MANUAL DE PRÁCTICASBIOQUÍMICA GENERAL TERCERA EDICIÓN Dra. Mirza Ema Ye Gómez UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL CAMPUS COATZACOALCOS 2015 1 ÍNDICE TEMA PAGINA INTRODUCCIÓN 3 UNIDAD DE COMPETENCIA 4 MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 4 RECOMENDACIONES A LOS ALUMNOS 5 INSTRUCTIVO PARA LA ELABORACIÓN DE REPORTES 8 PRACTICA No. 1. PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS 9 PRACTICA No. 2. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 15 Primera parte. Valoración del Peróxido de hidrógeno 18 Segunda parte. Determinación del orden de la reacción 18 PRACTICA No. 3. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 21 Primera parte. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática 23 Segunda parte. Efecto del pH sobre la actividad enzimática 24 PRÁCTICA No. 4. DET. ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CARBOHIDRATOS 26 Primera parte. Preparación de la curva de calibración 28 Segunda parte. Medición de la muestra problema (Jugo de caña) 28 PRACTICA No. 5. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE ALGUNOS LÍPIDOS 32 Primera parte. Extracción y separación de lecitina y cefalina del huevo 34 Segunda parte. Extracción de lípidos totales del hígado 34 PRÁCTICA No. 6. REGULACIÓN ÁCIDO-BASE DEL ORGANISMO HUMANO 37 PRACTICA No. 7. OXIDACIONES BIOLÓGICAS 42 BIBLIOGRAFÍA 47 2 INTRODUCCIÓN Las prácticas que se encuentran desarrolladas en este manual, están apegadas al programa de la Teoría de la experiencia educativa sobre Bioquímica General dentro del Modelo Educativo Integral y Flexible, con el objeto de que se complemente de una manera práctica, el conocimiento adquirido en el aula, reforzando de esa manera el aprendizaje, desarrollando las competencias que necesita todo el profesionista del área de la Química. Para lograr ese objetivo este manual se ha diseñado de tal manera que inicialmente se encuentran las prácticas que de acuerdo al programa, ilustran y complementan los temas que se estudian en esta experiencia educativa tales como las referentes a las propiedades físicas y químicas de las proteínas y las enzimas; posteriormente se realizan prácticas que son de gran importancia para la predicción de los procesos bioquímicos tales como cinética química, catálisis y oxidaciones biológicas. Se incluyen también prácticas sobre el conocimiento de las propiedades de los lípidos, y sobre los carbohidratos, como parte del estudio de las biomoléculas. En algunas prácticas se emplea como materia prima algunas partes de organismos vivos tales como músculos e hígado; así como algunos productos de animales como saliva, sangre, huevos, etc. El lenguaje utilizado en este manual es de estilo sencillo y fácilmente comprensible para los alumnos que llevan a cabo formalmente su preparación profesional en el área de la bioquímica, haciendo hincapié en aquellos detalles de gran utilidad cotidiana. Debido a la gran aplicación de esta Experiencia Educativa en el quehacer profesional de los Ingenieros Ambientales, tanto en los procesos de biorremediación como en el diseño de procesos enzimáticos que tiendan a optimizar la eliminación de muchos contaminantes de tipo orgánico, tales como hidrocarburos, pesticidas, insecticidas, fertilizantes, etc. Es muy importante el estudio de la Bioquímica General gracias a la cual es posible percatarse claramente de la interacción de las sustancias agresivas del entorno con los delicados procesos biológicos tanto animales como vegetales. 3 UNIDAD DE COMPETENCIA El estudiante en el laboratorio determina las características físicas y químicas de las biomoléculas más importantes tales como las proteínas, los carbohidratos y los lípidos, mediante pruebas químicas, mediciones de parámetros físicos y observaciones organolépticas; así también utiliza las condiciones adecuadas para llevar a cabo reacciones enzimáticas, determinando la cinética química de las mismas. Por otra parte, hace evidente la presencia de enzimas y su actividad en diversos productos del organismo como la saliva, la sangre y el tejido muscular, elaborando las gráficas correspondientes para la determinación de la velocidad de la reacción. Reporta los resultados de una manera clara y ordenada organizándose en equipos de trabajo con actitud responsable, solidaria y armónica. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Para que el desarrollo de una práctica de laboratorio logre sus objetivos, deberán seguirse ciertas normas de seguridad con el fin de evitar accidentes al realizar un experimento; los estudiantes deben seguir con mucho cuidado todas las instrucciones de su profesor y del manual de prácticas. A continuación se enumeran una serie de indicaciones: I. Antes de iniciarse las sesiones experimentales, el profesor o los encargados de los laboratorios deben: a. Cerciorarse de que todas las llaves de las mesas de trabajo, en especial las que están conectadas al gas, funcionen perfectamente y no haya fugas. b. Asegurarse de que la campana de extracción de gases y la regadera de presión tengan un buen funcionamiento. c. Dar a conocer la ubicación de los extintores, la regadera, el lavaojos, el botiquín de primeros auxilios, y darles instrucciones para su manejo en caso de emergencia. d. Revisar que todo el material de laboratorio, especialmente el de vidrio, no este roto o estrellado. II. Antes de realizar la práctica, el estudiante debe ponerse la bata de trabajo, la cual deberá ser de algodón y los lentes de seguridad. III. Cuando se trabaje con sustancias que desprendan vapores tóxicos, se recomienda trabajar en la campana de extracción. IV. Se prohíbe el uso de lentes de contacto en el laboratorio V. En la mesa de trabajo deben estar exclusivamente el material y las sustancias con las cuales se va a experimentar, el manual de prácticas 4 para seguir las instrucciones y la bitácora de laboratorio. VI. No se debe ingerir alimentos, ni fumar en el laboratorio y menos durante la realización de la práctica. VII. Antes de encender el mechero, cerciorarse primero de que esté lo suficientemente alejado de sustancias volátiles o combustibles y en seguida prender el cerillo, colocarlo en la boca del mechero y luego abrir la llave del gas. VIII. Al usar un reactivo, leer la etiqueta del frasco para evitar equivocaciones que puedan ser peligrosas. IX. Para agitar el contenido de un tubo de ensayo no debe taparse la boca del tubo con el dedo, sino tomar con una mano el extremo abierto y con la otra aplicar pequeños golpes en la parte inferior. X. Cuando se caliente cualquier dispositivo, para retirarlo del fuego deben utilizarse las pinzas adecuadas. XI. Al calentar sustancias en un tubo de ensaye, éste debe colocarse en forma inclinada, nunca vertical, y orientado de tal forma que si ocurren proyecciones no caigan sobre las personas que están en los alrededores, especialmente en la cara. XII. Al calentar líquidos en tubos de ensaye, éstos no deben sostenerse directamente sobre la flama, sino que deben retirarse de vez en cuando, agitando en forma continua para facilitar la salida de burbujas de gas del fondo del tubo y así evitar proyecciones. XIII. Al hervir líquidos en recipientes más grandes, debe agitarse el contenido con una varilla de vidrio o añadir una o dos perlas para ebullición, con lo cual se evitará alguna proyección. XIV. Nunca debe mezclarse el resultado de una reacción con el de otra si no está indicado en las instrucciones de la práctica. XV. Cuando se desee diluir un ácido concentrado, nunca debe verterse al agua sobre el ácido, sino al contrario; el ácido debe añadirse con sumo cuidado deslizándose lentamente sobre las paredes del recipiente que contenga el agua. XVI. Nunca debe probarse y menos ingerirse alguna sustancia química. XVII. Una sustancia química no debe olerse directamente y menos si se acaba de calentar. En vez de ello, la muestra se coloca a unos 15 cm de la nariz y se atraen los vapores abanicándolos con una mano. XVIII. Cuando se desprenden gases tóxicos en una reacción en cantidades que pueden afectar el sistema respiratorio, será preciso realizar el experimento en la campana de extracción, además de evitar una exposición prolongada a dichos gases. XIX. Para trabajar con tubos de vidrio será preciso redondear los extremos filosos directamente en la flama del mechero. 5 XX. Para introducir un tubo de vidrio o un termómetro (previamente humedecido) en tapones horadados, debe sostenerse el tapón con una mano y con la otra empujar poco a poco el tubo o el termómetro, haciéndolo girar como si fuera un sacacorchos para evitar su rompimiento y, por lo tanto cortaduras en las manos. XXI. En caso de sufrir un accidente al manipular el equipo de trabajo, debe acudirse inmediatamente con el profesor y de ser necesario con él medico. XXII. Al término de la práctica se debe: Lavar, entregar y/o guardar el material que se utilizó; cerrar perfectamente los frascos de los reactivos y cerciorarse de que queden bien cerradas todas las llaves, especialmente las de gas. (13) RECOMENDACIONES A LOS ALUMNOS El estudiante debe: Cuidar que los reactivos solamente se introduzcan en materiales de laboratorio, limpios, secos y a temperatura ambiente. Lavar siempre el material que se va a emplear antes de cada determinación, enjuagarlo muy bien con agua de la llave para eliminar cualquier residuo de detergente y después escurrirlo sobre una toalla o papel absorbente, durante el tiempo necesario para que se seque. Si quedan algunas gotas adheridas en el interior es necesario secarlas ya sea utilizando una porción de papel absorbente si el material es de boca ancha, en caso contrario, calentando el material con el mechero bunsen durante unos minutos procurando que la salida del aire caliente se dirija hacia arriba y después esperar el tiempo necesario para que se enfríe. Leer el procedimiento de las prácticas antes de ejecutarlas. Rotular cuidadosamente cada uno de los reactivos y soluciones empleadas para evitar confusiones entre ellas. Observar minuciosamente y críticamente cada uno de los cambios ocurridos y registrar cuidadosa y ordenadamente: los cambios de color, de aspecto, de temperatura, la velocidad de las reacciones, olores percibidos, desprendimiento de gases, etc., así como los datos numéricos de las mediciones efectuadas, y todo aquello que se considere necesario, en su bitácora de laboratorio, señalando el número y nombre de la práctica así como la fecha en que se realizaron las anotaciones. 6 Realizar cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqué de los hechos. Consultar los libros de texto o investigar en Internet antes y después de la ejecución de las prácticas para comprender él porque de las operaciones que se han de ejecutar, así como para aclarar las dudas que surjan al realizar sus experimentos, para llegar a sus propias conclusiones. Cuidar la higiene y evitar la contaminación al trabajar con animales y productos de origen animal. 7 INSTRUCTIVO PARA LA ELABORACIÓN DE REPORTES 1. Anotar el sustento teórico, las competencias, las tablas de materiales y reactivos y el procedimiento de la práctica. 2. Después del procedimiento, colocar el diagrama de bloques y las observaciones con las imágenes. 3. Anotar los resultados en el espacio correspondiente y redactar una discusión sobre los mismos, basados en las observaciones realizadas. 4. Redactar la conclusión en relación con las competencias que se pretende desarrollar en los estudiantes. 5. Resolver el cuestionario. 6. Colocar la fotografía del Vo. Bo. obtenido en la bitácora de laboratorio. 7. Anotar la fecha en que se realizó la práctica. 8. Subir el archivo electrónico del reporte a la plataforma EMINUS en el periodo indicado para ello. 9. Realizar las correcciones indicadas por la docente en el reporte en la retroalimentación. 8 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL_______ PRÁCTICA No. 1 PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS SUSTENTO TEÓRICO Las reacciones de desnaturalización y precipitación de proteínas explican los efectos del calor o de los metales pesados y ácidos sobre la actividad de las enzimas. La reacción de Biuret debe su nombre a que también es positiva con la biurea, por poseer un enlace peptídico. El color se debe a la formación de un complejo de coordinación de Cobre con 4 átomos de N peptídico. La reacción de Biuret así como la reacción xantoproteica, se deben a la presencia de aminoácidos fenólicos en la proteína, siendo la tirosina la más frecuente. COMPETENCIAS El estudiante: Realiza reacciones de desnaturalización y precipitación de proteínas, que tienen importancia en métodos de separación de algunas proteínas. Lleva a cabo reacciones de color típicas del enlace peptídico (reacción de Biuret) y la reacción xantoproteica. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA En esta práctica se realizarán 5 reacciones de precipitación de proteínas mediante adición de: 1) alcohol o cetona, 2) metales pesados, 3) ácidos orgánicos fuertes, 4) sulfato de amonio (salting out) y 5) reactivo de Esbach, la precipitación de las proteínas se debe a que sufren una desnaturalización (cambio de conformación estructural) en presencia de los reactivos mencionados También se realizarán 2 reacciones coloridas de las proteínas: 1) la reacción de Biuret, la cual da positiva en presencia de las uniones peptídicas, comunes en las proteínas y 2) la reacción Xantoproteica, que sirven para identificar las proteínas 9 que contienen aminoácidos aromáticas en su molécula. MATERIAL 14 Tubos de ensaye 13 x 100 mm Gradilla Embudo de filtración Soporte y anillo metálico Mechero bunsen 1 Vaso de pp de 250 mL 2 vaso de pp de 150 mL Pinzas para tubo de ensaye 4 Papel filtro Agitador de vidrio Piseta de 250 mL Papel pH Balanza analítica 2 pipetas graduadas de 5 mL REACTIVOS 2 mL de Caseína al 0.5 % 3 mL de Acido nítrico concentrado 2 mL de NH4OH concentrado 2 mL de Solución A de Biuret 2 mL de Solución B de Biuret 5 gotas de Solucion de PdCl2 al 5% 5 gotas de sol. de AgNO3 al 5 % 2 mLde Etanol al 95% 2 mL de sol. de Acido Tricloroacético al 5 % 2 mL de sol. saturada de sulfato de amonio. 2 mL de sol. de sulfato de amonio al 50 % 2 mL de sol. de sulfato de amonio al 10 % 4 mL de solución de Ninhidrina 3 mL de Reactivo de Esbach MATERIAL BIOLÓGICO: Clara de huevo diluida 1:5 (Diluir la clara de 2 huevos con 4 partes de agua destilada). 20 mL de Solución de gelatina al 0.5 % 10 PROCEDIMIENTO 1. Precipitación de proteína con etanol o acetona. Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de proteínas ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatación y por lo tanto las precipita. A 2 mL de clara de huevo diluida, se agregan 2 mL de alcohol al 95% o de acetona. Se anota el resultado observado. 2. Precipitación por metales pesados. Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinatos insolubles. Se preparan 2 tubos con 1 mL de clara de huevo diluida cada uno. Se agrega a uno de ellos, 5 gotas de AgNO3 al 5% y al otro 5 gotas de PdCl2,. Se mezcla bien y se anota el resultado. (Si no ocurre precipitación compruebe el pH). 3. Precipitación de gelatina con reactivo de Esbach. La gelatina es una proteína desnaturalizada proveniente de la acción del calor sobre el colágeno. No precipita con ácidos fuertes ni da la reacción del núcleo fenólico (xantoproteíca), pero sí precipita bastante selectivamente con el reactivo de Esbach. A 3 mL de gelatina al 0.5% se le agrega 3 mL de reactivo de Esbach. Se anota el color del precipitado. Se calienta suavemente y se anota el cambio que se observe. 4. Reacción del Biuret. Todas las moléculas que contengan 2 o más uniones peptídicas, por lo tanto todas las proteínas y todos los péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva esta reacción. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. A 2 mL de clara de huevo diluida y a 2 mL de gelatina al 0.5%, se les agrega lentamente y agitando, 1 mL de solución A de Biuret (NaOH al 40%). Después se agrega gota a gota y agitando, 1 mL de solución B de Biuret (CuSO4 al 1%). Se anota el cambio de color. Obsérvese que un exceso de sulfato de Cobre, por su color propio, puede enmascarar la reacción. Se anota y se comparan los resultados de los dos tubos. 5. Reacción Xantoproteica. Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina, la 11 tirosina y el triptofano. Por lo tanto la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula. Se prepara una serie de 3 tubos de ensayo, numerados; se agrega en cada uno 2 mL de las siguientes soluciones: Caseína, Gelatina y clara de huevo. Se añade 1 mL de ácido nítrico concentrado, se calienta ligeramente y se observa una coloración amarilla característica. Se deja enfriar la solución y se añaden cuidadosamente unas gotas de hidróxido de amonio concentrado, resbalando por las paredes del tubo, para lograr la estratificación. En la interfase se observará un anillo naranja. 6. Precipitación con ácidos orgánicos fuertes. Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos insolubles. A 2 mL de clara de huevo diluida, se agrega lentamente y agitando, 1 mL de disolución de ácido tricloroacético (TCA). Se filtra. El filtrado, que debe ser transparente, se trata con 1 mL de disolución de ninhidrina para demostrar que no hay proteínas. Si la reacción con ninhidrina es positiva (en caliente) quiere decir que la reacción no fue cuantitativa, por la falta de agitación o porque se requiere mas TCA. 7. Precipitación Salina (Salting Out). Por regla general, las proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio. Sin embargo, la concentración para precipitar diferentes proteínas es variable. Esta diferencia en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar proteínas, por ejemplo, las albúminas y globulinas de la clara de huevo Se pesan exactamente 3 papeles filtro y se anotan los pesos. Se toman 2 mL de solución de clara de huevo, se diluyen en 2 mL de agua destilada y se agrega agitando, 2 mL de disolución saturada de sulfato de amonio. Se filtra a través de uno de los papeles pesados. En el filtrado se determina la presencia de las proteínas, con ninhidrina. Se repite el procedimiento con otros 2 mL de clara diluida, usando ahora una disolución al 50% de sulfato de amonio y con otros 2 mL, utilizando disolución al 10% de la misma sal. Se dejan secar perfectamente los papeles, se pesan y se anotan los pesos de los 3 precipitados obtenidos que han quedados retenidos en los papeles filtro. 12 MANEJO DE RESIDUOS Y SUBPRODUCTOS El contenido de uno de los tubos de la precipitación por metales pesados (el precipitado con cloruro de paladio) se coloca en un frasco rotulado: Proteína + PdCl2 El contenido de los demás tubos es inocuo y puede desecharse de la siguiente manera: Sólidos: Se depositan en una hoja de papel y se colocan en el bote de la basura. Líquidos: Se desechan en el lavabo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Anote sus resultados en la siguiente tabla: Reacción Acidos Etanol o Metales Xantopro- Salting- Esbach Biuret Orgánicos Sustancia acetona pesados teica Out fuertes Gelatina Caseína Clara de huevo CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Escriba la reacción de formación de biurea por calentamiento de la urea 2. Escriba la formula del Complejo de coordinación de la biurea con los iones Cu2+ 3. Escriba la formula del ácido tricloroacético y el valor de su constante de disociación. Explique porque es un ácido tan fuerte. 4. Investigue la composición del reactivo de Esbach. 5. Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO 3. 13 6. ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas? BIBLIOGRAFÍA LENHINGER, A. (1991) Bioquímica. 15ª edición. Ed. Omega. Barcelona, España. MATHEWS, C. K., VAN HOLDE, K. E. (1998). Bioquímica. 2ª edición. Ed. McGraw-Hill. Interamericana, España. ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA LUQUE Guillén M. Victoria. (2009). Estructura y propiedades de las proteínas. Master Ingeniería Biomédica. http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/proteinas_09.pdf Vo. Bo. Fecha: 14 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 2 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS SUSTENTO TEÓRICO La velocidad de una reacción química puede medirse por varios métodos. Uno de los más utilizados consiste en tomar muestras de la mezcla reaccionante, a un tiempo dado, suspender la reacción y analizar los componentes de la mezcla en ese momento. Esto en ocasiones no es fácil, ya que muchas reacciones en solución acuosa son instantáneas. Las reacciones químicas de acuerdo a la teoría del complejo enzima-sustrato, por el número de moléculas que toman parte en ellas se clasifican en: Monomoleculares, cuando participa una sola moléculas: A B Bimoleculares, cuando participan dos moléculas: A+B AB Trimoleculares, cuando participan 3 moléculas simultánemente: A+B+C ABC Cuando se estudia la cinética de una reacción, tiene más importancia conocer el orden de la reacción que el tipo. El orden de una reacción nos indica la relación entre la velocidad y la concentración de los reactivos, por lo que se clasifican en reacciones de: Orden cero En estas reacciones, la velocidad no es afectada por la concentración. Está determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de difusión, etc. Primer orden Son aquellas en las que, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de una de las sustancias reaccionantes. Segundo Son aquellas en las cuales la velocidad de la reacción es orden proporcional a la concentración de 2 sustancias reaccionantes. Tercer orden Son aquellas en las cuales la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de 3 sustancias reaccionantes. 15 La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente, la reacción puede representarse así: Kc = dc / dt . . . . . . (1) Siendo: Kc = Constante específica de la velocidad de reacción. dc = Diferencial de la concentración. dt = Diferencial del tiempo. Si representamos por: s = Concentración inicial del sustrato. x = Cantidad de sustrato que ha reaccionado en un intervalo de tiempo. s – x = Concentración del sustrato en el tiempo t = Tiempo. La ecuación (1) puede expresarse en función de s, x y t y al integrarla nos queda: 2.303 s Kc = ----------- log ----------- . . . . . . . . . . . . . . . . (2) t s–x Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del sustrato, la ecuación se simplifica: s = 2 (s-x) Kc = (2.303 / t1/2) log [2(s-x) / s-x] Finalmente nos queda: t1/2 = 0.693 / Kc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (3) Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de una cantidad dada de sustrato.1 COMPETENCIAS El estudiante: Predice la velocidad de una reacción química y describe el curso de la misma. Determina el orden de reacción de la descomposición del peróxido de hidrógeno catalizada por la enzima peroxidasa. 1 UACAM:2002 16 DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA Esta práctica se realizará en dos partes: En la primera parte se llevará a cabo la valoración volumétrica del contenido de peróxido de hidrógeno en un frasco comercial de agua oxigenada, mediante una titulación de óxido-reducción empleando permanganato de sodio previamente valorado. Una vez hecha la cuantificación, se guarda el frasco en el almacén de la facultad a 21ºC aproximadamente. En la segunda parte se medirá la actividad de la enzima peroxidasa, presente en la sangre humana, adicionando a una solución sanguínea diluida, una cantidad exactamente medida de peróxido de hidrógeno, y cronométricamente se detiene la reacción en porciones de la mezcla a los 30, 60, 120, 300 y 600 segundos, añadiendo ácido sulfúrico y disminuyendo la temperatura en baño de hielo. Posteriormente se realiza la valoración volumétrica mediante permanganimetría del contenido de peróxido de hidrógeno que quedó sin descomponerse por la acción de la peroxidasa. Se establecerá mediante fórmulas matemáticas la velocidad inicial de la reacción(Vo) en cada matraz, la constante específica de la velocidad de la reacción (Kc), y se grafica la velocidad (Vo) en función del tiempo. MATERIAL 5 Matraz erlenmeyer de 250 mL Pipeta volumétrica de 10 mL Matraz volumétrico de 100 mL Soporte metálico Pinzas para bureta Bureta ámbar Vaso de pp de 50 mL Baño maría Embudo de separación Anillo metálico Probeta de 25 mL Reloj o cronómetro Traer: Hielo en las dos sesiones REACTIVOS Primera y segunda parte: 60 mL de Peróxido de hidrógeno nuevo 60 mL de ácido sulfúrico 1:4 Solución de KMnO4 0.1 N Segunda parte: 17 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06 % PROCEDIMIENTO Primera parte. Valoración del peróxido de hidrógeno 1. Se toma una alícuota del frasco de agua oxigenada comercial (se recomiendan 10 mL). 2. Se afora a 100 ml en un matraz volumétrico, con agua destilada. 3. Se toma una alícuota de 10 mL de esta dilución y se coloca en un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenga 100 mL de agua destilada, acidulando con 30 mL de H2SO4 (1:4). 4. Se enfría con baño de hielo y se titula con solución 0.1 N de Permanganato de potasio colocada en una bureta ámbar. (Ver figura 7). El punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la solución de permanganato.. NOTA: En la titulación con el permanganato, las primeras proporciones se decoloran con lentitud, debido a que se requiere la formación de sulfato de manganeso, el cual actúa como catalizador de la reacción. 5. Se realiza la determinación por duplicado y si los resultados no coinciden se repite el procedimiento. 6. Se calcula la cantidad de Peróxido presente en la muestra mediante la fórmula: V x N x meq. x 100 x Factor de dilución gr % de H 2O2 = --------------------------------------------------------- alícuota Donde: V = mL de KMnO4 gastados en la titulación. N = Normalidad del KMnO4.(meq./mL) meq. del Peróxido de hidrógeno = 0.017 gr / meq. Factor de dilución: 10 Alícuota = mL de muestra colocados en el matraz. 7. Se calcula la equivalencia de los gramos % obtenidos en moles/L. Esto representa el valor de s (Concentración inicial). 8. Se guarda el Peróxido de hidrógeno valorado en el almacén del laboratorio, anotando en la etiqueta los moles/L de H2O2 calculados y el equipo correspondiente. Segunda parte: Determinación del orden de la reacción 18 1. Se colocan en cada uno de 5 matraces Erlenmeyer de 250 mL, 100 mL de agua destilada y 30 mL de ácido sulfúrico. Se rotulan de la manera siguiente: 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos y 10 minutos respectivamente y se colocan en un baño de hielo durante 15 minutos. 2. Se coloca un embudo de separación de 250 mL en un anillo metálico sujeto a un soporte metálico. Se le depositan 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06 %. 3. Registrando cuidadosamente los datos con un cronómetro o un reloj con segundero, se adiciona al embudo 50 mL de la solución de peróxido de hidrógeno valorada en la sesión anterior. No se agita ni se le coloca el tapón al embudo.(SE ANOTA LA HORA DE PREPARACIÓN DE LA MEZCLA CON EXACTITUD). 4. Exactamente 30 seg. después de agregar el peróxido, se abre la llave del embudo y se miden 10 mL de la mezcla en una probeta de 25 mL, resbalando el líquido por las paredes de la probeta, realizando esta acción lo más rápido posible y sin tomar en cuenta la espuma que se forme después de la medición; se transfiere cada muestra a los matraces erlenmeyer que contienen la mezcla agua/H2SO4 fría para detener el proceso enzimático y se titulan con solución de permanganato de potasio 0.1 N, en la forma ya explicada. Se toman 4 muestras más a los 60, 120, 300 y 600 seg. 5. Se calculan los g % de Peróxido de hidrógeno que quedan en cada matraz al detener el proceso enzimático a determinado tiempo, aplicando la misma fórmula del inciso 4 (eliminando el factor de dilución) y calculando los moles/L. Estos valores representan la concentración final en cada matraz : x 6. Se anotan los resultados en la tabla correspondiente y se realizan los cálculos indicados. 7. Se elabora una gráfica colocando el valor de Vo en el eje Y y el tiempo (en segundos) en el eje X. MANEJO DE RESIDUOS Y SUBPRODUCTOS: El contenido de los matraces puede desecharse en el drenaje RESULTADOS Y DISCUSIÓN t (seg) mL de KmnO4 (s-x) mol L-1 Vo : Log (s / s-x ) Kc = 2.303/t [log (s / s- Eje X Eje Y x)] 0 30 60 120 180 300 19 CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Investigar la reacción de óxido-reducción que se produce en la titulación del peróxido de hidrógeno con el permanganato de potasio. 2. ¿Cuál es la razón de utilizar el ácido sulfúrico en la titulación? BIBLIOGRAFÍA BOHINSKI, R. C. (1991). Bioquímica. 5ª edición. Ed. Addison - Wesley Iberoamericana, E. U. A. LENHINGER, A. (1991) Bioquímica. 15ª edición. Ed. Omega. Barcelona, España. MATHEWS, C. K., VAN HOLDE, K. E. (1998). Bioquímica. 2ª edición. Ed. McGraw-Hill. Interamericana, España. ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA CINÉTICA ENZIMÁTICA file:///C:/Users/SEARS/OneDrive/BIOQUIMICAS/BIOQU%C3%8DMICA%202015/ art%C3%ADculo%20sobre%20cin%C3%A9tica%20enzim%C3%A1tica.pdf Vo.Bo. FECHA 20 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 3 FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA SUSTENTO TEÓRICO La vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curso y velocidad están determinados por la presencia de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego: en = en, zymo = fermento). La definición de enzimas dada por Woldschmidt y Leitz las describe como: catalizadores producidos por las células, pero que pueden actuar fuera de ellas a diferencia de vitaminas y hormonas. La mayor parte de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por las enzimas. La mayor parte de las enzimas, desde el punto de vista químico, son compuestos que pertenecen al grupo de las proteínas (aunque algunas sólo reaccionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prostético o coenzima). Debido a su carácter proteínico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio físico, químico o fisicoquímico. Así, cualquier cambio en la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la adición de sales, la presencia de agentes oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier factor que sea capaz de desnaturalizar a las proteínas será capaz de alterar su actividad. La velocidad de cualquier reacción cambia al modificarse la temperatura, debido a los cambios de energía cinética. Generalmente por cada 10 °C de cada aumento en la temperatura se duplica la velocidad: esto se conoce como la reacción de Van’t Hoff., o coeficiente de temperatura QT 10 2. Sin embargo, debido a la constitución proteínica de las enzimas, las temperaturas altas producen desnaturalización y una marcada disminución en la actividad catalítica. 21 Para la gran mayoría de enzimas de animales homotermos, la temperatura óptima está alrededor de 37 °C; cerca de 60 °C la mayor parte de las proteínas se inactivan. El pH es uno de los factores que más afecta la actividad de las enzimas, ya que afecta la estabilidad de la moléculas por desnaturalización, o bien afecta su carga eléctrica. Muchos de los grupos ionizables presentes en la molécula de la enzima pueden ser necesarios para la catálisis y los cambios de pH afectan el grado de ionización. Para que se realice la unión en el complejo enzima-sustrato es necesaria una adecuada distribución de cargas en ambas moléculas. El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada para asegurar la formación del complejo ES en las mejores condiciones. Además como ya se mencionó, los pH extremos provocan desnaturalización de la molécula enzimática y por tanto, inactivación de la misma. Cada enzima posee un pH óptimo en el cual su actividad es máxima; para la mayoría de las enzimas, la actividad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo, existen excepciones, por ejemplo, para la pepsina del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy ácido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos cuyo pH óptimo es de 9.5. COMPETENCIA El estudiante: Determina el efecto que producen algunos factores sobre la actividad enzimática. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA Esta práctica se realiza en dos partes. En la primera parte se coloca almidón como sustrato en 6 tubos de ensaye y en presencia de una solución amortiguadora de pH, se pone en contacto con la enzima amilasa, la cual cataliza la ruptura del almidón en moléculas de monosacárido, y cada uno de los tubos se pone en condiciones diferentes de temperatura. Después de 15 minutos de reacción en esas condiciones, se enfrían los tubos y se les agrega el reactivo de Fehling A y B, el cual tiene la capacidad de producir un precipitado rojo de cobre en presencia de los monosacáridos los cuales son azúcares reductores, de esa manera se podrá determinar si hubo ruptura del polímero y cuáles fueron las condiciones óptimas de temperatura en que la enzima amilasa actuó para producir mayor ruptura del almidón. En la segunda parte, similar a la primera, los tubos con almidón y la enzima 22 amilasa se ponen en contacto con soluciones con diferente valor de pH. En este caso se determina que valor de pH es el óptimo para que la enzima amilasa actuara para favorecer la ruptura del polímero. MATERIAL Probeta graduada de 50 mL Agitador de vidrio 8 tubos de ensaye de 13 x 100 mm Gradilla Tripié metálico Mechero bunsen Tela de alambre con asbesto REACTIVOS Vaso de pp de 400 mL Cuba hidroneumática Traer Hielo en la primera sesión Primera sesión Sustrato de almidón 8 mg/mL Solución (1:80) de amilasa salival Solución reguladora de fosfatos 0.02 M pH = 7 Reactivos de Fehling A y Fehling B Segunda sesión: Sustrato de almidón 8 mg/mL Solución (1:80) de amilasa salival Soluciones reguladoras de pH = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 Solución de NaOH 2N Reactivos de Fehling A y Fehling B PROCEDIMIENTO PRIMERA PARTE: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática 1. Se prepara una solución (1:80) de amilasa salival, diluyendo 0.25 mL de saliva en 19.75 mL de agua destilada. (Esta solución debe prepararse utilizando material perfectamente limpios y usarse inmediatamente, ya que las enzimas en soluciones diluídas se inactivan con facilidad. Se recomienda conservar esta solución en baño de hielo). 2. Se prepara una serie de siete tubos como se indica: 23 Reactivos Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 Sustrato de almidón 8 mg/mL - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Solución reguladora de fosfatos 0.02 - 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 M pH = 7 Agua 5 3 3 3 3 3 3 Incubar 5 minutos a: 25°C 5°C 25°C 40°C 50°C 60°C 92°C Enzima: Solución (1:80) de amilasa - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 salival Se agitan bien los tubos Incubarlos 15 minutos a: 25°C 5°C 25°C 40°C 50°C 60°C 92°C Se agrega a cada tubo 1 mL de R. de Fehling A y 1 mL de R. de Fehling B (*) Se agitan bien los tubos. Se ponen en baño maría a ebullición durante 5 minutos. (*) Nota: Este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores. 3. Se enfrían los tubos y sin agitarlos se observa el sedimento formado, empleando el tubo 1 como blanco. SEGUNDA PARTE: Efecto del ph sobre la actividad enzimática. 1. Prepare una serie de 8 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla: Reactivos Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Sustrato de almidón 8 - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 mg/mL Solución reguladora al pH pH=7 pH=3 pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 pH=10 indicado: mL: 5 4 4 4 4 4 4 4 Enzima: Solución (1:80) - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 de amilasa Se agitan bien los tubos y se incuban a 40 °C por 15 minutos. Se agregan a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y se agitan bien Se agrega a cada tubo 1 mL de R. de Fehling A y 1 mL de R. de Fehling B Se agitan bien los tubos. Se ponen en baño maría a ebullición durante 5 minutos. 2. Se enfrían los tubos y sin agitarlos se observa el sedimento formado, empleando el tubo 1 como blanco. MANEJO DE RESIDUOS Y SUBPRODUCTOS 24 El contenido de los tubos puede desecharse en el drenaje. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Primera parte: Se anotan los resultados indicando mediante cruces la cantidad de precipitado producido en cada uno de los tubos en el cuadro siguiente: Temperatura (°C) 5 25 40 50 60 92 Reacción de Fehling Segunda parte: Anote sus resultados indicando mediante cruces la cantidad de precipitado producida en cada uno de los tubos en el cuadro siguiente: pH 3 5 6 7 8 9 10 R. de Fehling Se analizan los resultados obtenidos y se sacan las conclusiones CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. En base a los resultados obtenidos diga ¿Cuál es el pH óptimo para la actividad de la amilasa salival? 2. En base a los resultados obtenidos diga ¿Cuál es la temperatura óptima para la actividad de la amilasa salival? 3. ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis del almidón? 4. Investigar qué es un azúcar reductor. BIBLIOGRAFÍA 25 ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA BELLO Gil Daniel, CARRERA Bocourt Emilia, DIAZ Maqueira Yuset. (2006). Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. Cubanstituto Cubano de Investigaciones. http://www.redalyc.org/pdf/2231/223120664006.pdf Cuba Vo.Bo. FECHA 26 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 4 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE CARBOHIDRATOS SUSTENTO TEÓRICO Sumner y colaboradores desarrollaron un método utilizando el ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) para calcular la concentración de azúcares reductores en distintos materiales. El procedimiento se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra. Este método ha sufrido varias modificaciones a través de los años para adecuarse al análisis de diferentes materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico. El método del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinación de azúcares reductores en muestras intensamente coloreadas como mieles y caldos de fermentación que la contengan. Estudios de Otero y colaboradores muestran dispersión en la determinación de azúcares reductores en mieles por el método del DNS con la modificación de Miller. En la actualidad, en especial la producción de alcohol a partir de jugos mezclados de caña de azúcar necesita del desarrollo de nuevos procedimientos analíticos: precisos, de elevada productividad y de poca manipulación técnica que permitan llevar con exactitud la contabilidad y eficiencia global del proceso. En este trabajo se desarrollará un procedimiento para la determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar por el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. COMPETENCIA El estudiante: Determina la cantidad de azúcares reductores presentes en el jugo de la caña de azúcar mediante un método espectrofotométrico. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA 27 Esta práctica se realizará en dos sesiones: En la primera sesión, se elaborará la curva de calibración de la glucosa preparando una serie de tubos de ensayo con diluciones de concentración conocida, a partir de una solución STD de glucosa, y se pondrá en contacto con el reactivo dinitro salicílico (DNS), calentando a ebullición durante 5 minutos, para obtener el desarrollo de color el cual podrá ser medido, una vez enfriado a temperatura ambiente, mediante un espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda definida, registrando la absorbancia de luz por la muestra. La intensidad de la coloración resulta directamente proporcional a la concentración de la glucosa en cada muestra. Con los datos obtenidos se procede a obtener la curva de calibración, graficando la concentración contra la absorbancia de cada tubo. En la segunda sesión, se centrifugará y filtrará una muestra de jugo de caña y se procederá a obtener la inversión de los azúcares en la muestra mediante un tratamiento con ácido clorhídrico diluido y calentamiento; después de un tiempo de reacción deberá neutralizarse con hidróxido de sodio y posteriormente se realizarán diluciones acuosas de la muestra de jugo de caña invertido (JCI) Se preparará una serie de 5 tubos con diluciones de las muestras de JCI, se pondrán en contacto con el reactivo DNS, se calentarán a ebullición por 5 minutos y después se enfriarán. Se tomarán las lecturas de absorbancia a cada uno de los tubos a la misma longitud de onda de la primera sesión, en el mismo espectrofotómetro empleado por los operarios. Con los datos obtenidos (absorbancias) de las muestras de jugo de caña se determinará el contenido de glucosa de las mismas empleando para ello la curva de calibración elaborada en la primera sesión.2 MATERIAL 6 tubos de ensaye de 18 x 150 mm 2 Gradillas para tubo de ensaye Papel fitro de filtrado rápido 4 matraces volumétricos de 50 mL Vaso de 600 mL Mechero Bunsen Tripié metálico Tela de asbesto Termómetro Piseta con agua destilada Vaso de pp de 100 mL 5 pipetas graduadas de 5 Ml 17 tubos de ensaye de 13 x 100 mm 2 ICIDCA. 2006 28 EQUIPO Espectrofotómetro UV-visible Centrífuga de 10,000 rpm Potenciómetro REACTIVOS Reactivo DNS HCl al 50 % en agua NaOH al 10 % en agua Sol. STD de glucosa de 1.5 g/L Jugo de caña de azúcar PROCEDIMIENTO Primera parte. Preparación de la curva de calibración. 1. Se prepara una gradilla con 7 tubos de ensaye de 13 x 100 mm para preparar 5 mL de las siguientes concentraciones: Blanco, 0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3 y 1.5 g/L de glucosa a partir de la solución STD con 1.5 g/L de este azúcar, roturándolos adecuadamente y procediendo de la siguiente manera. Tubo Blanco 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 mL de STD glucosa 1.5 0.0 1.67 2.33 3 3.67 4.3 5 g/L mL de agua 5 3.33 2.67 2 1.33 0.7 0 2. Agitar los tubos cuidadosamente y preparar en otra gradilla otros 7 tubos de ensaye de 13 x 100 mm, rotulándolos adecuadamente de acuerdo a las instrucciones siguientes: 1.5 /1000 mL = 0.0015 g/mL x 1.67= 0.0025 g/5 mL = Tubos Blanco 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 mL de los tubos anteriores 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 mL de Reactivo DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agitar cuidadosamente Colocar 5 minutos en un vaso de pp de 600 mL con 200 mL de agua a 100ºC Enfriar a temperatura ambiente Agregar a cada tubo 5 mL de agua destilada Agitar cuidadosamente 29 Leer la absorbancia de cada tubo a 540 nm en un espectrofotómetro UV-visible. Llevar a cero el instrumento con el blanco de reactivos. Trazar la grafica de la curva de calibración: concentración (Eje X) vs absorbancia (Eje Y) Segunda parte. Medición de la muestra problema (Jugo de caña) 1. Medir 10 mL de jugo de caña de azúcar, colocarlo en un tubo de ensaye de 18 x 150 mm y centrifugarlo 10 minutos a 10,000 rpm. Filtrar el sobrenadante en un papel de filtrado rápido. 2. Colocar con una pipeta volumétrica 0.5 mL del jugo filtrado en un tubo de ensaye de 18 x 150 mm, agregarle 2.5 mL de HCl al 50 %, mezclar bien. 3. Colocar el tubo en un vaso de 600 mL que tenga aproximadamente 100 mL de agua de la llave a una temperatura de 65 ºC y mantenerlo ahí durante 10 minutos a esas condiciones. 4. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se vacía a un vaso de pp de 100 mL procurando enjuagar el tubo con 5 mL de agua destilada; agregar otros 15 mL de agua destilada al vaso. Neutralizar la solución con NaOH al 10 % apoyándose con un potenciómetro. 5. Vaciar la solución cuantitativamente a un matraz volumétrico de 50 mL, aforar con agua destilada y rotularlo como jugo de caña invertido (JCI). 6. Preparar 5 tubos de ensaye de 18 x 150 mm rotulados de la siguiente manera: Blanco, 25%, 50%, 75% y 100%. 7. Preparar las diluciones de la manera siguiente: Tubo Blanco 25 % 50 % 75 % 100 % mL de Sol. JCI 0 2.5 5 7.5 10 mL de Agua 10 7.5 5 2.5 0 8. Agitar perfectamente estos tubos y preparar otra gradilla con 5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm y numerarlos adecuadamente, de acuerdo a las siguientes instrucciones: Tubo Blanco 25% 50% 75% 100% mL de los tubos 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 anteriores mL de reactivo DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Agitar cuidadosamente Colocar 5 minutos en un vaso de pp de 600 mL con 200 mL de agua a 30 100ºC Enfriar a temperatura ambiente Agregar a cada tubo 5 mL de agua destilada Agitar cuidadosamente Leer la absorbancia de cada tubo a 540 nm en un espectrofotómetro UV-visible. Llevar a cero el instrumento con el blanco de reactivos. Determinar la concentración de glucosa en cada tubo, utilizando la curva de calibración elaborada en la sesión anterior. . MANEJO DE RESIDUOS: El contenido de los tubos puede desecharse en el drenaje. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Primera parte: Datos obtenidos Tubo Concentración Absorbancia (g/L de glucosa) 0 (Blanco) ---- 0.0000 1 0.5 2 0.7 3 0.9 4 1.1 5 1.3 6 1.5 Curva de calibración: Segunda parte: Concentración de la glucosa en el jugo de la caña. Tubo Absorbancia Concentración de glucosa (g/L) 7 (25%) 8 (50 %) 9 (75%) 10 (100%) Nota: La concentración del Jugo de Caña Invertido se obtiene de la gráfica de la concentración de la glucosa 31 CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Realizar los cálculos para la preparación de las diluciones de la glucosa a partir del STD de glucosa al 1.5 g/L 2. Investigar la reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra. BIBLIOGRAFÍA ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA ICIDCA. 2006. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar, utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico. Instituto Cubano de Investigaciones de los derivados de la caña de azúcar. Vo.Bo. FECHA 32 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 5 EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE ALGUNOS LÍPIDOS SUSTENTO TEÓRICO Los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas (la mayoría biomoléculas) compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Tienen como característica principal el ser hidrófobas (insolubles en agua) y solubles en disolventes orgánicos como la bencina, el benceno y el cloroformo. En el uso coloquial, a los lípidos se les llama incorrectamente grasas, ya que las grasas son solo un tipo de lípidos procedentes de animales. Los lípidos cumplen funciones diversas en los organismos vivientes, entre ellas la de reserva energética (como los triglicéridos), la estructural (como los fosfolípidos de las bicapas) y la reguladora (como las hormonas esteroides). Las grasas y los aceites son usualmente mezclas de glicéridos mixtos, es decir, ésteres del glicerol con diversos ácidos grasos. Los ácidos grasos más abundantes en las plantas y los animales superiores, tienen un número par de átomos de carbono, tales como ácidos saturados palmítico (C16) y esteárico (C18); y los no saturados oléico y linoléico. La yema es la porción amarilla del huevo; está recubierta por la membrana vitelina que la separa de la clara y la protege de una posible rotura. El color está determinado principalmente por la dieta de la gallina. Puede presentar una mancha rojiza, que corresponde al disco germinativo, a partir de la cual se desarrollaría el pollo en caso de que el huevo hubiera sido fecundado. Es una dispersión de diferentes tipos de partículas suspendidas en una solución proteíca. La cantidad de proteína sobre sustancia seca es de 31,1% y la de grasa del 65,8%, con gran cantidad de lipoproteínas de baja densidad (LDL) ricas en colesterol. La fase continua (78%) está formada por un extracto seco de proteínas globulares y lipoproteínas de baja densidad (LDL), mientras que la fase dispersa (20%) lo está con proteínas globulares y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Normalmente el hígado tiene 5 g de contenido de grasa por cada 100g de peso, siendo los fosfolípidos los que más abundan llegando a constituir 33 aproximadamente hasta el 50% del contenido total, en menos proporción (7%) se hayan los triglicéridos y colesterol no esterificado (1). COMPETENCIAS El estudiante: 1. Aisla lípidos a partir de materiales biológicos. 2. Extrae y separa de la yema de huevo, dos grupos de lípidos muy importantes, ambos conocidos como fosfolípidos, por contener fósforo: Lecitinas y Cefalínas. 3. Extrae los lípidos totales del hígado. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA Esta práctica se realizará en dos sesiones: En la primera se llevará a cabo una extracción de los lípidos presentes en la yema del huevo, mediante solventes éter etílico. Posteriormente se lleva a cabo la precipitación de los fosfolípidos empleando la acetona, los que se separan de los demás por filtración y finalmente se separan la lecitina de la cefalina, aprovechando la solubilidad de la primera en alcohol frío. En la segunda sesión se extraerán los lípidos totales del hígado de un animal, mediante extracción con éter y alcohol en caliente, para después eliminarlos por evaporación y hacer una purificación mediante redisolución con éter de petróleo para filtrar las impurezas y obtener los lípidos mediante el secado del líquido filtrado. MATERIAL 1 vaso de pp de 100 mL Agitador de vidrio Embudo de filtración rápida 3 Papeles filtro Soporte metálico Anillo metálico Tubo de ensaye de 18 x 150 mm Cuba para baño maría Parrilla eléctrica Balanza granataria Navaja o bisturí Mortero con pistilo Guantes desechables 34 Vaso de pp de 250 mL 2 Matraz Erlenmeyer de 125 mL Termómetro de 0 a 100 °C Probeta de 100 mL Bolsas de polietileno REACTIVOS Acetona Etanol Éter etílico Éter de petróleo Sulfato de sódio anhidro Mezcla Etanol-Éter 3:1 Hielo Muestras biológicas: 1 huevo de gallina 1 hígado de pollo o de otro animal. PROCEDIMIENTO PRIMERA PARTE. Extracción y separación de Lecitina y Cefalina del huevo. 1. Se separa la yema de un huevo en un vaso de precipitado de 100 mL (pesado previamente vacío) y se pesa. 2. Se agrega 10 mL de éter etílico o un poco más hasta cubrir totalmente la yema y se agita con una varilla de vidrio para homogeneizar bien. 3. Se agrega lentamente y sin dejar de agitar, un volumen de acetona igual al de éter. Se observará que la acetona provoca la precipitación de los fosfolípidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos. 4. Se filtra la mezcla obtenida en un papel filtro previamente pesado, después de dejar en reposo unos minutos. El precipitado -que contiene lecitina y cefalina- se lava con alcohol bien frío, recibiendo el filtrado en un tubo de 18 x 150 mm, seco, limpio y pesado. 5. La lecitina es más soluble en alcohol frío por lo tanto queda en el papel filtro únicamente cefalina. 6. Para obtener la lecitina, se evapora el alcohol lentamente en baño de vapor. Se dejan secar los dos precipitados y se pesan. 7. Se calcula el porcentaje de lecitina y cefalina presentes en la yema de huevo examinada. 35 SEGUNDA PARTE: Extracción de lípidos totales del hígado. 1. Se pesa el hígado del animal y se anota este peso. 2. Se corta el tejido en fragmentos pequeños y se ponen en un mortero una porción de 2.0 g, con un peso igual de sulfato de sodio anhidro. 3. Se muele la mezcla en el mortero hasta obtener una pasta homogénea. 4. Se agregan 5 mL de alcohol y se continúa homogeneizando. 5. Se transfiere la papilla a un matraz erlenmeyer de 125 mL ayudándose con 3 porciones más de alcohol, de 5 mL cada una, de modo que quede limpio el mortero. 6. Se coloca el matraz en un baño de agua a 70°C y se mantiene agitando a esa temperatura durante 10 minutos. 7. Se deja enfriar y se agregan 10 mL de éter etílico para completar la extracción; 8. Se agita bien y se deja reposar hasta que se asiente bien. 9. Se filtra el sobrenadante por decantación recibiéndolo en otro matraz erlenmeyer de 125 mL y se agrega al residuo otra porción de 10 mL de mezcla de alcohol-éter en proporción 3:1; que se calienta a 70°C y se filtra en la misma forma. 10. Se repite por tercera vez la extracción con otros 10 mL de mezcla alcohol- éter. Se evapora el éter en los filtrados reunidos, colocando el matraz en el baño caliente, sin flama, hasta que no se desprenda olor a disolventes. 11. Se enfría el matraz y se agregan 10 mL de éter de petróleo, agitando, para volver a disolver los lípidos. 12. Se filtra, recibiendo el filtrado en una probeta seca y lavando el residuo con éter de petróleo hasta completar un volumen total de filtrado de 25 mL. 13. Se vacía en una cápsula de porcelana previamente pesada y se elimina el solvente por evaporación. 14. Se pesa la cápsula con los lípidos secos y se descuenta el peso de la cápsula. 15. Se calcula el contenido de grasa en el hígado completo. MANEJO DE RESIDUOS Y PRODUCTOS Colocar todos los desechos sólidos biológicos en bolsas de plástico, amarrarlas perfectamente bien y depositarlos en el bote de la basura. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 Primera parte Pesada de los materiales vacíos: Peso del vaso de pp de 100 mL seco_____________ gr Peso del tubo de 18 x 150 mm seco______________ gr Peso del papel filtro___________________________ gr Pesada de los materiales con muestra: Peso del vaso de pp de 100 mL más la yema ________________gr Peso del papel filtro con la cefalina secos ___________________ gr Peso del tubo de 18 x 150 mm con la lecitina secos ___________ gr Peso de la yema del huevo __________________gr Peso de la lecitina_________________________ gr Peso de la cefalina_________________________ gr Porcentaje de lecitina en la yema _____________ Porcentaje de cefalina en la yema _____________ Segunda parte Peso del hígado completo _________________________ gr Peso de la cápsula vacía seca _______________________ gr Peso de la cápsula con los lípidos secos____________ gr Peso de los lípidos en 2 gr de muestra de hígado ______________gr Contenido de grasa en el hígado completo ___________________ gr CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Escriba Las fórmulas estructurales de todos los productos de hidrólisis de la 1-a-lecitina (dioleil fosfatidil colina) 2. Escriba la formula general de la cefalina 3. ¿En que consiste la condición patológica conocida como “hígado graso”, y cuales son sus causas más frecuentes? 37 BIBLIOGRAFÍA ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA PEÑA Carrasco Juan Diego. HIGADO GRASO. Unidad de Videoendoscopia digestiva. Hospital Clínica Kennedy. http://www.gastroenterologosecuador.com/patologias/higado.htm Vo.Bo. FECHA 38 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 6 REGULACIÓN ÁCIDO-BASE DEL ORGANISMO HUMANO SUSTENTO TEÓRICO Dentro de los mecanismos de regulación de que dispone el organismo para mantener la Integridad fisiológica, aquellos involucrados en la homeostasis del pH en los fluidos extracelulares desempeñan un papel crucial para la supervivencia del individuo. En este sentido cabe señalar que, como resultado de la oxidación de los alimentos, un humano adulto promedio produce alrededor de 20 moles de CO2 al día. Al difundir a la sangre, gran parte de dicho gas se combina con al agua en el interior de los eritrocitos, produciendo ácido carbónico (H2CO3), reacción que es seguida por la disociación del H2CO3 para producir el anión bicarbonato HCO3 - y un ión hidrógeno (H+). Dado el carácter de ácido débil del H2CO3, la fracción disociada del mismo es pequeña; sin embargo, considerando la gran cantidad de CO2 que produce el organismo, la acidificación de los fluidos extracelulares sería importante en ausencia de mecanismos reguladores. En el hombre, la intervención de los pulmones y los riñones evita que ocurra tal acidificación manteniendo en un nivel constante la concentración de H+ y, por consiguiente, del pH. Para entender el papel que juegan ambos órganos en la homeostasis del equilibrio ácido-base, debe tenerse presente que el sistema del ácido carbónico implica la participación de un componente gaseoso o volátil (el CO2) y dos componentes no volátiles (el HCO3 - y el H+). En la sangre, el equilibrio entre dichos componentes determina el valor del pH sanguíneo, que puede evaluarse mediante la bien conocida ecuación de Henderson-Hasselbach. En el individuo normal, dicho valor fluctúa en un promedio 7.4, siendo la sangre venosa –enriquecida en CO2 - ligeramente más ácida en relación con la sangre arterial. Ahora bien, ya que a temperatura ambiente el CO2 existe en estado gaseoso, la cantidad de CO2 disuelto en la sangre dependerá de la presión parcial (PCO2) ejercida por el mismo a nivel de los alvéolos pulmonares. En el humano, la magnitud de dicha PCO2 es de aproximadamente 40 mm Hg lo que se traduce en una concentración de CO2 sanguíneo de aproximadamente 25 mm Hg; este último valor incluye no solo el CO2 como tal, sino también el bicarbonato y el ácido carbónico. 39 Considerando el pH sanguíneo normal y el pKa del sistema bicarbonato-ácido carbónico, es precisamente la PCO2 la que es controlada por los pulmones, ya que durante el proceso de la exhalación se elimina CO2, manteniendo constante la PCO2 en los alvéolos y evitando así que aumente el nivel de CO2, disuelto en la sangre. Todo proceso o patología que se manifieste en una alteración en la frecuencia y/o profundidad del proceso de inhalación-exhalación, dará como resultado una alteración de la PCO2 alveolar – aumentándola o disminuyéndola, con la siguiente modificación del nivel de CO2 disuelto en sangre y por consiguiente, del pH. Por lo que respecta a los riñones, su participación en el mantenimiento de un pH extracelular constante se da a través de dos mecanismos: la excreción de equivalentes ácidos (H+) hacia la orina y la regulación de la cantidad de HCO3- reabsorbido hacia la sangre desde el filtrado glomerular. A diferencia del intercambio gaseoso en los pulmones, los mecanismos de regulación renal son de largo plazo, por lo que su efecto será manifiesto en cuestión de horas. Su importancia se enfatiza en situaciones patológicas donde se altera el intercambio de gases pulmonar (es decir, en la acidosis y alcalosis respiratorias), en cuyo caso es necesario aumentar o disminuir la tasa de reabsorción del HCO3- , o bien en estados fisiológicos que producen cantidades importantes de ácidos orgánicos (por ejemplo, en la diabetes no controlada o durante el ejercicio intenso) donde se incrementa la excreción de H+ . Gran parte de este último aparece en la orina acomplejado con el amoniaco en forma de ión amonio (NH4 +) o asociado con el fosfato en forma de fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4), representando este último la llamada acidez titulable. En general, el pH de la orina será un reflejo de la producción de ácidos no volátiles por el organismo. El resultado final de los mecanismos fisiológicos que participan en el mantenimiento del equilibrio ácido-base es el de mantener el pH extracelular en un rango compatible con el funcionamiento adecuado del organismo.3 COMPETENCIAS El estudiante: 1. Comprueba las actividades reguladoras del pulmón y el riñón para mantener el equilibrio ácido-base en condiciones que tienden a romperlo. 2. Mediante la determinación del pH, observa la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha realizado ejercicio muscular intenso. 3. Mediante la medición del pH, observa la variación de la concentración de hidrogeniones en la orina de un individuo que ha ingerido bicarbonato de sodio. 3 UNAM: 2013-2014 40 4. Relaciona los resultados obtenidos con los cambios metabólicos originados por el ejercicio muscular intenso y la alcalosis metabólica por ingesta de bicarbonato de sodio. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA Esta práctica consta de mediciones de pH en muestras de orina recolectadas, durante una hora, de individuos sometidos a dos situaciones diferentes; uno de ellos, realizando ejercicio intenso y el otro después de ingerir una cantidad medida de solución de bicarbonato de sodio. En ambos casos se comprobará la regulación que efectúa el organismo humano para mantener la homeostasis del pH en los fluidos extracelulares. MATERIAL 10 Fcos. de 100 mL de polietileno con tapa EQUIPO Potenciómetro o pHmetro REACTIVOS 1500 mL de agua para beber embotellada 250 mL de solución de Bicarbonato de sodio al 3 % Muestras de orina recién emitida en diversas condiciones PROCEDIMIENTO A. Variación de hidrogeniones por el ejercicio muscular intenso. Dos alumnos por equipo desayunarán o comerán normalmente (evitar ingestión de jugos ácidos, bebidas alcohólicas); después harán lo que se indica a continuación. Uno de los alumnos arriba mencionados efectuará lo siguiente: 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Recolectar aproximadamente 25 ml de orina en el frasco para muestra. 4. Medir el pH inmediatamente 41 5. Realizar ejercicio muscular intenso, como subir y bajar varias veces las escaleras de tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido por el profesor. 6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, como en el inciso 3, hasta completar por lo menos cuatro muestras más. 7. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a aumentar debido a la pérdida de dióxido de carbono y a que el crecimiento bacteriano produce amoniaco a partir de la urea. 8. Trazar una gráfica de pH contra tiempo. B. Variación de hidrogeniones por la ingesta de Bicarbonato de sodio. El segundo alumno que se preparó para la prueba, efectuará lo siguiente: 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar esa orina. 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente antes de la clase práctica. 3. Recolectar aproximadamente 25 ml de orina en el frasco para muestra 4. Medir el pH inmediatamente. 5. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de bicarbonato de sodio. 6. Obtener muestras de orina cada 15 minutos, hasta completar por lo menos 4 muestras más. 7. A cada muestra se le determinará el pH inmediatamente después de haber sido obtenida. 8. Trazar una gráfica de pH contra tiempo. MANEJO DE RESIDUOS Depositar las muestras de orina en el inodoro de la institución. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Valores de pH de la parte A. pH de la muestra inicial de orina___________________ pH de la muestra de orina a los 15 minutos de iniciado el ejercicio___________ pH de la muestra de orina a los 30 minutos de iniciado el ejercicio___________ pH de la muestra de orina a los 45 minutos de iniciado el ejercicio___________ pH de la muestra de orina a los 60 minutos de iniciado el ejercicio___________ Valores de pH de la parte B. pH de la muestra inicial de orina___________________ pH de la muestra de orina 15 minutos después de ingerir el NaHCO3 _________ pH de la muestra de orina 30 minutos después de ingerir el NaHCO3 _________ pH de la muestra de orina 45 minutos después de ingerir el NaHCO3 _________ pH de la muestra de orina 60 minutos después de ingerir el NaHCO3 _________ 42 A. Gráfica de la variación de pH en el tiempo por el ejercicio intenso. B. Gráfica de la variación de pH en el tiempo después de la ingesta de Bicarbonato de socio. CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. ¿Por qué es importante que se mantenga constante, dentro de ciertos límites, el pH en el organismo? 2. ¿Cuáles son las reacciones de formación del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y H2O, y de su disociación para formar el ion bicarbonato? Escríbalas. 3. ¿Qué sistemas amortiguadores participan directamente en la regulación del pH sanguíneo? BIBLIOGRAFÍA ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA pH en el cuerpo humano y la salud. (2010). Enciclopedia de salud, dietética y psicología. http://www.enciclopediasalud.com/categorias/otros-temas/articulos/ph-en-el- cuerpo-humano-y-la-salud Vo.Bo. FECHA 43 UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS INGENIERÍA AMBIENTAL EXPERIENCIA EDUCATIVA: _BIOQUÍMICA GENERAL____ PRÁCTICA No. 7 OXIDACIONES BIOLÓGICAS SUSTENTO TEÓRICO De todas las propiedades que posee un ser vivo, quizá la más característica es su capacidad para utilizar y transformar la energía del medio ambiente. Todos los procesos químicos y físicos que están relacionados con la obtención de la energía en un ser vivo se denomina respiración. Sin embargo, este término se utiliza para designar simplemente la entrada y salida de aire de un compartimiento a otro. Un término que cada día se utiliza más como sinónimo bioquímico de respiración es bioenergética, aunque este término es más amplio que respiración, ya que quedan incluidos los procesos fotosintéticos. Todos los procesos químicos que constituyen la respiración conducen a la oxidación de substancias denominadas metabolitos, hasta CO 2 y H2O. Por regla general, todas las reacciones de oxidación son reacciones exergónicas, es decir, liberan energía cuando se efectúan; en ocasiones toda la energía se libera como calor, como ocurre cuando se quema u oxida un pedazo de madera. Sin embargo, un organismo viviente no es una máquina térmica y, por tanto, debe poseer un mecanismo enzimático que le permita capturar y almacenar la energía liberada en los procesos de oxidación. La utilización o captura de la energía involucra la participación de enzimas específicas, capaces de catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica). Todas las oxidaciones biológicas se caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto confirma el hecho de pensar que todos estos procesos son catalizados por enzimas. Warburg fue uno de los primero investigadores que trató de explicar las oxidaciones biológicas suponiendo una activación del oxígeno. Comprobó que la velocidad de oxidación de varios aminoácidos era aumentada si añadía al sistema “carbón de sangre”, pero no, si agregaba “carbón vegetal”. Posteriormente pudo comprobar que el hierro que llevaba como impureza el carbón de sangre era el responsable de la catálisis. Su teoría fue demostrada plenamente al lograr aislar una enzima que contiene hierro. Actualmente se sabe 44 que en los tejidos existe un sistema de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxigeno molecular se activa y actúa como un agente oxidante. Wieland observó que la activación del oxígeno era insuficiente para explicar las oxidaciones tisulares. Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la activación del hidrógeno por la acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrógeno a diferentes aceptores que pueden ser el oxígeno u otros agentes oxidantes. Szent Györgyi coincilió las dos teorías al suponer que es necesaria la activación del hidrógeno y también la del oxígeno. Keillin supuso que interviene, como eslabón intermediario, el citocromo. Sin embargo, las oxidaciones biológicas no son tan sencillas, pues se ha comprobado que en la oxidación de cada metabolito intervienen una gran cantidad de aceptores de hidrógeno.4 COMPETENCIA El estudiante: Demuestra la actividad de la deshidrogenasa láctica, basada en la reducción del azul de metileno (aceptor de electrones) el cual al reducirse se decolora formando una leucobase, y es simultánea a la oxidación del sustrato correspondiente, por lo que la observación puede hacerse de manera cuantitativa. DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA En esta práctica se demostrará la actividad de la deshidrogenasa láctica presente en los músculos de las patas de las ratas. Se aísla la enzima HDL mediante extracción acuosa caliente, así como la coenzima NAD+ de estos tejidos mediante la extracción con solución salina en frío, y posteriormente se ponen en contacto con el sustrato de lactato (una sal del ácido láctico) y azul de metileno para observar la reducción de éste al producirse la decoloración, la cual indica que la oxidación del sustrato se llevó a cabo. MATERIAL 4 vasos de pp de 100 mL Balanza granataria Matraz erlenmeyer de 125 mL Una cuba para baño maría Mechero bunsen, tripié y tela de asbesto 2 Morteros con pistilo 2 Tubos para centrífuga 4 UACAM:2002 45 Agitador de vidrio Vaso de pp de 250 mL Termómetro de 0 a 100 °C Guantes, cubreboca y bolsas de polietileno Cuchillo filoso o bisturí Un frasco grande de boca grande con tapa Una tabla para cortar EQUIPO Centrífuga REACTIVOS Eter etílico Agua destilada 50 mL de Solución de NaCl al 0.9 % 4 mL de KCN al 0.5 % 3 mL de lactato de sodio al 1 % 1.5 mL de azul de metileno 0.002 M Vaselina Una rata blanca viva Hielo PROCEDIMIENTO 1. Se coloca un algodón impregnado con éter etílico en el interior de un frasco grande con tapa. 2. Se introduce una rata en el frasco y cuando esté dormida se mata. 3. Se disecan los músculos de las patas traseras, se pesan por separado dos porciones de 4 g cada una y se colocan en hielo. Preparación de la coenzima (NAD+) 1. Se colocan en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, 4 g de músculo de las patas traseras (cortados en fragmentos pequeños). 2. Se agrega agua destilada en proporción de 1 a 6. 3. Se hierve durante 5 minutos. 4. Se colocan los fragmentos hervidos en un mortero y se trituran perfectamente. 5. Se pasa el triturado a un tubo de centrífuga y se enjuaga el mortero con el agua donde se hirvieron los fragmentos, pasando todo al mismo tubo. 46 6. Se centrífuga a 3,000 rpm durante 15 minutos. 7. Se recoge el sobrenadante y se etiqueta como coenzima NAD+. 8. Se desecha el precipitado. Preparación de la enzima deshidrogenasa láctica (LDH). 1. Enfriar 50 mL de una solución de NaCl al 0.9 % y un mortero. 2. Colocar en el mortero ya frío, los otros 4 g de músculos de las patas de la rata. 3. Se trituran perfectamente agregando la solución fría de NaCl en proporción de 8 mL por gramo de tejido. 4. El triturado se transfiere a un vaso de precipitados y se deja reposar en frío durante 30 minutos. 5. Se pasa a un tubo y se centrifuga en frío a 3,000 rpm durante 15 minutos. 6. Se recoge el sobrenadante y se etiqueta como deshidrogenasa láctica (LDH). 7. El precipitado se desecha. Demostración de la actividad de la LDH. 1. Preparar una serie de tubos como se indica a continuación: Reactivos en mL Tubos No 1 2 3 4 KCN al 0.5 % 1.0 1.0 1.0 1.0 Lactato al 1 % 1.0 1.0 0.0 1.0 Azul de metileno 0.002 M 0.3 0.3 0.3 0.3 Agua destilada 0.0 1.0 1.0 1.0 Sobrenadante “Coenzima NAD+” 1.0 0.0 1.0 1.0 Sobrenadante “Enzima LDH” 1.0 1.0 1.0 0.0 Mezclar bien el contenido de cada tubo Vaselina 0.5 0.5 0.5 0.5 2. Una vez agregada la vaselina, no agitar el contenido de los tubos. 3. Incubar en baño maría a 37 °C y hacer observaciones sobre la coloración de los tubos a los 0, 10, 20 y 30 minutos. 4. Anote en el cuadro de resultados, el “grado de coloración” utilizando “cruces” (de una a tres). MANEJO DE RESIDUOS Colocar todos los residuos biológicos en una bolsa de plástico, eliminar el aire del interior y amarrarla perfectamente bien. Depositarla en los botes de basura del área exterior del laboratorio. 47 RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Tubo No. 1 2 3 4 (minutos) 0 10 20 30 Explique sus resultados con base al contenido de cada tubo. CONCLUSIÓN CUESTIONARIO 1. Investigar la función biológica de la deshidrogenasa láctica. 2. Investigar la función biológica de la coenzima nicotín-adenín dinucleótido (NAD+) 3. ¿Cuál es la diferencia entre enzimas y coenzimas? BIBLIOGRAFÍA ARTÍCULOS RELACIONADOS CON LA PRÁCTICA ARANDA Torrelio Eduardo. (2010). Interpretación de la deshidrogenasa láctica (DHL). Revista de la Sociedad Boliviana de Pediatría. http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1024- 06752010000200009&script=sci_arttext Vo.Bo. FECHA 48 BIBLIOGRAFÍA 1. MATHEWS C. K., Van Holde K. E. (2013). Bioquímica. 4a. edición. Ed. Pearson Higher Education. 2. UNAM. (2013-2014). Manual de Bioquímica. http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/Main/Manual_2013-2014.pdf 3. UACAM.(2002). Manual de Bioquímica. https://www.google.com.mx/search?newwindow=1&es_sm=93&q=Manual+ de+Bioqu%C3%ADmica.+Universidad+de+campeche&oq=Manual+de+Bio qu%C3%ADmica.+Universidad+de+campeche&gs_l=serp.12...16009.2767 3.0.30576.34.27.7.0.0.4.327.3858.0j10j5j3.18.0.msedr...0...1c.1.61.serp..20 .14.2076.CvVghVV-PuU 4. LEHNINGER. Principios de Bioquímica, 5ª Edición, Barcelona, Ediciones Omega 5. LUQUE Guillén M. Victoria. (2009). Estructura y propiedades de las proteínas. Master Ingeniería Biomédica. http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/proteinas_09.pdf 6. CINÉTICA ENZIMÁTICA file:///C:/Users/SEARS/OneDrive/BIOQUIMICAS/BIOQU%C3%8DMICA%2 02015/art%C3%ADculo%20sobre%20cin%C3%A9tica%20enzim%C3%A1t ica.pdf 7. BELLO Gil Daniel, CARRERA Bocourt Emilia, DIAZ Maqueira Yuset. (2006). Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. Cubanstituto Cubano de Investigaciones. http://www.redalyc.org/pdf/2231/223120664006.pdf 8. Estudio del comportamiento de la fibra Lyocell frente a la hidrólisis enzimática con celulasas.file:///C:/Users/SEARS/OneDrive/BIOQUIMICAS/BIOQU%C3%8 DMICA%202015/Reaccion%20glucosa%20DNS%20Pag.%20142.pdf 9. PEÑA Carrasco Juan Diego. HIGADO GRASO. Unidad de Videoendoscopia digestiva. Hospital Clínica Kennedy.http://www.gastroenterologosecuador.com/patologias/higado.htm 10. pH en el cuerpo humano y la salud. (2010). Enciclopedia de salud, dietética y psicología. http://www.enciclopediasalud.com/categorias/otros- temas/articulos/ph-en-el-cuerpo-humano-y-la-salud 11. ARANDA Torrelio Eduardo. (2010). Interpretación de la deshidrogenasa láctica (DHL). Revista de la Sociedad Boliviana de Pediatría. http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1024- 06752010000200009&script=sci_arttext 49 Esta tercera edición del manual de prácticas de laboratorio fue compilada, modificada y actualizada por la Dra. Mirza Ema Ye Gómez, catedrática titular de la Experiencia Educativa de BIOQUÍMICA GENERAL que se imparte a los alumnos de Ingeniería Ambiental en la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Veracruzana, Campus Coatzacoalcos. Coatzacoalcos, Ver., febrero de 2015. 50