Manual Bioquímica III

}2,016 Manual de prácticas de BIOQUIMICA III Elaboración Licda. Eyda Mendía de Campollo (QB) Licda. Ana Ester Barrientos (QB) Revisión Licda. Ana Margarita Paz Morales de Ramírez (QB, MA) Licda. Isabel Cristina Gaitán Fernández (QB, MA) 1 REGLAMENTO GENERAL MANUAL DE PRÁCTICAS BIOQUÍMICA III TERCER AÑO QUINTO SEMESTRE FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ DE GUATEMALA BASADO FECHAS EN DE GUÍAS DE LABORATORIO I2QB3 MODIFICACIÓN: AÑO 2008, AÑO 2011 2 INDICE N O. DE PRACTICA 0 NOMBRE N ORMATIVA N O. DE PRACTICA DE LABORATORIO DE HOJA 3 1 C APACIDAD BUFFER 13 2 SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 21 EN 3 4 SUERO Y COAGULACIÓN FUNCIÓN RENAL: PLASMA 28 SANGUÍNEA DETERMINACIÓN DE 34 UREA 39 CREATININA 5 FUNCIÓN RENAL: DETERMINACIÓN 6 D ETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE 7 EL ELISA DE ÁCIDO ÚRICO 44 COMO UN ANÁLISIS CUALITATIVO Y 50 CUANTITATIVO 8 D ETERMINACIÓN CUALITATIVA DE TIROXINA Y 54 TRIIODOTIRONINA TOTAL 9 10 11 D ETERMINACIÓN DE CORTISOL D ETERMINACIÓN FSH Y LH D ETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DE UNA PRUEBA CUALITATIVA PRUEBA HCG DE EMBARAZO 3 60 66 71 Para evitar este tipo de situaciones. 2. Se comprometa con los Laboratorios del Instituto a guardar compostura tanto en su rendimiento académico como en su comportamiento personal. se ha diseñado una práctica de introducción para dar a conocer al estudiante lo que se espera de él o ella durante el transcurso de los laboratorios. de manera que pueda obtener el mayor provecho de su experiencia en el laboratorio. Conozca la responsabilidad que adquiere al trabajar dentro del lab oratorio de Bioquímica. 4 . Es necesario que cualquier persona que se encuentre dentro de las instalaciones del laboratorio sepa comportarse de forma adecuada. sino podría también tener serias implicaciones de salud y seguridad. Objetivos Que el estudiante: 1. Es absolutamente necesario que tanto el instructor como el estudiante que trabaja dentro del laboratorio sepan que una acción fuera del comportamiento adecuado puede desencadenar un serio accidente que puede afectar tanto la salud y seguridad propia como la de los demás. Conozca el trabajo que se espera de él o ella antes.INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DENTRO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA NORMATIVA DE COMPORTAMIENTO Y DE TRABAJO Introducción Trabajar dentro de un laboratorio de cualquier índole supone un grado de responsabilidad del cual muchos estudiantes no están conscientes. durante y después de realizarse un laboratorio de Bioquímica 3. Un mal comportamiento no solamente tendrá implicaciones disciplinarias. Alcance Que el estudiante: 1. si el alumno justifica su ausencia (razones médicas o por luto). 2. 4. El alumno que no se presente puntualmente a la puerta del laboratorio. Esté consciente de las consecuencias de su calidad de trabajo en el laboratorio 3. Asistir al laboratorio de manera PUNTUAL. debe cumplir con las siguientes reglas: 1. Reglamento para el estudiante Para que un estudiante tenga derecho a participar en las sesiones del Laboratorio de Bioquímica. El faltar al reglamento tiene consecuencias que pueden llegar hasta el retiro definitivo del laboratorio. teniendo un cero inmediato. Independientemente que su ausencia sea 5 . Estar inscrito en el curso teórico de Bioquímica III. Conozca a cabalidad los aspectos que se tomarán en cuenta en la evaluación del laboratorio como parte del curso de Bioquímica. Puede encontrar una copia del REGLAMENTO DEL LABORATORIO en el apéndice al final de este manual. perderá el derecho de presentar examen corto. 3. Sin embargo. perderá el derecho de ingresar a la práctica. el alumno pierde automáticamente el derecho a presentar todos los componentes de la nota de esa práctica. Conozca la forma de evaluación dentro del laboratorio 2. De no asistir a una práctica. la nota de ese laboratorio será eliminada del promedio para obtener la nota final. Guardar un comportamiento adecuado en las actividades del laboratorio. adhiriéndose completamente al R EGLAMENTO DEL LABORATORIO establecido. El alumno que se presente después de haberse presentado las instrucciones para el laboratorio. las cuales incluyen. de manga larga. mochilas ni artículos de uso personal (celulares. joyas. pero no se limitan a. Es responsabilidad del estudiante asegurar sus pertenencias personales ANTES de llegar al laboratorio. Utilizar su equipo de protección personal todo el tiempo que se encuentre dentro de las instalaciones del laboratorio. práctica y reporte. 6. Se practicará un examen corto al inicio de la práctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y el procedimiento a seguir. es responsabilidad del alumno ponerse al día con el contenido de la práctica perdida. No utilice su teléfono móvil como calculadora. Haber cumplido con las tareas preparativas de cada práctica. la información solicitada en el cuaderno. 7. localizadores. ésta se confiscará y se devolverá al final de la práctica.).justificada o no. 6 . El no cumplir con esta regla es causa justificada para retirar a un alumno del laboratorio del día. anteojos de seguridad y zapatos cerrados. perdiendo el derecho a presentar examen. el alumno incluso puede ser retirado definitivamente de laboratorio. El laboratorio no se hace responsable de guardar ninguna pertenencia personal de los alumnos durante la práctica. De reincidir. Como equipo d e protección personal se incluye: bata larga (siempre cerrada). De descubrirse que un alumno porta consigo una de estas pertenencias. una lectura a conciencia de la práctica y cualquier investigación previa que se haya solicitado (ya sea escrita o no). Queda a discreción del instructor permitir la entrada de un alumno que evidentemente no maneja el conocimiento previo requerido. 5. etc. No llevar consigo bolsas. Existe la opción de reponer prácticas si el alumno lo tramita con su instructor anticipadamente y si existe espacio disponible para hacerlo. sin bolsas en los costados y deberá contar con su respectivo nombre y logo de la Universidad. cuaderno. lleve la propia. La resolución escrita del Pre -Lab deberá entregarse al Instructor antes de empezar la práctica del día. se ha diseñado un cuestionario que llamaremos Pre -lab. El Pre-lab es un cuestionario que queda bajo la responsabilidad del estudiante el resolver a conciencia para asegurarse que se comprenderá el trabajo que se va a realizar durante el laboratorio.La importancia Clínica-medica que tiene la práctica . El trabajo que se realice dentro del laboratorio deberá ser registrad o por cada estudiante a manera de poder comprobar qué se hizo. Como ayuda al estudiante. se espera que el estudiante haga su mejor esfuerzo para aprovechar al máximo el recurso que se tiene en el laboratorio.Cuestionario . Para este propósito. Es necesario asegurar que el estudiante esté familiarizado con el tema a tratarse en el laboratorio. es necesario la realización de un examen corto y que cada uno lleve un cuaderno de laboratorio. así como con el procedimiento que se seguirá.Referencias Bibliográficas Trabajo dentro del Laboratorio Como se indicó anteriormente.Trabajo antes de llegar al laboratorio: El Pre-Lab El laboratorio es un lugar donde nunca debe llegarse a improvisar.Revisión Bibliográfica acerca de la práctica (No más de una página) . Responder el Pre-lab a conciencia tiene la ventaja de ayudar a un mejor rendimiento para el examen corto que se realizará en cada práctica al inicio de la misma. 7 . Para la presentación del Pre-Lab se deberá incluir: . cómo se hizo y cuándo se hizo. 8 20 . o Cuaderno de Laboratorio El cuaderno de laboratorio está diseñado para cumplir como evidencia del trabajo que se ha realizado durante cada práctica de laboratorio. legible. Lo más valioso de su cuaderno de laboratorio es el contenido. Objetivos Enumerar de dos a tres objetivos a conseguir durante la práctica. El alumno pierde el derecho a esta prueba si llega después de iniciado el laboratorio. Si alguna persona desea usar el cuaderno de laboratorio de otro curso que haya llevado previamente. por lo que se espera que el estudiante tenga un cuaderno tan ordenado como sea posible. Cada estudiante debe poseer un cuaderno de laboratorio que cumpla con ciertas especificaciones establecidas. Aunque su presentación es importante. Encabezado Indicar claramente el título de la práctica que se llevará a cabo Valor1 --- en el laboratorio y número de la misma. Incluir los presentados en la guía y dos personales más. puede hacerlo siempre y cuando se identifique claramente el cuaderno (vuelto a forrar si hay cambio en el color a usarse) y la sección que se utiliza. Un trabajo que no puede leerse simplemente no tiene validez alguna. distintos. No se permitirá el uso de lápiz o de corrector en el mismo. por lo que el estudiante no debe temer a hacer cualquier anotación dentro de su cuaderno en cualquier momento. y sobre todo. El cuaderno de laboratorio deberá contener las siguientes secciones: Sección Contenido Fecha de Indicar claramente la fecha en que se llevará a cabo la realización práctica de laboratorio.o Examen Corto Al inicio de cada laboratorio se realizará un examen corto que evidenciará el conocimiento con el que se preparó el estudiante para la práctica. no es lo principal en un cuaderno de laboratorio. No puede usarse el mismo cuaderno de laboratorio para dos cursos simultáneos en un mismo ciclo. 9 100 . Tablas de resultados Se debe preparar por adelantado las tablas que se usarán para 20 registrar los resultados de la práctica. 10 Es de vital importancia incluir los efectos de exposición. forma de aplicar primeros auxilios y la forma adecuada de desecho. incluyendo los pesos preparativos involucrados. es necesario incluir la toxicidad del reactivo que se manejará. No debe confiarse en la memoria ni debe recurrirse a papelitos sueltos para anotar esta clase de información (Durante el laboratorio) Nota total del cuaderno de laboratorio 1 Valor: Algunos rubros no tienen valor asignado. En él de evidencia el nivel de comprensión y la calidad del trabajo realizado por el estudiante. su ausencia sí resta puntos de la nota del cuaderno Trabajo posterior al laboratorio La principal forma de evaluación del trabajo hecho durante el laboratorio. Observaciones Es necesario que después de anotar los resultados obtenidos -- en la práctica. es el reporte del mismo.Materiales y Reactivos Enumerar los materiales y reactivos que se requerirán durante 10 la práctica. Cálculos previos Cualquier cálculo que sea necesario en la preparación de 10 soluciones a usarse o de la muestra en sí. Sin embargo. Reacciones Reacciones químicas o bioquímicas involucradas en la práctica 10 de laboratorio. así como la comprensión obtenida después de realizado el laboratorio. se anote también cualquier observación que posteriormente pueda explicar una alteración en los resultados. ya que su presencia no agrega puntos de nota al laboratorio. Toxicidades Para los reactivos. Debe incluirse al final un diagrama de flujo para hacer más fácil el seguimiento del procedimiento. Procedimiento Enumerar los pasos a seguir durante la práctica. Debe 20 indicarse claramente cada paso. 10 Resultados Debe presentar de la 20 Recuerde que a partir de ellos. Por qué obtuve esos resultados. Se de presentar en tablas de fácil entendimiento a manera que alguien que no haya estado en el desarrollo de la práctica pueda entenderlo con facilidad. Para presentar un buen reporte de laboratorio.o Reporte del Laboratorio El reporte de laboratorio tiene doble función: permite al estudiante entrenarse en el arte de la escritura científica y le brinda la oportunidad de demostrar qué tanto aprendió durante la realización de la práctica. Como futuros médicos. El reporte debe contener las siguientes secciones: Sección Encabezado Resumen Contenido Ver hoja 13. Debe incluir: el número de la tabla. es importante que los estudiantes ejerciten su habilidad de escribir bien. Debajo de la tabla. debe asegurarse que el contenido del reporte sea acorde al tema que se trató en el laboratorio. ya que forma parte de la buena formación de todo profesional. el estudiante debe esforzarse en varios aspectos. principalmente respondiendo las preguntas ¿Cómo lo hice?. los resultados obtenidos en la práctica. NO se aceptan resultados escritos a mano Discusión de Es la sección en donde el estudiante debe discutir los resultados resultados obtenidos en la práctica. Objetivos Se debe de escribir el o los objetivos principales de la práctica. Máximo 10 líneas. es necesario que muestre tanto una buena redacción como una buena ortografía. el título de la tabla entre comillas (“ ”). Primero. incluir la fuente de los datos con tamaño 8. deberá realizar sus conclusiones. posibles fuentes de error. ¿Por qué lo hice? y ¿A qué llegué?. Debe refutar su justificación de fuentes confiables. Valor 1 - Se debe incluir de forma sintetizada lo realizado durante la 10 práctica. manera más ordenada posible. Segundo. 10 30 . no se otorgara calificación si la imagen no tiene descripción. • Fuente de los datos obtenidos. Arial • Los objetivos y las conclusiones. se deben escribir con viñetas. todo de acuerdo a las normas de laboratorio. No se recibirán reportes parcial o totalmente escritos a MANO (salvo excepciones precisas indicadas por su instructor). no se puede concluir teoría ni un asunto que no 15 haya sido incluido en la discusión. Mínimo deben ser 3 conclusiones.Conclusiones Como regla. nombre y fuente y agregar descripción. Estos deberán entregarse debidamente engrapados. Bibliografía Debe escribir toda fuente CONFIABLE que haya consultado para 10 justificar su discusión.0). ni en formato electrónico. así como imágenes si usted lo desea. 8. Sin embargo. El reporte de laboratorio debe ser entregado durante el período de laboratorio siguiente de realizada la práctica. Si incluye imágenes en la sección de ANEXOS debe colocar el número de la figura. • Título de las tablas “Entre comillas”. ya que su presencia no agrega puntos de nota al laboratorio. blancas. Es necesario haber discutido un punto para poder concluir al respecto. su ausencia sí resta puntos de la nota del cuaderno Formato para entregar el REPORTE DE LABORATORIO: Hojas tamaño carta. Nota total del reporte de laboratorio 1 Valor: Algunos rubros no tienen valor asignado. Todo reporte debe presentarse escrito con máquina de escribir o impreso. Se 11 100 . Anexo Debe incluir cualquier información adicional que complemente sus 5 resultados (datos o cálculos) o discusión de resultados. • Fuente: Arial 11. • Interlineado sencillo (1. esto no quiere decir que el estudiante se libere de la evaluación del RESPONSABILIDAD DEL ALUMNO investigar el tema tratado durante la práctica que faltara. donde se anotará semanalmente la fecha en que se entregó el informe. y una reincidencia puede significar el retiro definitivo del o los alumnos involucrados del laboratorio del curso. De ser justificada. ES embargo. palabra por palabra. Cualquier indicio de plagio (reproducción no autorizada de una publicación. Toda aquella persona que se haya ausentado por cualquier motivo de una práctica. sin importar si la falta ha sido justificada o no. Cualquier indicio de copia (entrega de reportes idénticos por parte de dos o más alumnos) será evaluado como un cero para todos aquellos estudiantes que tengan el reporte igual. Las actividades que se entreguen impresas deberán de ir debidamente identificadas de la siguiente manera: 12 . la nota de dicho laboratorio se eliminará. NO TIENE DERECHO a entregar un reporte. Los reportes se corregirán durante la semana y se devolverán en la siguiente semana. independientemente si la falta ha sido justificada o no. incluyendo Internet) será castigado con una nota de cero en el reporte. Si algún alumno tiene cualquier reclamo sobre la forma en que se ha calificado su reporte.entregará una hoja de control de entrega de reporte. sin importar quién lo generó ni quién lo copió. debe hablar con el catedrático DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA después de haberlo recibido corregido. IMPORTANTE: NO se tolerará ningún tipo de copia en los reportes de laboratorio. No se aceptarán reclamos posteriormente. Sin tema de la práctica durante las pruebas finales del laboratorio del curso. Todo caso quedará documentado. a manera de no ser tomada en cuenta en el cálculo de la nota final. UNIVERSIDAD MARIANO GÁLVEZ FACULTAD DE MEDICINA BIOQUIMICA III NOMBRE DE ALUMNO CARNÉ SECCIÓN NUMERO DE LA PRACTICA INFORMACIÓN SOLICITADA NOMBRE DE LA PRACTICA Evaluación de todo el trabajo del laboratorio Al final del curso. la nota final de laboratorio se compondrá de la siguiente forma Rubro a evaluar Puntaje Exámenes cortos de laboratorio 4 Trabajo teórico practico 3 Cuaderno de laboratorio 4 Reportes de laboratorio 4 Texto paralelo 1 Exámenes parciales de laboratorio 2 Examen final de laboratorio (Incluye los temas 2 vistos en todas las prácticas del laboratorio) Total Nota de Laboratorio 20 13 . Estos compuestos forman las conocidas soluciones buffer. que se llevan a cabo dentro del organismo. el jugo gástrico se encuentra en el rango de pH 1 y no se regula en gran manera. Determine el valor de pK de disociación de un ácido débil (KH2PO4). mientras que el pH de la sangre ronda los 7. Conozca las propiedades de las soluciones buffer y la importancia de su rol dentro del organismo y dentro de las actividades del laboratorio de Bioquímica. en su versión simplificada. el organismo se vale de las propiedades de algunos compuestos químicos que tienen capacidad de “resistir” cambios de pH drásticos por la adición o remoción de iones H +. 14 . de gran importancia dentro del organismo.REALIZADO POR: LICDA . 1 CAPACIDAD BUFFER Introducción El papel de las soluciones buffer son de gran importancia no solamente para el organismo sino para el trabajo dentro del laboratorio.40 y es uno de los parámetros más regulados del organismo. El significado del pK de disociación pasa de ser un valor numérico a un valor práctico que el cuerpo usa en la regulación del pH. 3. El pH de los diferentes fluidos orgánicos varía grandemente. así como a sus propiedades. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / D RA. El principal propósito de esta práctica es ilustrar al estudiante a visualizar algunos procesos. Objetivos Que el estudiante 1. 2. Esta práctica ayuda al estudiante a darle un significado más allá que el puramente teórico a la existencia y comportamiento de las soluciones buffer. Para cumplir esta regulación. Por ejemplo. DORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO PRÁCTICA NO. Identifique una solución con mejor comportamiento de buffer. Aprenda la aplicación de curvas de calibración de un aparato simple. Adquiera destreza en el manejo y preparación de soluciones. Antecedentes El agua tiene diversas propiedades que le ha convertido en el solvente universal adecuado para la vida tal y como la conocemos. Conozca la forma correcta de utilizar un potenciómetro. por lo cual su disociación puede escribirse como una transferencia de protones entre ácido y base. la cual se define de la siguiente manera: 15 . como proteínas y ácidos nucleicos. de la siguiente forma: Se ha observado que la tendencia del agua a disociarse se comporta de manera tal que mantiene una constante de disociación. Esta característica le permite interaccionar con la gran cantidad de moléculas de diferente naturaleza que nos conforman. lo cual estabiliza su relación con otras moléculas de agua así como otras moléculas polares (hidrofílicas).Alcance Que el estudiante 1. Una de sus propiedades más importantes fisiológicamente es la tendencia que muestran las moléculas de agua a que una pequeña porción de ellas se disocien. 4. pueda ser estable. El agua tiene capacidad para funcionar como ácido o como base. Es una molécula tetraédrica con extremos ligeramente cargados. Aplique su conocimiento matemático en la obtención e interpretación de gráficos en el laboratorio. 3. 2. K. Es capaz de formar puentes de hidrógeno. Esta propiedad ayuda a que la estructura tridimensional de las grandes moléculas orgánicas. dándole carácter de molécula polar. basicidad. El valor del pH del organismo no permite fluctuaciones muy amplias dentro de la escala.Sin embargo. se recurre a una escala logarítmica mucho más fácil de utilizar: el pH. 16 .40. un valor menor a siete indica acidez y uno mayor. se encontrará una concentración de protones (H +) equivalente a 1 x 10 -7. así que puede incorporarse a la constante (ya que siempre permanece constante) para dar la siguiente ecuación: Esta nueva constante. Esto quiere decir que en un vaso de agua pura. Para facilitar el manejo de estas concentraciones. El pH se define clara y llanamente como el logaritmo negativo de la concentración de protones de una solución. Para lograr esto. En el caso específico de la sangre.0 ni de 7. la disociación del agua se da en un grado tan pequeño que no afecta la concentración total del agua. donde no hay influencias de ácidos o bases. igual número de protones y grupos OH-). ya que ambos casos son generalmente fatales. KW. el pH se encuentra alrededor del 7. el organismo recurre a las llamadas soluciones buffer.7. por ejemplo. pero no puede ir más allá de 7. y es válida para todas las ecuaciones acuosas. Este número varía y ya no se hace tan sencillo cuando ya se consideran soluciones con la influencia de ácidos y bases. y tiene un valor de 1 x 10 -14. se conoce como producto iónico del agua. la regulación debe hacerse de forma muy cercana. o escrito matemáticamente: Esta ecuación permite que lo que sería una escala complicada se convierta en una simple escala lineal que va desde valor 1 a 14. donde el 7 indica neutralidad (es decir. Por tanto. El sistema buffer de más importancia en el organismo es el de CO2 / bicarbonato. 1 es el valor del pK del ácido carbónico El ácido carbónico (H2CO3) se calcula multiplicando la concentración del pCO2 (presión parcial de bióxido de carbono) * la constante 0.3) pH = 6.4 17 . Una característica única para cada sistema buffer es su valor de pK. EL SISTEMA AMORTIGUADOR QUE SE APLICA EN CLÍNICA ECUACIÓN DE HENDERSON HASSELBACH LA CUAL DICE QUE: ES LA pH de la sangre Sustituyendo En donde 6.2 = 20 y logaritmo de 20 = 1. La capacidad de resistir a estos cambios.3 = 7.1 + log de 24 mEq/L / 40 mmHg pH = 6. Estas soluciones generalmente están formadas por ácidos o bases débiles (parcialmente ionizados) con la presencia de una sal del mismo anión que el ácido o base fuerte. se dice que el buffer se encuentra en su capacidad máxima.2 mEq/L) (24/1.1 + 1. depende de la concentración del ácido conjugado y de la base conjugada. Cuando el pH del medio es igual al pK del buffer estudiado.2 (40 por 0.1 + log del bicarbonato/pCO 2 pH = 6.Las soluciones buffer son soluciones que se resisten a cambiar de pH por adición de protones (H+) o grupos hidroxilo (OH-).03 = 1. que no es más que el logaritmo negativo de su constante de disociación.03 que convierte los mmHg del CO2 en mEq/l pH = 6. o capacidad buffer.1 + log de 24/1. Soluciones buffer o amortiguadoras: a. ¿Cómo se encuentra diseñado? c. Cristalería Balón aforado de 50 mL Pipeta volumétrica de 1 mL Pipeta volumétrica de 5 mL Pipeta volumétrica de 10 mL Beacker de 100 mL c. ¿Qué es y para qué se usa? b. solución 1M Fosfato diácido de potasio.Pre—Laboratorio En su trabajo de Pre-Laboratorio. ¿Cuál es su papel dentro del organismo? d.05M b. ¿Qué significa la pK de una solución buffer? 2. ¿Cómo se definen? b. ¿Cuáles son los principales sistemas buffer que se encuentran en el organismo? e.05M Fosfato ácido de potasio. ¿Cómo se maneja y qué cuidados debe tenerse al manejarlo? Materiales a. Instrumentación Medidor de pH. ¿Cómo se calibra? d. Reactivos Hidróxido de sodio. conteste claramente las siguientes preguntas: 1. solución 0. solución 0. ¿Cuáles son sus principales características? c. NaOH. o potenciómetro 18 . Investigue sobre el potenciómetro: a. K2HPO4. KH2PO4. . .Usando las soluciones que se le facilitan en el laboratorio. utilice balones de 50 mL.00 y sonara Beep. prepare las muestras siguiendo las indicaciones del cuadro siguiente. o Presionar la tecla CAL y se escuchará un Beep.05M (mL) 0 1 5 20 30 45 49 50 KH2PO4 0.Calibración del potenciómetro: o Retirar la tapa del potenciómetro. Siga claramente las instrucciones del docente de laboratorio y asegúrese de se r supervisado al momento de tomar las lecturas de su muestra. o Presionar la tecla ON/OFF. o Lavar el sensor con agua destilada y eliminar el exceso de agua sin tocar al sensor. Preparación de las muestras.Obtenga el valor del pH para cada una de las muestras.0 y sonara Beep o Retirarlo del Buffer pH 7. o Introducir el sensor del potenciómetro en el buffer pH 4. Rotule claramente cada muestra para evitar confusiones. esperar a que en la pantalla indique 7. .05M (mL) 50 49 45 30 20 5 1 0 II. Para mayor facilidad. 19 . esperar a que en la pantalla se indique 4. o Seguidamente presionar la tecla CAL y se escuchara un Beep. Procese la información que obtuvo como se indica en la sección de Observaciones importantes. Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 K2HPO4 0. o Retirar el tapón de plástico que está en el sensor.Procedimiento I. o Introducir el sensor del potenciómetro en el buffer pH 7. transfiera el volumen menor usando pipeta volumétrica y afore con el volumen mayor. Lectura. o Obtenga el valor de pH para cada una de las muestras. Total 3. adicionado = [HPO4-2] * Vol. [HPO4-2] usando la información del volumen de K2HPO4 que agregó en la muestra.5% . .Coloque en un beacker 50 mL de muestra (un beacker por muestra) y 50 mL de agua en otro beaker. en el eje y el valor 20 . El logaritmo de la relación de las dos concentraciones usando la siguiente ecuación 2 Haga una gráfica en donde se muestre en el eje x el valor de la relación de concentraciones obtenidas en el inciso anterior.Luego de haber medido el pH de cada solución.Vuelva a medir el valor de Ph de cada solución.o Retirarlo del buffer pH 4.Mida el pH de cada solución. o Introducir el potenciómetro en el beacker con la muestra y presionar la tecla READ y espere el sonido Beep y en la pantalla se le indicara el pH de la muestra. Comparación. [H2PO4-] usando la información del volumen de KH 2PO4 que agregó en la muestra Concentración original * Vol. Total 2. Observaciones importantes Asegúrese de anotar claramente dentro del cuadro que preparó para datos. No lo apague. III. en su cuaderno los valores de pH para todas sus muestras. adicionado = [H 2PO4-] * Vol. o El potenciómetro está listo para leer su muestra. añadir 5 gotas de NaOH al 2. . o Lavar el sensor con agua destilada y eliminar el exceso de agua sin tocar el sensor. . utilizando la siguiente formula Concentración original * Vol. calcule los siguientes parámetros: 1. Para cada muestra. L. 2003 Clinical Chemistry. C. T. y A.natureandscience. (Se recomienda revisar su manual de BQI) Busque en la literatura el valor teórico para el pK de disociación de la siguiente ecuación y calcule el porcentaje de error de su experimento. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. Consultado el 23 de junio. Mosby. 4ª. Department of Biochemistry. Modificado el 23 de diciembre. Inc. Bibliografía de referencia 1. (ed) 2002. Anexo Investigue lo siguiente 1.obtenido para cada muestra. 38-39 3. http://www.net/labmanual. 2003. Pesce. pág. ¿Qué significa rango buffer o de amortiguación y cuál es su relación con el pK? d. University of Minnesota. Estados Unidos. Dé un ejemplo de un buffer o amortiguador médico y describa su función.htm 2. S. A. Capacidad buffer o de amortiguación: a. Analysis. Wiley-Liss. ¿Qué significa? b. J. Páginas 12-13. Devlin. Kazmierczak. ¿Qué sucede cuando se excede? c. 2005. Labotatory Manual for Biochemistry 5025. Edición. Theory. Correlation. 5ª Edición. ¿Por qué una solución buffer no puede actuar de la misma manera en todas las situaciones (a varios valores de pH? 2. 21 . Obtenga una regresión lineal entre estos datos y el valor que obtenga para el intercepto será su valor del pK. 1998. Kaplan. Durante esta práctica el estudiante podrá poner en práctica la precipitación de proteínas plasmáticas y de huevo. concentración y función 3. Para el estudio de las proteínas es necesario que estas se encuentren en estado puro. Las proteínas proporcionan estructuras. hidroge no y nitrógeno. Existe para cada proteína un segmento de ADN que codifica la información que especifica su secuencia de aminoácidos. 4. Explique cómo se encuentran constituidas las inmunoglobulinas. Su papel central en la célula queda reflejado en el hecho que la información genética se expresa en forma de proteínas. 22 . oxigeno. Describa cada una de las fracciones que constituyen a las proteínas del plasma con base a su origen. 2 SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN SUERO Y PLASMA Introducción Las proteínas están compuestas por carbono.R EALIZADO POR: D R. La mayoría de ellas contienen además azufre y algún fósforo. Luego de la separación por medio de la precipitación es necesaria una purificación más profunda a través de la cromatografía. OCHAETA Y LICDA . Objetivos Que el estudiante: 1. así mismo podrá identificar la presencia de proteínas en soluciones de varios alimentos a través del reactivo de Biuret. Conozca e interprete la diferencia entre suero y plasma. catalizan reacciones celulares y llevan a cabo multitud de tareas. NANCY DEL CID PRÁCTICA NO. y las diferentes características de cada una de ellas. existen varias técnicas para poder separarlas como la precipitación por adición de sales y precipitación por adición de aniones y cationes. Describa que es la sangre y sus constituyentes. 2. células. leucocitos y plaquetas) y un líquido llamado plasma.7) o Albúmina Esta fracción de las proteínas del plasma es la más abundante. 2. Aplique su conocimiento matemático en la obtención e interpretación de gráficos en el laboratorio. Está constituida por una fracción celular (eritrocitos. electrolitos.0 g/100 mL (5. factores de la coagulación.7 – 9. Tiene un peso molecular aproximado de 23 . en el que se encuentran suspendidos los constituyentes de la fracción celular además de nutrientes.Alcance Que el estudiante 1. es sintetizada en el hígado. Aprenda la aplicación de curvas de calibración de un aparato simple. sistema del complemento. 4. 3.6) 7.4 g/100 mL (2. metabolitos.3 g/100 mL (3. Antecedentes Las proteínas plasmáticas son un grupo de más de 100 moléculas distintas con características y funciones muy diversas La sangre es considerada como un tejido que circula por un espacio virtualmente cerrado. Conozca la forma correcta de utilizar un potenciómetro.2 – 0. que son los vasos sanguíneos. entre otros.5 – 5. .5 g/100mL de proteínas totales siendo su fraccionamiento el siguiente: Albúmina 4.5) Globulina 2. del cual el 55% está constituido por el plasma y el 45% por células sanguíneas.3 g/100 mL (0.Proteínas del plasma La sangre normal circulante contiene en su plasma alrededor de 7 a 7.6) Fibrinógeno 0. proteínas.0 – 3. Adquiera destreza en el manejo y preparación de soluciones. El volumen de la sangre es de aproximadamente el 8% del peso corporal total. hormonas. IgG.3g por 100 mL. formando capas que se pueden desplegar bajando el pH y volverse a plegar cuando se sube el pH. IgD.000. la Ceruloplastina para el cobre. al asociarse a carbohidratos forman gluco y mucoproteínas.000 hasta algo más de 1 millón. La molécula de fibrinógeno es un dímero que consta de 2 mónomeros constituidos de 3 cadenas 24 . desde cerca de 40. tienen actividad de defensa actuando como anticuerpos. forman las llamadas lipoproteínas. La estructura secundaria parece ser solo una. o Globulina Es una mezcla de varias proteínas las cuales se han podido separar por métodos especiales de laboratorio. con excepción de las gamma globulinas que se sintetizan en el sistema retículo endotelial. Se conocen 5 clases de inmunoglobulinas: IgA. como la Siderofilina o Transferrina para el hierro. la cual esta plegada sobre si misma. La estructura primaria de la albúmina está constituida por 610 aminoácidos dispuestos en una sola cadena peptídica.69. Gamma Globulinas: también llamadas Inmunoglobulinas (Ig). colesterol libre y esterificado. Cada molécula de Ig está formada por 4 cadenas polipeptídicas (2 pesadas llamadas H y 2 livianas llamadas L) las que están unidas por puentes disulfuro. IgM e IgE. α2 y β. El sitio principal de su síntesis es el hígado. o Fibrinógeno Es una proteína que está presente en el plasma humano a una concentración de ± 0. Algunas globulinas se unen a metales para transportarlos por el plasma. La albumina en el organismo cumple con varias funciones como por ejemplo: transporte de co mpuestos orgánicos y recambio de nutrientes y metabolitos. Las globulinas α1. fosfolípidos). α2. uno de ellos es la electroforesis son la cual se obtienen fracciones de globulinas conocidas como α1. Todas las globulinas al asociarse a fracciones de lípidos (TAG. Los pesos moleculares de las globulinas cubren una gama muy amplia. La prueba se basa en la reacción del sulfato de cobre con compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos. en un medio alcalino. El hecho de que una proteína se disuelva en un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrógeno.1M de Oxalato de sodio Solución de hidróxido de sodio al 10% Solución saturada y semisaturada de sulfato de amonio Cristales de sulfato de amonio 25 . pues ésta ha sido transformada en fibrina insoluble en el proceso de la coagulación. Reactivos Solución 0. Si se recoge sangre sin anticoagulante y se deja que está coagule. inmediatamente después de extraer la sangre. El suero carece de células y de factores de la coagulación incluyendo la proteína fibrinógeno. Con el agua a mayor cantidad de puentes de hidrógeno mayor solubilidad. La presencia de hidratos de carbono en la molécula tiene algún significado en el mecanismo de la coagulación. El reactivo de Biuret se utiliza para la determinación de proteínas. lo cual provoca su precipitación. cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de enlaces peptídicos presentes. el líquido que se separa se llama suero. Una de las técnicas de precipitación se basa en la baja solubilidad que tienen las proteínas en disoluciones salinas concentradas. . se le agregan anticoagulantes como oxalato. La acción de la sal es liberar el agua unida a la proteína por puentes de hidrógeno.Plasma y suero El plasma se obtiene cuando. o heparina y se centrifuga. peptidos cortos y otros compuestos con dos o más en laces peptídicos. la sal que más se ha utilizado es el Sulfato de Amonio.polipeptídicas cada uno enlazados por puentes disulfuro. Materiales a. (NH4)2SO4. EDTA. La reacción final produce un complejo color violeta. citrato. Reactivo de Biuret Suero y Plasma oxalatado Agua destilada b. Cristalería Tubos de ensayo Tubos de centrifuga Pipeta volumétrica de 5 mL c. Equipo Gradillas para tubos de ensayo Pipetas pasteur Pipetas de 1 mL y de 5 mL Espátula Centrífuga Procedimiento I. Presencia de Fibrinógeno - Colocar 1 mL de plasma oxalatado en un tubo de centrifuga, agregarle 1 mL de una solución semisaturada de sulfato de amonio y mezclarlos. - Observe el fibrinógeno que se precipitó. - Centrifugue el tubo con su contenido durante 5 minutos, descartar todo el sobrenadante. - Al sedimento agréguele 1 mL de agua destilada, mézclelo completamente. - Agréguele 1 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret. - Observe el color que se desarrolla. II. Separación de Globulinas - Tomar 1 mL de suero y colocarlo en un tubo de centrifuga, agregarle 1 mL de una solución saturada de sulfato de amonio y mezclarlos. - Observe el precipitado. 26 - Centrifugar durante 10 minutos. - Pasar el sobrenadante a otro tubo de centrifuga limpio (este se utilizara en el apartado III). - Al sedimento agregue 1 mL de agua destilada y mézclelo. - Agréguele 1 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret. - Observe el color que se desarrolla. III. Separación de Albúmina - Al sobrenadante del inciso anterior, agréguele unos cristales de sulfato de amonio y agítelo suavemente hasta que se disuelva (si es necesario agregue un poco más). - Observar el precipitado que se forma. - Agréguele 2.5 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 1 mL de reactivo de Biuret. - Observe el color que se desarrolla. Anexo Investigue lo siguiente: 1. Describir la función de por lo menos tres proteínas plasmáticas que se incluyen dentro de las globulinas. Bibliografía 1. Quesada Mora, Silvia. Manual de experimentos para Bioquímica. San José Costa Rica. EUNED. 2007. 148 p. 2. Departamento de Bioquímica, Universidad Autónoma de México. Programa académico, objetivos del curso, contenido temático y manual de practicas de Laboratorio, Biología y Biología Molecular. 2004. Consultado en enero 2010. Reimpreso 2006. 27 R EALIZADO POR: LICDA . N ANCY DEL C ID PRÁCTICA NO. 3 C OAGULACIÓN SANGUÍNEA Introducción El organismo dispone de un sistema de seguridad que le permite detener una hemorragia o pérdida de sangre debido a la rotura de la pared vascular, a este mecanismo se le conoce como hemostasia o coagulación sanguínea. Existen diferentes pruebas para poder evaluar este proceso como el tiempo de sangría, tiempo de coagulación, tempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial, entre otras. Objetivos Que el estudiante: 1. Conozca las pruebas de coagulación y la importancia de cada una de ellas. 2. Conozca que se evalúa en cada prueba. 3. Conozca la forma adecuada de realizar cada una de las pruebas. Antecedentes Antecedentes: Fases de la hemostasis: 1. VASOCONSTRICCIÓN: es la disminución de la luz del vaso sanguíneo, como un mecanismo de defensa, llevado a cabo por el estímulo directo del sistema nervioso simpático sobre el músculo liso de la pared del vaso sanguíneo. 2. AGREGACUÓN PLAQUETARIA: es el proceso que se desencadena cuando una plaqueta se adhiere al factor de Von,Willebrand unido a la 28 XI. La vía intrínseca se inicia con el contacto con una superficie patológica como la exposición de las cargas negativas en el endotelio lesionado. extrínseca y común. La vía extrínseca se inicia con la activación del factor VII y el factor tisular (factor III). COAGULACIÓN SANGUÍNEA: tradicionalmente se le divide en 3 fases: intrínseca. tanto la vía intrínseca como la extrínseca convergen en la activación del factor X que inicia la vía común la cual comprende la conversión de la protrombina en trombina y la conversión de fibrinógeno en el coágulo de fibrina como se observa en el siguiente esquema: 29 .colágena del vaso sanguíneo. lo cual atrae a otras plaquetas. además de la calicreina (que existe inicialmente como precalicreina) y el cininógeno de alto peso molecular. La vía intrínseca comprende los factores XII. IX y VIII. 3. está plaqueta libera tromboxano A2. Las plaquetas que se van agregando emiten pseudópodos y sustancias que activan a otras plaquetas para que sigan uniéndose hasta formar el coágulo plaquetario. Al inicio la INR se calculaba asi: INR = TP del pac. IX y X). está prueba también está alargada. Actualmente cada vez que mandamos hacer un tiempo de protrombina el laboratorio nos informa del INR que significa “razón normalizada internacional”. su valor normal es de 30 a 40 segundos. se trató de que este exponente se aproximara a la unidad y como cualquier número elevado a un exponente 1 no se modifica entonces actualmente solo se utiliza INR = TP del pac / TP control y su valor normal va de 0. y de la enfermedad de von Willebrand.8 a 1. Con esta prueba monitorizamos a las personas que están siendo tratadas con heparina y también refuerza el diagnóstico de enfermedades como las hemofilias tipo A (deficiencia del factor VIII). Con el tiempo de protrombina (TP: valor normal de 10 a 15 segundos). monitorizamos a las personas que están siendo tratadas con warfarina un inhibidor competitivo de la vitamina K (la vitamina K es necesaria para que se dé la gamma-carboxilación de los factores II. VII.2 30 . / TP controlISI. Por medio del tiempo parcial de tromboplastina (TPTP). como se hace muy difícil elevar al exponente. evaluamos la vía intrínseca. esta razón fue propuesta por la OMS en 1982.Dos pruebas de coagulación nos sirven para evaluar la vía intrínseca y extrínseca. hemofilia tipo B (deficiencia del factor IX) y hemofilia tipo C (deficiencia del factor XI). anormalmente en la deficiencia de vitamina K y en las hepatopatías graves. El exponente ISI significaba índice de sensibilidad internacional. Tiempo de coagulación: Es el intervalo requerido para que la sangre venosa se coagule en condición controlada. Esta prueba se altera principalmente en la enfermedad de Von Willebrand (el valor de esta prueba puede pasar los 25 minutos). es una medición del tiempo requerido para la formación de las primeras trazas de trombina que bastan para formar un coagulo visible. Valor de referencia: 2 – 9 minutos. La duración del sangrado de un capilar depende de la calidad y cantidad de plaquetas y de la vasoconstricción. porque la información que proporciona tiene poco utilidad clínica. El tiempo de sangrado constituye la mejor prueba para detectar alteraciones de la función plaquetaria y es uno de los principales estudios en los trastornos de la coagulación.. Se hace una pequeña herida en el lóbulo auricular o en con el antebrazo y se anota el tiempo de sangrado y la velocidad que se forma el coágulo plaquetario. Valor de referencia: 5 a 8 minutos. 31 . Esta prueba casi no se hace actualmente.Tiempo de sangría: El tiempo de sangrado mide la fase primaria de la hemostasia: la interacción de las plaquetas con la pared del vaso sanguíneo y la formación del tapón hemostático. Pre-laboratorio De la coagulación investigue lo siguiente: 1. Otros Papel mayordomo Cronometro Lancetas 32 . Cristalería Tubos de ensayo Laminas porta-objeto c. A que se refiere cuando se habla de la vía intrínseca y extrínseca de la coagulación 4. Equipo Gradillas para tubos de ensayo Micro pipeteador automático 200µL Micro pipeteador automático 50 µL Baño de María a 37ºC d. Reactivos Reactivo para Tiempo de Protrombina (TP) Agua Destilada Control Normal para TP Control Patológico para TP b. ¿Qué son las plaquetas? 3. ¿A qué conocemos como fibrina? 2. ¿Qué tipo de anticoagulante debe de usarse en pruebas de coagulación? Materiales a. 1 Muestra No.Añadir con fuerza 100 µL del Reactivo de TP al tubo del inciso 3) y cronometrar hasta la formación de hilos de fibrina.Usando una lanceta.Calentar el reactivo de TP a 37ºC .Desinfectar el área a puncionar. 2 II. Tiempo de Sangría . MUESTRA TIEMPO EN INR SEGUNDOS Control Normal -- Control Patológico -- Muestra No.Luego de recolectada y separada la sangre . .Colocar 50 µL del control normal de TP en un tubo e incubarlo a 37ºC en el baño de Maria durante 2 minutos. . Tiempo de Protrombina (TP) .Colocar una lámina portaobjetos detrás del pabellón de la oreja (esto con la finalidad de darle firmeza a la punción que se ejecutará). La herida deberá ser lo suficientemente posible profunda para que fluya libremente la sangre sin apretar con el dedo. . se perfora el lóbulo de la oreja mediante un golpe firme. .Calentar la oreja. 33 . .Se utiliza la zona que esta 15 a 20 mm por encima de la porción grasa redonda del lóbulo de la oreja.Procedimiento I.Repetir el inciso 3) y 4) para el control patológico y la muestra. . explique el por qué.Cuando el papel ya no absorba nada. 2.A intervalos de medio minuto.Reportar el tiempo transcurrido en minutos y segundos. JR. Cuantos factores de la coagulación existen. Fernández Ch. 2. 2002. 34 .. mencione cada uno de ellos Bibliografía 1. JG. 102 p. detener el cronometro.. Pérez Folgar. Diagnostica Stago. recoger la cota de sangre que se forma en la oreja con un pedazo de papel mayordomo . Manual de Prácticas de Laboratorio de Hematología Básica.Activar el cronómetro inmediatamente . Anexo Investigue lo siguiente 1. Guatemala. cuando hay administración de anticoagulantes en un paciente. USAC. . Francia. Ficha técnica NEOPLASTINE® CI PLUS. Clínicamente cual es el comportamiento del TP. NANCY D EL C ID (2011) PRÁCTICA NO. El principio del método se basa en que la creatinina reacciona con el picrato alcalino formando un complejo de color rojo. 35 .REALIZADO POR: LICDA . Aprenda a realizar cálculos de concentración por interpolación usando curvas de calibración 3. lo cual permite su cuantificación con el uso de estándares de creatinina de concentración conocida. 4 FUNCIÓN RENAL: DETERMINACIÓN DE CREATININA Introducción La prueba que se usará en el laboratorio es un método colorimétrico de punto final para la detección de creatinina en suero u orina. Practique la preparación de curvas de calibración con estándares de concentración conocida. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / D RA . 2. Realice un método espectrofotométrico para determinación de analitos en muestras biológicas. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones. Objetivos Que el estudiante 1. 2. La intensidad de color es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra. Interprete resultados clínicos. Alcance Que el estudiante 1. DORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO MODIFICADO POR: LICDA . a una longitud de onda de 510 nm. Investigue las patologías que presentan alteraciones de los valores de creatinina sérica y urinaria. con variaciones diarias de menos del 10%. La creatinina deriva de la deshidratación no enzimática de la creatina en músculo esquelético. La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el picrato alcalino para formar un complejo de color rojo. y por lo tanto la tasa de deshidratación de creatina es constante también-. Como otros compuestos de la muestra también reaccionan con la muestra. Por lo tanto la concentración de creatinina sérica es muy estable. La intensidad del color se cuantifica con un espectrofotómetro. Pre-laboratorio 1. 36 . La concentración de creatinina se calcula por diferencia entre la absorbancia (intensidad de color) antes y después de agregar e l ácido. y por interpolación (comparación) con la absorbancia de un estándar o curva estándar se obtiene la concentración de la muestra que se analiza. la tasa de depuración de creatinina puede ser usada como estimación de la función glomerular. el cual destruye el complejo picrato -creatinina pero no los otros complejos. La cantidad de creatina por unidad de masa muscular es constante. ¿Qué es la creatinina? 2. La creatinina es un compuesto sumamente difusible y se elimina del organismo casi exclusivamente por filtración renal: Es filtrada libremen te en el glomérulo y no es reabsorbida en los túbulos. para eliminar la interferencia se agrega ácido.Antecedentes Los niveles de creatinina sérica y la excreción urinaria son una función de la masa muscular en personas normales. y muestran muy poca respuesta a cambios en la dieta. Por estas propiedades. Su determinación en suero y la tasa de depuración de creatinina endógena constituyen parámetros importantes para el diagnóstico de diversas afecciones renales. 200-1000 L . 1:100 y 1:200 de la muestra de orina. ácido acético al 20% b. 1:50. Haga los cálculos necesarios para obtener 1 mL de una muestra de orina diluida para cada una de las siguientes diluciones: 1:2.3. Reactivos Muestras de suero y orina de 24 horas diluida 1:50 Solución salina.0 mg/dL Solución de ácido pícrico 41 mmol/L Solución de buffer alcalino. Solución stop.5 mL Tubos de vidrio 37 L. lectura a 510 nm Celdas para espectrofotómetro Baño de agua a 37°C Reloj o timer Micropipetas de 2 a 20 μL. Materiales a.4 Reactivo de trabajo: Prepare en frasco de plástico mezcla a partes iguales de ácido pícrico y buffer alcalino. 2. Cristalería Tubos Eppendorf de 1. pH 12.9% Estándar de creatinina. 10-100 Puntas para micropipeta c. Instrumentación Espectrofotómetro. NaCl al 0. De be usarse guantes en todo momento. Procedimiento Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo debidamente identificados: Blanco Estándar Muestra de Muestra de Suero orina Estándar -- 10 µL -- -- Muestra Suero -- -- 10 µL -- Muestra Orina -- -- -- 10 µL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Reactivo de Creatinina Mezcle e incube por 10 min en baño a 37°C Dentro de los 15 minutos después de retirarlo del baño. Evite derrames y el contacto directo con la piel y mucosas. Toda muestra biológica debe tratarse como potencialmente infecciosa.Precauciones Los reactivos utilizados son tóxicos y corrosivos. llevando a cero con el blanco. así como ser cauteloso durante la manipulación. Maneje todas las soluciones con cuidado. leer e l estándar y las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 510 nm. 38 . por lo cual debe cumplirse con las normas de bioseguridad adecuadas. Llevando el equipo a cero con el Blanco Stopper 50 µL -- 50 µL 50 µL Mezclar y dejar los tubos 5 minutos a temperatura ambiente y volver a leer las muestras. pero en la orina de cada 39 . arginina y metionina. la cual es sintetizada a partir de 3 aminoácidos: glicina. Si en el plasma existen 20 mg de urea por cada 100 ml y se filtran 130 ml de plasma cada minuto. La creatinina se sintetiza por la deshidratación de la creatina-P (un reservorio de energía).Calculo de resultados • Creatinina en suero (mg/dL)= (Abs 1.E)= La creatinina tiene la ventaja de que es un compuesto endógeno. entonces se filtran 26 mg de urea cada minuto. Estándar • Creatinina en orina (g/24 horas)= Abs1-Abs2 * 0.020 g/L * 50 * Vol en L Abs. sin embargo la creatinina también es secretada en los túbulos de la nefrona y por eso cada minuto realmente se depura la creatinina de 180 ml de plasma y no 130 ml como en el caso de la inulina que solo se filtra.C. Si existe por ejemplo 1 mg de creatinina por mililitro de plasma y se filtran 125 o 130 ml de plasma cada minuto. por lo tanto lo forma nuestro propio cuerpo. Estándar • Depuración de Creatinina Endógena (D. esto significa que aparecieron 50 mg de creatinina más de lo que podría esperarse si la creatinina solo se hubiera filtrado. es otro compuesto que en alguna oportunidad también se uso para medir tasa de filtración glomerular. en la orina aparecen 180 mg de creatinina en cada minuto. • La UREA.0 mg/dl Abs.Abs2)* F F= 2. del 100 % de urea que se filtró se reabsorbió el 53 %.C. (ml/min)= Creatinina en orina de 24 horas (g/24 horas) * 694 mL/min Creatinina en suero (mg/L) 40 .8 a 2.6 a 1.4 g/día Las mujeres tienen un valor de creatinina urinaria de 0.2 mg/dl D. en los túbulos y se excretó el 47 % La velocidad del filtrado glomerular o tasa de filtración glomerular en una persona adulta sana es de 125 ml por minuto. Para la eliminación de creatinina corregida con la superficie corporal.78 mg) se reabsorbió. en las mujeres se debe de considerar un 10 % menos.73/A TFG = tasa de filtración glomerular U = concentración de creatinina urinaria V = volumen de orina eliminada en 24 horas (1440 minutos) P A = concentración de creatinina en el plasma = Area de superficie corporal de la persona a quien se investiga Los valores normales de creatinina en orina y plasma son: Los hombres tienen un valor de creatinina urinaria de 0. La creatinina en plasma para hombres y mujeres es menor o igual a 1. por lo tanto. quiere decir que el resto (26-12. la TFG es para los hombres adultos de a 137 ml/min y para las mujeres de 88 a 128 ml/min.22=13.E.22 mg.8 g/día La diferencia consiste en que la creatinina en la orina esta en relación a la masa muscular y los hombres tienen más masa muscular que las mujeres.minuto solo aparecen 12. 97 TFG = U (mg/dl) x V (ml/24 h) / P (mg/dl x 1440 min x 1. Correlation. Pesce. L.1.64 .92 mg/dL Hombres 1.0 – 2. 864101004. y A. Kazmierczak.8 – 1.04 mg/dL Mujeres Orina: 0. 2003 Clinical Chemistry. Analysis.8 g /24 horas Depuración de creatinina: 80-140 mL/min Bibliografía de referencia 1. Mosby.57 . Inc. C. S. Rosario.0 g /24 horas Mujeres 0. Edición. 41 . Kaplan. Argentina 2.Valores de referencia Suero: Hombres 0. Theory. 4ª. Wiener Lab. J. A. Ficha técnica Creatinina Directa.0. Interprete resultados clínicos. NANCY DEL C ID (2011) PRÁCTICA NO. Se familiarice con el uso de las micropipetas y diluciones. El amoníaco formado se incorpora al α-cetoglutarato por acción de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidación paralela de NADH a NAD+. 42 . Alcance Que el estudiante 1. 5 FUNCIÓN RENAL: D ETERMINACIÓN DE N ITRÓGENO DE U REA Introducción La concentración de urea será cuantificada espectrofotométricamente. GABRIELA CIFUENTES MODIFICADO POR: LICDA . 2. en donde la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea. Realice la prueba de determinación de nitrógeno de urea. Use los valores obtenidos para evaluar la condición del paciente. en amoníaco (NH3) y anhídrido carbónico (CO2). presente en la muestra.R EALIZADO POR: LICDA . 2. ureasa Urea + H2O 2 NH3 + CO2 GIDH NH3 + NADH + H + 2-oxoglutarato I-glutamato + NAD+ + + H2O Objetivos Que el estudiante 1. Igual ocurre en los vómitos intensos. diabetes. tuberculosis renal. en el coma diabético. y constituyen el producto final del metabolismo de las proteínas. donde intervienen factores de hipotensión. La cantidad de urea excretada está directamente relacionada con la ingesta de proteínas en la dieta. sudoración profusa. diarreas. pielonefritis y riñón poliquístico. glomerulonefritis aguda. Reactivos Muestra de suero 43 . anuria traumática. pero reversible a veces en pocas horas. y actividad de la glándula adrenal. en el post-operatorio inmediato. quemaduras extensas. insuficiencia suprarrenal y en la agonía. infecciones que ocurren por proteólisis tisular aumentada. catabolismo proteico.Antecedentes La urea se forma en el hígado con la ayuda del CO2. hidronefrosis. Sus niveles se correlacionan mejor con la sintomatología de uremia que los niveles de creatinina. y es usada como índica de función glomerular. aumentada en estados febriles. Niveles altos se encuentran en uremia aguda. Pre-laboratorio 1. Cuando el aumento obedece a causa extrarrenal. Sus niveles se aumentan en necrosis tisular. choque hemolítico post-transfusional. Mencione 3 patologías que se asocien a la alteración del nitrógeno de urea y mencione los síntomas de cada una de ellas. El test de Nitrógeno de Urea mide la porción de nitrógeno de la urea. esclerosis renal. pues también se eleva por causas extrarrenales. pero hay que tener en cuenta que no todo aumento significa nefropatía. donde por la mañana se puede encontrar en 40 mg/dL y en la tarde estar dentro de la normalidad. nefrosis. como sucede en la deshidratación aguda. es fenómeno agudo o subagudo. Materiales a. Su aumento es signo elemental de insuficiencia renal orgánica. Cristalería Tubos de vidrio Procedimiento Seguir el siguiente esquema de pipeteo en cada tubo de ensayo. 10-100 L.Reactivo de trabajo. NADH. ureasa y glutamato deshidrogenasa) Estándar con una concentración de 0. Instrumentación Espectrofotómetro. Continuar con la incubación Medir nuevamente la absorbancia a los 120 segundos (60 segundos después de la primera lectura) la cual será la ABS2 para las muestras y S2 para el estándar. la cual será la ABS1 para las muestras y S1 para el estándar. 200-1000 L Puntas para micropipeta Gradilla c. debidamente identificados: Estándar (S) Muestra 1 (Mx1) Muestra 2 (Mx2) Estándar -- 10 µL -- Muestra Suero 1 -- -- 10 µL Muestra Suero 2 -- -- -- 1 mL 1 mL 1 mL Reactivo de trabajo Mezclar (sin invertir) y disparar un cronometro A los 60 segundos exactos medir la absorbancia de los tres tubos. lectura a 340 nm Celdas para espectrofotómetro Cronometro Micropipetas de 2 a 20 μL. el cual consta de una mezcla de buffer y enzimas (2oxoglutarato.60 g/L b. 44 . 861237005. Argentina 2.14 Nota: para el reporte de sus resultados. 7ª. Gilberto y Ángel. Wiener Lab. Ficha técnica Urea Cinética. Mauricio. Bogotá. Rosario. Valores de referencia Urea = 15 – 39 mg/dL Nitrógeno de Urea = 7 – 20 mg/dL Anexo: Investigue sobre la reacción de Berthelot modificada Bibliografía 1. Ángel.Calculo de resultados Urea (g/L) = f * (ABS1 – ABS2) En donde f = 0. Editorial Médica Panamericana. 2006. 45 . Interpretación Clínica del Laboratorio.60 g/L (S1 – S2) Para la determinación del Nitrógeno de Urea: divida el resultado de la Urea / 2. deberá de calcular la concentración de Nitrógeno de Urea en mg/dL. Edición. 2. aco plada a la formación de un complejo de color. uricasa Ácido úrico + O2 + 2H2O Alantoína + CO2 + H2O2 peroxidasa 2 H2O2 + DCHBS + PAP Quinoneimina + HCl + 4H2O Objetivos Que el estudiante 1. Alcance Que el estudiante 1. DORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO PRÁCTICA NO. Se introduzca a los métodos enzimáticos para determinaciones clínicas. El H 2O2 formado reacciona por la actividad catalítica de la peroxidasa con ácido 3. La uricasa cataliza la reacción del ácido úrico presente en la muestra.5-dicloro-2hidroxibencensulfónico (DCHBS) y 4-aminofenazona (PAP) para producir un complejo rojo-violeta de quinoneimina que se cuantifica en el espectrofotómetro con una longitud de onda de 520 nm. para formar alantoína y peróxido de hidrógeno (H2O2). 6 D ETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE ÁCIDO ÚRICO Introducción La concentración de ácido úrico será cuantificada espectrofotométricamente a través de la reacción de ácido úrico catalizada por uricasa. 46 . Estudie las patologías asociadas con ácido úrico elevado. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / D RA . Continúe familiarizándose con la aplicación de métodos espectrofotométricos para determinación de analitos en muestras biológicas.REALIZADO POR: LICDA . (3) secreción hacia el lumen en la porción distal del túbulo proximal.2. o la acidosis láctica pueden interferir con la secreción tubular del urato. Los depósitos de urato son los responsables de los síntomas La artritis gotosa puede asociarse con cristales en fluido articular. La falla renal aguda o crónica puede producir retención renal de ácido úrico. producen una respuesta inflamatoria intensa mediada por leucocitos polimorfonucleares y macrófagos. Cuando los depósitos ocurren en tejido blando. Antecedentes El ácido úrico es el mayor producto del catabolismo de los nucleósidos de purina. (2) reabsorción de 98-100% en el túbulo proximal convolucionado. La gota secundaria es resultado de hiperuricemia asociada a causas identificables.0 mg/dL (hombres). Un 75% del acido úrico excretado por los seres humanos es excretado por la orina. El manejo renal es complejo y ocurre en 4 pasos: (1) filtración glomerular. cuando el urato monosódico precipita de los fluidos sobresaturados. La hiperuricemia se define como concentraciones de ácido úrico en sangre mayor a 6. el resto es secretado al tracto gastrointestinal. Las purinas provenientes de la dieta se convierten a ácido úrico directamente. La acidemia orgánica por aumento del ácido acetoacético en diabéticos. Algunos medicamentos. 47 . En células tumorales. Interprete resultados clínicos. Sin embargo la mayor parte de las purinas que se excretan como ácido úrico en la orina proviene de la degradación de ácidos nuc leicos endógenos. donde se degrada a alantoína y otros compuestos por las enzimas bacterianas.0 (mujeres) o 7. y depósitos de cristales en los tejidos que rodean la articulación. el rápido recambio de ácidos nucleicos puede también inducir hiperuricemia. en particular diuréticos p ueden ser la causa de la falla. La gota primaria se asocia con hiperuricemia esencial debido a la sobreproducción metabólica de purinas o excreción disminuida de ácido úrico. y (4) nueva reabsorción en el túbulo distal. La filtración neta de ácido úrico es de 6 a 12% de la cantidad filtrada. La manifestación clínica extrema de hiperuricemia ocurre en forma de gota. Se reducen la interferencias con metabolitos como bilirrubina o ácido ascórbico usando moléculas complejas. 3. como el fenol substituido de la aminofenazona. Reactivos .0 mg/dL. 2. con producción de H 2O2. Investigue cuales son los valores normales de ácido úrico en sangre y en orina de 24 horas Materiales a.0 mg/dL tienen alrededor de 150 veces más riesgo de tener artritis gotosa que el grupo de hombres con valores menores a 6. Investigue en que situaciones se pide análisis de ácido úrico. Haga un cuadro de causas de hiperuricemia. alcanzando niveles similares a los reportados en hombres. o molécula coloreada. Un acercamiento a la interpretación de valores de ácido úrico sérico es considerar el grado de hiperuricemia en relación con el riesgo de desarrollo de gota. Hombres con valores de ácido úrico por encima de 9. aumentando un 10% entre los 20 y 60 años de edad.Solución de reactivo 48 . Las mujeres muestran un aumento considerable después del inicio de la menopausia. 8 mg/dL .El nivel de ácido úrico en la sangre se incrementa gradualmente con la edad.Estándar de ácido úrico. ¿Cuáles son los diferentes métodos para la identificación de ácido úrico? 4. Prelaboratorio 1. La uricasa cataliza la oxidación del ácido úrico a alantoína. La excreción de ácido úrico Los métodos que involucran reacciones enzimáticas tienen mayor especificidad que otros métodos colorimétricos debido a que el sustrato reacciona específicamente con la enzima utilizada. En este procedimiento se utiliza un sistema de peroxidasa acoplado con moléculas aceptoras de electrones que producen un cromógeno. Blanco Estándar Muestra Suero Muestra Orina Estándar (S) Muestra de Muestra de orina Suero (Mx1) (Mx2) -- 20 µL -- -- -- -- 20 µL -- -- -- -- 20 µL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL diluida Reactivo de Acido Urico Mezcle e incube a temperatura ambiente por 20 min o 5 min en el baño de maría.3 mmol/L DCHBS 4 mmol/L Uricasa > 200 U/L Peroxidasa>1000 U/L b.0. Mida la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 520 nm 49 . lectura a 520 nm Celdas para espectrofotómetro Baño de agua a 37°C Micropipetas de de 2 a 20 μL. Prepare una dilución 1:11 de la muestra de orina. pH 7. Cristalería Tubos de vidrio de 10 mL c. 50 mmol/L 4-aminofenazona. 20-200 L.enzimático Buffer fosfato. 200-1000 L Puntas para micropipeta azules y amarillas Procedimiento 1. 0. Instrumentación Espectrofotómetro. C.4 a 7. 4.4 a 5. Burtis. p 422-426. . Saunders Company. muestra suero y muestra orina frente al Blanco antes de 15 min. y E. Calculo de resultados Acido Úrico en suero (mg/dL): Abs de Mx1 * Concentración del Estándar Abs de S Acido Úrico en orina (mg/24 horas): Abs de Mx2 * Concentración S * 11 * Vol Abs de S Valores de referencia Suero: • Hombres: 3. USA. Ashwood. 50 5ª.B. 106901E Human. transfiera 1 mL a la celda espectrofotométrica Mida en el siguiente orden: Estándar. Wiesbaden.0 mg/dL • Mujeres: 2. W. Edición. Alemania. 2001. Ficha técnica URIC ACID Liquicolor. Filadelfia.7 mg/dL • Orina: 250 a 750 mg/24 horas Bibliografía de referencia 3. Fundamentals of Clinical Chemistry.Para medir la absorbancia. Como su nombre lo indica. GABRIELA C IFUENTES (2009).R EALIZADO POR: LICDA . Objetivos Que el estudiante: 1. D ORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO MODIFICADO POR: LICDA . Podrá describir la base inmunológica de una prueba de ELISA 3. Simule una prueba de ELISA para una especie específica. Explicará el por qué la especificidad del análisis de ELISA 51 . LICDA . Diferencie entre ELISA directo. ELISA tipo sándwich y ELISA indirecto Alcance El estudiante 1. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / DRA . está relacionado con el uso de partículas inmunológicas unidas a un soporte para la detección de la especie que se busca. 7 EL ELISA COMO UN ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO Introducción El ELISA (por el término en inglés Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es uno de las técnicas clínicas más utilizadas para fines de diagnóstico humano. Reconocerá el esquema de cada uno de los tres tipos diferentes de ELISA que existen 2. N ANCY D EL C ID (2011) PRÁCTICA NO. En la presente práctica se realizará una simulación de análisis de ELISA para la mejor comprensión de la base química e inmunológica de la prueba. sea esta patógena o no 2. mientras que el ELISA se usa frecuentemente en diagnósticos virales (como HIV). radioinmunoensayo generalmente se Figura 1: Placa de ELISA. usando un anticuerpo de captura para el antígeno que se busca. en el ELISA se realiza por una reacción que convierte un sustrato incoloro a una sustancia coloreada dentro del pozo.Antecedentes El radio inmmunoensayo (RIA. con análisis El terminado. Una versión modificada del ELISA directo. Pre—Laboratorio 52 Es . En cualquier caso. se requiere la preparación de un antígeno o anticuerpo conocido puro (o ambos) para lograr estandarizar la prueba. Mientras que el radio inmunoensayo la detección se realiza midiendo la cantidad de radiación que permanece en el pozo de la placa. Para ambos métodos. haciendo que la recolección de datos sea más fácil. a la vez que evita los riesgos del manejo de material radioactivo. cuando se requiere. En el ELISA directo se mide o detecta la presencia de un antígeno específico en la muestra. siempre y cuando sea el mismo tipo de muestra. aunque la forma de detección final en ambos procedimientos es diferente. mejora la sensibilidad del análisis. como la que se muestra en la Figura 1. utiliza para la medición de hormonas en sangre y tejidos. por ello que esta técnica es la preferida por encima del RIA. el ELISA se lleva a cabo en placas de 96 pozos de material plástico especial. por sus siglas en inglés) son ensayos que involucran la unión directa de un anticuerpo para la determinación de un antígeno o anticuerpo buscado. llamada ELISA tipo sándwich. por sus siglas en inglés) y el ensayo inmunoadsorbente ligado a una enzima (ELISA. El cambio de color puede verse directamente en la placa. mientras que en el ELISA indirecto se mide o detecta la presencia de un anticuerpo específico. usando para ello una enzima unida a un anticuerpo. Estandarizar la prueba significa asegurar que la prueba funcionará bien y de la misma forma para la muestra de cualquier paciente. Solución de lavado . en oscuridad STOP 100µL 100µL 100µL Mezclar cuidadosamente 53 100µL .Placa para ELISA Procedimiento 1.Antes de llegar al laboratorio.Enzima conjugada . en inglés. Reactivos .Muestra 2 . indirecto y tipo sanwich? Materiales a.Muestra1 . “screening test”) 3. Seguirá el siguiente esquema de pipeteo para una prueba de ELISA Pozo Calibrador 1 A1 B1 C1 20µL Calibrador 2 20µL Muestra 1 20µL Muestra 2 Conjugado D1 20µL 200µL 200µL 200µL 200µL Mezclar e Incubar por 10 minutos a T° ambiente Lavar con 400µL cada pozo (repetir 3 veces) Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL Incubar por 5 minutos a T° ambiente. investigue: 1.Calibrador 2 . Explique de qué depende la especificidad de un análisis de ELISA. 4. ¿Qué significa un “análisis de tamizaje” (o. Otros .Calibrador 1 . ¿En qué consiste el ELISA directo. Se le dará una tira con pozos inactivos para ELISA 2.Sustrato . ¿Qué aplicaciones diagnósticas importantes tiene el ELISA? 2.Solución STOP b. Garland Science Publising. et al.html 2. http://www.ShowTOC&rid=imm.biology.nlm. 5a Edición. Además.TOC&dep th=10 54 . New York.edu/immunology/activities/elisa/elisa_intro. C. http://www. 1998.ncbi. ELISA Activity.gov/books/bv. febrero. A. The Biology Project. Bibliografía de referencia 1. investigue qué otros tipos de ELISA existen además de los tres ya mencionados. Janeway. Página consultada el 25 de 2007.. 2001.View.Anexo Investigue qué pruebas clínicas se realizan con ELISA.arizona.nih. Inmunobiology.fcgi?call=bv. 8 D ETERMINACIÓN C UALITATIVA DE TIROXINA Y TRIIODOTIRONINA Introducción En la presente práctica se llevará a cabo una prueba de ELISA para determinar la presencia de tiroxina total en muestras desconocidas.R EALIZADO POR: LICDA . Demuestre la forma correcta de utilizar una micropipeta. 55 . Reconozca los cuidados que debe tenerse durante todas las etapas de la realización de una prueba de ELISA Alcance Que el estudiante: 1. 2. Objetivos Que el estudiante: 1. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / DRA . Practique las precauciones indicadas durante el manejo de muestras clínicas. 2. Conozca la forma correcta de manejar una muestra clínica para asegurar su integridad y la calidad de los resultados obtenidos 5. Explique el esquema de la técnica de ELISA utilizado. Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de T4 total en muestras desconocidas. Indique la importancia de realizar correctamente los lavados durante una determinación por técnica de ELISA 4. enfatizando los cuidados que debe tenerse para asegurar el resultado obtenido. 3. Esta práctica pretende ilustrar al estudiante sobre cómo se lleva a cabo una determinación sencilla usando la técnica de ELISA. D ORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO MODIFICADO POR: LICDA . N ANCY DEL CID (2011) PRÁCTICA NO. Sin embargo. investigue: 1. Más del 99% de T4 en la sangre está unida reversiblemente a las proteínas plasmáticas. en el recién nacido. Es parte integrante del perfil tiroideo. ¿Qué significa el término ELISA competitivo? 2. La concentración de T3 es mucho más baja que la de T4. quedando una parte muy pequeña libre.  Triiodotironina – T3 total Es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. Reactivos Calibradores 56 . pero su potencia metabólica es mucho más alta. Al igual que la T4. Bajos niveles de T4 han sido asociados con cretinismo. debe de interpretarse con reservas. que es la porción que controla los procesos metabólicos. Para la realización de T3 y T4 se utilizará un ELISA de tipo competitivo. Niveles elevados de T4 han sido encontrados en hipertiroidismo debido a enfermedad de Grave y de Plummer así como en tiroiditis aguda y subaguda. Pre—Laboratorio Antes de llegar al laboratorio. hacer un esquema de este tipo de ELISA. TBG).Antecedentes  Tiroxina – T4 total – Tetraiodotironina La Tiroxina es una hormona sintetizada y almacenada en el tiroides. la T3 representa una herramienta muy valiosa para el diagnóstico de enfermedad tiroidea. el cual se emplea en el diagno stico de toda afección tiroidea y su dosificación aislada. Materiales a. su dosificación permite diagnosticar precozmente el hipotiroidismo congénito y evitar el retraso mental. enfermedad de Hashimoto y algunas anormalidades genéticas. mixedema. Más del 99% de T4 en la sangre está unida reversiblemente a las proteínas plasmáticas (principalmente a Globulina unida a Tiroxina. 100-1000 L Puntas para micropipeta azules y amarillas Procedimiento 1. que se haya obtenido usando EDTA o heparina como anticoagulantes. debe usarse muestras de suero o plasma (¿Cuál es la diferencia?). Determinación de T3 Pozo Calibrador 1 A1 B1 C1 D1 E1 50µL Calibrador 2 50µL Calibrador 3 50µL Muestra 1 50µL Muestra 2 Conjugado 50µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Mezclar e Incubar por 60 minutos a T° ambiente Lavar con 300µL cada pozo (repetir 3 veces) 57 . En este caso. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente ante s de usarse.Enzima Conjugado-antigénico Solución de lavado Reactivo Sustrato Solución STOP Muestra desconocida para T3 y T4 b. No debe usarse muestras hiperlipidémicas o hemolizadas (¿Qué quiere decir esto y por qué?). es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el mismo tiempo en todos los pocillos. Instrumentación Tiras de micropocillos Micropipetas de 10 a 100 μL. 2. Se le proporcionarán las muestras a utilizar para el análisis. Para obtener resultados reproducibles. Se le darán diferentes calibradores (por mesa se utilizarán 3).00 ng/mL o D = 2. en oscuridad STOP 50µL 50µL 50µL 50µL 50µL Mezclar cuidadosamente e interpretar Observaciones importantes .50 ng/mL o C = 1. en oscuridad STOP 50µL 50µL 50µL 50µL 50µL Mezclar cuidadosamente e interpretar Determinación de T4 Pozo Calibrador 1 A1 B1 C1 D1 E1 25µL Calibrador 2 25µL Calibrador 3 25µL Muestra 1 25µL Muestra 2 Conjugado 25µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Mezclar e Incubar por 60 minutos a T° ambiente Lavar con 300µL cada pozo (repetir 3 veces) Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Incubar por 15 minutos a T° ambiente.Calibradores para T3 o A = 0 ng/mL o B = 0.50 ng/mL o E = 5. los cuales tienen una concentración conocida de T3 o T4.Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Incubar por 15 minutos a T° ambiente.00 ng/mL o F = 7. .50 ng/mL 58 . C. Theory. Analysis. Correlation. Interpretación de resultados Los resultados se interpretaran de la siguiente manera: . . Edición. si T3 o T4. Mosby. 59 . L. Kaplan. Inc.Calibradores para T4 o A = 0 µg/mL o B = 2.0 µg/mL o D = 10. y A.. Kazmierczak. 4ª. A. Inserto del producto. 827-848 2. pág.0 µg/mL . T4 Prueba ELISA para la determinación cuantitativa de Tiroxina Total (T4) en suero o plasma humanos. S.Deberá de conocer cuales calibradores está utilizando su grupo de trabajo.0 µg/mL o E = 15. ¿Existen otras pruebas que deben acompañar a éstas? Bibliografía de referencia 1. .Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio de cruces.Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber la concentración de cortisol presente en sus muestras. Anexo Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados (elevados o disminuidos) de la hormona T4 y T3. J.Deberá de tener en cuenta que prueba está realizando su mesa.0 µg/mL o C = 5. 2003 Clinical Chemistry. Pesce. siendo de menor (+) a mayor (+++) intensidad.0 µg/mL o F = 25. Es formado y secretado por la corteza suprarrenal. Antecedentes El cortisol. Explique el esquema de la técnica de ELISA competitivo y pueda reconocer las diferencias que existen entre cada tipo de ELISA. es un esteroide de 21 carbonos y es el glucocorticoide más importante en el humano. 2. también llamado hidrocortisona o componente F. El resto de forma libre (alrededor de un 3%) es la forma biológicamente activa del cortisol. Reconozca los puntos críticos en la realización de una prueba de ELISA. Alcance Que el estudiante 1. 2. Estudios han demostrado que todo el cortisol secretado deriva del colesterol circulante en condiciones basales y como resultado de la estimulación aguda con adrenocorticotropina (ACTH). Objetivos Que el estudiante: 1. saliva y orina.R EALIZADO POR: LICDA . Realice una prueba de ELISA competitivo para detectar la presencia de cortisol en muestras desconocidas. Adquiera destreza en el manejo y preparación de una placa de ELISA. plasma. el cual puede determinarse en muestras de suero. GABRIELA CIFUENTES MODIFICADO POR: LICDA . 9 D ETERMINACIÓN C UALITATIVA DE CORTISOL POR EL MÉTODO DE ELISA Introducción El cortisol es el principal glucococorticoide secretado por la corteza suprarrenal humana y el esteroide más abundante en la sangre periférica. mientras que alrededor del 7% está unida a la albumina. N ANCY DEL CID (2011) PRÁCTICA NO. 60 . El 90% del cortisol está ligado a la proteína plasmática transcortina. En el hombre. pueden producirse variaciones diarias de los niveles de ACTH en el plasma en ausencia de toda variación de los niveles plásmaticos de cortisol (Enfermedad de Addison). muestran en individuos normales no sometidos a estrés. durante estos episodios. los niveles plasmáticos son el resultado de una serie de episodios secretorios distintos y son más elevados entre la 6 y las 9 de la mañana. Los impulsos de secreción guardan correlación generalmente con la concentración plasmática de ACTH. Esta secreción puede comenzar a concentración cero de cortisol en plasma o a una alta concentración de cortisol o ACTH. en 20100pg/ml. No obstante. del ejercicio o de la luz. algunos individuos muestran escasa correlación entre la ACTH detectable por inmunoensayo o bioensayo y el cortisol plasmático. y es independiente de la ingestión de alimentos. por lo que la periodicidad circadiana parece ser secundaria a la periodicidad en la secreción de ACTH. el índice de secreción de cortisol puede variar hasta 10 veces. Sin embargo.Regulación de la Secreción de Cortisol La secreción del cortisol está determinada por el índice de secreción de ACTH por parte de la adenohipófisis bajo la estimulación del factor de liberación de corticotropina (CRF) procedente del hipotálamo. variaciones cíclicas constantes en un periodo de 24 horas. entre las 6 y las 9 de la mañana. para descender lentamente hasta alcanzar valores próximos a cero cerca de medianoche. La se creción episódica de cortisol y ACTH representa una serie de impulsos de amplitud y duración variable. el índice de secreción de ACTH d ha calculado en unos 10µg/día y la concentración plasmática. El descenso del cortisol plasmático no unido a proteínas produce un aumento en la secreción de ACTH y un ascenso inhibe dicha secreción. 61 El acto . El ritmo circadiano depende del esquema sueño -vigilia. Las concentraciones plasmáticas de ACTH y cortisol. El índice de secreción de ACTH presenta el balance entre las influencias estimuladoras del sistema nervioso central y las inhibidoras del cortisol circulantes sobre la hipófisis o los centros hipotalámicos. En sujetos que tienen un ciclo sueño-vigilia normal. por lo que es dudoso que el concepto usual de un mecanismo cerrado de retroacción negativa cumpla alguna función en la regulación minuto a minuto de la secreción de cortisol en el hombre. No debe usarse muestras hiperlipidémicas o hemolizadas. condicionada debida a la anticipación Pre-Laboratorio 1. Reactivos Muestra desconocida Calibradores para cortisol b. Que técnica analítica funciona mejor para la medición de hormonas y por qué? 3. Equipo Solución de conjugado Micropipetas de 2 a 20µL Solución de lavado (diluida) Micropipetas de 10 a 100µL Solución de sustrato Micropipetas Solución STOP de 100 a 1000µL Cloro 5% Puntas para micropipetas Alcohol 70% Pocillos para ELISA Procedimiento Se le proporcionarán las muestras a utilizar para el análisis. Todos los reactivos deberán de 62 .inmediato de dormirse o despertarse no es el determinanate directo de la actividad suprarrenal. y el aumento de ACTH que se produce a diario antes del despertar es probablemente una respuesta subconsciente de dich despertar. Haga un esquema para ejemplificar lo que sucede al realizar un ELISA COMPETITIVO Materiales a. ni deben contener azida de sodio. que pueden ser suero o plasma obtenido con EDTA. ¿Qué significa la frase “proceso de retroacoplamiento negativo? 2. ¿Cuál es la importancia de realizar una prueba de cortisol? 4. es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el mismo tiempo. identificados de la siguiente manera: A = 0 ng/mL B = 20 ng/mL C = 50 ng/mL D = 100 ng/mL E = 200 ng/mL F = 400 ng/mL G = 800 ng/mL .Deberá de conocer cuales calibradores está utilizando su grupo de trabajo. Para obtener resultados reproducibles.estar a temperatura ambiente antes de ser utilizados. en oscuridad STOP 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Mezclar cuidadosamente Observaciones importantes Se le darán diferentes calibradores. Pozo Calibrador 1 A1 B1 C1 D1 E1 20µL Calibrador 2 20µL Calibrador 3 20µL Muestra 1 20µL Muestra 2 Conjugado 20µL 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL Mezclar e Incubar por 60 minutos a T° ambiente Lavar con 400µL cada pozo (repetir 3 veces) Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Incubar por 15 minutos a T° ambiente. Interpretación de resultados Los resultados se interpretaran de la siguiente manera: 63 . los cuales tienen una concentración conocida de cortisol. A. y Pesce. L. Ediciones Omega. 55050 Human. C. Menciones los efectos que tiene el cortisol sobre: a. ¿Qué pruebas complementarias deben acompañar al cortisol para dar un diagnostico más certero? 3.. Investigue la función del cortisol en el estrés y la inflamación Bibliografía 1. Theory Analysis Correlation. 4ª. S. siendo de menor (+) a mayor (+++) intensidad. El metabolismo de las proteínas c. Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados de cortisol 2. Alemania 64 . Anexo Investigue lo siguiente: 1. Lehninger Albert L. Inc. El metabolismo de las grasas 4. S. . 2. 2003 Clinical Chemistry. Kazmierczak. Mosby. Wiesbaden. El metabolismo de los carbohidratos b.A. 2ª. Pag 827-848. Bioquimica. Edición.Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio de cruces. Ficha técnica CORTISOL. Edición. 832-834 3. las bases moleculares de la estructura y función celular.Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber la concentración de cortisol presente en sus muestras. Kaplan. Pag. 10 D ETERMINACIÓN CUALITATIVA DE FSH Y LH Introducción Entre las gonadotropinas hipofisiarias conocidas están la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH). 2.R EALIZADO POR: LICDA . Objetivos Que el estudiante: 1. es decir. Todos los ciclos menstruales tienen un patrón característico de secreción de FSH. Explique el esquema de la técnica de ELISA de tipo sandwich y pueda reconocer las diferencias que existen entre cada tipo de ELISA. Adquiera destreza en el manejo y preparación de una placa de ELISA. Alcance Que el estudiante 1. las cuales son hormonas glocoproteínicas encargadas de regular los ciclos sexuales. donde induce la espermatogénesis (en el hombre) y la esteroidogénesis (en la mujer) respectivamente. alrededor 65 . Antecedentes  Hormona Foliculo Estimulante (FSH) Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 35. el valor más elevado se observa cerca del momento de la ovulación.5 kD. Realice una prueba de ELISA de tipo sandwich para detectar la presencia de FSH y LH en muestras desconocidas. secretada por la glándula pituitaria. N ANCY DEL CID PRÁCTICA N O. Fisiológicamente esta hormona actúa en los testículos y en los ovarios. 2. Mientras la concentración disminuye con el progreso de la fase folicular. Reconozca los puntos críticos en la realización de una prueba de ELISA. de la mitad del ciclo. Hormona Luteinizante (LH) Es una hormona glicoproteica de aproximadamente 30 kD. Pre-Laboratorio 1. Fisiológicamente esta hormona actúa en las gonadas donde es esencial para su desarrollo y función. Reactivos Muestra desconocida Calibradores para FSH y LH Solución de conjugado Solución de lavado (diluida) Solución de sustrato Solución STOP Cloro 5% Alcohol 70% b. la LH estimula el desarrollo del folículo de Graaf. La utilidad clínica y diagnostica de la medición de FSH para la evaluación de la homeostasis que regula la fertilidad a través del eje hipotalámico-hipófisiario-gonadal ha sido bien establecida. La ovulación se induce por los valores más altos de LH. ¿Cuál es el principio del ELISA tipo sandwich? 2. La determinación de LH es indispensable para monitorear pacientes sometidas a procedimientos de fertilización in vitro. sintetizada en la hipófisis. Equipo Micropipetas de 2 a 20µL Micropipetas de 10 a 100µL 66 . La utilidad clínica y diagnostica de la medición de LH para la para la evaluación de la homeostasis que regula la fertilidad a través del eje hipotalámico-hipófisiario-gonadal ha sido bien establecida. Durante la primera fase del ciclo menstrual. ¿Qué relación existe entre la hormona FSH y LH? Materiales a. en oscuridad STOP 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Mezclar cuidadosamente e interpretar Observaciones importantes 1. ni deben contener azida de sodio. Se le darán diferentes calibradores (por mesa se utilizarán 3). los cuales tienen una concentración conocida de FSH o LH.0 UI/L 67 . Todos los reactivos deberán de estar a temperatura ambiente antes de ser utilizados. Para obtener resultados reproducibles. es importante agregar los reactivos en el mismo orden y con el mismo tiempo.Micropipetas de 100 a 1000µL Puntas para micropipetas Pocillos para ELISA Procedimiento Se le proporcionarán las muestras a utilizar para el análisis. Calibradores para FSH  A = 0 UI/L  B = 5. Pozo A1 Calibrador 1 B1 C1 D1 E1 20µL Calibrador 2 20µL Calibrador 3 20µL Muestra 1 20µL Muestra 2 Conjugado 20µL 200µL 200µL 200µL 200µL 200µL Mezclar e Incubar por 30 minutos a T° ambiente Lavar con 400µL cada pozo (repetir 3 veces) Substrato 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL Incubar por 7 minutos a T° ambiente. que pueden ser suero o plasma obtenido con EDTA. No debe usarse muestras hiperlipidémicas o hemolizadas. 2. Anotar la intensidad de color de sus calibradores y de sus muestras por medio de cruces.Los calibradores le servirán para que pueda comparar estos contra su muestra y así saber la concentración de FSH o LH presente en sus muestras. Calibradores para LH  A = 0 UI/L  B = 5. si FSH o LH. Deberá de conocer cuales calibradores está utilizando su grupo de trabajo. Deberá de tener en cuenta que prueba está realizando su mesa. C = 10.0 UI/L  C = 25. Anexo Investigue lo siguiente: 1.0 UI/  F = 200.0 UI/L 4.0 UI/L  F = 100. siendo de menor (+) a mayor (+++) intensidad. Interpretación de resultados Los resultados se interpretaran de la siguiente manera: .0 UI/L  D = 25.0 UI/L 3. Investigue brevemente qué condiciones médicas pueden dar origen a niveles alterados de FSH y LH 2.0 UI/L  E = 50. ¿Qué pruebas complementarias deben acompañar a la FSH y LH para dar un diagnóstico más certero? 68 .0 UI/L  E = 100. . 5.0 UI/L  D = 50. Pag. Wiesbaden. Inc. Wiesbaden. L. Edición. Theory Analysis Correlation. Edición. Lehninger Albert L. S. Pag 827-848. Alemania 69 . Ediciones Omega. 832-834 3. Mosby. 4ª.A. 2003 Clinical Chemistry. Alemania 4. Ficha técnica LH 53010 Human.Bibliografía 1. Kazmierczak. las bases moleculares de la estructura y función celular. C. S.A. Ficha técnica FSH 53020 Human. Bioquimica. 2. Kaplan. y Pesce. 2ª. 000 mUI/mL a las 10 a 12 semanas de embarazo. que se utiliza como cualitativa. 11 D ETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DE UNA PRUEBA CUALITATIVA PRUEBA DE EMBARAZO Introducción La prueba que se usará en el laboratorio es una prueba rápida de detección de hCG en orina o en sangre como indicador de embarazo. En esta práctica se determinará el límite de detección de la prueba. En el embarazo en un ser humano.00 a 200. Se inicie en el manejo de muestras de suero. La aparición de hCG en la orina y el suero poco después de la 70 . Los niveles de hCG continúan aumentando muy rápidamente superando las 100 mUI/mL tras la primera falta y alcanzando el máximo en torno a 100. Aprenda el uso de las micropipetas 3. Realice una cromatografía inmunológica para la detección de hCG 2. Determine el límite de detección de una prueba cualitativa de detección de hCG como prueba temprana de embarazo. SARA BEATRIZ MOLINA DE SAMAYOA / DRA . D ORA INÉS MAZARIEGOS C ORDERO PRÁCTICA N O. aplicando todo sus conocimientos de bioseguridad 2. Relacione cada muestra con la realidad personal de un paciente Antecedentes La gonadotropina coriónica humana (hCG) es una hormona glucoproteica producida por la placenta en desarrollo poco después de la fertilización. Alcance Que el estudiante 1. Objetivos Que el estudiante 1. la hCG puede detectarse tanto en orina como en suero a partir de los 7-10 días de la concepción.R EALIZADO POR: LICDA . Reactivos Muestra de suero con contenido de hCG conocido Prueba rápida de embarazo. El ensayo se realiza añadiendo la muestra al pozo de la placa y observando la presencia o ausencia de bandas en la ventana de resultados. que contiene anticuerpos policlonales de cabra contra ratón. placa de reacción y gotero incluido Solución salina (NaCl 0. Si la muestra contiene hCG.5 mL Micropipetas de 2 a 20μL Puntas para micropipeta 71 . interferencias Con este nivel de sensibilidad. Se incluye una línea de control. la prueba no muestra cruzadas con otras hormonas glucoproteicas estructuralmente relacionadas. La ausencia de esta línea sugiere un resultado negativo. tales como la FSH. el complejo hCG-antihCG-oro se une al anticuerpo de captura en la línea de prueba y se desarrolla un color rosado-vino tinto. La prueba utiliza una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales para detectar selectivamente los niveles elevados de hCG en orina o suero.concepción y su rápido aumento posterior durante el principio de la gestación hacen de esta hormona un marcador ideal para la indicación temprana del embarazo La prueba de embarazo en tarjeta es una prueba rápida que detecta cualitativamente la presencia de hCG en una muestra de orina o suero con una sensibilidad de 25 mUI/mL. En el pozo de la muestra se encuentra un conjugado de anticuerpo monoclonal de ratón contra hCG y partículas coloidales de oro. independiente que la muestra contenga hCG o no. Esta prueba se basa en un inmunoensayo de flujo cromatográfico en un solo paso que permite detectar selectivamente los niveles elevados de hCG. que migra hacia las líneas de prueba y control. La formación de color en la línea control asegura que la prueba ha sido efectuada correctamente. Materiales a. Cristalería Tubo Eppendorf de 1.9%) para diluir b. la LH y la TSH a niveles fisiológicos altos. y debe formarse siempre. No toque las membranas reactivas con los dedos. Toda muestra de esta naturaleza de be tratarse como potencialmente infecciosa. Obtenga una prueba para hCG y rompa la bolsa. Espere cinco minutos a que aparezcan las líneas correspondientes al control (siempre debe aparecer) y a la de prueba (aparece únicamente si es positivo). Pase su muestra a su compañero de la derecha. Manteniendo el gotero en posición vertical. por lo cual debe cumplirse con las normas de 72 . 3. ¿Entre qué valores se encuentra el límite de detección? Observaciones importantes En esta práctica se estarán manejando muestras de suero humano que se sabe son positivas para hCG. 7. Tome la muestra que le corresponda a su mesa (de su compañero de la izquierda) y realice la dilución que le haya tocado. 2. 6.Procedimiento 1. 4. agregue 4 gotas (unos 100 μL) de muestra a pozo de la placa marcado con S (SAMPLE). Anote en su registro la concentración de la muestra que le llegó y la que usted produ jo. Compare resultados con sus compañeros de mesa. 5. Coloque la placa en una superficie nivelada y limpia. quien le indicará la forma adecuada de utilizar una micropipeta y realizar diluciones. Escuche atentamente a su instructor. Investigue qué otras pruebas existen con este tipo de principio. así como ser cauteloso durante la manipulación. Investigue en qué casos. CA. 2. USA 73 .. fuera valores elevado de hCG. Anexo 1. Ficha técnica Prueba de Embarazo Instant-View (Orina/Suero) Alfa Scientific Designs Inc. Debe usarse guantes en todo momento.bioseguridad adecuadas. de embarazo normal se pueden observar Bibliografía de referencia 1.