. Cinética de la fermentación alcohólica Durante la fermentación alcohólica del mosto de la uva. 2. Las levaduras implicadas en la fermentación del vino suelen ser de dos tipos: las llamadas levaduras silvestres. y las levaduras de vino cultivadas. la variedad de uva empleada y el proceso de fermentación. succínico. como Acetobacter aceti y Gluconobacter spp. con desprendimiento de CO2 como subproducto. pero muestran una fase estacionaria muy corta debido principalmente a la falta de nutrientes. 9 . en concentraciones de 4-7 g/L de vino. como Saccharomyces cerevisiae. En las uvas maduras se encuentran como microflora bacterias lácticas como Leuconostoc oenus.Práctica 1 Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Introducción El vino El vino es un producto de la fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras a partir del zumo de frutas y otros materiales ricos en azúcar. así como sustancias albuminoides. etc. sales minerales y agua. El grado de etanol presente en el vino se encuentra entre 6 y 13° Gay Lussac (gl) y hasta 20 °gl en licores. málico. semillas y pulpa. gomas. Además contiene sustancias orgánicas como los ácidos tartárico. Sobre la superficie de las uvas habitan levaduras y bacterias aerobias estrictas. Las levaduras que predominan en la superficie de las uvas maduras son Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora spp. Multiplicación. La concentración de las levaduras totales no varía mucho.3. La cinética de consumo de los azúcares va a depender de la cepa de levadura utilizada. Manual de biotecnología | práctica 1 10 Bioquímica de la fermentación alcohólica La primera parte del metabolismo de los azúcares ocurre en presencia o en ausencia de oxígeno. Objetivos específicos • • • • Familiarizar al estudiante con el manejo de algunas técnicas microbiológicas. Determinar el grado alcohólico de las muestras y la concentración de azúcares reductores presentes al inicio y al final de la fermentación alcohólica. Ambas vías funcionan simultáneamente. Gracias a este proceso. el mosto es enriquecido con vitaminas.000 ml Refrigerador 1 asa de siembra metálica Campana de flujo laminar 1 mechero 1 mechero * 6 gasas grandes * 100 gr de algodón. ya que al morir las levaduras se presenta un fenómeno de hidrólisis de la pared celular (autólisis) por su propia lisozima. Identificar las rutas metabólicas principales asociadas al proceso de fermentación alcohólica. pero satisfacen diferentes exigencias: la glucosa difosfato se encarga de la síntesis de energía y la fructosa monofosfato de la creación de precursores para la síntesis celular y del Nadph necesario. de que no exista sustrato limitante y de la concentración de etanol que se genera. siguiendo las rutas de Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) o la de Warburg-Dickens (pentosas-fosfato). pero las cuentas viables disminuyen rápidamente a 105 células/ml. Reconocer en la elaboración del vino un proceso biotecnológico de gran impacto en la industria y en constante transformación Material y equipo Parte I Material Equipo * 2 kg de uvas (verdes o rojas) Licuadora * 1 garrafón de plástico c/tapa de 5 litros Autoclave * 1 botella de vidrio c/tapa de 500 ml Incubadora con agitación * 1 botella de vidrio c/tapa de 1. Objetivo general Introducir al estudiante en el conocimiento de la biotecnología de las fermentaciones tradicionales. de la temperatura del proceso. Fase de declinación. aminoácidos y lípidos que estimulan el desarrollo de las bacterias lácticas. hilo y tijeras * 1 L cloro comercial *Material que deberán traer los alumnos . 000 ml Refrigerador 1 jarra para jugo 1 baño de hielo 1 vaso de precipitados de 500 ml 1 colador de cocina * 1 frasco Gerber * 1 metro de manta de cielo * Garrafón con el fermentado de uvas *Material que deberán traer los alumnos Parte IV Material Equipo 10 tubos de ensayo de 5 ml Vórtex 1 gradilla Espectrofotómetro 1 micropipeta de 1.000 µl Baño maría Puntas para micropipeta Potenciómetro 1 vaso de precipitados de 50 ml 1 vaso de precipitados de 100 ml 2 celdas para espectrofotómetro 1 piceta 1 cronómetro Reactivos Muestra inicial (tomada en la parte II) Vino centrifugado Glucosa DNS 11 Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae | práctica 1 Material .Parte II Material Equipo Botella con el inóculo Refrigerador Botella con el macerado de uvas * 1 frasco Gerber *Material que deberán traer los alumnos Parte III Equipo 2 botellas para centrífuga de 500 ml Centrífuga de banco 1 alcoholímetro Balanza de 2 platos 1 matraz Erlenmeyer de 1. 3. Inoculación e incubación 1. 6. Colocar el producto en botellas para centrífuga y balancearlas. 3. esta medida se toma como 0 °Gl. Maceración e inóculo del medio de cultivo (preparación del mosto) 1.000 ml. Incubar a 29 °C (los estudiantes se llevan el garrafón a casa.Metodología Manual de biotecnología | práctica 1 12 Parte I. 7. Eliminar las células del microorganismo que se depositaron en el fondo de la botella (pastilla). 3. Obtención del producto por centrifugación 1. 4. a. 6. Tomar una muestra de 5 mL que se utilizará en la parte IV como muestra final (mantener a 4 °C en un frasco Gerber). tomar la medida que indique la escala. mientras las partes III y IV se hacen al final para permitir una buena fermentación. lavándolo con abundante agua y cloro concentrado. Se estima que la primera y segunda parte pueden llevarse a cabo al principio del semestre. manteniéndolo en un sitio fresco en el que que no reciba luz directa) para no desviar la fermentación de los azúcares hacia la producción de ácido acético. Filtrar el producto en una jarra. agitando manualmente hasta su homogeneización. Volver a centrifugar todo el sobrenadante una vez más. limpio y previamente desinfectado con cloro concentrado.000 ml. Parte III. Centrifugar a 8 Krpm durante una hora. Lavar y moler 2 kg de uvas en la licuadora hasta obtener una pasta. Incubar a 37 oC por tres días u ocho días a temperatura ambiente. 5. dejarlo secar y almacenarlo hasta su utilización. Esterilizar ambas botellas en autoclave —de 115 a 120 oC— por 10 minutos. Almacenar la botella de 1. En el matraz de inóculo. 2. Parte II. Tomar una muestra de 5 ml que se utilizará en la parte IV como muestra inicial (mantener a 4 °C. hasta separar los componentes de la uva del líquido. b. Determinar la concentración de alcohol en grados Gl con ayuda de un alcoholímetro. en el frasco Gerber hasta su utilización). aplicar tres veces con un asa de siembra Saccharomyces cerevisiae en condiciones de esterilidad.000 ml a 4 °C hasta su utilización. 9. Calibrar el alcoholímetro sumergiéndolo suavemente en agua. 5. —con manta de cielo y colador—. Colocar 250 ml de las uvas maceradas en una botella de 500 ml (inóculo). 2. 8. Verter el sobrenadante en un matraz de 1. 7. Dejar enfriar a temperatura ambiente. procurando no exceder ¾ del nivel de la botella. Colocar el resto de la pasta en una botella de 1. Esterilizar el garrafón. 2. Mantener en frío (—baño de hielo—) el producto hasta el momento de la centrifugación. Sumergir suavemente el alcoholímetro en el vino. reservar los matraces obtenidos.000 ml). . Se depositan en el garrafón de plástico los 250 ml de inóculo cultivado y la pasta de uva restante (botella de 1. Agitar dos o tres veces al día (oxigenación) y liberar el CO2 formado girando levemente la tapa del recipiente para permitir la salida del gas. 4. 2.6 4 0. Sacar los tubos del baño y agregar 5 ml de agua destilada.2 - Muestra inicial (ml) 0. 8.5 13 Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae | práctica 1 Tubo .4 0. 4.5 0. Determinación de la concentración de azúcares reductores. 30 ml de una solución de dns al 0.6 0.5 0.2 6 1.0 2 0.5 0.5 0.5 0.5% y 30 ml de solución de glucosa estándar (1.5 0.5 0.9 5 1.4 0. 1. pH de las muestras inicial y final: Muestra TI1 TI2 TF1 TF2 pH DNS (ml) 0. Determinar el pH de las muestras inicial y final (por duplicado).8 1.0 - Agua (ml) 1. Agitar nuevamente en Vórtex.5 Tubo Concentración de glucosa (mg/ml) 1 0. para todo el grupo.6 0.5 0.5 0. de glucosa (ml) 0. Incubar los tubos tapados durante cinco minutos a baño María.8 0. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 540 nm. Agitar todos los tubos en vórtex -de 30 a 60 segundos aproximadamente. 3. 5.Parte IV.5 0. Preparar.5 Tabla de concentraciones de glucosa para la curva estándar.5 0. 6.3 3 0. Resultados 1. Marcar los tubos de ensaye y agregarles las soluciones como se muestra en la siguiente tabla: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sol.2 0.5 - Muestra final (ml) 0.5 mg/ml).0 0. 7. Linealizar la curva anterior por regresión lineal y obtener la pendiente (m) y la ordenada al origen (b).0 2 0.2 6 1. Sustituir en la ecuación de la recta resultante de la regresión lineal. Muestra Absorbancia (nm) TI1 TI2 TF1 TF2 5.b m .9 5 1.2. los datos de absorbancia de las muestras.3 3 0.6 4 0. Construcción de una curva patrón de glucosa: Tubo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa 1 0. y = mx + b Obtener las lecturas de la absorbancia de las muestras (por duplicado).5 Curva patrón de glucosa Absorbancia (nm) Manual de biotecnología | práctica 1 14 Concentración de glucosa (mg/ml) 3. de acuerdo a la ecuación de la recta: Donde: x es la concentración de glucosa y es la absorbancia 4. x= y. Prentice Hall. 10a ed. J. y C. D.Donde: x es la concentración de glucosa y la absorbancia m pendiente (obtenida en el paso 3) b ordenada al origen (obtenida en el paso 3) Tiempo Absorbancia (nm) Concentración de glucosa (mg/ml) TI1 TI2 TF1 TF2 Registrar la concentración de alcohol en el producto (resultado de la determinación con el alcoholímetro). 15 Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae | práctica 1 6. (1992) Elaboración de los vinos de mesa. Reyes. Martinko. Madrid. Biología de los microorganismos. uam Iztapalapa.M. México. M. Bibliografía Madigan. H.J. . y J.L.R. vol. Parker (2003) Brock.T. I. Verde.A. Escalilla. Manual de biotecnología | práctica 1 16 . comercialización y gestión. técnicamente factibles y con un alto impacto social y económico. en cuarto las del área física y después los artículos relacionados con las ciencias sociales. Contar con información suficiente del área tecnológica en la que se pretende incursionar. La información de patentes puede ser una herramienta muy eficaz.Práctica 2 Inteligencia tecnológica competitiva Introducción El primer paso en cualquier proyecto de investigación. porque cada año aparecen publicados cientos de miles de artículos científicos en miles de revistas especializadas. Se sabe que. existe una fuerte correlación entre el nivel de desarrollo tecnológico de los países y la capacidad de sus estructuras productivas para acceder a la información y utilizarla libremente. La inteligencia tecnológica competitiva establece una excelente base para administrar y desarrollar proyectos tecnológicos. Las nuevas disposiciones legales en materia de propiedad intelectual en México y en el entorno mundial que cada vez resulta más competitivo. tanto en la investigación aplicada como en el resto de las actividades del proceso de innovación. planificación industrial. es importante hacer una búsqueda sistemática y rigurosa que considere tanto la información científica. Esto es importante para los grupos de investigación de universidades e institutos. Para tener una idea certera de lo que ocurre en el mundo alrededor de un objetivo particular. resulta indispensable para desarrollar proyectos exitosos. incluso. elegir las tecnologías adecuadas y responder de forma oportuna y acertada a los cambios del entorno. sino para la 17 . como las patentes y la información comercial del sector tecnológico de interés. Se hace así más necesario en cada momento disponer de un buen sistema de seguimiento de las tendencias del progreso tecnológico. obligan a las empresas mexicanas a observar atentamente el entorno tecnológico en el cual se insertan. en tercero las de biología. La mayor parte de los artículos publicados son del área médica. no sólo para el seguimiento. En los últimos años el proceso de diseño de las nuevas tecnologías ha visto incrementada su complejidad y su dificultad. en segundo lugar están las publicaciones químicas. que incluya tanto fuentes bibliográficas como patentes publicadas y datos económicos y comerciales. pero resulta de especial relevancia para las empresas. públicos y privados. fabricación. porque permite identificar oportunidades y ventajas competitivas. La información tecnológica es actualmente condición indispensable del éxito en cualquier proceso relacionado con los sistemas productivos: investigación. básica o aplicada es buscar información publicada acerca del tema. desarrollo. Para acceder a información estratégica de un área tecnológica es indispensable utilizar fuentes de información electrónica. Se identifica cuál es la oferta tecnológica global y dentro de ella. Los alumnos podrán hacer búsquedas individuales o formar equipos de dos integrantes. se puede identificar posibles licenciatarios de tecnología o tecnologías de libre acceso. Aprender a recuperar patentes de las bases públicas de Internet. Material y equipo Equipo Material (individual) Computadora con acceso a Internet conectada a la * Unidad de memoria usb red unam * Un tema de investigación biotecnológico lo suficientemente preciso *Material que deberán traer los alumnos Metodología La práctica se llevará a cabo en un aula de cómputo en dos sesiones de tres horas. El monitoreo y el análisis sistemático de la información permite construir el mapa completo del área tecnológica de interés. se efectuará una búsqueda de patentes. en bases de datos especializadas Objetivos específicos • • • • • Detectar a los mejores proveedores de bases de datos relacionados con el tema. En la primera sesión se realizará una búsqueda de fuentes bibliográficas. Aprender a recuperar las listas bibliográficas y los artículos específicos. Con esta información es posible determinar cuáles son las tecnologías estratégicas para el grupo con el fin de diseñar programas de investigación y desarrollo. .previsión y la planificación del proceso de desarrollo tecnológico. en la segunda. a quién pertenecen esas tecnologías. las maduras y las que están por entrar al mercado. Encontrar las palabras clave idóneas. Manual de biotecnología | práctica 2 18 Objetivo general Hacer una búsqueda sistemática de artículos científicos y de patentes. en torno a un tema de investigación biotecnológico. así como localizar socios potenciales para establecer alianzas tecnológicas en el nivel nacional e internacional. Identificar las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. o bien. así como en la realización de investigaciones económicas. La información obtenida será utilizada para determinar el estado del arte de un tema biotecnológico particular elegido libremente o sugerido por los profesores. cuáles son las tecnologías emergentes. científicas y tecnológicas con diferentes propósitos. cuál es su tendencia de desarrollo y el posible impacto a nivel nacional e internacional de cada una de ellas. buscando las palabras clave sólo en el título o localizando sólo revisiones) hasta obtener un número manejable de citas (entre 150 y 200). Un documento impreso con la bibliografía de los artículos encontrados. Se anota el número de publicaciones encontradas en la base de datos. 14. Las palabras clave utilizadas y el número de referencias obtenidas. 3. Las citas se revisan y se seleccionan las que resultan pertinentes. 5. Un archivo electrónico con la información bibliográfica de las patentes recuperadas. Una lista de las bases de datos consultadas. La búsqueda en esta sección se hace en español. 5. Se selecciona un proveedor. . Dependiendo del tema particular. 6. 3. La historia de la búsqueda. Un archivo electrónico con la lista de referencias bibliográficas y los artículos recuperados. La búsqueda bibliográfica se realiza en la página de la Dirección General de Bibliotecas de la UNAM: <http://www. Aparece un buscador que localiza las bases de datos disponibles por tema. Se realiza una búsqueda con palabras clave (en inglés) localizadas en título y abstract. 8.com/quickSearch?locale=en_EP) 2. 19 Inteligencia tecnológica competitiva | práctica 2 Primera sesión: búsqueda de fuentes bibliográficas 1. Una lista de las bases de datos más adecuadas para la búsqueda. b. La estrategia para acotar la información. 9.unam. biotecnología o medicina. 11. Se localizan otras bases de datos útiles. Los datos generales de la patente se copian y se pegan en un archivo de Microsoft Word. Ingresar a la oficina de patentes europea: (http://ep. Aparece una lista de bases de datos. utilizando palabras clave en inglés. 4. selecciona: Bases de datos. 13. 4. con los temas particulares que cada base incluye y las empresas proveedoras del servicio. se realiza la búsqueda con las mismas palabras clave y se comparan resultados. Las citas seleccionadas se guardan en la unidad Usb. 12. Resultados El alumno debe entregar: 1. Se pide al buscador que cree la lista de la bibliografía consultada y se guarda en la unidad Usb. 4. En donde dice colecciones. Se seleccionan de la lista las patentes de Internet. Se regresa a la página de las citas seleccionadas y se obtienen los artículos completos que se encuentran disponibles en formato Pdf. Se realiza una búsqueda simultánea en las bases de datos que tienen el mayor número de citas. a.dgbiblio.mx/> 2. c.espacenet. 15. La búsqueda se acota si es necesario (a los últimos años. pueden utilizarse palabras clave como: biología. 10. Se hace una búsqueda en la base seleccionada utilizando palabras clave en inglés.Segunda sesión: búsqueda de patentes 1. 3. 2. Se seleccionan bases de datos individuales que pueden resultar útiles para la búsqueda 7. Los artículos completos se guardan en la unidad Usb. Maspons. E. G.oepm. y A. R. Zhu.> Manual de biotecnología | práctica 2 20 . Technological forecasting & social change 69: 495–506. Las patentes como fuente de información tecnológica. Izquierdo e I. Oficina Española de Patentes y Marcas.Bibliografía Cruz. La detección de las tecnologías emergentes: El caso de los biomateriales.htm. Seminario ALTEC 2003 Código ES.145. Escorsa. Porter. P.es/internet/inftecn/primera. (2002) “Automated extraction and visualization of information for technological intelligence and forecasting”.03. <http://www. Ortiz (2003). D. aquellas que tienen dominios transmembranales podrían tener dificultades al momento de la translocación al núcleo. por ejemplo. es recomendable establecer si ésta es adecuada para el proceso. el sistema de doble híbrido se basa en un ensayo genético en donde la interacción entre dos proteínas se mide por la reconstitución de un activador transcripcional funcional en la levadura. Aun desconociendo específicamente dónde y cómo actúa una proteína particular. puede ser que no se genere el plegamiento adecuado de la proteína. En este sistema se construye una fusión con el dominio de unión a dna proporcionado por el represor LexA de Escherichia coli y se expresa en un plásmido que contiene el marcador selectivo His3 (plásmido “carnada”). o bien. se reconstituye el factor transcripcional y se activa la transcripción ya sea del reportero LexAoperador-lacZ (localizado en un tercer plásmido) o bien. 21 . La mayoría de las proteínas pueden utilizarse de manera exitosa en el sistema del doble híbrido. Por otra parte. El sistema del doble híbrido tiene restricciones que impiden que algunas proteínas funcionen adecuadamente. es posible encontrar las proteínas con las que interactúa y potencialmente utilizar esta información para conocer más sobre la posible función de dicha proteína. Cuando las proteínas fusionadas interactúan. sin embargo. Objetivo general El alumno aprenderá a utilizar el sistema de doble híbrido en la levadura Saccharomyces cerevisiae como una herramienta para el análisis de posibles interacciones entre proteínas.Práctica 3 Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido Introducción El sistema de doble híbrido en levadura se desarrolló con la idea de identificar genes que codifican para proteínas que se asocian físicamente con una proteína dada in vivo. antes de intentar buscar posibles proteínas que interactúen con la proteína de interés (“carnada”). se construye una fusión con el dominio de activación de la transcripción B42 (“acid blob”) que se expresa en un plásmido que contiene el marcador Trp1. de LexAoperador-Leu2 (localizado río arriba del gen cromosómico Leu2 en la cepa EGY48). En contraste con los métodos bioquímicos que detectan interacciones proteína-proteína. Material y equipo Manual de biotecnología | práctica 3 22 Material 1 mechero Equipo Vórtex Puntas estériles blancas. . Los tres plásmidos empleados son multicopia. soluciones y medios.Objetivos específicos • • El alumno aprenderá a transformar a la levadura S. his3. 1.trp1. Saccharomyces cerevisiae EGY48 (Matα. Material biológico: 150 ml de células competentes de Saccharomyces cerevisiae EGY48 150 ml de DNA de esperma de salmón (10 mg/ml) Plásmidos: • 1 mg de pEG202+Gpa1 • 500 ng de pJG4-5+Ste4 • 500ng de pJG4-5+endoquitinasa • 1 mg de pSH18-34 Cepas. coli (pBR ori) y de levadura (2m) y tienen el marcador selectivo AmpR para bacterias. cerevisiae. plásmidos. LexAop-Leu2) 2.000 ml. ura3. estéril Microcentrífuga * 1 masking tape Micropipetas de 1.6. El alumno podrá discriminar si dos proteínas interactúan o no mediante el ensayo genético del doble híbrido. 200 ml y 20 ml * 1 encendedor Espectrofotómetro * 1 marcador indeleble Centrífuga * 1 asa de vidrio o 3 pipetas pasteur de tallo largo Termomixer * Cajas petri estériles * Palillos de dientes estériles Hielo Tubos para centrífuga. contienen orígenes de replicación de E.5 ml Incubadora a 42°C Agua destilada. azules y amarillas Incubadora a 30°C 3 tubos eppendorf estériles de 1. estériles Reactivos elaborados previamente por el profesor Medio YPD Medio SD + Leu Medio SGal + Leu + XGal Medio SGal + rafinosa Solución PEG/acetato de litio/TE DMSO * Material que deberán traer los alumnos. Protocolo para transformar levadura 1. eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 100 ml de agua con ayuda del vórtex. 9. 23 Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido | práctica 3 Parte I. Volver a centrifugar igual que en 4. Inocular 5 ml de YPD con la cepa EGY48 de Saccharomyces cerevisiae y dejarlo creciendo toda la noche a 30°C y 250 rpm (profesor). Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de agua. El plásmido pEG202 contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (Adh1) y se utiliza para la expresión de las proteínas fusionadas a LexA.6 (aproximadamente 1 x 107 células/ml). Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón en 1 ml de TE/acetato de litio 1X (preparado fresco a partir de TE 10X y acetato de litio 10X) 8. c. 12. Metodología Tubo 1: agregar 500 ng del plásmido pEG202+Gpa1. 500 ng de pJG4-5 + endoquitinasa y 500 ng de pSH18. colocar 50 ml de células y agregar 50 mg de dna de esperma de salmón sonicado y hervido. Preparar los tubos de la siguiente manera: . Tubo 2: agregar 500 ng de pEG202+Gpa1. Centrifugar igual que en el paso 6. El sitio múltiple de clonación se localiza río arriba del terminador Adh1 y el marcador selectivo para levadura es His3 (figura A). inocular 30 ml de YPD nuevo con aproximadamente 1 ml del cultivo de la noche anterior. 4.5-0. El plásmido pJG4-5 contiene el promotor inducible Gal1 y los sitios únicos EcoRI y XhoI para obtener una fusión con la secuencia de localización nuclear de SV40 (NLS). Medir la densidad óptica (do) inicial a 600 nm. Medir la do y sacar el cultivo cuando llegue a una do (600 nm) de 0. Tubo 3: no agregar plásmidos. Centrifugar durante 5 segundos. mezclar en el vórtex 14. Al día siguiente. Repetir el proceso con otros dos tubos. coli. Agregar 300 ml de PEG40%/Litio/TE (preparado fresco con 1 vol de TE 10X. Meter en hielo. En un tubo eppendorf limpio. 2. 3. Centrifugar 5 min a 2 500 rpm. eliminar el sobrenadante y agregar un volumen igual de agua destilada estéril. Dar un choque de calor a 42°C por 15 min. 2 y 3). Resuspender en el vórtex y pasar las células a un tubo de 1. 5. El plásmido pSH18-34 contiene un sitio de unión a LexA seguido del gen reportero lacZ de E. Agregar 40 ml de DMSO.5 ml estéril. 7. 6. Incubar a la misma temperatura y rpm. Ura3 es el marcador selectivo para levadura. El marcador selectivo es Trp1 (figura B).a. Resuspender en el vórtex. b. Centrifugar en la microfuga 5 seg a máxima velocidad. 500 ng de pJG4-5+Ste4 y 500 ng de pSH18-34. Mezclar en el vórtex e incubar 30 min a 30°C 13. eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 300 ml de TE/acetato de litio. Marcar los tubos con números (1. 10. 1 vol de acetato de litio 10X y 8 vol de PEG4000 al 50%). 15. el dominio B42 (activador de la transcripción) y la etiqueta de hemaglutinina (HA). 11. 5. tomando una sola colonia cada vez. Plaquear las células de cada tubo en medio SD+leucina e incubar a 30°C por dos días. Una vez que hayan crecido las colonias de levaduras transformadas.16. 3. Ensayo de doble híbrido 1. debe observarse el crecimiento de las colonias. Resultados Manual de biotecnología | práctica 3 24 1. Para sembrar las transformantes se emplean palillos planos estériles.0. 2. sembrar 5 o 6 colonias de las cajas 1 y 2 en medio SGal + leucina pH 7. en el cual previamente se plaquearon 50 ml de X-Gal. ¿Cuál es la función del gen reportero lacZ? ¿Para qué sirve el compuesto X-Gal? ¿Qué pasaría si olvidaras adicionar este compuesto a tus cajas de SGal + Leu? . Incubar la caja a 30°C por 2 días. 4. Transcurrido este tiempo. 2. Doble híbrido: anotar si las transformantes obtenidas generaron un color azul o no en el medio SGal + X-Gal + leucina. 2. Transformación de levadura: anotar y explicar por qué hubo crecimiento o no en cada una de las tres cajas. ¿Por qué crees que es importante sembrar las transformantes en un medio que sólo contiene leucina? ¿Cuáles son las diferencias entre un medio selectivo y un medio completo? ¿Qué crees que hubiera pasado si hubieras sembrado tus transformantes en un medio completo? ¿En qué consiste el ensayo de doble híbrido y para qué sirve? Menciona un ejemplo. ¿Cómo interpretas los resultados obtenidos? Plásmidos utilizados Crecimiento en medio SD + Leu Coloración en medio SGal + Leu (pH7) + XGal pEG202 + GpaI pJG4-5 + Ste4 pSH18-34 pEG202 + GpaI pJG4-5 + endoquitinasa pSH18-34 Sin plásmidos Cuestionario 1. Parte II. D. Fink (1991). Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.A. Maniatis (1989). 25 Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido | práctica 3 Mapas de los plásmidos empleados en la práctica . Figura A. Molecular cloning. (1997). Gottschling. y O. 194. Stearns. Fields. vol.E.Bibliografía Adams.. J. C. pEG202: plásmido para la fusión a LexA. “A novel genetic system to detect protein-protein interactions”. Fritsch y T. Kaiser y T. y G. Methods in Enzymology. Trends in Genetics 10: 286-292. Sternglanz (1994). y R. Guthrie. C. Cold Spring Harbor Laboratory Press. E. A. Nature 340: 245-246.R. A laboratory manual. S.. Methods in yeast genetics.F. “The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions”. Fields. Sambrook. S. “Guide to yeast genetics and molecular biology”. Song (1989). Manual de biotecnología | práctica 3 26 Fusion cassette NLS B42 domain EcoRI HA Tag XhoI ATG GGT GCT CCT CCA AAA AAG AAG … CCC GAA TTC GGC CGA CTC GAG AAG CTT … M G A P P K K K … P E F G R L E K L … Figura C. pJG4-5: plásmido para la fusión al dominio de activación de la transcripción.Figura B. . Plásmido pSH18-34: plásmido con el gen reportero lacZ. la participación del hombre y la mujer en las sociedades prehistóricas. la identificación mediante análisis morfométrico resulta incierta o imprecisa en restos óseos de niños y preadolescentes debido a la ausencia de dimorfismo sexual. la interpretación de artefactos y arte prehistóricos. basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). recientemente el grupo de investigación en antropología molecular del laboratorio de bioquímica de la Facultad de Ciencias de la unam. ya que permite identificar el sexo con un índice de certeza de aproximadamente 95%. Las reacciones de amplificación por PCR fueron optimizadas 27 . la psicología y la biología. El método utiliza dos primers específicos para las secuencias de los alelos de la amelogenina en los cromosomas Y y X y un primer común a ambos alelos. En los humanos hay dos genes que la codifican. es la herramienta idónea para la identificación del sexo en los restos óseos incompletos. como la sociología. la selección de víctimas en casos de infanticidio. relaciones de parentesco entre individuos recuperados del mismo entierro. Sin embargo. la historia. La antropología ha sido subdividida en áreas especializadas entre las que está la antropología física o biológica. las cuales funcionan adecuadamente en muestras forenses. este dato es fundamental para reconstruir el contexto arqueológico con la finalidad de entender a) aspectos culturales en las poblaciones antiguas. En estos casos el método molecular. que estudia la evolución y biología de las poblaciones humanas. la antropología estudia el origen del hombre. etc. etcétera. La identificación del género es importante en muchos aspectos biológicos y sociales en la vida de una persona. El sexo masculino se identifica por la presencia del producto que proviene del cromosoma Y. y b) la historia evolutiva humana relacionada con demografía. propuso un método que se basa en la amplificación del intrón 1 del gen de la amelogenina para identificar el sexo en restos óseos humanos. Para este análisis la pelvis es considerada el hueso ideal. éstos se localizan en los cromosomas Y y X y fueron secuenciados en su totalidad en 1991.Práctica 4 Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses Introducción En el campo de las ciencias sociales. antes del nacimiento de un bebé se tiene la expectativa de cuál será su sexo. Esta disciplina integra los descubrimientos de otras ciencias. La amelogenina es una proteína del esmalte dental. Así. uno de los primeros registros que se realiza en excavaciones arqueológicas es la identificación del sexo en restos humanos. Esta identificación por análisis molecular también es utilizada con frecuencia en antropología forense. Por otra parte. el tamaño de los productos de amplificación es diferente en los dos alelos. Existen varias técnicas de PCR que se basan en la amplificación de la amelogenina para identificar el sexo.. Distintos métodos morfológicos permiten identificar el sexo en restos de esqueletos humanos de adultos. la economía. Tradicionalmente. o en restos incompletos de adolescentes y adultos. mientras que el femenino se identifica por su ausencia. por ejemplo. individuos modernos y restos arqueológicos. Con el método de extracción de dna el alumno conocerá las características requeridas para obtener y manipular la muestra biológica de mucosa bucal y adquirirá la capacidad para extraer dna de ésta. GelRed 10. Los productos de PCR son detectados directamente en electroforesis en gel de agarosa y/o poliacrilamida. También aprenderá a cuantificar dna por comparación con un marcador de tamaño molecular. Objetivo general Identificar el sexo en los alumnos que cursan la materia de biotecnología con la finalidad de que aprendan tres metodologías básicas en el área de la biología molecular. TAE 50X 12. Objetivos específicos Manual de biotecnología | práctica 4 28 1. por lo que este método funciona adecuadamente para analizar dna contemporáneo y antiguo.2–1ml y de 0.1 ml Baño a ebullición Microfuga Cámara de electroforesis Soluciones 1. dNTPs (200 mM) 6. Agua inyectable 8. Agarosa 11. Taq DNA polimerasa (1U) 9. PBS 20X 2. La electroforesis en gel es una herramienta que se realiza de manera rutinaria en la investigación científica.2 ml Baño a 56°C Hisopos estériles Vórtex Micropipetas de 0. 200ml de cloro al 30% 3.y establecidas con dna humano moderno. 3.05 . Solución de lisis 4.0. Buffer c/MgCl2 (1X) 7.5 ml y de PCR de 0. 2. lo cual le permitirá entrenarse en una técnica ampliamente utilizada en la antropología molecular y la biología. Con el método de PCR el alumno amplificará las regiones específicas del gen de la amelogenina de los cromosomas X y Y para identificar el sexo en humanos. Primers (200 ng c/u) 5. Marcador de peso molecular para DNA . Material y equipo Material Equipo Tubos de 1. Con la técnica de electroforesis en gel de agarosa el alumno aprenderá a visualizar el extracto de dna y los productos de amplificación de PCR. 3.25 µg/µl Primer COM 5 µM 1. enjuagar el hisopo en el fondo y contra las paredes del tubo.1 mM BSA 2. Poner en cada tubo: Reactivo Agua Mezcla de reacción Concentración final cbp ajustar a 25 µl Amortiguador 10X 2. Resuspender con cuidado utilizando la micropipeta. • Agitar durante 15 segundos. • Enfriar a temperatura ambiente por 2 minutos.2 o 0.5 µl 0. Colocar el hisopo en un tubo de 1.Metodología La práctica se lleva a cabo en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras II) Amplificación del dna III) Electroforesis en geles de agarosa MÓDULO I.5 µl 2. añadir 1 ml de buffer PBS. • Incubar a 56°C x 15 minutos. 2.5 µl 1X MgCl2 25 mM 2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1. • Guardar en hielo o a –20 0C. Colocar el hisopo en una solución de cloro (blanqueador para ropa) al 30% para descartarlo.2 µM Primer XSP 5 µM 0.5 ml.1 µM Primer YSP 5 µM 0.0 µl 0. • Descartar el sobrenadante y resuspender en 150 µL de solución de lisis. • Agitar vigorosamente por 2 minutos.5 ml de acuerdo con el termociclador que se utilizará. raspar 30 veces la parte interna de cada mejilla para obtener las células. Extracción de dna Extracción de dna • Transferir las células/PBS a tubos de 1.5 ml y centrifugar a 14 000 rpm durante 1 min. • Centrifugar a 14 000 rpm durante 2 minutos • Obtener el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio de 1. 2.1 µM 29 Extracción de adn e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses | práctica 4 Obtención de células 1.0 µl 0.5 µl 0.5 mM dNTP´s 1. Hacer un raspado de mucosa bucal con un hisopo de algodón estéril.25 mM 2. .5 µl 1. • Calentar en baño a ebullición por 10 minutos.5 ml. Visualizar y cuantificar de manera aproximada en un gel de agarosa 1%/TAE MÓDULO II.5 µg/l 0. Marcar tubos de pared delgada de 0. • Enfriar a temperatura ambiente por 30 segundos. para lo cual se detendrá el horno cada vez que sea necesario. Incluir en el gel una muestra del marcador de tamaño molecular. de esta manera se evita la contaminación. b) Colocar cuidadosamente ~6 µl de muestra en cada pozo utilizando la micropipeta de 10 µl. Siempre se debe usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo. El gel polimerizado tiene una apariencia opaca. Dejar el gel solidificando a temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos. En una superficie plana nivelada colocar la base acrílica que soportará el gel y colocar el peine para hacer los pozos 5.75 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X. Evitar que hierva. Colocar los tubos en el termociclador y programar: Desnaturalización inicial: 94°C por 5 minutos 40 ciclos Manual de biotecnología | práctica 4 30 { 94°C por 30 segundos 57 °C por 30 segundos 72 °C por 1 minuto Extensión final: 72 °C por 7 minutos Guardar a 4 °C MÓDULO III.3 gr de agarosa y agregar 30 ml de buffer TAE 1X.20ng 1 . 4. 1. Vaciar la solución de agarosa evitando la formación de burbujas. Enfriar la agarosa aproximadamente a 50 °C. a) Para dna genómico (agarosa al 1%): Pesar 0. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis. agregar 1µl de GelRed para monitorear la movilidad electroforética y para visualizar en UV. 3. Poner todas las muestras deseadas de igual manera. 1U Agregar una gota de aceite mineral en caso de que el tipo de termociclador lo requiera. Añadir TAE 1X hasta cubrir completamente el gel. 2. c) Conectar la cámara de electroforesis. Electroforesis en gel de agarosa Preparación del gel de agarosa 1. 4. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros) entre la cámara. . Preparar las muestras de la siguiente forma: a) Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm. b) Para productos de PCR (agarosa al 2. Calentar la agarosa en un horno de microondas por aproximadamente 1 minuto hasta que se disuelva completamente. el cable y la fuente de poder.5%): Pesar 0. 2. Preparación de la cámara de electroforesis y las muestras (extracto de dna y los productos de PCR) 1. 6.3 µl Taq dna polimerasa 3. el cable y la fuente de poder.dna 10 . 3. “Sex identification of children sacrificed to the ancient Aztec rain gods in Tlatelolco”. 522 p. K. Román. Ancient Biomolecules 3:215-225. (2001). L. Current Anthropology 49: 519-526. Bibliografía De la Cruz. B.A.d) e) f) Encender la fuente de poder y seleccionar el voltaje en 100 voltios. • Tomar un registro fotográfico del gel con una cámara digital. A. Cuando el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles. Jurmain. . Trevathan y H.. González-Oliver.. D. Thomson.M.A. Este método fue diseñado como parte de un proyecto apoyado por papiit. Canada. W. Desplazar las muestras tres cuartos del tamaño del gel. R. Wadsworth.G. Las muestras de DNA deben dirigirse hacia el electrodo positivo. J. Introduction to physical anthropology. “Identifying the sex of human remains by ancient DNA analysis”.. unam y por el CONACyT. El tamaño de los fragmentos amplificados es de 192 pb en el cromosoma X y de 158 pb para el cromosoma Y. Resultados Agradecimientos Se agradece al Dr. y A. Nelson (2003). Torre-Blanco (2008). 31 Extracción de adn e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses | práctica 4 Visualización del dna • El extracto de dna y los productos de PCR en el gel de agarosa se observarán con una lámpara de luz UV o sobre un transiluminador. Smith. Brown. 9 ed. Kilgore. Alfonso Torre-Blanco del Laboratorio de Bioquímica de la Facultad de Ciencias por su participación. Apagar la cámara de electroforesis para detener el desplazamiento de las muestras. Kemp. I. . las bases de datos iniciales –Pir (Protein Information Resource) y GenBank– fueron ampliando sus recursos informáticos para incluir programas de búsqueda y comparación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos.uk/embl). etc. a principios de 1980 se crea el Centro Nacional de Información Biotecnológica (Ncbi. más recientemente. que es un proyecto conjunto del embl/ebi y el Instituto Sanger de Inglaterra (http:// www. para el resguardo y análisis de las bases de datos de dna.ddbj. existen otras Bases de Datos tales como embl/Ebi del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (http://www. dependiente de los institutos nacionales de salud en Bethesda.ac.nih. Como se mencionó anteriormente. todas estas bases de datos cuentan con recursos bioinformáticos muy amplios con los cuales se pueden llevar a cabo múltiples análisis de las secuencias.ensembl. Conforme estas bases de datos fueron creciendo. traducción de secuencias de nucleótidos a aminoácidos o búsqueda de señales estructurales o funcionales en las secuencias.ac. las ciencias computacionales y la tecnología de la información en una disciplina única. comparación y análisis de secuencias de nucleótidos y proteínas. 33 . el Centro Nacional de Información Biotecnológica (ncbi) crea bases de datos públicas de dna.Práctica 5 Sesión de Bioinformática Bases de datos y herramientas bioinformáticas ¿Qué es la bioinformática? La bioinformática es el campo científico que integra a la biología. ¿Qué es el ncbi? Establecido en 1988 como un recurso computacional para el manejo de información en biología molecular. la Biblioteca de Datos del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (Embl) y el Banco de Datos de dna en Japón (DDBJ).ncbi.ebi. Así. Estados Unidos. Al inicio de la “revolución genómica” la bioinformática se entendió como la creación y mantenimiento de bases de datos en las cuales se guardara información biológica tales como secuencias de nucleótidos (genes. todas estas bases de datos han sido puestas a disposición de todo el público de manera gratuita a través de diferentes páginas Web. Con el desarrollo de la Red Internacional –internet–.gov).org).nig. desarrolla herramientas de software para análisis de datos genómicos y disemina información biomédica para investigación básica y clínica. las secuencias de proteínas fueron depositadas en la base de datos Pir y.jp) y Ensembl.) y de aminoácidos (proteínas). el dna Databank de Japón (ddbj. conduce investigación en biología computacional. Maryland.nlm. Además de Ncbi y sus Bases de Datos asociadas (http://www. http://www. secuencias reguladoras. en la base de datos Protein DataBank (Pdb). por sus siglas en inglés). fue necesario desarrollar nuevas interfases entre los remitentes de secuencias y los usuarios de tales bases. De esta manera. Todas estas bases de datos cuentan con múltiples recursos bioinformáticos para la recuperación. Por su parte. sin embargo. Si el identificador de la proteína cuenta con dos o más palabras. mientras que para una deshidrogenasa teclear Deh. Recuperación de secuencias En esta sesión de bioinformática se accederá a la base de datos del ncbi. de esta manera.ncbi. Nota: Se pueden utilizar indistintamente mayúsculas y minúsculas en la escritura del identificador. Formalizar lo anterior mediante un ejemplo de búsqueda. Metodología Manual de biotecnología | práctica 4 34 1.nih. si se pretende recuperar la secuencia del gen de la insulina teclear Ins. Para entrar en la base de datos del ncbi teclear la siguiente dirección: <http://www.gov> y aparecerá la página de presentación del sitio: . mediante una búsqueda cuidadosa en toda la página.nlm. sino que también varía el diseño de las páginas. se hará una búsqueda de una secuencia determinada y se utilizarán algunas de las herramientas computacionales que el ncbi pone a disposición de la comunidad académica mundial. recuperación y análisis de secuencias de genes y proteínas. Para recuperar una secuencia de un gen o una proteína. siempre será posible llevar a cabo el ejercicio propuesto. para recuperar la secuencia de la Heat Shock Protein teclear Hsp. teclear las iniciales de dichas palabras.Objetivos • • Presentar al alumno los conceptos básicos y las herramientas computacionales en el campo de la bioinformática. la nomenclatura aceptada en las bases de datos señala lo siguiente: • • Se puede buscar la secuencia del gen o de la proteína señalando las tres primeras letras del nombre o identificador en inglés. Nota: Las bases de datos no sólo incrementan constantemente sus contenidos. así. la página contiene el localizador Search (búsqueda) y una ventana en la que aparecen diversas bases de datos. al seleccionar Nucleotides (nucleótidos) se está escogiendo una base de datos específica y en la ventana del localizador escribir el nombre del gen que se desea recuperar. el del gen codificante de la proteína de choque térmico Hsp10. Explóralos y busca en el apartado de regiones genómicas. transcritos y productos. en donde dice GenBank. para obtener la secuencia genómica de nucleótidos del gen Hsp10 a partir de la Base de Datos Genbank: ORIGIN 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 acccgcgcag gcctcgctcg atcgcgtcat aaaagcctag gcagggccct gggcgagggg cacgtgtcgc agtctgaggc cctgtctgag ttggtggcca ccttttctcc cgagaacccg aatatcttgg tttctggaaa aaagctggtc gggaattaaa gaggtttggt cctgttgata ggacaagcgt gctgaaactg caagcaacag ggaactattt cgcttattaa tttcttaaag cttattttat ggtgtgctag gttccagaac ttccgggagg aaacagctcc tggggcgaat gctagcggcg cagggccgga ggagggagta gcgtacgggg ctcagtgacc cccagggctc ggcgcacgcg gtaaaaatca aacctgaaga tggttgctca cttggaatat gttaactttc atgtgattac ttagaaagtt taaccaaagg tagtcgctgt tttatagtgt gtagagttta ggaaatgact gtgatagttt cgcgctcagc tttccagaaa ggacgaaggg ttttttcttc cgcggtgcgc accgctgggg ctgcgagtct atggtgagtc atccctgacg agcgcccgat tttgcacgcg cagcgtctca tggtgccagg aggaaaacat ccggaggagc tggttagtac aaagccaaaa atttagtttt tcttccactc aggcattatg tggatcgggt gcagtggagg tgtcgttttc aatataaagt cagagtatta cctctccggc atgccgcgct gtagttcttt cgcctccgag gtcggggcga cgagcgcgcc ctttgcggcg ccgcgtggcc cccctctttt ggcaccttgg cgtgtgctgc cctgcttctg cagggagctt ttgaccttgg gacaacgacc attcaaatgc cgtgttgaga tgtttcaaaa tttgaccgag cttccagaaa tctaaaggaa gaaaagaagt aagatcatta tgcttatttt aaaattgtcc cggcttagtc ccctacggct cacctcggct tcttcgcgtc ccgccctccc tgcgcgctgg ctacactaga ccgaggcctg gttgggctgg agcggcaagg cggtgtgtaa cagggccttt gacccagcgt aataaactaa cctaacagac gcttccttaa tgtatagcac catttctctt tattggttga aatctcaagg aggtaaatgg aattctggag actgctttgg atatgaccaa tcaataggcc tagttcccgg caagggtcaa gggcgcctag agcgtcctgc tccctgggag gtgatttttt gcagagtacg caggcccggg gcgggaggga cccgcccgac ggcagggggg gtggatgtgt ttcctgaaaa ggttgacctt gtaaggaatc cgaataagct ggtggcgttg cctacaggca aaggagtgct aaaagtattg gagctgcagt tattaaaagt ttctaatctg tgctatgatg gggtgcggtg 35 Sesión de Bioinformática. habrá que escribir Hsp10 human. en este caso. si se quiere restringir la búsqueda al gen que codifica a la proteína Hsp10 humana. Bases de datos y herramientas bioinformáticas | práctica 5 Por otra parte. including: HSPE1 (Homo sapiens): heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) HSPD1 (Homo sapiens): heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin) Hspd1 (Mus musculus): heat shock protein 1 (chaperonin) Al seleccionar la primera entrada de la lista de secuencias correspondiente a Hsp10 human se obtendrán muchos descriptores. El programa de búsqueda generará un reporte de todas las entradas que existen en la base de datos en las que aparece el registro Hsp10: This search in Gene shows 164 results. including: hsp10 (Arthroderma benhamiae CBS 112371): mitochondrial heat shock protein Hsp10 HSP10 (Bifidobacterium bifidum PRL2010): 10 kDa chaperonin GROES hsp10 Hsp10hsp10 (Salmo salar): heat shock protein 10 This search in Gene shows 4 results.Como se muestra. De esta manera el programa de búsqueda recuperará la secuencia deseada: . la secuencia contiene una numeración que facilita la búsqueda de una subsecuencia particular. De igual forma se puede recuperar.2” recuperada solamente muestra los exones que conforman el rna mensajero maduro: /gene=”HSPE1” ORIGIN HSPE1/RNAm 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 acccgcgcag gcctcgctcg atcgcgtcat aaaagcctag gcagggccct gggcgagggg cacgtgtcgc agtctgaggc accgagtatt cagaaaaatc aaggaaaggg cagaatatgg gtgacattct atgctgccca ggtgtgctag gttccagaac ttccgggagg aaacagctcc tggggcgaat gctagcggcg cagggccgga ggagggagta ggttgaaagg tcaaggaaaa tggagagatt aggcaccaaa tggaaagtac ttccactgaa cgcgctcagc tttccagaaa ggacgaaggg ttttttcttc cgcggtgcgc accgctgggg ctgcgagtct atggcaggac agtgctgctg gtattgcaag caaccagtta gtagttctag gtagactgaa gttctgaaat cctctccggc atgccgcgct gtagttcttt cgcctccgag gtcggggcga cgagcgcgcc ctttgcggcg aagcgtttag aaactgtaac caacagtagt gcgtgaaagt atgacaagga ataagtcact ctttcgtcat cggcttagtc ccctacggct cacctcggct tcttcgcgtc ccgccctccc tgcgcgctgg ctacactaga aaagtttctt caaaggaggc cgctgttgga tggagataaa ttatttccta attgaaatgg gtaaataatt tagttcccgg caagggtcaa gggcgcctag agcgtcctgc tccctgggag gtgatttttt gcagagtacg ccactctttg attatgcttc tcgggttcta gttcttctcc tttagagatg catcaacatg tccatatttc .Manual de biotecnología | práctica 4 36 // 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 gctctcgcct gttcaagacc gccgggtgtg catttgaacc cagtatgggg gcaatttggt aaagaggctg gaggatcgtt tgagacctcc gggcatttaa tgccctaatc cagtcttgtc actttcttaa tgttagtgta aagattgcac aagatctcag ttctagttgc aagactttgg gaacaaaaca gaaagaagga ggtttatttc gttaactaaa tagtttaagc tctgtaattc atttgagtga gaactagata gttagcgtga ctagatgaca ttgtcttaac ttcttggaaa cccattccac ataataaact tataaacact gtaatctcag agcctgacca gtggcatgcg ctggaggcgg gacagggcga agcctagtgt tgcgtggtgg tgagctcagg tgtctacaaa gaattgagag ttaaccagtt caatctgcag aacctgatat ttttatgtgt acctctgttt ccaaaataca ttctgaggag ggagtggaca atcacaagag aaatatgacc atatagttga gttagctttt cactgtgtat tagtatgagt ccatgtttca tctttgctaa aagttggaga aggtgtgtaa taatggtttt gtacgtagac tgaagttctg aatgataact tccaaataaa cactttggga acatggtgaa cctgtaatcc aggttgcaag gattctgtct gatcagtgtt ctcacacctg attcaaaatc ataaataaat gaaacttgga ggtatacctg cctgggacag ttcttttgca ggcccaacac tagatgttcc cagtaaacgc gaaagctcta cttagctgca tatgttctaa atttgtatat taagttatgt ccagaatatt tatttcaaag cgtatcactt ttagttgtag taaacatcct taaagttctt acttaataat tttcacttgc tgaaataagt aaatctttcg aatgacatcc aatatgtaaa ggccgaggtg accccgtctc cagctactgg gagccgaggt caaaaaaaaa tgccttacat taatccttgc aggagttcaa acaaaagatg ctgttcgttt gttgtatacc ctctgaatgc atttttttta agttcttcca tcagttaatt cgttggggcc ctgaggagct gtccctttcc atccaaaaaa ggcattttct taatatttaa ttcttgaact tgtaactaca agccacgaaa tgatttaaaa tcctttttta ctcccagaat tctaaaaaga aggattattt cactattgaa tcatgtaaat agtgtctcca tgagtggtta tgcggatcac tactaaagat ggaggctgag tgcaaggcgc aaaaaaaaat tctaaatttt attttgggag aatcagtctg tgcttcaagg aacccctaac taccagagga cgcctaacgc agcttaccag gtgtggccca gtttaggcct aaataatgtt gtcatggagt ccaaatctgt actttaaatt gggtgctggc cagttataaa tttacgttgg gtggtatttt tatattttta gttaactgtt agggtggaga atggaggcac agtcagatat cctatttaga atggcatcaa aatttccata aaattgtttc atcttta aaggtcagga acaaaaatta gcaggagaat ccctgcattc cccctcaata taataagaca gccaaagcag ggcaacataa taaaatgagg acattgaaat acaggttggt aaatccctaa ctactgctaa gggaagccaa cgggcttcta aactgcattg taggaatagg tctttggagg tttgtatgtt tactgttgca gttagcttta agtcaggttt tgagtgaaga atataattgg tatgttgggt gattcaacca caaagtagtt ttgcaattag gatggtgaca catgatgctg tttctctttt cttgtactga Como se puede observar. y en este caso. la secuencia del rna mensajero del gen. la secuencia “NM_002157. dando clic en transcript. aparecerá una ventana con la siguiente información: En esta página se selecciona nucleotide blast para realizar la búsqueda con una secuencia de nucleótidos. se iniciará una búsqueda de secuencias relacionadas en otros genomas. conviene seleccionar blastn (somewhat similar sequences [blast n]) para permitir una búsqueda amplia. para proteínas. Bases de datos y herramientas bioinformáticas | práctica 5 // 841 tcttttataa taaactaatg ataactaatg acatccagtg tctccaaaat tgtttccttg 901 tactgatata aacacttcca aataaaaata tgtaaatgag tggttaatct ttaaaaaaaa 961 aaaaa . 37 Sesión de Bioinformática. Al seleccionar en la página de entrada la opción blast. Este algoritmo está basado en la comparación de similitudes de nucleótidos o aminoácidos entre secciones cortas (locales) de la secuencia de búsqueda (query) y cada una de las secuencias de la base de datos. en selección de programa. Para esto el Ncbi cuenta con un programa de comparación de secuencias denominado blast (Basic Local Alignment Search Tool o Herramienta Básica de Búsqueda por Alineamiento Local). amplía la búsqueda en regiones contiguas. Aparecerá una ventana en la que se inserta la secuencia del mRna obtenida anteriormente. ya sea en forma de secuencia completa con intrones o en la forma de rna mensajero. Más abajo. Word Size: La longitud de la secuencia que comienza el alineamiento entre secuencias relacionadas. la longitud de las secuencias comparadas es de tres aminoácidos y para nucleótidos la longitud mínima es de 11. Cuando el algoritmo encuentra regiones idénticas o similares.Con la secuencia del gen. Entre los parámetros opcionales más importantes del algoritmo figuran: Expect threshold: Número de secuencias que pueden ser encontradas al azar (Valor de Expect con elevada significación estadística: 0.000001 = (1 x 10-6)). con la finalidad de explorar el grado de divergencia de ambas secuencias o de comparar la presencia de inserciones o deleciones de nucleótidos a lo largo de la evolución de ambas secuencias a partir de un ancestro común. extendiendo el alineamiento hasta que ya no encuentre identidades o similitudes y evaluando el grado de sustituciones o de inserciones y deleciones de nucleótidos o aminoácidos entre las secuencias. Si en vez de hacer el Blast contra todos los genomas. El resultado de la búsqueda aparecerá en el siguiente formato: Manual de biotecnología | práctica 4 38 Las barras horizontales indican las secuencias con mayor índice de similitud con la secuencia de búsqueda.. TATATATATAT…. Pulsar la tecla Blast. AGAGAGAGAG…. según se mencionó antes. Al colocar el cursor sobre una línea determinada aparecerá en la pantalla la secuencia correspondiente. que va en decremento desde la línea superior a la inferior en función de los valores de puntuación señalados: < 40 hasta > 200. se selecciona en la ventana previa sólo la base de datos de humano. tal como se observa en la siguiente ventana: . con lo cual el programa buscará en la bases de datos las secuencias que muestren identidad total o parcial.. por ejemplo: AAAAAAAAAA…..Filter: Elimina secuencias con baja complejidad composicional. expresado esto como el valor de Score (puntuación). se puede obtener una visión cromosómica de las ubicaciones de las secuencias obtenidas con la opción Human genome view y el programa desplegará una pantalla mostrando las ubicaciones de las secuencias recuperadas por cromosoma. Chromosome view hsp10 human 2. listando una pequeña muestra de los genomas secuenciados hasta la fecha con la opción Blast Assembled RefSeq Genomes: BLAST Assembled Genomes Choose species genome to search or list all Genomic BLAST databases Human Mouse Rat Arabidopsis thaliana Oryza sativa Bos taurus Danio rerio Drosophila melanogaster Gallus gallus Pan troglodytes Microbes Apis mellifera También con la opción list all Genomic Blast databases se tendrá acceso a las bases de datos de todos los genomas secuenciados hasta la fecha. Bases de datos y herramientas bioinformáticas | práctica 5 39 . tanto procariontes como eucariontes. Un ejemplo de lo anterior lo representa la recuperación de la secuencia homóloga del gen de Hsp10 humano en el genoma del chimpancé. Comparación de secuencias La base de datos del ncbi también da la opción de llevar a cabo búsquedas de secuencias relacionadas con la de interés en muy diversos genomas totalmente secuenciados. -Hsp10-. lo que permite hacer comparaciones evolutivas y construir relaciones filogenéticas entre diversos organismos. y se repite el procedimiento anterior de copiar y pegar la secuencia Sesión de Bioinformática. en la pantalla siguiente se muestra el formato de la ventana configurada en la opción Blast (Blast Home). Si se selecciona el genoma del chimpancé (Pan troglodytes) para buscar en él la secuencia del gen de interés. PIR. SwissProt y TrEMBL. probabilidad de alineamientos al azar entre dos secuencias no relacionadas. el sitio Web es <http://www. el programa dará por resultado un alineamiento pareado entre la secuencia del gen de Hsp10 humano y las secuencias homólogas de Hsp10 en el genoma del chimpancé. Para el caso de recuperar y comparar secuencias de aminoácidos. que en este caso es del orden de 1 x 10-6 y en donde no hay línea. el valor de Expect. uniprot. un recurso bioinformático muy útil es UniProt. La primera entrada corresponde al gen tal como se muestra en el siguiente recuadro: Manual de biotecnología | práctica 4 40 Se puede observar que el programa indica el porcentaje de identidad registrado entre las dos secuencias –en este caso de 93%–.de Hsp10 en el cuadro en blanco de la pantalla Blast y se pulsa la opción Begin Search (comenzar la búsqueda).org/>. el cual es una base de datos combinada de tres depositorios internacionales de secuencias de proteínas. se obtendrá el siguiente resultado: . Al entrar a la base de datos de UniProt y teclear el comando Hsp10 human en la casilla de búsqueda (QUERY). las sustituciones que han ocurrido en estas proteínas desde el tiempo de divergencia entre las dos especies. así que se puede conducir una búsqueda entre secuencias de proteínas utilizando el algoritmo blast. de manera similar a como se realizó con la secuencia del gen. incluyendo la secuencia de aminoácidos: Esta secuencia corresponde a la de 102 aminoácidos de Hsp10. la secuencia se copia en formato FASTA y se lleva a cabo una nueva búsqueda de su secuencia homóloga en diversos organismos. la búsqueda mediante blast produjo los alineamientos entre las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de diversas especies. Bases de datos y herramientas bioinformáticas | práctica 5 41 . saliendo primero los de mamífero. una vez recuperada. La base de datos de UniProt también cuenta con el recurso bioinformático del blast. Q6WSP6: Sesión de Bioinformática. El programa realiza búsquedas de similitud entre proteínas de todos los organismos que están en las bases de datos. se muestra el ejemplo del alineamiento de la secuencia de Hsp10 humana con la secuencia de Hsp10 de cerdo.La primera entrada corresponde a la proteína de humano. Al dar un “clic” en esa entrada se obtiene toda la información disponible sobre dicha proteina. En el siguiente ejemplo. ). Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences..Manual de biotecnología | práctica 4 42 En este ejemplo. Discutir el impacto de la bioinformática en la biología. y A. Inc. Discusión de resultados Puntos a discutir: a) b) c) d) Explicar cuál es el método de búsqueda del algoritmo blast. Academic Press. J. Methods in enzimology vol. Bioinformatics. J. Academic Press. Collado. Coulson (1990). R. b). (1990).). y A. R. Molecular Evolution: Computer Analysis of Proteinand Nucleic Acid Sequences. Doolittle (ed.Y. Fronteras de la biología en los inicios del siglo Xxi. Inc. Sequence and genome análisis. Methods in Enzimology vol. durante y después de los genomas”. Señalar cuál es el significado estadístico del valor de Expect en el programa bioinformático Blast. R. Bibliografía Burks. Doolittle (ed. Los alumnos presentarán un informe sobre el desarrollo de la sesión que incluya la discusión de los incisos a). D. R. (coord. 183. Second Edition. Academic Press. (2004). Módulo 1: Genómica. Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences. México. y d). “Significance of protein sequence similaritie”. (1990). por qué se deben filtrar las secuencias de baja complejidad. “La biología computacional antes. desde el punto de vista estadístico. Cold Spring Harbor Laboratory Press. et al. N. Collins. Doolittle (ed. proteómica y bioinformática. Mount. 183. el programa blast recuperó y alineó las secuencias de Hsp10 humana y Hsp10 de cerdo (Sus scrofa) que muestran una identidad de 100%. “GenBanK: Current status and future directions”. Medrano (2003). Inc. “Searching through sequence databases”. Methods in Enzimology vol.). Bolívar F. 183. c). Dolittle. C. El Colegio Nacional. Analizar.). . las catalasas y varias peroxidasas. tanto el peróxido de hidrógeno (H2O2) como el anión superóxido (O2-). como la superóxido dismutasa. modificar o agregar genes al dna de un organismo. En esta práctica se utilizarán dos cepas que han sido genéticamente manipuladas y su cepa parental. ya que llevan a la producción de más especies reactivas. por sus siglas en inglés). Para defenderse contra estas especies reactivas de oxígeno las células contienen enzimas antioxidantes.Práctica 6 Análisis de la actividad de catalasas 43 Introducción El oxígeno es una molécula altamente reactiva que se reduce parcialmente dando lugar a diversos agentes químicamente reactivos conocidos como especies reactivas de oxígeno (Ros. particularmente en presencia de iones metálicos. son incluidos también como ros. la ingeniería genética cambia el tipo o cantidad de proteínas que puede producir un organismo. Además de estas moléculas muy reactivas. radiación y recicladores redox presentes en el medio y por la exposición a metales pesados. El estrés oxidativo ocurre cuando la concentración de estos oxidantes se incrementa por encima de la capacidad amortiguadora antioxidante de la célula. incluyendo a los ácidos nucleicos. además de que también producen moléculas antioxidantes como el ascorbato. Dada la ubicuidad de las Ros no es sorprendente que todos los organismos hayan desarrollado medios para proteger a sus componentes celulares contra estos oxidantes altamente reactivos. También se forman por la exposición de las células a agentes ionizantes. Al modificar esta información. Estas formas de oxígeno son altamente dañinas para los componentes celulares. el tocoferol y el glutatión. con el fin de que mediante un experimento muy sencillo los estudiantes puedan apreciar la diferencia en la expresión genética entre una cepa silvestre y cepas genéticamente alteradas. con lo cual hace posible que éste elabore sustancias nuevas o desempeñe funciones distintas. Así. Las catalasas son un sistema de enzimas hemoproteicas cuyo papel es la detoxificación de los metabolitos de oxígeno generados en los diversos procesos celulares: 2 H2O2 O2 + 2 H2O La ingeniería genética es la técnica que se utiliza con el fin de cambiar alguna o algunas características del código genético. Estos cambios pueden consistir en retirar. los lípidos y las proteínas. Las Ros se pueden generar endógenamente en las células como consecuencia de los procesos metabólicos. . además de que comprendan y analicen tanto el poder como los alcances y limitaciones de la manipulación genética. todos los organismos aeróbicos están expuestos continuamente al ataque de agentes oxidantes a través de estos mecanismos. contiene cromosoma y 6 plásmidos CFNX186/katG (Derivada de la CFN42. Manual de biotecnología | práctica 6 44 Material y equipo Material Equipo Círculos de 3 cm de diámetro de papel filtro Vórtex Perlas de vidrio para romper 2 vasos de precipitados de 250 ml Centrífuga 1 pipeta de 5 ml Incubadora con agitación 1 pipeta de 10 ml Cronómetro 1 probeta de 1 00 ml Cámara de video 1 probeta de 1. cepa silvestre. mutante del pásmido p42f. La elaboración de los medios de cultivo está en el anexo. H2O2) * Material que deberán traer los alumnos a Reactivos para preparar medios de cultivo.000 ml Reactivos 2 tubos de cultivo de vidrio estériles a Tubos eppendorf de 1. mutante del plásmido p42f complementada para actividad de catalasa ++) CFNX186/katG (Derivada de la CFN42.5 ml a Tubos para centrífuga a Baño de hielo Agua destilada Pinza para papel filtro a Triptona Extracto de levadura NaCl KCl Na2HPO4 a KH2PO4 a NaOH a Ampicilina(50 mg/ml) a Hielo * Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada. Objetivo específico Determinar la actividad de catalasa en cepas bacterianas usando un ensayo de liberación de oxígeno. catalasa –) .Objetivo general Identificar cómo a través de la ingeniería genética se puede alterar la expresión genética de los organismos. Material biológico: cepas de Rhizobium etli CFN42. Harcourt. 5. Se observa durante cinco minutos. Incubar a 37 0C con agitación constante (250 rpm) durante 12 hrs. 3. Cada uno de los círculos mojados se toman con las pinzas por una orilla y se colocan en la solución de H2O2 depositándolos hasta al fondo del vaso. Centrifugar los cultivos tres minutos a 13. 6. J.000 g por cinco minutos y trasladar los sobrenadantes a un tubo nuevo. 4. y A. . 3. Alejandro García de los Santos del Centro de Ciencias Genómicas por permitirnos utilizar sus cepas. Centrifugar a 13. Tener lista la cámara y el cronómetro. catalasa. Bibliografía Díaz. añadir perlas de vidrio cubriendo hasta ¾ del líquido y romper 5 intervalos de 1 min por uno de reposo en el vórtex. (2003). 2. Herráez (2001). tener cuidado de marcar antes con lápiz cada uno de los círculos. Luque. Inocular las tres cepas (silvestre. REB 22 (2): 76-84. Biología molecular e ingeniería genética. discutir los siguientes puntos: ¿En qué vaso se formaron más burbujas? ¿En cuál vaso no se formaron? ¿Por qué? ¿Por qué se forman estas burbujas? ¿Las burbujas se generarían de la misma forma con otro reactivo? ¿Qué aplicaciones potenciales tiene una cepa con gran actividad de catalasa? Agradecimientos Se agradece al Dr. 7. En este momento preparar 400 ml de una solución al 1% de H202 en agua destilada y distribuir 200 ml en tres vasos de precipitados de vidrio. A. 5.Metodología 2. Empapar los círculos de papel filtro con el sobrenadante de cada cepa. 8. 45 Análisis de la actividad de Catalasas | práctica 6 1.y catalasa+) cada una por separado en tubos de cultivo que contengan 3 ml de PY con 10 ml de ampicilina 50 mg/ml. La estructura de las catalasas. Resultados 1. De acuerdo con los resultados.000 g. 4. Resuspender las pastillas en 200 µl de PBS. Manual de biotecnología | práctica 7 46 Práctica 7 Síntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnológicas 47 Introducción La celulosa es el polímero de mayor abundancia natural, conformado por una larga cadena lineal de moléculas de D-glucopiranosa enlazadas mediante los carbonos C1 y C4 (enlace ß14, ver figura). Estructura lineal de la celulosa. Diversas especies dentro de los géneros Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Sarcina, Zoogloea y Gluconacetobacter producen celulosa, siendo G. xylinum la bacteria que tiene la mayor capacidad de síntesis. Al estudiar la fermentación de vinagre se observó que se formaba una masa gelatinosa sobre la superficie del medio de cultivo a la que se denominó “madre del vinagre”. Análisis posteriores determinaron que la masa estaba compuesta por celulosa y que la bacteria Bacterium aceti era el organismo responsable de su producción. Posteriormente, la bacteria fue referida como Acetobacterium xylinum ó Bacterium xylinodes; el nombre derivó a Acetobacter xylinum y finalmente la denominación actual de esta bacteria es Gluconacetobacter xylinum. G. xylinum es un miembro de la familia Acetobactereaceae; es una bacteria Gram negativa con forma de bacilo cuyo tamaño varía entre 0.6 – 0.8 µm x 1.0 – 1.4 µm. Es un microorganismo aerobio estricto, con metabolismo respiratorio que oxida en forma incompleta azúcares y alcoholes —fermentación oxigénica—. Su hábitat natural son frutas y vegetales en proceso de descomposición. En cultivo estático, la bacteria secreta microfibrillas de celulosa, las cuales en el exterior se ensamblan formando una nata gruesa o “película”. Se ha propuesto que la celulosa permite a las células alcanzar la superficie del medio de cultivo, donde existe mayor disponibilidad de O2 para su crecimiento. Manual de biotecnología | práctica 7 48 La película de celulosa posee funciones de vital importancia para G. xylinum: aumenta su capacidad para colonizar sustratos, evita la desecación y protege a la bacteria contra la radiación ultravioleta. La celulosa producida por G. xylinum tiene alta pureza y una estructura similar a la de la celulosa vegetal. La estructura de la celulosa depende de las condiciones de cultivo: en condiciones de cultivo estático se genera una “película” en la interfase aire/líquido mientras que en cultivo agitado se forman gránulos irregulares, cadenas fibrosas o ramificadas de celulosa. El mecanismo de síntesis de celulosa bacteriana le confiere una pureza superior a la de la celulosa vegetal y posee características peculiares: alto grado de cristalización, alta resistencia a la presión, elasticidad y durabilidad, elevada absorción de agua y mayor área superficial que la que presenta la celulosa vegetal. Además, es inerte metabólicamente, no es tóxica ni provoca reacción alérgica al contacto, propiedades de particular importancia para fines biomédicos y cosméticos. G. xylinum no lleva a cabo glucólisis (carece de la enzima fosfofructocinasa-1), pero en cambio a partir de triosas fosfato realiza gluconeogénesis; la ruta de las pentosas fosfato y el ciclo de Krebs son las vías anfibólicas más activas en la bacteria. Mediante estas vías se produce la celulosa tanto a partir de la poza de hexosas fosfato (glucosa, fructosa, manosa) como por síntesis a través de la vía gluconeogénica. La síntesis de celulosa es un proceso costoso debido a los requerimientos de energía y fuente de carbono; sin embargo, la película permite a G. xylinum situarse cerca de la superficie del medio y obtener así un mayor acceso a los nutrientes y sobre todo al oxígeno, indispensable para la síntesis de Atp. Aplicaciones biotecnológicas La celulosa bacteriana (cb) generada por G. xylinum tiene cualidades únicas que no están presentes en la celulosa vegetal: es un producto de alta pureza que no posee lignina ni ningún otro material común en la celulosa de otras fuentes. La celulosa nativa exhibe un alto grado de hidrofilicidad, puede retener una cantidad de agua aproximada a 600 veces su peso seco, se ha demostrado que el 99% de la cb es agua. La Cb es permeable a gases, tiene una alta fuerza tensil y resistencia a la presión; es inerte metabólicamente y no tiene propiedades alergénicas; estas últimas características le permiten una variedad de aplicaciones en la industria cosmética, farmacéutica y biomédica (ver cuadro). Industria Aplicaciones Turística Ropa deportiva, equipo para acampar. Textil Material de alta absorción acuosa. Papel Restauración de documentos, papel de alta calidad. Alimentos Aditivo de alimentos, emulsificante, fibra dietética. Refinería Material para la absorción de aceites. Maquiladora Componente de partes y refacciones para autos, aviones, etc. Tecnología Diafragmas de alta sensibilidad en micrófonos y audífonos. Investigación Inmovilización de proteínas y células, resinas para cromatografía. Médica Fabricación de piel artificial en terapia de quemaduras. Componente en implantes dentales. Aplicaciones industriales de la celulosa de origen bacteriano. Dejar los matraces en reposo a temperatura ambiente durante una o dos semanas (es importante no mover estos matraces para evitar que la película de celulosa se hunda).Objetivo general Que el alumno obtenga celulosa de origen bacteriano de alta pureza. xylinum —cultivada por el profesor durante una semana anterior a la fecha de la práctica a una temperatura ~ 30°C. xylinum crece en la matriz de la película de celulosa en estas condiciones. Objetivos específicos • Demostrar las aplicaciones biotecnológicas industriales de los productos del metabolismo bacteriano. Que el alumno compare las ventajas y desventajas de la producción de la celulosa bacteriana vs la celulosa vegetal. Para hacer más fácil la inoculación de G. Material y equipo 49 Material Equipo 200 ml de medio BEGG Potenciómetro 1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Balanza analítica Pipeta serológica de 5 ml Horno (opcional) * Caja Petri (estéril) Campana de flujo laminar Pinza (estéril) * Recipiente para colocar la película de celulosa en NaOH Papel aluminio 1 bisturí (con navaja estéril) 50 ml de NaOH 0. cada equipo inoculará su respectivo matraz con un fragmento de celulosa. la película de celulosa formada en una caja de Petri vacía y una sola persona corte cinco fragmentos con el bisturí. con la ayuda de unas pinzas. Para inocular se utilizará un fragmento de la película de celulosa formada en el cultivo estático. ya que G. se sugiere que en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar o cerca del mechero) se coloque. xylinum. Síntesis de celulosa bacteriana de Gluconacetobacter xylinum para aplicaciones biotecnológicas | práctica 7 • .5 M * Algodón y gasas para elaborar un tapón *Material que deberán traer los alumnos. Metodología Inocular G. La película de celulosa se coloca en NaOH O. con base en este rendimiento. “Cellulose biosynthesis and function in bacteria”. Manual de biotecnología | práctica 7 50 Agradecimientos Se agradece al Dr. Sci. “Sources.J. “On acetic ferment which forms cellulose” J. Bibliografía Brown. Chapter 11. Chem. (1995). Iguchi (1989). posteriormente. (1886). Mater. J. Yamanaka.). and commercial applications of cellulose”. se obtiene la película de celulosa. P. A. De no contar con un horno se puede dejar en la sosa a temperatura ambiente por varios días. Mayer y M. “The structure and mechanical properties of sheets prepared from bacterial cellulose”. a 100 °C. S. Gilbert. Microbiol 55: 35-58. investigador del Instituto de Fisiología Celular de la unam por la donación de la cepa de Gluconacetobacter xylinum IFO 13693. J. Benziman (1991). Applications of bacterial cellulose in cellulosic polymers. Ross. cuál es el porcentaje de humedad que retiene la película de celulosa.5 M por 30 min. N. (ed. Yamanaka. Watanabe. Eur. S. 24: 3141-3145. 12: 514.Resultados Transcurrido el tiempo. Soc. y K. . El alumno reportará el rendimiento de celulosa tanto en peso húmedo como seco. Cincinnati. Watanabe (1994). y K. Determinar el peso húmedo y el pH final del medio de cultivo. se lava con abundante agua y se deja secar a temperatura ambiente para determinar su peso seco. R. José Edgardo Escamilla Marván. 49: 432-439. industrial derivatives. Kitamura y M. Englehardt.. R. Carbohydr. con el fin de blanquearla. OH. Hanser Publishers Inc. También debe reportar. el pH. La ramnosiltranferasa II (Rt 2). solo P. que incluyen la detoxificación de suelos contaminados con petróleo. como la limitación de nitrógeno. recuperación terciaria de petróleo. Los factores de virulencia son expresados de una manera coordinada a altas densidades celulares por un mecanismo llamado respuesta sensora de quórum (Qs). Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental que puede proliferar en diversos hábitats. incluyendo agua. codificada por el operón rhlAB. así como en la industria cosmética y farmacéutica. y la temperatura. aeruginosa tienen la capacidad de producir biosurfactantes llamados ramnolípidos. se les ha considerado como factores de virulencia y antimicrobianos y se les ha implicado en el establecimiento de la estructura y en la disgregación de las biopelículas. bajo condiciones de limitación de nitrógeno o de fosfatos. los ramnolípidos producidos por P.Práctica 8 Emulsificación de diesel. protección contra plagas. aeruginosa han sido estudiados para su aplicación en distintas áreas. suelo y plantas. el papel de RhlB es el de transferir una molécula de dTDP-L-ramnosaal dímero de HAAs. Los ramnolípidos están formados por una molécula hidrofóbica que generalmente es un dímero de ácido ß-hidroxidecanoico y una parte hidrofílica constituida por una (monorramnolípido) o dos (dirramnolípido). Esta bacteria secreta numerosos compuestos que se encuentran involucrados en el éxito de colonizar diferentes ambientes. aeruginosa no ha sido completamente establecida. que es usada en química fina y como materia prima para la síntesis de compuestos orgánicos. moléculas de ramnosa. La síntesis de ramnolípidos se lleva a cabo por la ramnosiltranferasa I (Rt 1). la eliminación de metales tóxicos de suelos. La función principal de los biosurfactantes es permitir a los microorganismos crecer en sustratos inmiscibles en agua a través de la reducción de la tensión superficial. Dentro del género Pseudomonas. Son también una fuente importante de L-ramnosa. La producción de ramnolípidos por P. 51 . aeruginosa depende de factores nutricionales y medioambientales. gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses Introducción Los ramnolípidos son moléculas tensoactivas que actúan como biosurfactantes. En particular. Aunque la función fisiológica de los ramnolípidos en P. fluorescens (viscocina) y P. toma una segunda molécula de dTDP-L-ramnosa. rhlA produce el dímero de ácidos grasos (HAAs). así como en la movilidad tipo “swarming” de esta bacteria. La biosíntesis de ramnolípidos ocurre durante la fase exponencial tardía y la fase estacionaria de crecimiento. 2. Inocular. Centrifugar a 4 000 rpm por diez minutos y guardar el sobrenadante (fuente de biosurfactantes) a 4 °C. Cubrir la mesa de trabajo con papel periódico antes de comenzar. Prueba de emulsificación. mientras que los que llevan las letras Sm corresponden a la cepa de Serratia marcenses y los que van etiquetados con . 1. 3 ml de aceite de maíz a c/u de los tres tubos y a un último se le colocan 3 ml de tritón. SmD. que será utilizado como blanco de reacción. y así los demás tubos).Objetivo Evaluar la emulsificación del diesel y del aceite de maíz por las cepas Pseudomonas aeruginosa. en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PPGAS. Poner 3 ml de diesel a c/u de los tres tubos de ensaye. una colonia fresca de la cepa Serratia marcenses. SmT.EcA y EcT. Al mismo tiempo. 3 ml de gasolina a c/u de los otros tres tubos. una colonia fresca de la cepa Pseudomonas aeruginosa y en otro matraz con el mismo medio inocular una colonia de Escherichia coli. e incubar a 30 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. EcG. inocular en otro matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio PG. Material y equipo Material Equipo 4 matraces Erlenmeyer de 125 ml Incubadora a 30 °C Tubos para centrífuga Manual de biotecnología | práctica 8 52 Incubadora a 37 °C 1 gradilla Centrífuga 12 tubos con tapa de 15 ml Vórtex Pipetas de 10 ml Reactivos * Papel periódico Medio PPGAS * Regla Medio PG Tritón X-100 *10 ml de gasolina *10 ml de diesel *10 ml de aceite de maíz *Material que deberán traer los alumnos Metodología Obtención de los biosurfactantes producidos por las cepas Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. 1. 3. 2. Los tubos deben etiquetarse de la siguiente manera: PaD (por P. Agregar 2 ml del sobrenadante de cada cepa a evaluar. aeruginosa Diesel. SmA. PaG. SmG. PaA. EcD. Esterilizar los paquetes celulares para desecharlos. e incubar ambos matraces a 37 °C con agitación de 200 rpm durante 24 horas. PaT. Transferir los cultivos crecidos a tubos para centrífuga. los que están marcados con Pa corresponden al sobrenadante de Pseudomonas aeruginosa. Serratia marcenses y Escherichia coli. las letras Ec corresponden al sobrenadante de Escherichia coli. el porcentaje de emulsificación es del 100%. 53 Emulsificación de diesel. en caso de que la nata formada sea de menor volumen y coexistan dos fases se deberá hacer una relación con una regla de proporciones. con base en la siguiente apreciación: si la nata blanca que se forma es de 5 ml y existe una sola fase. aeruginosa S.coli 3 ml - - - 2 ml - - PaG - 3 ml - - 2 ml - - PaA - - 3 ml - 2 ml - - PaT - - - 3 ml 2 ml - - SmD 3 ml - - - - 2 ml - SmG - 3 ml - - - 2 ml - SmA - - 3 ml - - 2 ml - SmT - - - 3 ml - 2 ml - EcD 3 ml - - - - - 2 ml EcG - 3 ml - - - - 2 ml EcA - - 3 ml - - - 2 ml EcT - - - 3 ml - - 2 ml 3.marcenses Sobrenadante E. Resultados Cada equipo deberá determinar los mililitros de nata que se forman en cada tubo y obtener el porcentaje de emulsificación. hasta que se forme una nata blanca que es el indicador de emulsificación. marcenses E. coli En el pizarrón se anotarán los resultados de todos los equipos y con éstos se obtendrá el promedio y la desviación estándar de cada muestra. gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses | práctica 8 PaD Diesel . Anotar el porcentaje (%) de emulsificación en la siguiente tabla: Diesel Gasolina Aceite de maíz Tritón X-100 P. de acuerdo con la siguiente tabla: Gasolina Aceite de maíz Tritón Sobrenadante P. aeruginosa Sobrenadante S. Agitar en el vórtex cada tubo a velocidad máxima durante dos minutos y dejar reposar 30 minutos. G. C. S.M. Bacteriol. Appl. Soberón-Chávez (2003).H. Juárez. Brown y B. y G.R. 54:625-633. Juárez y G. Appl. Lépine y E. Microbiol. “Production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa”. Soberón-Chávez (2000). . Soberón-Chávez (2003). “Mechanism of Pseudomonas aeruginosa RhlR transcriptional regulation of the rhlAB promoter”. Appl. Valderrama y G. Gillis. B. Marx. G. “The Pseudomonas aeruginosa rhlAB operon is not expressed during the logarithmic phase of growth even in the presence of its activator RhlR and the autoinducer N-butyryl-homoserinelactone”. K. Iglewski (2001). Biotechnol.. Biotechnol. Maier. Microbiol. Environ. Soberón-Chávez. J.. K. Medina. “Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications”. Microbiol.Bibliografía Manual de biotecnología | práctica 8 54 De Kievit. J. “Quorum-sensing genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms: their role and their expression patterns”. T. 67: 1865-1873. Bacteriol 185: 59765983. F. Déziel (2005).. 185: 377-380.. R. Medina. G. R. 68:718-725. incluyendo los aminoácidos aromáticos. proporcionan a la planta características químicas útiles para su sobrevivencia. por mencionar los principales y más comunes. y como principios activos que pueden presentar alguna actividad biológica para un gran número de organismos. por su abundancia o ausencia. El ácido shikímico.. de manera paralela. Las vías están interrelacionadas con el metabolismo primario. los ácidos cinámicos y ciertos polifenoles. se originan también otro tipo de compuestos que de acuerdo con sus características particulares y específicas se denominan compuestos o metabolitos secundarios. Existen tres precursores principales: 1. ácidos nucleicos. etc. Estos compuestos pueden o no encontrarse en un determinado vegetal. Glucósidos: se determinan mediante la prueba de Mölish. proteínas. su clasificación botánica y su aprovechamiento por parte del hombre. aún de diferentes reinos. flavonoides. carbohidratos. 2. antibióticos macrocíclicos. Se identifica cualitativamente la presencia o ausencia de cada uno de los grupos según el cambio de coloración o la precipitación: • • • • Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. las prostaglandinas.Práctica 9 Metabolismo secundario Introducción A medida que en las plantas se generan los compuestos primarios como son los aminoácidos. glucósidos. fenoles. 3. Entre los numerosos grupos de metabolitos secundarios producidos por una planta se encuentran los alcaloides. precursor de los poliacetilenos. a través de las mismas o similares vías de biosíntesis. Los aminoácidos que dan origen a los alcaloides y a los antibióticos peptídicos incluyendo las penicilinas y las cefalosporinas. éste provee un cierto número de pequeñas moléculas que son empleadas como precursores de todas las vías metabólicas secundarias importantes. Las pruebas específicas para la determinación de grupos de metabolitos secundarios se llevan a cabo con un extracto de planta y a través de las técnicas colorimétricas y de precipitación reportadas por Domínguez. 55 . lípidos. Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff. ácidos carboxílicos. polifenoles e isoprenoides. El acetato. terpenos. precursor de muchos compuestos aromáticos. Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. cultivada en LB entre 8-24 horas previo a la práctica *a Extracto de planta . a través de pruebas químicas preliminares la presencia de grupos de metabolitos secundarios en el extracto hexánico de hoja de planta. Material y equipo Material Equipo * 2 frascos Gerber * Alcohol de curación (para elaborar el extracto) 56 3 goteros Vórtex Manual de biotecnología | práctica 9 Parte I 1 espátula Propipeta 1 vaso de precipitados de 500 ml 4 pipetas serológicas de 5 ml Cloroformo 5 tubos de ensaye Ácido clorhídrico Espátula Draguendorff 1 vaso de precipitados de 500 ml para el baño de agua – hielo Ácido sulfúrico Metanol Mölish Liebermann-Burchard Viruta de Mg Material biológico *a Extracto de planta *Material que deberán traer los alumnos Parte II Material Equipo * 3 cajas de Petri Mechero Perlas estériles para espatular Campana de flujo laminar Sensi-discos o papel filtro (1 cm diámetro) Incubadora a 37 oC Pinzas Reactivos * Regla o Vernier Agar nutritivo Violeta de genciana Hexano Material biológico Cepa de Escherichia coli GM2163. Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli.Objetivos • • Que el alumno determine. La prueba se considera positiva si se observa un precipitado de color naranja-marrón. procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye). Flavonoides.Preparación del extracto: Una semana antes de llevar a cabo la práctica. tapar y dejar macerar. tapar y llevar ambos frascos a la clase. que se impregnará con 20 ml de violeta de genciana. se considera la prueba positiva si se observa un color violeta. 0. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (2–4 mm) y dos gotas de ácido clorhídrico concentrado. Parte II. hasta aproximadamente ¼ de volumen de un frasco de Gerber limpio y cubrir hasta la mitad del frasco con etanol al 70%. en la primera se determinarán los grupos de metabolitos secundarios del extracto de la planta y en la segunda parte se determinará la actividad biológica del extracto mediante un ensayo biológico con bacterias. Dejar destapado para evaporar el etanol. Preparar agar nutritivo: Pesar 2. Glucósidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol. A la fase inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolución y esterilizar en autoclave a 121 0C a 15 lb de presión por 15 minutos. tomar ~ 10 ml del extracto líquido y transferir a otro frasco Gerber limpio. Tubo 4. a Metodología Esta práctica se lleva a cabo en dos partes. si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. 3. colocar clavo entero (especia).0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua purificada. Metabolismo secundario | práctica 9 57 . Al mililitro de extracto se le añade una gota de ácido clorhídrico concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. Determinación de la actividad biológica de un extracto de planta 1. se le agregan dos gotas de Mölish. 4. de acuerdo al viraje o precipitado según la prueba. Se considera positiva la prueba si se observa un cambio de coloración al azul-verdoso o rojo-naranja. Control. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja. si se observa un cambio de coloración hacia el verde o naranja la prueba se considerará positiva. Tubo 2. después. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado. Tubo 3. 40. Realizar el ensayo por triplicado. Distribuir. Tubo 5. Determinación de los grupos de metabolitos secundarios 1. Parte I. Se coloca el tubo en un baño agua–hielo y se añade 1 ml de H2SO4 concentrado dejando que éste se deslice por las paredes del tubo de ensaye formando así una interfase.2 ml de cultivo líquido de Escherichia coli GM2163. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo: Tubo 1. para que se evapore el solvente. 3. Alcaloides. 5. 2. Una vez reducido el volumen. Se toma lectura de la coloración del anillo formado en la interfase. El día anterior a que se lleve a cabo la práctica. Dejar enfriar a 45 – 50 0C. Se prepara una solución madre del extracto y se toma 1 ml colocándolo en un tubo de ensaye. 2. Terpenos. 60 y 80 ml) y uno más que será el control positivo. con perlas estériles. Sólo se agrega 1ml del extracto. se agita un minuto y se deja reposar. Vaciar ~25 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del frasco 1 (20. o bien bactericida. Distribución de los discos Manual de biotecnología | práctica 9 58 7. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriostática. elaborar una tabla como la indicada abajo. (++).6. 9. asumiendo que esto se debe a la inhibición parcial del crecimiento bacteriano. 8. completar la tabla siguiente y asignar valores (+). observado como un halo transparente. Incubar las cajas por 24 horas a 37 °C. en donde se especifique el diámetro de los halos. (+++) y (++++) según la intensidad de la reacción y (-) para aquéllas en las que no se observa reacción. con una densidad celular menor que la presentada en el resto de la caja. coli. Grupo químico Intensidad Terpenos Alcaloides Glucósidos Flavonoides Para el ensayo con E. esto es. presencia de un halo de inhibición alrededor de los filtros. separándolos de manera que se alejen lo más posible entre ellos y del borde de la caja (ver figura). inhibición total de crecimiento bacteriano alrededor del disco. Medir con una regla o Vernier el diámetro de los halos Resultados Para las pruebas colorimétricas y de precipitación. Distribuir los cinco discos por caja. Caja 1 2 3 4 5 20µl 40 µl 60 µl 80 µl . indicando con un asterisco (*) los que tuvieron actividad bactericida. (1988). (2004). L. analizar los valores asignados (+) según la intensidad de la reacción y determinar la abundancia de los grupos de metabolitos secundarios. L. Elsevier. al observar la media del diámetro de los halos de inhibición. (2008). Domínguez.Diámetro del halo (mm) Graficar el promedio de los halos por la cantidad de extracto en una gráfica de línea: 40 60 80 extracto (µl) Discusión 1. analizar si la actividad biológica (bacteriostática o bactericida) depende de la cantidad de extracto. coli. Food drying science and technology: microbiology. Y. De acuerdo con los resultados obtenidos en las pruebas colorimétricas y de precipitación. Métodos de investigación fotoquímica. 2. Ecología química. J. México. unam/ Plaza y Valdés. Limusa. Para el bioensayo con E. T. México. Bibliografía Anaya. analizar en la tabla si presenta o no halo de inhibición en cada una de las concentraciones y de qué tipo principalmente (bacteriostático o bactericida). Secondary metabolism in model systems. 3. A. Amsterdam. Romeo. X. H. Instituto de Ecología. Hui. (2003). 59 Metabolismo secundario | práctica 9 20 . chemistry applications. En la gráfica. A. Lancaster Pennsylvania. . las lacasas han sido más estudiadas ya que son enzimas robustas y con un amplio rango de sustratos. herbicidas. Entre los sistemas más interesantes para la biorremediación se encuentran los hongos ligninolíticos. entre otros. Algunas de estas degradaciones o cambios ocurren usualmente en la naturaleza —entonces se denomina “atenuación natural”— sin embargo. Las lacasas pertenecen al grupo de las fenol oxidasas y contienen cuatro átomos de cobre en su sitio activo que son los que llevan a cabo las reacciones de óxido reducción. Objetivo general Determinar la actividad enzimática de lacasas y relacionarla con su función como agentes de biorremediación. En esta práctica se harán ensayos destinados a demostrar la importancia de las lacasas en la capacidad de crecimiento de diversos hongos ligninolíticos. gasolinas y metales pesados. 61 . petróleo y sus hidrocarburos derivados. Una gran variedad de contaminantes pueden ser eliminados por biorremediación: pesticidas. la velocidad de tales cambios es baja. los sistemas biológicos pueden ser optimizados para aumentar la velocidad de cambio o degradación para que puedan ser usados en sitios con una elevada concentración de contaminantes. Mediante una adecuada manipulación. Determinar la actividad de lacasa de los hongos crecidos en el inciso anterior. Entre estas enzimas.Práctica 10 Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas Introducción La biorremediación es el proceso que se ocupa de la utilización de sistemas biológicos para degradar compuestos tóxicos. así como su determinación por métodos colorimétricos. Objetivos específicos • • Determinar el crecimiento de diversas cepas de hongos ligninolíticos en presencia de petróleo. aguas y aire. o bien aislando la sustancia tóxica. generando compuestos de menor o ningún impacto ambiental. Estos organismos degradan la madera a través de un conjunto de enzimas oxidasas poco específicas que pueden usar como sustrato un sinnúmero de compuestos xenobióticos. contaminantes y sustancias de importancia ambiental (denominados genéricamente compuestos xenobióticos) en suelos. . Monitoreo de la actividad de lacasas en hongos tolerantes a petróleo Material y equipo Material Reactivos 1 mechero Petróleo crudo Maya 2 vasos de precipitados de 1.2’-azinobis 3 etilbenzotiazolina-6-ácido mente esterilizado) (de café Oro) sulfónico) * Papel aluminio Manual de biotecnología | práctica 10 62 Carbonato de calcio * Jugo V8 Equipo Autoclave Incubadora Cámara fotográfica Balanza *Material que deberán traer los alumnos Material biológico Cepa de hongo resistente a petróleo Cepa de hongo no resistente a petróleo Metodología Preparación del medio V8 + petróleo crudo Maya y crecimiento de hongos 1.Parte I. para una concentración final de 200 000 partes por millón (ppm). se vacía en el frasco de vidrio de boca ancha y se agrega 20 g de petróleo crudo Maya.25% p/v). Esterilizar ambos matraces durante 15-20 min a una temperatura de 120 °C y 1 atm de presión. 3.0 g Agar 20 g Composición del medio V8 2. Aforar a 1. A uno de ellos se le agrega lecitina de soya (0. En un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final Jugo V8 180 ml CaCo3 2.000 ml Lecitina de soya Bisturí KCl * 24 cajas Petri de 45 mm de diámetro Agar * Frasco de vidrio de boca ancha de 500 ml (previa.000 ml MgSO4•7H2O 3 matraces Erlenmeyer de 1.000 ml y dividir en dos matraces con 500 ml c/u.ABTS (2.000 ml K2HPO4 1 probeta de 1. Al salir de la autoclave y mientras sigue caliente el medio que contiene lecitina de soya. Agitar vigorosamente hasta alcanzar un mezclado homogéneo. . Actividad enzimática Los hongos cuentan con diversas enzimas extracelulares que les permiten degradar ciertos compuestos. Material y equipo 1. que están involucradas en la transformación de una amplia variedad de compuestos fenólicos. Preparación del medio mineral 20X + ABTS [1mM] modificado de Olsson. 6. mientras que el crecimiento de la cepa no tolerante se notará afectado. Los hongos se dejan crecer 30 días a temperatura ambiente y se observa el resultado. 2001. inoculando por triplicado en las cajas V8 con y sin petróleo bajo condiciones de esterilidad. Resultados Anotar las observaciones. preparar: Reactivo Por litro de volumen final Stock medio mineral 20X 50 ml ABTS [1mM] 0. Nota: Para llevar a cabo la segunda parte se utilizarán los hongos tolerantes y no tolerantes cultivados en medio V8 de esta primera parte de la práctica. 5. en donde un sustrato es oxidado (cambiará el color del sustrato como indicador) en presencia de la enzima lacasa. Los micelios de los dos tipos de hongos se siembran tomando un fragmento de 4×4 mm de la caja original.5487 g Agar 20 g 63 Degradación de compuestos xenobióticos a través de actividades enzimáticas | práctica 10 La cepa del hongo tolerante a petróleo deberá crecer de manera similar a la condición control. ¿Qué efectos tendrá el petróleo en los organismos vivos? Parte II.4. teniendo en cuenta los siguientes puntos: 1. Composición del medio mineral 20X (stock 1 L): Reactivo Por litro de volumen final K2HPO4 2g MgSO4·7H2O 2g KCl 2g En un vaso de precipitados. entre estas enzimas se encuentran las lacasas. Se vacían ~ 10 ml de medio con petróleo en cada caja Petri (45 mm de diámetro) y lo mismo del medio sin petróleo. Con base en esto se pretende probar la capacidad ligninolítica de estos hongos a través de un ensayo colorimétrico. ¿Qué mecanismos son los responsables de comportamientos diferentes en los hongos bajo estas condiciones? 2. Journal of environmental science and health. Trends Biotechnol 11: 44-49. se inoculan en el medio mineral 20X + ABTS [1mM]. De Jong..A. Margesin. a una temperatura de 120 oC y 1 atm de presión.occurrence and properties”. G. FEMS Microbiol 30: 215-242. Vaciar 10 ml de medio en cada caja Petri (45 mm de diámetro). Toxic/hazardous substances & environmental engineering 40: 2189-2201. J. A. responder: 1. y J. Zimmerbauer y F. mientras que la cepa no tolerante no tendrá reacción alguna.. Field. cubriendo las cajas con papel aluminio. 3. . Part A. Se toman micelios de los hongos ya crecidos en las cajas con medio V8 y se cortan en cuadros de 1 cm2. en ausencia de luz. Chemosphere 40: 339-346. Feijoo-Costa. R. Olvera-Barrera y L. Rojas-Avelizapa. De acuerdo con lo observado. E.A. Colocar a 4 oC en oscuridad (envolver con papel aluminio). “Fungal laccases . Resultados El ABTS oxidado por la lacasa se vuelve visible cuando el medio cambia la coloración a verde o azul oscuro. ¿Por qué cambia de color el ABTS en presencia de la lacasa? Bibliografía Baldrian P. (2006). Schinner (2000). “Monitoring of bioremediation by soil biological activities”. “Feasibility study of bioremediation of a drilling-waste-polluted soil: Stimulation of microbial activities and hydrocarbon removal”. De Bont (1993). El ensayo se lleva a cabo por triplicado. N. por lo que la cepa del hongo tolerante a petróleo deberá hidrolizar al ABTS. 2.M. Fernández-Linares (2005). Manual de biotecnología | práctica 10 64 Aforar a 1 litro con agua destilada. ¿Qué relación tiene el ABTS con el petróleo? 2. la abundancia del hongo no es relevante.Nota: Este medio es sólo para la determinación de actividad. Transferir a un matraz Erlenmeyer y esterilizar durante 15–20 min. “Screening for ligninolytic fungi applicable to the biodegradation of xenobiotics”. Se incuban durante una semana a 28 oC.. E. Solo excepcionalmente es posible reproducir a una especie por las dos rutas. pero los mejores resultados en los cultivos de tejidos vegetales se obtienen cuando se emplean como explantes tejidos de plantas que han sido germinadas in vitro en condiciones estériles.Cultivo de tejidos vegetales Se conoce como cultivo de células vegetales a una serie de técnicas encaminadas a conseguir la reproducción de células. o incluso porque es la única que produce plantas completas y fértiles. una de estas técnicas de propagación in vitro es la elegida porque es más eficiente que la otra. Mediante el empleo de estas estrategias se puede reproducir una gran cantidad de plantas completas. . Primero tallo y hojas y después raíces. La reproducción de plantas in vitro puede darse por dos rutas: organogénesis y embrio génesis somática. tejidos u órganos de una planta bajo condiciones controladas y asépticas. ya que las primeras cuentan con una o varias cubiertas que protegen a las células meristemáticas del efecto de los agentes antisépticos. en poco tiempo y espacio. llamadas embriones bipolares (porque tiene la capacidad de dar origen a raíces y tallos). Esto ocurre porque los tratamientos de desinfección pueden ser más severos en semillas que en órganos de las plantas. La embriogénesis somática involucra la formación de pequeñas semillas. que pueden germinar y formar plantas completas. por lo general. tallos o raíces de plantas crecidas en suelo. En la organogénesis las plantas se reproducen por formación secuencial de órganos vegetales. a partir de pequeñas porciones de una sola planta. Pueden iniciarse cultivos a partir de hojas. Manual de biotecnología | práctica 11 66 . La eliminación biológica de contaminantes ambientales se lleva a cabo generalmente por organismos que han logrado adaptarse a las condiciones particulares del sitio a tratar. sedimentos. Esta planta se encuentra como especie dominante en zonas perturbadas o con una alta concentración de cromo -el cromo hexavalente es un agente mutagénico y altamente cancerígeno que tiene efectos adversos para la salud humana y animal. pionera. Los contaminantes elementales. transformar o contener sustancias contaminantes localizadas en suelos. que tiene propiedades alelopáticas.) Kuhn es un helecho silvestre ampliamente distribuido en todo el mundo. la meta de la fitorremediación es la mineralización de las sustancias hasta componentes no tóxicos (fitodegradación o fitotransformación).Práctica 11 Fitorremediación con helechos Introducción La polución de ambientes naturales con metales pesados es un problema muy complejo que ha llevado a la búsqueda de estrategias menos costosas y más efectivas que las utilizadas hasta ahora para su control. Las plantas son el grupo biológico con las más altas capacidades biosintéticas de la tierra. lo cual sugiere su gran potencial como especie útil para la fitorremediación de suelos contaminados. 67 . La eliminación biológica de contaminantes de los ambientes naturales es sin lugar a duda la mejor alternativa disponible. Uno de los grupos biológicos más resistentes a la presencia de contaminantes elementales son los helechos. cianuros y los isótopos radioactivos son más difíciles de tratar. Pteridium aquilinum (L. acuíferos. por lo cual pueden transformar y mineralizar una amplia variedad de complejos orgánicos. pero los contaminantes inorgánicos como los metales pesados. cuerpos de agua superficiales e incluso en la atmósfera. agrícolas y pesticidas son generalmente susceptibles a ser degradados por microorganismos. aguas residuales. son esencialmente inmutables a la acción enzimática. nitratos. Los contaminantes orgánicos como el petróleo. Es una especie heliófila. antibacterianas y cancerígenas. Las plantas silvestres que crecen en sitios contaminados con metales pesados pueden ser una fuente muy importante de posibilidades para la biorremediación. Las plantas sin embargo pueden secuestrarlos y almacenarlos en sus tejidos (fitoextracción y fitoacumulación). La fitorremediación es una tecnología emergente que utiliza a plantas y a los microorganismos asociados a la rizósfera para remover. que incluyen metales tóxicos y radio nucleótidos. Una posibilidad muy promisoria de biorremediación para elementos tóxicos se encuentra en el empleo de especies vegetales para remover contaminantes de los ecosistemas. En el caso de los contaminantes orgánicos. fungicidas. Material y equipo Material Equipo Vórtex Autoclave Micropipeta de 1. Se ajustará el pH del medio a 5. Probar el efecto del cromo sobre el desarrollo de esporofitos.Objetivo general Determinar la tolerancia a cromo VI de los gametofitos de Pteridium aquilinum.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 .22 µm estériles Reactivos * 1 paquete de cajas Petri de 10 cm de diámetro esMedio MS tériles * 1 espátula delgada Sacarosa * 10 frascos Gerber grandes Agar * Papel aluminio Dicromato de potasio * 2 pinzas largas estériles Alcohol etílico * Un frasco de vidrio con algodón * Cloro * Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack * Material que deberán traer los alumnos. Objetivos específicos 1. Manual de biotecnología | práctica 11 68 Probar el efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinación de esporas de Pteridium aquilinum. 3.000 µl Microcentrífuga Mechero Potenciómetro 10 tapas para frascos Gerber Balanza analítica Puntas para micropipetas de 1.000 µL estériles Campana de flujo laminar Microtubos de 2 ml estériles Incubadora de vegetales Papel filtro estéril Microscopio estereoscópico Embudo de cristal estéril Cámara digital 6 filtros Millipore con membrana de 0. Determinar cuál es el efecto del cromo VI sobre el desarrollo de gametofitos y su maduración. 2. Material biológico Esporas de Pteridium aquilinum Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando un medio de cultivo ms (Murashige y Skoog) modificado —se emplea solo la mitad de la concentración de macronutrientes— (ver anexo). Germinación de esporas in vitro 1. Para determinar el porcentaje de germinación de las esporas y el desarrollo protálico. los gametofitos se riegan con 1 ml de agua destilada cada semana hasta la aparición de los esporofitos La respuesta se evaluará a los 7. Se colocan 90 mg de esporas en un microtubo de 2 ml que contiene 1. El papel filtro se coloca en una caja de Petri estéril. 14 y 21 días después de la siembra. Se centrifuga el tubo en microcentrífuga durante un minuto a 14 000 rpm. A partir de este punto el procedimiento se realiza en condiciones estériles. El medio de cultivo se deja enfriar. 50. los gametofitos se transplantan a frascos Gerber con el mismo medio utilizado en la germinación. Inducción de formación de esporofitos 11. 7. 2. 14. Nota: Antes de centrifugar debe tenerse listo un tubo con 1. bajo lámparas fluorescentes. 25. Los bordes de las cajas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos. Después de 21 días de sembradas las esporas.22 µm (cada equipo probará uno de los tratamientos).5 ml de agua para equilibrar la centrífuga. A los 56 días después de la siembra se determina en cuáles de los tratamientos se desarrollaron esporofitos. 10. Las esporas se resuspenden en 10 ml de agua destilada. 5. Nota: Es importante que la solución de hipoclorito de sodio se prepare en el momento en que va a usarse y que las esporas no permanezcan en la solución un tiempo mayor al indicado. se observan los cultivos en un microscopio estereoscópico (a 320 aumentos) y se toman cuatro fotografías de diferentes campos (de cada caja Petri). Se considera que una espora ha germinado cuando aparece la célula rizoidal (ver figura).minutos a 120 0C. 9. Se vierte el sobrenadante con las esporas suspendidas. aquilinum. en cajas de Petri de 10 cm de diámetro con 25 ml de medio de cultivo semisólido.5 ml de una solución de hipoclorito de sodio al 0. 6. 100. 4. Cuando llegue a 55 o 60 0C se agregarán diferentes concentraciones de dicromato de potasio (0. en foto-periodo de 16 horas luz 8 oscuridad. 150. a los 7. Las esporas que se encuentran adheridas al papel filtro se enjuagan tres veces con 5 ml de agua destilada estéril. 200 µm) esterilizado por filtración con membranas Millipore de 0. 21 y 56 días después de la siembra. por el porcentaje de germinación de las esporas y la capacidad de desarrollar gametofitos y esporofitos. Las cajas se mantendrán en una cámara de incubación a 25 ºC.3%. 69 Fitorremediación con helechos | práctica 11 3. El tubo se agita vigorosamente durante dos minutos en un agitador Vórtex. . en un papel filtro estéril colocado en un embudo de vidrio. Se inoculan 250 µl de suspensión de esporas de P. 8. Gametofitos dioicos con dimorfismo sexual marcado: masculinos (♂). la célula media y la célula opercular (h). pequeños con alas poco desarrolladas. . ri= rizoide. mostrando la célula basal. 17 días (i). cu= cuello. co= célula opercular. cr= célula rizoidal. dos a cinco días (b). me= meristemo.Manual de biotecnología | práctica 11 70 Espora trilete (a). 21 días (k). Filamentos cortos de cuatro a seis células. Gametofito monoico. Gametofito espatulado. Gametofito femenino con los arquegonios cerca de la muesca. con simetría bilateral y meristemo apical. entre los rizoides. Gametofito cordiforme. cm= célula media. desnudo. femeninos (♀) de talla mayor con alas amplias (l). mu= muesca. cb= célula basal. Cuello del arquegonio con cuatro células (j). an= anteridio. fi= filamento. Germinación tipo Vittaria. Acercamiento de los anteridios (g). es= espora. 11 días (e). 13 días (f). ar= arquegonio. Gametofito masculino con anteridios en la superficie ventral de la lámina. seis días (c). ocho días (d). Morfología del anteridio. aquilinum por tratamiento *(Cromo VI 25 µM) Tratamiento * Porcentaje (14 días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Caja 5 Promedio Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Tratamiento * Porcentaje (21 días) Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro * Cada equipo reporta sólo sus resultados Caja 4 Fitorremediación con helechos | práctica 11 71 . aquilinum Tratamiento * Porcentaje de germinación (siete días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Control Cromo VI 25 μM Cromo VI 50 μM Cromo VI 100 μM Cromo VI 150 μM Cromo VI 200 μM Tratamiento * Porcentaje de germinación (14 días) Caja 1 Caja 2 Caja 3 Caja 4 Caja 5 Promedio Control Cromo VI 25 μM Cromo VI 50 μM Cromo VI 100 μM Cromo VI 150 μM Cromo VI 200 μM Tabla 2. Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre la germinación de esporas de P. Evaluación del desarrollo protálico de los gametofitos de P.Resultados Tabla 1. Cervantes. Air.)”. E. J. Henderson y J. .Y. Campos-García. y M. Schmidt. 5. ¿Cuál es la fase haploide y cuál la diploide en el ciclo de vida de los helechos? 7. Trends in Analytical Chemistry 25: 1006-1015. Etapa Porcentaje (14 días) 0 µM 25 µM 50 µM 100 µM 150 µM 200 µM 0 µM 25 µM Porcentaje (21 días) 50 µM 100 µM 150 µM 200 µM Gametofito filamentoso Gametofito laminar Gametofito maduro Etapa Gametofito filamentoso Gametofito laminar Manual de biotecnología | práctica 11 72 Gametofito maduro Discusión Temas que se sugieren para el análisis: 1. Water. S. I. F. ¿Pteridium aquilinum es una especie prometedora para la fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados? 6.. He. M. K. “Chromium determination and speciation since 2000”. “Interactions of chromium with microorganisms and plants”. Devars.Tabla 3. Gutiérrez-Corona y H. “Phytoremediation technology: Hyper-accumulation metals in plants”. P. C. T. J. ¿Cuál es la ventaja de la fitorremediación sobre otros métodos de limpieza de sitios contaminados? 2. P. (Sci B) 9:210-220. Callao (2006). Anderson.I. (2007). Efecto de diferentes concentraciones de cromo VI sobre el desarrollo protálico de los gametofitos de P.. Baladi. Londo y A.P. Soil Pollut 184:105-126. ¿Cuáles son las condiciones más importantes que pueden influir en el proceso de germinación de las esporas? 3. Gomez V. Loza-Tavera (2001).K. FEMS Microbiology Reviews 25: 335 – 347. Critical Review in Plant Science 24:109-122. y L. Lewandowski.. S. U. “Phytorremediation-An overview”. 89: 68-89. Faaij (2006).. P. Coats (2005). Padmavathiamma. Lone.J. Li. Yang (2008). ¿Cuál es la condición indispensable para que los anterozoides realicen la fecundación de las oosferas? 4. “The economic value of the phytoremediation function-assessed by the example of cadmium remediation by willow (Salix spp. M. Comparar los resultados obtenidos y los reportados en la literatura con otras especies vegetales. Zhejiang Univ. Z. “Phytoremediation of heavy metal polluted soils and water: Progresses and perspectives”. aquilinum. Stoffella y X. Agricultural Systems. ¿Cuál es la ventaja que puede tener hacer selección de organismos haploides en un sistema de mejoramiento genético de esta especie? Bibliografía Arthur. Rice. El desarrollo de un embrión tanto in vivo como in vitro está codificado por los mismos genes. Durante la etapa de desarrollo. 73 Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria | práctica 12 Introducción . germinaban y producían plantas completas. Esta posibilidad tecnológica se descubrió precisamente en esta especie. Ellos llamaron a estos propágulos embriones somáticos. o bien. Steward. con una forma de desarrollo similar a la que presentan los embriones cigóticos. conocida como inducción. también hay semillas sintéticas que emplean otros propágulos: brotes (tallos con algunas hojas) o raíces. Sometidas a los estímulos adecuados. Como los requerimientos de cultivo de estas tres etapas son distintos. b) se dividen para formar directamente embriones. las células meristemáticas suelen dar dos tipos de respuestas: a) se multiplican y generan una masa desorganizada de células que recibe el nombre de callo embriogénico (porque tiene capacidad potencial de generar embriones). observaron que las células de zanahoria crecidas en un cultivo de callos en suspensión. donde se estimula a los cúmulos de células potencialmente embriogénicos para que experimenten un proceso completo de desarrollo y formen embriones. El principal modelo de estudio de la embriogénesis somática es la zanahoria. la producción de embriones somáticos se divide en tres etapas: En la primera. en 1958 y Reinert en 1959. La obtención de un embrión maduro. En ocasiones se somete a los embriones a un proceso de maduración. se ocupan en las diferentes etapas. del desarrollo y la maduración de los embriones. Generalmente. medios de cultivo diferentes. las plantas se generan directamente por germinación de embriones sin madurar. Pero la mayor parte de las veces. tenían la capacidad de formar unidades estructurales discretas. se induce el desarrollo de un tejido embriogénico. La embriogénesis somática es un proceso complejo regulado por tres programas genéticos que se prenden de forma secuenciada y son los responsables de la formación de tejido competente para la embriogénesis. La maduración de los embriones mejora la eficiencia de germinación y es muy conveniente cuando los embriones no están destinados a producir de inmediato plantas completas. el callo embriogénico se transplanta a un nuevo medio de cultivo. Si estos embriones se ponían en condiciones adecuadas. los cuales pueden generar después de uno o varios pasos de cultivo in vitro plantas completas. fértil y bien desarrollado depende de que estos programas se enciendan en el momento adecuado. Cuando se obtiene callo embriogénico es necesario estimular el desarrollo de los embriones. Durante este proceso se almacenan en los cotiledones sustancias de reserva y el embrión pierde paulatinamente humedad.Práctica 12 Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Durante la embriogénesis somática las células en cultivo experimentan un proceso de desarrollo similar al que ocurre en las plantas cuando se forman las semillas. Objetivo general Obtener embriones somáticos de zanahoria.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.4-D sobre la inducción de callo embriogénico de zanahoria. Material y equipo Material Equipo 1 espátula estéril Autoclave 30 tapas para frascos Gerber Potenciómetro Pinzas largas estériles Balanza analítica 2 mecheros Incubadora de vegetales 2 mallas de acero inoxidable estériles Campana de flujo laminar *1 paquete de cajas Petri estériles *12 frascos Gerber grandes de boca ancha (125 ml) Reactivos *Mango para bisturí del no. . al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados. Probar el efecto de diferentes concentraciones de 2. 21 o 22 Agar *Papel aluminio Sacarosa *Una caja de cartón L-glutamina *Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack Cloro al 30% HCl 1N Material biológico KOH 1N Semillas de zanahoria *Material que deberán traer los alumnos Metodología Los experimentos se llevarán a cabo empleando el medio de cultivo básico ms (ver anexo). En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5. Objetivos específicos • • • • Manual de biotecnología | práctica 12 74 Germinar semillas de zanahoria en condiciones estériles. 4 ácido diclorofenoxiacético) Alcohol etílico al 70% *5 hojas para bisturí estériles del no. 4-D (2. 4 Medio MS 2. Probar el efecto de la concentración de sacarosa y la fuente de nitrógeno en el desarrollo de embriones somáticos de zanahorias. Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de callos embriogénicos de zanahoria. Con ayuda de las pinzas se colocan cinco semillas en cada frasco (cada equipo sembrará cinco frascos). 3. Se colocan en un colador de acero inoxidable y se enjuagan con agua corriente hasta que se elimine el detergente por completo. grasas y ceras 4. Las cajas se mantendrán a 25 °C bajo condiciones de oscuridad (cada equipo probará uno de los tratamientos). Germinación de semillas in vitro Cultivo in vitro Se emplearán frascos de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico ms semisólido (ver anexo) adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. después de usarse. se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodón en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Se bañan con alcohol al 70% para eliminar aceites. Se ocuparán porciones de tallos. se pasa rápidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. Se toma la tapa con las pinzas. En la campana de flujo laminar. PARTE I. 5. Las semillas se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante. 2. 7.5 y 2 mg/L de 2. Antes de volver a usar las pinzas. se sumergen en un frasco con agua destilada estéril para que se enfríen.4-D. se remueve la solución con ayuda de un colador de acero inoxidable estéril. El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero 2. PARTE II. 6. 5. . Se harán cinco repeticiones por tratamiento. 1. Se sumergen en una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial). se flamean y cuando el alcohol remanente se apaga. bajo lámparas fluorescentes. 6. Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. 4. Se probarán tres tratamientos para la inducción de callo embriogénico: Medio semisólido ms (ver anexo) con 1. Inducción de callo embriogénico 1.El proceso de inducción de embriogénesis somática se efectuará en tres etapas: germinación in vitro de semillas. 3. raíces y hojas (de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad) como explantes. 75 Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria | práctica 12 Desinfección de semillas 1. Los frascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 °C en foto-periodo de 16 h luz/8 h oscuridad. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). Las semillas se colocan en una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. 2. 3. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución. En todos los casos se colocarán cinco explantes en caja Petri con 25 ml de medio. Después de seis semanas de cultivo las plantas están listas para utilizarse como explantes. inducción de callo embriogénico y embriogénesis. 1. Las semillas se enjuagan tres veces con agua destilada estéril. Nota: Las pinzas. PARTE III. 2. de semillas germinadas Manual de biotecnología | práctica 12 76 Se probarán cuatro tratamientos para el desarrollo de embriones somáticos de zanahoria: Medio ms con 3% de sacarosa. Embriogénesis 1. La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento por la presencia de callo embriogénico y la frecuencia de respuesta. Resultados Germinación de semillas Día Frasco 2 4 6 8 10 1 2 3 4 5 Promedio DS Germinación Germinación (%) No.4. el resultado se evaluará por la presencia de embriones somáticos en estado cotiledonario. Días Gráfica de velocidad de germinación 12 14 16 . medio ms con 6% de sacarosa. se harán tres repeticiones por tratamiento). medio ms con 3% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina y medio ms con 6% de sacarosa y 750 mg/L de L-glutamina (cada equipo probará uno de los tratamientos). En cajas de Petri con 25 ml de medio nutritivo se colocarán cuatro porciones de callo (del mejor callo obtenido en la etapa de inducción. Las cajas se mantendrán en las condiciones antes descritas durante cuatro semanas. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos. 3. Los resultados de todos los equipos se reunirán y el reporte de la práctica se hará con el resultado de todos los experimentos. 5.4-D 1 2 3 4 5 Total % de respuesta por explante * La evaluación se hace a las cinco semanas de tratamiento ** Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos Desarrollo de embriones somáticos* Número de brotes por explante** Frasco 3% de sacarosa 6% de sacarosa 3% de sacarosa 750 mg/L de glutamina 6% de sacarosa 750 mg/L de glutamina 1 2 3 4 5 No. 3.Inducción de callo embriogénico* Presencia de callo embriogénico por explante** Frasco 1 mg/L de 2.0 mg/L de 2.4-D 2.4-D 1. 2. 4.5 mg/L de 2. de brotes por tratamiento * La evaluación se hace a las cuatro semanas de tratamiento Las tablas deben tener los resultados de todos los equipos ** Se emplearán como explante los mejores callos obtenidos en la etapa anterior Análisis 1. ¿A qué se llama células totipotenciales? ¿Qué son los meristemos? ¿Cuáles son los factores que determinan la inducción de un cultivo embriogénico? ¿Qué características debe tener un tejido que se usa como explante para embriogénesis somática? ¿Cuáles son los factores más importantes durante el desarrollo de embriones somáticos? Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria | práctica 12 77 . “Transition of somatic plant cells to an embryogenic state”. y S. “Involvement of plant hormones and plant growth regulators on in vitro somatic embryogenesis”. Invited review. Rose. Feher. y D. y K. Thorpe. (2007).. Arabidopsis Book 7: 1-22. Plant Cell. Pasternak. Jimenez. y F. Chatfield.J. (2002). “Embryogenesis: Pattern formation from a single cell”. A. Molecular Biotechnology 37: 169-180. Plant Growth Regulation 47: 91-110. T. Manual de biotecnología | práctica 12 78 . Tissue and Organ Culture 74: 201-228. R. Dudits. T. “History of plant tissue culture”.M. T. T.P. Skoog (1962).E. (2005). Physiol Plant 15: 473. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant 42: 473-481. Murashige.A. Nolan (2006) Genetic regulation of somatic embryogenesis with particular reference to Arabidopsis thaliana and Medicagotruncatula”.Bibliografía Berleth. “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture”.497. V. (2003). ) pueden formar brotes o raíces directamente. la elección del explante. El enfoque empírico que ha sido extensamente usado en estudios in vitro de organogénesis ha mostrado que el proceso depende principalmente de tres factores. N. La manipulación de estos factores lleva a la inducción del desarrollo organizado. Existen varios estudios que reportan su capacidad de retener en sus tejidos altas concentraciones de Pb. células que generan primordios que finalmente formarán brotes y raíces. La organogénesis de novo inicia a partir de células en división activa localizadas en los centros meristemáticos de las plantas. glauca es considerada un modelo ideal para llevar a cabo estudios de fitorremediación. Una vez que estos brotes se desarrollan pueden subdividirse en grupos más pequeños o brotes individuales que pueden a su vez cultivarse en medio fresco con auxinas. El proceso de organogénesis ocurre en diferentes etapas que incluyen: la adquisición de competencia. La determinación se completa cuando el tejido es capaz de continuar su programa de desarrollo en ausencia de reguladores de crecimiento exógenos. Las condiciones de organogénesis son variables para cada especie vegetal. 79 Organogénesis somática de nicotiana glauca | práctica 13 Introducción . Recientemente se ha encontrado que los explantes de hojas de tabaco requieren permanecer de cuatro a seis días en el medio de cultivo para que se determine la formación de brotes y sólo requieren un día en el medio de cultivo para que se determine la formación de raíces. Por estas características.Práctica 13 Organogénesis somática de Nicotiana glauca La organogénesis somática ha resultado ser una herramienta muy valiosa para la propagación comercial de cultivos industriales. Esta planta se comporta como pionera en ecosistemas perturbados y resiste concentraciones elevadas de diversos contaminantes. su empleo en biorremediación de suelos contaminados depende en gran medida del desarrollo de un protocolo eficiente de reproducción para la especie. la inducción o determinación de una ruta morfogenética particular y la diferenciación morfológica y el desarrollo. Cd y Co. Por tratarse de una especie silvestre. plantas ornamentales y hortalizas. generalmente citocininas (solas o en combinación con una proporción mucho menor de auxinas). Cuando los explantes se colocan en un medio de cultivo con ciertas hormonas vegetales. Es una especie con rápido crecimiento y alta producción de biomasa que produce alcaloides repelentes de herbívoros. dependiendo de las fitohormonas presentes en el medio. el medio de cultivo y el control del ambiente físico. Zn. Nicotiana glauca es una planta perteneciente a la familia Solanaceae con una amplia distribución en México y el mundo. En general es mejor utilizar explantes jóvenes con crecimiento activo y con meristemos abundantes. para inducir la formación de raíces. Los explantes de hoja de tabaco (Nicotiana tabacum L. Las hojas y los nudos de los tallos suelen dar muy buenos resultados. los brotes axiales emergen y forman un agrupamiento de brotes. glauca Cloro 30% *Material que deberán traer los alumnos Metodología Los experimentos se realizarán empleando el medio de cultivo básico ms (Murashige y Skoog. En todos los casos se ajustará el pH del medio a 5.7 con HCl y KOH 1N y se esterilizará en autoclave durante 20 minutos a 120 0C.5 ml Balanza analítica 1 espátula estéril Incubadora de vegetales Pinzas largas estériles Campana de flujo laminar 1 jeringa hipodérmica estéril Reactivos *1 paquete de cajas Petri estériles de 10 cm de diámetro Sales del medio ms *15 frascos Gerber grandes de boca ancha Sacarosa *Papel aluminio Agar *Algodón Ana *Mango para bisturí del número 4 Bap *5 hojas para bisturí estériles del no. 2. 21 o 22 Alcohol etílico 70% *Un rollo de plástico Parafilm o Plastipack HCl 1N Material biológico KOH 1N Semillas de N. Determinar cuál es el mejor explante para la inducción de brotes. 3. Material y equipo Material Equipo 2 mecheros Autoclave 30 tapas para frascos Gerber Potenciómetro Tubos eppendorf de 1. Manual de biotecnología | práctica 13 80 Probar el efecto de diferentes concentraciones de bencil aminopurina (Bap) en combinación con ácido naftalenoacético (Ana) sobre la inducción de brotes adventicios de tabaco. . El proceso de inducción de organogénesis somática se efectuará en tres etapas: germinación in vitro de semillas. Probar el efecto de la composición del medio de cultivo en la rizogénesis de los brotes obtenidos. al que se le agregarán distintas concentraciones de hormonas de crecimiento en los diferentes experimentos efectuados.Objetivo general Obtener plantas completas a partir de cultivos in vitro de Nicotiana glauca por organogénesis somática Objetivos específicos 1. inducción de brotes y rizogénesis. Con ayuda de unas pinzas y una espátula delgada estériles. bajo lámparas fluorescentes. • Se adiciona a las semillas una solución al 30% de hipoclorito de sodio (a partir de la solución comercial) que debe prepararse en ese momento y se mantienen en la solución de cloro durante 20 minutos en agitación constante. . • Se bañan con alcohol al 70% durante un minuto para eliminar aceites. • Las semillas quedan listas para ser sembradas en el medio de cultivo. Los bordes de las tapas se sellan usando un rollo de plástico (Parafilm o Plastipack). • Se enjuagan las semillas con agua corriente empleando una jeringa hipodérmica. Después de 6 semanas de cultivo las plantas estarán listas para utilizarse como explantes. Antes de volverse a usar. se sumergen en un frasco con agua destilada estéril para que se enfríen. • Deben sembrarse las semillas inmediatamente en los frascos con medio de cultivo. se colocarán entre 10 y 15 semillas en cada frasco (cada equipo sembrará 5 frascos). • • • • Se toma la tapa con las pinzas. 81 Organogénesis somática de nicotiana glauca | práctica 13 Desinfección de semillas • Las semillas se colocan en un microtubo de 1. se enjuagan las semillas tres veces con agua destilada estéril. adicionado con 30 g de agar y 8 g de sacarosa. Los frascos se mantendrán en una cámara de incubación a 25 oC. • Empleando la jeringa estéril. • En la campana de flujo laminar se remueve la solución con ayuda de una jeringa hipodérmica estéril. • Con ayuda de una jeringa hipodérmica se retira la solución jabonosa (cuidando no succionar las semillas.5 ml con una solución jabonosa ligera (una pizca de cualquier detergente) y se agitan durante un minuto para eliminar basura y polvo. en foto-periodo de 16 h luz 8 h oscuridad. se pasa rápidamente por la flama y se tapa el frasco con las semillas. Es muy importante que las semillas no permanezcan más tiempo en la solución. que deben permanecer en el fondo). las pinzas y la espátula se flamean.Parte I. • • El frasco se destapa y la tapa se coloca hacia arriba cerca del mechero. cuando el alcohol remanente se apaga. Nota: Las pinzas y la espátula después de usarse se colocan en un frasco con alcohol (al frasco que contiene alcohol se le pone un poco de algodón en el fondo para que no se confunda con los frascos de agua). Germinación de semillas in vitro Parte II. Cultivo in vitro Se emplearán frascos Gerber de 125 ml con 25 ml de medio de cultivo básico Murashige y Skoog (1962) semisólido. grasas y ceras. hasta eliminar el detergente por completo. 0 0. Parte IV. glauca: Tratamiento Manual de biotecnología | práctica 13 82 bap ana (mg/L) (mg/L) 1 0.Parte III.1 Se emplearán como explantes hojas y raíces provenientes de plantas germinadas in vitro de dos meses de edad.0 0. cinco frascos por tratamiento (un tratamiento por equipo).5 0.5 0. Rizogénesis Para la inducción de raíces en los brotes obtenidos se probará el efecto de la osmolaridad del medio de cultivo sobre el desarrollo de raíces.0 2 1. glauca* Tratamiento** % de respuesta Número de brotes por explante*** Número de brotes por tratamiento Grado de desarrollo de los embriones 1 2 3 4 5 6 * La respuesta se evaluará después de cinco semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar.0 0. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). Los experimentos se evaluarán después de cinco semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y el número de brotes obtenidos por explante.1 5 1. Se utilizarán como medio de inducción: el medio ms completo. Los valores con la misma letra indicarán que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0. Los reportes de las prácticas deben contener los resultados de los experimentos efectuados por todos los equipos. .05 de acuerdo con la prueba de Tukey. Los brotes más desarrollados obtenidos en la etapa anterior se emplearán como explantes. Se sembrarán tres brotes por frasco.0 0. Inducción de brotes Se probarán seis tratamientos (uno por equipo) para la inducción de brotes en hojas y raíces de N.0 4 0. Resultados Inducción de brotes de N. La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento por la frecuencia de respuesta y la biomasa fresca promedio de las raíces obtenidas.0 3 2.1 6 2. Cada equipo sembrará cinco frascos con raíces y cinco frascos con hojas. el medio ms con la mitad de los macronutrientes y el medio ms con un cuarto de los macronutrientes. (2007). Bisen (2006). Pennazio. Tissue and Organ Culture 81: 277-285. “History of plant tissue culture”. Malik y P. “In vitro culture of tobacco callus on medium containing peptone and phytate leads to growth improvement and higher genetic stability”. Molecular Biotechnology 37: 169-180. G.. 2. “Micropropagation: A tool for the production of high quality plant-based medicines”. 5. M. Current Pharmaceutical Biotechnology 7: 33-49. Rivista Di Biologia . Organogénesis somática de nicotiana glauca | práctica 13 Análisis 83 . Rech y D.S.A. Ziv. P. Comparar los resultados de esta planta con los procesos de micropropagación de plantas del mismo género ¿Cuál puede ser la utilidad de contar con un protocolo eficiente de micropropagación para el proceso de domesticación de la especie? Bibliografía Debnath.Biology Forum 95: 455-472. Parc. T. Rembur. “The culture of single plant cells: A historical view”. Plant Cell Reports 26: 145-152.Enraizamiento de los brotes* Tratamiento** % de respuesta Biomasa promedio de raíz *** Biomasa de raíces por tratamiento 1 2 3 * La respuesta se evaluará después de cuatro semanas de tratamiento ** Se incluirán los resultados de todos los equipos *** El resultado debe incluir desviación estándar. (2005). Los valores con la misma letra indicarán que no hay diferencia significativa entre tratamientos a nivel P= 0. 1. (2002). “Simple bioreactors for mass propagation of plants. Plant Cell”..P. S. C. Thorpe. 4. (2007). 3. J.05 de acuerdo con la prueba de Tukey. Chriqui. Los valores deberán estar seguidos por letras (a-d). ¿Cuál es el papel de las hormonas de crecimiento en la inducción de brotes? ¿Cómo se comporta la planta en respuesta a las fitohormonas utilizadas? Observaciones en relación con la eficiencia del proceso de micropropagación generado. M. . Material y equipo Material Equipo 20 Tubos eppendorf de 1. la introducción de genes mediante el plásmido Ti y la tecnología antisentido. La introducción de genes específicos a través de la biotecnología puede proveer de ciertas ventajas. Existen varios procedimientos biotecnológicos que pueden ser usados para la ingeniería genética de plantas. supermercados. . semillas de soya y granos de maíz fueron los primeros organismos genéticamente modificados en ser aprobados en Estados Unidos en los años noventa. La idea es que traigan soya adquirida en distintos sitios: mercados. pueblos. etcétera. Las plantas también pueden ser modificadas para inhibir la expresión de genes específicos que están involucrados en la maduración de la fruta. una planta genéticamente modificada se protege a sí misma contra parásitos después de la introducción de un gen para la producción de una endotoxina capaz de destruirlos. Objetivo Los alumnos podrán identificar la presencia de transgenes en muestras vegetales adquiridas comercialmente. tiendas orgánicas. Como ejemplo podemos mencionar el uso de pistolas genéticas. A partir de entonces la biotecnología de alimentos continúa creciendo rápidamente.Práctica 14 Identificación de organismos genéticamente modificados Introducción 85 Los jitomates. Como ejemplo.5 ml limpios y estériles por equipo Baño María a 65 oC por grupo Licuadora o mortero por grupo Micropipetas por equipo Centrífuga por grupo 1 mechero por equipo *100 g de soya *Material que deberán traer los alumnos. incubar a 55 oC por 30 min. 10 ml de agua estéril Manual de biotecnología | práctica 14 86 Metodología Esta práctica se realiza en tres módulos: I) Extracción de dna de las muestras.2 M 4. MÓDULO I. 13. 8. mezclar con vórtex por 2 min.02 M). 14.4 M. II) Amplificación del dna. Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. III) Electroforesis en geles de agarosa. Adicionar 350 µl de cloroformo.9%) 5. Tris 1 M y Na2 EDTA 0. descartar el sobrenadante. El sobrenadante se descarta y el dna precipitado se disuelve en 350 µl de NaCl 1. mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. Secar la pastilla en el mechero y posteriormente resuspender en agua estéril (aproximadamente 100 µl). 50 ml de amortiguador de precipitación CTAB (CTAB 5 g/l y NaCl 0. Extracción de dna Extracción de dna usando ctab (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) 1. incubar a temperatura ambiente por 60 min.2 M.5 ml se colocan de 50-300 mg de muestra (1 tubo por alumno) 3. Adicionar 500 µl de etanol al 75%. 11. 10. 1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) o pronasa (50 mg/ml) 6. 15. mezclar y centrifugar a 14 000 rpm por 10 min.Reactivos por grupo 1. mezclar suavemente e incubar 20 min a temperatura ambiente. Agregar 1. el homogenizado servirá para todo el grupo. En una licuadora se trituran 100 g de muestra con 25 ml de solución fisiológica salina.04 M) 3. Transferir la fase superior a un tubo nuevo y limpio. 9. Agregar un volumen de cloroformo. 5. Centrifugar a 14 000 rpm por 2 min. .0 ml de amortiguador de extracción CTAB precalentado a 65 °C. descartar el sobrenadante. 6. Posteriormente centrifugar a 14 000 rpm por 15 min. 2. El sobrenadante se transfiere un tubo nuevo y limpio. NaCl 1. Agregar 600 µl de isopropanol. Agregar 2 volúmenes del amortiguador de precipitación CTAB. 50 ml de solución fisiológica salina (NaCl 0. 4. 50 ml de NaCl 1. 50 ml de cloroformo 7. 50 ml de isopropanol 8.0 (CTAB 20 g/l. 50 ml de amortiguador de extracción CTAB pH 8. 12. Tomar la fase acuosa superior y transferirla a un tubo nuevo y limpio. agitar e incubar por 30 min. 2. En un tubo eppendorf de 1. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min. Adicionar 10 µl de proteinasa K (20 mg/ml). 50 ml de etanol al 75% 9. 7. 2. Al inicio de los años ochenta. el cual da la señal de terminación de la transcripción y dirige la poliadenilación.5 µl de amortiguador de reacción (10X) 3. 2. La concentración se calcula de acuerdo con la siguiente formula: 1. El proceso mediante el cual se realiza la construcción requiere el corte y empalme de diferentes elementos para formar una unidad genéticamente funcional.La pureza y concentración del dna puede calcularse de la siguiente manera: 1. 2. Chua y colaboradores en la Universidad de Rockefeller aislaron el promotor responsable de la transcripción del genoma completo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación Promotor CaMV 35S CaMV 35SF CaMV 35SR Tamaño esperado del amplicón: 196 pb 87 Identificación de organismos genéticamente modificados | práctica 14 La producción de plantas genéticamente modificadas se lleva a cabo mediante la inserción selectiva de genes foráneos de interés dentro de su genoma. Dos de los elementos regulatorios más utilizados son el promotor para una elevada expresión constitutiva en tejidos de plantas.5 µl dNTP´s 2 mM. La pureza se estima sacando la siguiente proporción: DO260/DO280. Es conveniente que el profesor haga un stock para todo el grupo con el fin de optimizar el uso de los reactivos. La cantidad de reacciones de PCR será determinada por el profesor. El promotor 35S es un promotor constitutivo muy fuerte. aunque es menos efectivo en plantas monocotiledóneas. Estos dos elementos pueden estar juntos o separados. así como un gen que confiere una ventaja.0 de DO260 = 50mg/µl para dna de doble cadena. especialmente en cereales. Amplificación del dna Metodología Mezcla de reacción: 1. ya que no se pueden realizar para todo el grupo debido al elevado costo de los reactivos. El promotor fue nombrado CaMV 35S o promotor 35S por su coeficiente de sedimentación. Hacer una dilución 1:100 de la muestra obtenida y medir la DO a 260 y 280 nm. 50 pmol de cada primer 4.5 U de Taq dna polimerasa 5. 1-5 µl de dna 7. Volumen total 25 µl 2. CaMV-35. aislado del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador Nos aislado del gene de la nopalina sintasa (nopaline synthase) de Agrobacterium tumefaciens. ya que provoca altos niveles expresión de genes en plantas dicotiledóneas. Módulo II. un promotor y un terminador. La discrepancia se debe probablemente a la diferencia en la cantidad y/o cualidad de los factores de regulación. . X µl de agua libre de nucleasas estéril 6. por cauliflower mosaic virus). La modificación generalmente incluye dos elementos regulatorios. La electroforesis permite separar moléculas de dna al ser sometidas a un campo eléctrico. proteínas. hacer una aproximación de la cantidad de dna que se obtiene después de un proceso de extracción. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula. Desnaturalización 94 °C. También se utiliza para visualizar el resultado de procesos como la restricción y PCR. 30 seg. Si el dna tiene un tamaño desconocido se debe utilizar un gel de agarosa al 1. nucleótidos.Terminador NOS NOSF NOSR Tamaño esperado del amplicón: 180 pb Programa de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Desnaturalización 94 °C. Segundo.0% (1g/100 ml). Alineamiento 54 °C.0% (1g/100 ml). Preparar el gel al porcentaje de agarosa deseado según se indica en el siguiente ejemplo. 7 min. bien como cationes. la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula. Hay que determinar qué cantidad de agarosa se necesita para preparar 30 ml: (30 ml)(1 g/100 ml) = (X g) . ya que son atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. 2. Determinar la concentración y el volumen de gel que se necesita. ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas. Extensión 72 °C. Extensión final 72 °C. Electroforesis en geles de agarosa La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución. o bien como aniones. Reactivos Amortiguador TAE 50X GelRed Agarosa Metodología Preparación del gel de agarosa 1. Ejemplo 1: preparar 30 ml de agarosa al 1. la fuerza eléctrica atrae el dna hacia el electrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga. Primero. 30 seg. Número de ciclos 30 ciclos Manual de biotecnología | práctica 14 88 Módulo III. 30 seg. 5 min. La electroforesis permite además. Muchas moléculas biológicamente importantes (aminoácidos. péptidos. Unir los electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a las terminales correspondientes. Colocar el molde para hacer los pozos en la charola que soporta el gel. de esta manera se evita la contaminación. Enfriar la agarosa hasta unos 50 °C. pausando el horno cada vez que sea necesario para impedir que hierva. 5. Conectar el equipo de electroforesis. Añadir el volumen deseado de solución amortiguadora Tris acetato EDTA (TAE) 1X (ejemplo 1 = 30 ml). 6. agregar 1ml de GelRed para monitorear la movilidad electroforética. El resultado en este caso es 0. Cargar cuidadosamente ~ 6 µl de muestra por pozo utilizando una micropipeta. El gel sólido tiene una apariencia opaca. Dejar que el gel se solidifique a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos). entonces se podrán observar burbujas saliendo de los electrodos. seleccionar el voltaje deseado (aproximadamente 100 voltios). Calentar en un horno de microondas hasta que se disuelva la agarosa totalmente (aproximadamente un minuto). Encender el equipo.3 g 3. 8. Incluir en el gel una muestra de un marcador de peso molecular. Para que el gel quede de un espesor uniforme la charola debe estar en una superficie plana nivelada. Correr la electroforesis hasta que las muestras se hayan movido aproximadamente entre la mitad y tres cuartos de la charola. 7. Conviene asegurarse de que las muestras están corriendo en la dirección correcta. Vaciar la solución de agarosa en la charola evitando la formación de burbujas. 4. 7. 9. 4.Se despeja la ecuación para la X. 5. Colocar el gel dentro de la cámara de electroforesis. Si el equipo está funcionando bien. Siempre se debe de usar una punta de micropipeta nueva para cada tubo. 3. Cargar todas las muestras deseadas de igual manera. 8.5 cm) Las muestras se preparan de la siguiente forma: Tomar 5 µl de la muestra y depositarla en un cuadrito de Parafilm.3 g) y transferir a un matraz Erlenmeyer. 89 Identificación de organismos genéticamente modificados | práctica 14 Pesar la cantidad de agarosa que se necesita (ejemplo 1 = 0. Apagar el equipo. Si se forman burbujas. 2. Preparación de la cámara y de las muestras 1. Añadir suficiente TAE 1X para cubrir completamente el gel (aproximadamente 0. se pueden remover usando una punta para micropipeta. Resultados Visualización del dna • Colocar el gel en una lámpara de luz UV o transiluminador • Fotografiar el gel usando una cámara digital. hacia el electrodo positivo. 6. . D.A. Dewettinck (2004). L.. N. Oraby. Glynou. Anal Bioanal Chem 392: 347-354. J Sci Food Agric 84:1357-1363. A.. J Sci Food Agric 85: 1974-1980. L. Simoni..Bibliografía Elenis. Kalogianni. K.. “Evaluation and optimization of five different extraction methods for soy DNA in chocolate and biscuits. Mezzanotte y A. “Screening food products for the presence of CaMV 35S promoter and NOS 3´ terminator”. A. Manual de biotecnología | práctica 14 90 . K. Messens y K. Anal Bioanal Chem 392: 355-367. Gryson. Cevenini.K. Hassan y A. Christopoulos (2008). (2005). P.C. “Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms”.S.A. P. “New trends in bioanalytical tools for the detection of genetically modified organism: an update”. Ioannou y T. Extraction of DNA as a first step in GMO analysis”. E. Mossallam. Roda (2008).S. Michelini. H.P. D. Anexo . . 0. galactosa 2%. dna de esperma de salmón: Solución de trabajo 10 mg/ml. PEG 50%: Disolver 25 g de PEG 3350 en 50 ml de agua y esterilizarlo. Fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae se mantendrá sembrada en cajas de medio rico (YPD) y se utilizará para el inóculo una caja con no más de una semana de haber sido sembrada.8 g 93 Manual de biotecnología | Anexo YPD Y (extracto de levadura) P (peptona de caseína) D (glucosa) Agar . 1989.2): Na2HPO4 (anhidro) 21. Acetato de litio 10X (10 ml para el grupo): Preparar una solución 1 M de acetato de litio. sin aminoácidos (YNB) 0. ajustar el pH a 7. pH 8. Cajas de SGal + Leu. Práctica 4.40 % 0. peptona 20 g. TE 10X.5.67%. leucina 20 mg/L. dextrosa (glucosa) 20 g. agar 2%. Transformación de levadura y ensayo de doble híbrido Preparar por grupo: Medio YPD (g/L) (5 matraces con 30 ml c/u para el grupo): Extracto de levadura 10 g. agar 2%. X-Gal: solución al 2% en N.75 % 21. EDTA 10 mM. Cajas de SD + Leu (3 por equipo): Base nitrogenada para levaduras.. glucosa 2 %. agar 2%. pH 7. DNS (Miller. leucina 20 mg/L.0 (1 por equipo): YNB 0.5. preparado según Sambrook et al.N-dimetilformamida (guardar a -20 °C).2 M PBS.Práctica 1.0 (10 ml para el grupo): Tris 100 mM.67%. 1959) Hidróxido de Na Ácido 3. pH 7. rafinosa 1%. Extracción de dna e identificación del sexo en humanos: su importancia en las ciencias antropológicas y forenses PBS 20X (0.67 %. pH 7.54 % 0.59 % Práctica 3.60 % 0. Cajas SGal + rafinosa al 1% sin leucina (1 por equipo): YNB 0.dinitrosalicílico Tartrato de Na y K Fenol Metabilsulfito de Na 1% 2% 2% 2% 1. NaH2PO4 (anhidro) NaCl Agua destilada Ajustar pH a 7.2 Guardar a temperatura ambiente 6.4 g 180 g 1,000 ml Solución de Lisis: Tris-HCl 1 M, pH 7.5 1 ml EDTA 500 mM 2 ml NaCl 5 M 1 ml SDS 20% (p/v) 10 ml Agua libre de nucleasas cbp 100 ml Esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. Manual de biotecnología | Anexo 94 TAE 50X (1L): Tris base Ácido acético EDTA 0.5 M, pH 8.0 242 g 57.1 ml 100 ml EDTA 500 mM, pH 8.0: EDTA (sal de sodio) 18.61 g Ajustar a pH 8.0 con lentejas de NaOH. Aforar a 100 ml, esterilizar y almacenar a temperatura ambiente Proteinasa K o Pronasa (20 mg/ml) Proteinasa K o pronasa 100 mg Agua estéril 5 ml Almacenar a -20 °C en alícuotas de 400 µl Acetato de sodio 3 M pH 5.2 (100 ml) Acetato de sodio trihidratado 40.8 g Ajustar el pH a 5.2 con ácido acético glacial. Ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Esterilizar con autoclave y almacenar a temperatura ambiente Práctica 6. Análisis de la actividad de catalasas Preparación de medio PY, en un vaso de precipitados, preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final Peptona de caseína 5g Extracto de levadura 3g Esterilizar en autoclave 20 minutos a 120 0C y 1 atm de presión. Después, añadir 10 ml de CaCl2 0.7 M. Preparación de PBS 10X: en un vaso de precipitados preparar como se enlista a continuación: Reactivo Por litro de volumen final KCl 2g NaCl 80 g Na2HPO4.2H2O 14.4 g KH2PO4 2.4 g Ajustar el pH a 7.4 con NaOH Preparar 200 ml (por equipo) de medio de cultivo BEGG (g/L): Glucosa* 40, extracto de levadura 5, glutamato de sodio 10, KH2PO4, 13.6, MgSO4.7H2O 0.5, etanol** al 1.4% (v/v) pH 6.0. NaOH 0.5 M 50 mL (por equipo): 1 g de hidróxido de sodio, aforar a 50 mL con H2O * La glucosa se esteriliza por separado y se añade posteriormente al medio para evitar que el grupo amino de las proteínas del extracto de levadura reaccionen con la glucosa. ** El etanol se añade después de la esterilización y una vez que el medio se encuentre a una temperatura ≤ 30 °C para evitar su volatilización. Práctica 8. Emulsificación de diesel, gasolina y aceite de maíz por Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcenses. Medio MS 100 ml (por equipo), para preparar 1 L: Cloruro de amonio 20 mM Cloruro de potasio 20 mM Tris - HCl 120 mM Peptona 1% Dextrosa (20%) 0.5% Sulfato de magnesio (1.0 M) 1.6 mM 1.068 g 1.492 g 18.912 g 10g 26ml 1.6ml Pesar y disolver los reactivos excepto la dextrosa y el sulfato de magnesio en 200 ml de H2O desionizada, ajustar el pH a 7.4 y aforar a 975 ml. Esterilizar durante 20 minutos. Stock de Dextrosa al 20%, 100 ml Dextrosa 20% 20g Pesar y disolver en 85 ml de H2O desionizada y aforar a 100ml. Esterilizar durante 20 minutos. Sulfato de magnesio 1.0 M 12.32g Pesar y disolver en 50 ml de H2O desionizada. Esterilizar por filtración. 95 Manual de biotecnología | Anexo Práctica 7. Síntesis de celulosa bacteriana para aplicaciones biotecnológicas, utilizando Gluconacetobacter xylinum Antes de usar el medio PPGAS, se añaden 26 ml de glucosa al 20% y 1.6 ml de sulfato de magnesio. MEDIO PG (50 ml por equipo), para preparar 1,000 ml: Bacto peptona 5g Glicerol 10 ml Ajustar pH a 7.2 Aforar a 1 L Esterilizar 20 minutos Práctica 9. Metabolismo secundario Manual de biotecnología | Anexo 96 Preparación de reactivos: Liebermann-Burchard (1 ml por equipo). Mezclar 1 ml de anhídrido acético y 5 ml de cloroformo a 4 °C (en baño de agua-hielo), añadir una gota de ácido sulfúrico concentrado. Draggendorff (2 gotas por equipo). Preparar por separado dos soluciones: Solución A.- mezclar 10 ml de ácido acético y 40 ml de agua y agregar 0.85 g de nitrato de bismuto básico. Solución B.- Disolver 20 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Mezclar la solución A con la solución B y guardar en un frasco ámbar. Mölish (2 gotas por equipo). Pesar 0.5 g de α-naftol y disolver en 10 ml de etanol. Práctica 11. Fitorremediación con helechos Práctica 12. Inducción y desarrollo de embriones somáticos de zanahoria Práctica 13. Organogénesis somática de Nicotiana glauca Estas tres prácticas contemplan el manejo de cultivos vegetales, por lo que se utilizará el medio Murashige y Skoog, Ms, modificado. Medio Ms modificado: Preparar soluciones stock. Las soluciones stock se preparan por separado para evitar que se precipiten: Stock Componente gramos/litro 10X (g/L) 1 macros (NH4)NO3 KNO3 MgSO4× 7H2O KH2PO4 1.65 1.9 0.37 0.17 16.5 19 3.7 1.7 2 CaCl2 0.44 20X (g/L) 44 Todas las soluciones deben conservarse en refrigerador.0005 0. Preparar 1 L de stock 1(10X).008 0.002 0.496 0.0 7 Glicina 0.040 0.01689 0. se llevan a cabo los siguientes pasos durante la práctica con el grupo: Cuando el medio nutritivo va a vaciarse a cajas Petri: se vierte en un matraz Erlenmeyer de 2L (es importante que el volumen del matraz sea mucho mayor que el del medio) y se le agrega el agar (8 g por litro) directamente. El medio se esteriliza en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.7 con HCl ó KOH 1N. nicotínico Piridoxina•HCl 0.984 5 vitaminas Tiamina•HCl Ác. 1 L: Poner 500 ml de agua destilada en un vaso de precipitados y en agitación constante. Cuando el medio va a vaciarse en frascos de 125 ml (Gerber). Los frascos con el medio se esterilizan en autoclave durante 20 minutos a 120 oC.688 0.0001 0. Se deja que el medio enfríe hasta alcanzar alrededor de 60 0C y se vacía en cajas Petri estériles en una campana de flujo laminar.00083 0. Al final se agrega la sacarosa necesaria y cuando se haya disuelto por completo.002 0.002 4* FeSO4•7H2O Na2•EDTA 0. de preferencia juntas en un recipiente de plástico.224 2.0062 0. < 97 Manual de biotecnología | Anexo 3 micros MnSO4× H2O ZnSO4× 7H2O H3BO3 KI NA2MoO4• 2H2O CuSO4•5H2O CoCl2 • 6H2O . Preparación del medio Ms. se agregan 100 ml del stock 1 y de manera secuencial 10 ml de cada uno de los demás stocks.020 0.10 8.000025 1.0086 0.160 Sacarosa 30 *Pesar y disolver el fierro y el EDTA por separado. Es importante dejar que la autoclave se enfríe lentamente para evitar que las tapas de los frascos se boten por cambios bruscos de presión. Para que los alumnos prueben los distintos tratamientos.00025 0. Finalmente se afora el medio nutritivo a un litro. Calentar el EDTA sin ebullir hasta que se disuelva y luego mezclar con el fierro.0278 0.040 6 Inositol 0. Elaborar 200 ml de c/u de los stock 20X restantes. se añade agua destilada hasta llegar a 950 ml y ajustar el pH de la solución a 5. debe quedar una solución color ámbar (amarillenta).352 0.020 0.0373 2. Se vacían 25 ml del medio de cultivo a cada frasco.0005 0.0.000025 0. se disuelve con agar en una parrilla con agitación hasta que se torna claro y transparente (generalmente cuando llega al punto de ebullición). Manual de biotecnología | Anexo 98 .