1NO. 1 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los alumnos y alumnas que estén en un momento dado trabajando en el laboratorio. La bioseguridad se refiere a las medidas para evitar la transmisión de agentes lesivos (biológicos, químicos o físicos) tanto a los usuarios como a los encargados de dar un servicio médico.el riesgo más importante es la infección, no obstante se debe de tomar en cuenta todos los riesgos de accidentes que pueda llevar a lesiones. Los centros de atención médica producen desechos sólidos y líquidos los cuales, para fines prácticos son clasificados en comunes, peligrosos y especiales. Los desechos comunes provienen de actividades administrativas, de recreación, de cocina y preparación o venta de alimentos. Su destino depende de un manejo municipal que los lleva usualmente a un relleno sanitario administrativo por la municipalidad. Los desechos peligrosos son los producidos en instituciones dedicadas al cuidado de pacientes, que por naturaleza pueden afectar la salud humana, animal y medio ambiente. Esta categoría de desechos se dividen en: Bio-infecciosos: sangre y derivados, secreciones humanas, equipo, materiales contaminados con las mismas, material punzo cortante (principalmente agujas hipodérmicas). Químicos: reactivos de laboratorio, corrosivos, tóxicos y citotóxicos. Y Radioactivos. Los desechos Especiales son mobiliario y equipo en desuso, objetos de gran tamaño, fármacos y reactivos de laboratorio vencidos y otros que no deben ser depositados en los recipientes normales de desechos. NORMAS 1. Lavado de manos. 2. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. 3. El uso de la bata es de carácter obligatorio, ya que evita posibles proyecciones de sustancias químicas lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en tus prendas de vestir. 4. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido. 5. En el laboratorio está terminantemente prohibido: fumar, tomar bebidas, comer y jugar con sus compañeros. 6. Se debe de llevar zapatos cerrados. 7. Trabajar con guantes. 8. Presentarse a la hora indicada por el docente 9. No entrar bolsas, maletas o mochilas. 10. No abrir las vitrinas 11. Tapar los microscopios después de usarlos 12. Manejar los equipos y materiales cuidando su conservación y orden. 2 13. No sacar del laboratorio material o equipo 14. Desechar el material inservible en el basurero. Según su clasificación. 15. Mantener limpia el área de trabajo 16. Dejar limpio y en su lugar los instrumentos utilizados. 17. No manchar mesas, instrumentos o equipos del laboratorio. 18. Queda prohibida la entrada, permanencia y uso del laboratorio a personas no Autorizadas. UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS 1. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rótulo. 2. Como regla general, no tocar ningún producto químico. Tu profesor o profesora te lo proporcionará. 3. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 4. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua. 5. No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos. 6. No pipetear con la boca. Utilizar la bomba manual, una jeringuilla. 7. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos, nunca echar agua sobre ellos; siempre al contrario, es decir, ácido sobre agua. 8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos se hará al baño de María, nunca directamente a la llama. 9. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucho agua y avisa al profesor. 10. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente. UTILIZACIÓN DEL VIDRIO 1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. 3. Las manos se protegerán con guantes o trapos cuando se introduzca un tapón en un tubo de vidrio. 4. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos normas: a.Tener sumo cuidado y tener en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente. b. Calentar el tubo de ensayo lateralmente y no por el fondo, agitar suavemente. 3 UTILIZACIÓN DE LA BALANZA 1. Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel filtro sobre los platos de la misma y si es necesario porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizará un vidrio de reloj. 2. Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc. INCLUIR EN INVESTIGACIÓN Y PRESENTACIÓN 1. Clasificar el laboratorio por niveles de bioseguridad y clasificar microorganismos por grupo de riesgo en el trabajo que realizará el grupo de clase y deberá presentarlo por escrito. 2. Normas del manejo de desechos comunes. 3. Normas para el manejo de material punzo-cortante. 4. Normas para manejo de material bio-infeccioso no anatómico. 5. Normas para el manejo de material bio-infeccioso anatómico. 6. Normas de manejo de material bio-infeccioso líquido. 7. normas para el manejo de residuos químicos (líquidos). 8. Normas para el manejo de muestras de laboratorio. 9. Normas en el momento de tomar muestras biológicas. 10. Normas para el manejo de instrumentos y equipos. 4 No. 2 ESPECTROFOTOMETRIA Objetivo Que el estudiante, después de haber realizado su práctica de laboratorio, esté en la capacidad de conocer como funciona un espectrofotómetro. Definición de espectroscopia Método instrumental en el cual se mide la interacción de compuestos químicos con radiación electromagnética. Estos instrumentos electrónicos acortan considerablemente el tiempo para extraer información, aumenta la capacidad para obtener información estructural y requiere cantidades muy pequeñas de muestra. Todas las sustancias químicas interactúan con radiación electromagnética de alguna manera. Cuando una molécula absorbe energía, ocurre una transformación o perturbación que puede ser temporal o permanente. La radiación de baja energía puede causar simplemente una rotación molecular o la vibración un enlace. La energía viaja en ondas y corresponden a una luz blanca que en el interior del aparato se hace pasar a través de un prisma, el cual descompone la luz, separándolas en sus colores constituyentes (según longitud de onda), formando un abanico de colores, en los experimentos de física de luz. La luz del sol es una forma de energía, conocida como energía electromagnética, llamada radiación que viaja en ondas rítmicas. La distancia entre las crestas de ondas electromagnéticas se conoce con el nombre de longitud de ondas, se representa por una letra griega llamada lambda (λ) y su dimensión se expresa en manómetros (nm) (1 nm = 10 m). El número de ondas que pasan por un punto en un tiempo dado o número de ondas por unidad de distancia es la frecuencia, que se expresa como ciclos por segundo o hertz (Hz). 5 Luz visible La luz, que llega a nuestros ojos y nos permite ver, es un pequeño conjunto de radiaciones electromagnéticas de longitudes de onda comprendidas entre los 400 nm y los 750 nm. Espectrofotómetro Es un aparato instrumental electrónico que es utilizado para medir las proporciones de luz de diferentes longitudes de onda que son absorbidas y transmitidas por una solución coloreada que contiene compuestos químicos. La espectrofotometría se refiere a los métodos cuantitativos de análisis químicos que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas. Se conocen como métodos espectrofotomètricos y según sea la radiación utilizada como espectrofotometría de absorción visible (colorimetría), ultravioleta o infrarroja. Los espectrofotómetros que se utilizan habitualmente proporcionan longitudes de onda que van de 340 a 1000 nm, utiliza lámpara incandescente de tungsteno como fuente de emisores, y de los 200 a 1000 nm cuando poseen la combinación de lámparas de deuterio y tungsteno. Los componentes básicos son: fuente de radiación, selector de longitud de onda, portamuestra, detector y dispositivo de registro. El espectrofotómetro tiene un botón donde un prisma sea movido y conforme va girando, permite que en cada momento sea diferente color de luz, la que es dirigida sobre una pieza metálica que posee una rejilla por la que podrá pasa la energía del rayo que en este momento se haya escogido. Eso permite que se pueda elegir que color se hará pasar a través de la rejilla. Simultáneamente que cambia el color, aparece en la ventana de lectura de longitud de onda, la que corresponde al color que estamos usando. Después de la rejilla esta el espacio donde se colocan los tubos de ensayo con las sustancias que se están estudiando. No se usara luz blanca (policromática) que emite la bombilla (monocromática). El tubo de ensayo (cubeta óptica) recibe un rayo de luz monocromática que posee una determinada cantidad de energía, en función de su color. El contenido de la cubeta óptica (solvente y soluto) podrá absorber alguna parte de la energía de ese rayo luminoso a su paso a través de la misma, y la luz que logre atravesar la solución seguirá su curso hasta chocar contra un dispositivo (foto celda o tubo fotoeléctrico) sensible a la cantidad de energía que logra pasar, convirtiéndola en electricidad y trasladándola, por medio de un galvanómetro, a una pantalla donde el movimiento de una aguja demuestra los cambios en la cantidad de energía que logró llegar a la foto celda. 6 Si el rayo luminoso no encuentra ningún obstáculo en su camino, la pantalla mostrará su energía en 100% y si una sustancia, por ejemplo absorbe la mitad de la energía del rayo luminoso, en la pantalla se observará su energía en el 50%. En otras palabras, el selector separa y selección las longitudes de onda que se presentan a la muestra desde la fuente, un haz se trasmite directamente al detector, el haz de la muestra que pasa a través de la misma antes de alcanzar el detector. Si la muestra interactúa con radiación de una longitud de onda en particular, la absorbe y la intensidad del haz de muestra disminuye. El detector compara la intensidad de los haces de referencia y de la muestra. El porcentaje del haz de la muestra que se trasmite se registra como un pico o banda en el dispositivo de registro. Con la incorporación de una computadora en los instrumentos, la presentación y comparación de los haces de muestra y de referencia se pueden hacer de manera diferente, pero el PRINCIPIO no cambia. Espectrofotómetro sus partes: 7 Ventajas de la espectrofotometría: Las ventajas de la espectrofotometría sobre otros métodos analíticos de laboratorio son: es rápida, precisa, versátil, fácil de usar y eficiente en costo. Los espectrofotómetros se han mejorado en precisión y versatilidad en los últimos años con los avances de la tecnología, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de química analítica. Usos de la espectrofotometría La espectrofotometría se usa para diversas aplicaciones, como: análisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un laboratorio de investigación, estandarización de colores en diversos materiales, como plásticos y pinturas, detección de niveles de contaminación en aire y agua, y determinación de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos. Parámetros que utiliza la espectrofotometría (expresada en %) Los espectrofotómetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). Transmitancia: La transmisión se puede considerar una doble refracción. Si pensamos en un cristal; la luz sufre una primera refracción al pasar del aire al vidrio, sigue su camino y vuelve a refractarse al pasar de nuevo al aire. 1. Si después de este proceso el rayo de luz no es desviado de su trayectoria se dice que la transmisión es regular como pasa en los vidrios transparentes. 2. Si se difunde en todas las direcciones tenemos la transmisión difusa que es la que pasa en los vidrios translúcidos. Y si predomina una dirección sobre las demás tenemos la mixta como ocurre en los vidrios orgánicos o en los cristales de superficie labrada. 3. El porcentaje de transmitancia se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. 8 4. Una solución límpida, no absorbente, mostrará una lectura de 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado. Absorbancia (expresada en logaritmos) La absorción es un proceso muy ligado al color. El ojo humano sólo es sensible a las radiaciones pertenecientes a un pequeño intervalo del espectro electromagnético. Son los colores que mezclados forman la luz blanca. Su distribución espectral aproximada es: 1. Cuando la luz blanca choca con un objeto una parte de los colores que la componen son absorbidos por la superficie y el resto son reflejados. Los componentes reflejados son las que determinan el color que percibimos. 2. Si la refleja toda es blanco y si la absorbe todas es negro. Un objeto es rojo porque refleja la luz roja y absorbe las demás componentes de la luz blanca. Si iluminamos el mismo objeto con luz azul lo veremos negro porque el cuerpo absorbe este componente y no refleja ninguna. 3. Las unidades de absorbancia van de 0 a 2. 4. La absorbancia se relaciona con la transmitancia como: A = - log T = - log I/I0 Ejemplo: Una sustancia que absorbe el 30% de la energía del rayo mostraría en la pantalla un 70% de transmitancia y un 30% de absorbancia. El concepto se aplica de la misma forma y por esa razón una sustancia que logre absorber el 50% de la engría del rayo luminoso nos dará una transmitancia del 50%. Como norma general siempre se utiliza la Absorbancia, debido a que las cifras obtenidas en logaritmos pueden graficarse en mejor forma cuando el procedimiento de fonometría es utilizado en estudio de investigación médica. 9 La mayoría de los componentes biológicos, tales como proteínas, grasas, carbohidratos y los ácidos nuclèicos, absorben luz en alguna parte de fonometría es utilizado en estudios de investigación médica. BASES TEORICAS PARA EL CALCULO DE CONCENTRACIÒN DE SUSTANCIAS BIOLOGICAS Cuando el rayo de luz llega a la cubeta óptica lleva el 100% de su energía. A medida que penetra en la sustancia, puede ir perdiendo su potencia en función de tres variables: 1. El grado de concentración de solutos en la sustancia que analiza. 2. La longitud del medio absorbente o sea la distancia que el rayo debe recorrer depende del ancho del tubo que se esta utilizando. 3. Longitud de onda (o color) del rayo que se esta usando. Si la sustancia que se esta estudiando tiene un color determinado, se comporta diferente frente a los diferentes colores de luz que se puedan hacer pasar a través de ella. Por ello la fracción de la luz incidente (lo) absorbida por una solución, a una determinada longitud de onda, esta relacionada con la concentración de la especie que absorbe y con el espesor de la capa absorbente. Ley de Beer: Se aplica cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a media que la concentración del medio absorbente aumenta. Ley de Lambert: Se aplica cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a media que la longitud del medio absorbente aumenta. La combinación de ambas leyes puede expresarse en forma integral de la manera siguiente: Long Io / I = e c I Donde: • • • • • Io = intensidad de la luz incidente. I = intensidad de la luz transmitida. e = coeficiente de absorción molar ( unidades de litros por mol por cm) c = especie absorbente. I = espesor de la muestra absorbente. 10 Ley de Lamber-Beer: Supone que la luz incidente es paralela, monocromática y que las moléculas del solvente y el soluto están orientadas al azar de manera uniforme. La expresión log (Io/I) se denomina absorbancia y se designa como A. Es la base matemática que permite calcular cuanta energía, puede haber sido absorbida por la sustancia que se estudia. Es importante considerar que cantidad de milímetros de espesor de una solución absorben en una cubeta óptica de 10 cm (medida estándar) no absorbe una cantidad constante de la luz incidente. La absorbancia (A) es directamente proporcional a la concentración de la solución absorbente. El coeficiente de absorción molar varía tanto con la naturaleza del compuesto absorbente, como con las propiedades del solvente, la longitud de onda del rayo utilizado, el pH de la solución, y el estado de oxidorreducción de los componentes, las cuales pueden presentar perdida o ganancia de protones o electrones al asociarse. El uso del espectrofotómetro se puede obtener los datos para elaborar una gráfica del espectro de absorción de cualquier sustancia, en la cual podemos comparar objetivamente las diferencias de cada sustancia en función de su coeficiente de absorción molar y de la longitud de onda del rayo empleado. Una gráfica construida con el espectrofotómetro ( A vrs. c ) muestra la absorbancia a diferentes longitudes de onda, nos proporciona la información necesaria para saber cual es la longitud de onda a la que se absorbe mas la luz un compuesto en solución. Por ello cuando la necesidad de hacer un análisis de un compuesto especial, se tendrá que ajustar el fotómetro a la longitud de onda de máxima absorbancia, ya que en la calibración se obtendrá las determinaciones más exactas ante cualquier variación de la concentración de la muestra que obtengamos conteniendo este compuesto. Los ordenamientos específicos de los átomos o de las moléculas, poseen espectros de absorción característicos y por eso pueden utilizarse para identificar moléculas y medir sus concentraciones. Debe tenerse en cuenta que la ley de Beer, no toma en cuenta la luz dispersada o reflejada y no se cumple por altas concentraciones del material absorbente. La base de calorimetría y de la espectrofotometría radica en que muchas sustancias tienen color propio o pueden dar lugar a productos finales coloreados en ciertas reacciones químicas. Existe relación entre la intensidad de este color y la concentración del producto final o sea la concentración de uno o varios de los reactivos, de esta manera, la intensidad del color puede utilizarse para medir la concentración. 11 Cálculo de la concentración de Compuestos: El espectrofotómetro, permite conocer la concentración de un compuesto en una solución, en casi todas las técnicas de laboratorio deberá a proceder con la preparación de tres tubos: 1. Tubo blanco. 2. Tubo estándar. 3. Tubo muestra. Tubo blanco Tubo que contiene diluyente (estabilizadores del pH, reactivos colorantes y enzimas que producen la reacción) sin la sustancia en estudios. Los usos: 1. Sirve para la calibración del espectrofotómetro, desechando la absorbancia de todos los componentes diferentes de la sustancia en estudio. 2. Esto permite que la sustancia sin reaccionar en la cubeta óptica permita ajustar manualmente la absorbancia en cero y transmitancia en 100%. 3. De esta forma la misma sustancia en otros tubos ya no interfiera en las próximas lecturas. Tubo estándar: Contiene la sustancia del blanco + la sustancia del estudio a concentración conocida. Se define como una absorbancia patrón dependiente de la concentración. 1. Se prepara en el laboratorio pesando determinada cantidad de la sustancia que vamos a analizar y diluyéndola en un determinado volumen de solvente o bien, es proporcionado a través de una casa comercial. 2. Esto permite comparar su absorbancia (en función a su concentración) con la de la muestra. Tubo muestra: Contiene lo mismo que el tubo blanco, sólo que en este caso se agrega la sustancia en estudio (muestra), cuya concentración no se conoce. Se prepara a partir de fluidos biológicos (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina u otros) en los que se desea medir la concentración de algún soluto. Para calcular la concentración de la muestra se utiliza la siguiente formula: Concentración = Concentración Absorbancia 12 De la Muestra del Estándar X de la Estándar Absorbancia de la Muestra A= 2-Log de %T Para esta práctica se utilizará glucosa con estándar de valor conocido. Se deberá enfocar en el uso del equipo y su funcionamiento. Escriba el procedimiento para sus compañeros de laboratorio. BIBLIOGRAFÍA 1. 2. CAMPBELL, N. A. Biology. The Benjamin Cumming Publishing Company Menlo Park, California, 1987. 3. HAWK and OSER. Practical Physiological Chemistry. 4th Ed. McGraw-Hill, Co. S. A. 1965. 4. LYNCH, M. J. Métodos de Laboratorio. 2ª edición Omega, S. A. Barcelona 19987 5. STROTHER, G. K. Fisica aplicada de las ciencias de Salud. MacGraw-Hill Latinoamérica, S. A. Bogota, Colombia. 1980. No. 3 HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN 13 La amilasa presente en la saliva (o ptialina) secretada en las glándulas salivare, cuyo sustrato (almidón) será convertido a maltosa, maltriosa y alfa dextrinas. La amilasa actúa sobre los polisacáridos del almidón, hidrolizando el enlace O-glucosídico, por lo que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa. Por ello debemos recordar algunas definiciones que aprendimos en Química Orgánica. Debido a que se necesita muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, pocas enzimas pueden medirse directamente. Por consiguiente, la presencia de una enzima se demuestra generalmente midiendo los cambios de concentración, conforme ocurre la desaparición del sustrato o la aparición de producto de su acción catalizadora. Polisacáridos: Los polisacáridos son compuestos de peso molecular elevado, formados por gran número de unidades de monosacáridos, combinados para dar una molécula grande o polímero. Almidón: El almidón es la forma de almacenamiento de carbohidratos por las plantas, especialmente abundante en las semillas (cereales) y bulbos (patatas, etc.), donde se presenta en forma de granos. Existen dos tipos de moléculas de almidón: a. Amilosa: Constituye el 20-30% de la mayor parte de los almidones, esta formada por cadenas rectas de unidades de glucosa con enlaces 1,4-alfaglucosídica. Se a observado a la amilosa con pesos moleculares entre 69,000 a 1,000,000. b. Amilopectinas: Son moléculas ramificadas con unidades rectas a base de enlaces 1,4, como en la amilosa, y ramificaciones a nivel de ciertos enlaces de 1,6. Se han observado en las Amilopectinas, ramificaciones cada 24 a 30 unidades de glucosa, formando moléculas mayores, y sus pesos moleculares pueden ir de 200,000 a varios millones. Degradación enzimática Las enzimas más importantes de la digestión son las amilasas, las cuales degradan el almidón (y el glicógeno) a fragmentos de maltosa. El nombre de la amilasa se utiliza como denominación de grupo: 14 Su hidrólisis se efectúa por vía enzimática en varios pasos: La hidrólisis enzimática del almidón por efecto de amilasas de saliva y jugo pancreático produce polisacáridos menores, llamados dextrinas, y tiene como etapa final la aparición del disacárido maltosa. INVESTIGACIÓN En la práctica deberá usar reactivo de Lugo y Benedict. Buscar procedimiento en libros o internet y experimentar para que se realice el día asignado para la práctica. REACTIVOS 1. Lugol: solución de yodo metálico y yoduro de potasio, el cual en presencia de almidón provoca el aparecimiento de un color azul oscuro al introducirse entre las hélices alfa de la forma amilosa. 2. Reactivo de Benedict: Solución de Sulfato de Cobre, Carbonato de Sodio y citrato trisódico, en presencia de compuestos reductores, como carbohidratos con grupo aldehído o cetónico libre, se forma un precipitado que se observa de color rojo ladrillo de oxido cuproso. El color de la solución puede variar dependiendo de la concentración del azúcar reductor. Esta prueba se usa para detectar azúcares reductores. PROCEDIMINETO 1. Tome 4 tubos de ensayo y márquelos del 1 al 4. 2. Coloque en los tubos 1, 2, 3 – 2ml (2cc) de solución de ALMIDÓN. 3. Al tubo de ensayo No. 1 vierta aproximadamente 3 ml de saliva y llévelo al baño de María o incubar a 37°C durante 10 a 15 minutos. 4. Al tubo de ensayo No. 2 agréguele una gotas de LUGOL y observe y explique el cambio de color que se presenta. 15 5. Al tubo de ensayo No. 3 agréguele 2ml de reactivo BENEDICT y coloquelo en baño de María en ebullición. Agite suavemente y observe los cambios físicos que se presentan. 6. Pasar la mitad del contenido del tubo No. 1 al tubo No. 4. 7. Al tubo de ensayo No. 1 agréguele una gotas de LUGOL. Observe y explique el resultado. 8. Al tubo No.4 agréguele 2ml de reactivo de BENEDICT y póngalo en baño de María de ebullición. Observe y explique el resultado. Maltosa Dextrinas y Lugol 1 Almidón y Lugol Almidón y Benedict Maltosa Dextrinas Y Lugol 4 2 3 Identificación de azucares reductores y no reductores Numerarlos tres tubos del 5 al 7. 1. Al tubo de ensayo No.5 se le agregan 2 ml de Fructosa al 5% seguido de 2 ml de Reactivo Benedict y se coloca en Baño María en ebullición. 2. Al tubo de ensayo No.6 se le agregan 2 ml de Glucosa al 5% y luego 2 ml de Reactivo Benedict y colocar a Baño María en ebullición. 3. Al tubo de ensayo No.7 se le agregan 2 ml de Sacarosa al 5% seguido de 2ml de Reactivo Benedict y se coloca a Baño María en ebullición. BIBLIOGRAFÍA. 1. WADE l. G Jr. Química Orgánica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S. A. 1993 pp. 1312, 1151 y 1152. 2. TAYLOS G. A. Química Orgánica para estudiantes de medicina y biología. 1era Ed. Editorial Alambra S. A. 1974 Barcelona, España. Pp 289, 223 a 226. 3. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 4. Curso de Bioquímica. 2do año de la Carrera de Médico y Cirujano. Centro Universitario de Oriente (CUNORI). Universidad de San Carlos de Guatemala. 2010. 16 No. 4 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE Mecanismos para mantener la glicemia: Después de un ayuno de varias horas y en condiciones de reposo la concentración de glucosa en sangre es de 65 a 100 mg / dl. Después de la ingestión de alimentos, sobrevienen alzas hasta de 120 a 140 mg/ dl y, unas horas después, regresan a los valores en ayunas. De la misma manera, las modificaciones producidas por las emociones violentas, el ejercicio intenso y la aún inanición, son equilibrados para volver a lo normal. Si la glucosa de la sangre se mantiene dentro de los límites estrechos, es por que la serie de los fenómenos que concurren a proporcionar glucosa a la sangre, se equilibran con los mecanismos que la sustraen de ella. En ayunas, la única fuente de glucosa sanguínea es el hígado. La velocidad de formación y degradación del glucógeno hepático es uno de los factores más importantes en la regulación de la glicemia. Como la salida de glucosa del hígado depende, en gran parte, de la concentración de glucosa en la sangre, cuando ésta se modifica, funciona el mecanismo glucogénico, el glucogenolítico, debido a las hormonas relacionadas: La insulina: que favorece la utilización y captación de glucosa y es secretada al elevarse la glucemia, el glucagón y la epinefrina, impulsores de la glucogenólisis, y son secretados por páncreas y glándulas suprarrenales cuando hay hipoglucemia. La hormona insulina tiene gran importancia en la participación de la regulación de glucosa sanguínea, se produce en las células beta del páncreas en respuesta a la hiperglucemia, la administración de insulina produce hipoglucemia inmediata. La adrenalina y la noradrenalina impiden la liberación de la insulina. Por otro lado, el glucagón se opone a la acción de la insulina, es producido en las células alfa del páncreas y es secretado cuando hay hipoglucemia llegando a través de la vena porta al hígado para producir glucogenólisis y gluconeogénesis. Otras hormonas influyen en la hiperglucemia como la hormona del crecimiento que inhibe la utilización de la glucosa y favorece la de ácidos grasos, los glucocorticoides que aumentan la gluconeogénesis, la adrenalina secretada cuando hay estímulos estresantes causa glucogenólisis. Al ascenso de la glucosa sanguínea por arriba de 120 mg/dl se denomina hiperglucemia y puede ser signo de muchas enfermedades, la hiperglucemia siempre se da después de una comida pero se regula por medio de la insulina que lleva la glucosa a los tejidos para su almacenamiento ya que es el principal combustible celular. 17 La hiperglucemia se da por la disminución de la entrada de glucosa a las células, por la disminución de la utilización de glucosa por varios tejidos y por el aumento en la producción por el hígado. La entrada de glucosa a las células la da la insulina, si la glucosa no entra a las células el cuerpo necesita tomar energía de otro lado, por lo general de las grasas, la degradación de las grasas causa cuerpos cetónicos y consecuentemente cetosis, el hígado en este caso aumentaría la producción de glucosa al ver que las células no están recibiendo la suficiente glucosa, agravando el problema. La hipoglucemia está presente en el ayuno pero es fácilmente regulada por los procesos gluconeogénicos o glucogenolíticos, si existe una buena reserva de glucógeno, se considera una hipoglucemia cuando los niveles de glucosa sanguínea están por debajo de los 60 mg/dl y esta es mucho mas peligrosa que la hiperglucemia ya que fácilmente puede causar un shock hipoglucémico con convulsiones y coma por falta de glucosa para el funcionamiento cerebral. La principal causa de hipoglucemia es la presencia de insulina en exceso y se puede regular por el glucagón o la adrenalina como se mencionaba anteriromente, ya que son antagónicos. Las causas principales de hipoglucemia en una persona sana son muy obvias, como por ejemplo ayunos prolongados, desnutrición, por vómitos y diarrea, ejercicio en exceso, etc. En el caso de una persona que se le suministre insulina tendrá que ser muy bien controlada ya que al darse en gran cantidad, y sí no hay buenos niveles de glucosa en sangre la insulina en exceso que entró se encarga de la poca glucosa que existe poniendo en riesgo al paciente, causándole una hipoglucemia severa. La enfermedad que se caracteriza por hiperglucemia es la Diabetes Mellitus, en este caso la insulina de la persona es de baja calidad o hay total ausencia de ella causando que la glucosa no pueda entrar en las células y se adquiere la energía de las grasas o lípidos. Existen dos tipos de Diabetes: 1. La Diabetes tipo I o también llamada insulino dependiente, las células beta del páncreas se han destruido debido al desarrollo de anticuerpos en contra de los receptores de insulina. 2. La Diabetes tipo II o no insulino dependiente, que ésta es la que presenta el 90% de los afectados y por lo general son obesos y aunque producen insulina es de muy mala calidad y los receptores trabajan mal. Los principales síntomas, son la hiperglucemia, la polifagia, polidipsia y poliuria, causándole mucha fatiga y desnutrición. 18 La gran complicación es la glucosilación nerviosa y vascular que inclusive un infarto o cortadas pequeñas pasan desapercibidos, sin olvidar el pie diabético que muchas veces se tienen que amputar. Otro gran problema es la cetosis por los cuerpos cetónicos que pueden llegar a causar la muerte en especial a los de diabetes tipo I. Datos clínicos que se obtienen con la curva de Tolerancia a la Glucosa: Las características de la curva de la glucosa sanguínea después de la administración de una cantidad conocida de glucosa indica la tolerancia a esta. La diabetes mellitus tipo I se caracteriza por la disminución de la tolerancia a la glucosa debido a la disminución de secreción de insulina en respuesta a la carga de glucosa. Esto se manifiesta por la hiperglucemia, glucosuria y metabolismo de las grasas. La tolerancia a la glucosa disminuye en la diabetes tipo I, en trastornos relacionados con lesión hepática, infecciones, diabetes tipo II que se acompaña de obesidad y aumentos de concentraciones plasmáticas de ácidos grasos, disminuye la tolerancia bajo la influencia de algunos fármacos y algunas veces en la arteroesclerósis. La insulina incrementa la tolerancia a la glucosa, su administración disminuye el contenido sanguíneo de glucosa e incrementa la utilización y almacenamiento hepático de esta. Un exceso de insulina puede producir hipoglucemia intensa y esta resulta en convulsiones y muerte, a menos que se administre glucosa de inmediato. En las insuficiencias hipofisiaria y corticosuprarrenal se incrementa la tolerancia a la glucosa debido a la disminución del antagonismo de la acción de la insulina a cargo de la hormonas secretadas por estas glándulas. Métodos de medición: Antes se utilizaban métodos no específicos que aprovechaban las propiedades reductoras de la glucosa, los que eran susceptibles a error causado por la presencia de sustancias reductoras distintas a la glucosa, presentes también en sangre. Actualmente se utilizan método enzimático altamente específico. • Glucosa Oxidasa Peroxidasa: la glucosa es oxidada a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, por la acción de la enzima glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno, en presencia de peroxidasa, oxida el cromogeno (4aminofenazona/fenol), convirtiéndolo en un compuesto coloreado rosado fuerte – rojo, cuya intensidad es proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. D- glucosa + O2 + H2O----GOD------- D- gluconato + H2O2 H2O2 + fenol + 4-aminofenazona-------POD----- compuesto coloreado + H2O 19 • Glucosa hexoquinasa: la glucosa es fosforilada por el triofosfato de adenosina (ATP) en presencia de la enzima hexoquinasa. La grlucosa –6-fosfato (G-6-P) formada es oxidada a 6-fosfogluconato (6-PG) en presencia de dinucleótido de nicotinamida (NAD). Esta reacción es catalizada por la enzima glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH). Durante esta oxidación, una cantidad equimolar de NAD es reducida a NADH. El consecuente incremento en la absorvancia a 340 nm es directamente proporcional a la concentración de glucosa. MATERIALES • Algodón. • Hipoclorito de sodio al 4.72% (dilución 1:10). • Jabón antiséptico. • Descartador de puntas de pipeta. • Gradillas. • Liga. • Guantes. • Bata. • Jeringas para punción venosa de 5cc. • Micropipetas de volumen variable. • Papel absorbente. • Puntas de pipeta para micropipetas de volumen variable. • Recipiente descartador para punzocortantes. • Tubos vacutainer sin anticoagulante. • Viales de almacenamiento • Alcohol • Espectrofotómetro • Centrífuga • Agua Destilada • Reactivo de Glucosa PROCEDIMIENTO Se debe de extraer 5 ml de muestra de sangre venosa (de un estudiante en ayuno y que tenga interés personal de verificar sus niveles de glicemia), la cual se deberá colocar en un tubo si anticoagulante el cual se deberá de centrifugar por 10 minutos para separa las células sanguíneas y obtener el suero el cual servirá para prepara el tubo de muestra. 20 La hemolisis visible (suero rojo por destrucción de eritrocitos) hace inadecuada la muestra. La bilirrubinas no interfieren mientras sean menor a 20 mg/dl, Ácido úrico < 20mg/dl y hemólisis ligera. El resultado debe ser antes de dos horas desde el momento de la extracción de la muestra, por la destrucción enzimática de la glucosa (glucólisis) por los eritrocitos y leucocitos, esto es proporcional al tiempo y a la temperatura, siendo máximo a los 37°C. Ya separado el suero este se puede procesar en un plazo no mayor de 4 horas a temperatura ambiente (25°C) o 24 horas en refrigeración. 1. Rotular un tubo “E” (estándar). Se prepara agregando 10 µL de la solución estándar de glucosa con valor conocido o también llamado calibrador y luego 1 ml de Reactivo de glucosa. Agitar e incuba 10 minutos o 25 a temperatura ambiente. 2. rotular un tubo “M” (muestra). Se agrega 10 µL de muestra y 1ml de reactivo de glucosa. Agitar e incubar. 3. rotular el tercer tubo “B” (blanco). Se prepara al colocar 10 µL de agua y 1 ml de reactivo de glucosa. Agitar e incubar. 4. calibrar el espectrofotómetro con 505 nm de longitud de onda y medir la absorbancia, en un plazo no mayor de 30 minutos (margen de estabilidad de las reacciones efectuadas). Para LCR la muestra debe ser 20 µL, ya que la concentración es bala. Luego el resultado obtenido se le divide entre 2. Estándar= 100 mg/dl Formula: [M] = Estándar X Absorbancia de la Mx/Absorbancia del estándar. Valores de referencia 60 a 110 mg/dl Es importante la separación rápida del suero o plasma de los componentes celulares para evitar glucólisis, lo cual disminuirá el valor de la glucosa. El método de glucosa oxidasa-peroxidasa interfiere los anticoagulantes citrato y oxalato, mientras que en le método glucosa hexoquinasa no interfiere ningún anticoagulante. BIBLIOGRAFÍA 1. Manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica General y Bioquímica II. Guatemala: Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2003. pp 0103. 2. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 21 No. 5 CUERPOS CETÓNICOS EN LA ORINA Nombres alternativos: Cuerpos cetónicos en orina; Cetonas urinarias; Ácido acetoacético y ácido betahidroxibutírico. Los cuerpos cetónicos (acetoacetato y D(α )-3-hidroxibutirato) son compuestos que se producen en las mitocondrias del hígado a partir de acetil-CoA. El ciclo de Lynen sintetiza acetoacetato, el cual se transforma enzimáticamente en 3hidroxibutirato. El equilibrio de esta reacción está controlado por la proporción mitocondrial de [NAD+]/[NADH]. La proporción de [hidroxibutirato]/[acetoacetato] en la sangre varía entre 1:1 y 10:1. La acetona, un compuesto relacionado, se forma como producto de la descarboxilación espontánea del acetoacetato. El acetoacetato e 3-hidroxibutirato son productos normales del metabolismo. Se forman principalmente a partir de los productos de degradación de ácidos grasos o como producto del metabolismo de algunos aminoácidos (leucina, fenilalanina, tirorina). Los cuerpos cetónicos son liberados por el hígado a la sangre donde son captados por órganos y tejidos periféricos que los metabolizan por medio del ciclo de Krebs. Mediante la producción de cuerpos cetónicos el hígado puede abastecer a los tejidos periféricos con un combustible hidrosoluble originado de la degradación de las grasas. Especialmente el cerebro, que no puede utilizar los ácidos grasos transportados en la sangre, puede cubrir una gran parte de sus requerimientos energéticos con los cuerpos cetónicos después de un cierto período de adaptación metabólica. Normalmente el hígado produce únicamente las cantidades de cuerpos cetónicos que los órganos periféricos pueden metabolizar. Por lo tanto, los niveles sanguíneos de éstos son bajos y no exceden de 0.2 mmol/l en la sangre de mamíferos bien alimentados. Cantidades mas altas en la sangre (cetonemia) y en la orina (cetonuria) caracterizan un estado llamado cetosis. Los cuerpos cetónicos son ácidos moderadamente fuertes y su pérdida continua por la orina produce pérdida del catión amortiguador, lo cual causa depleción progresiva de la reserva alcalina y como causa cetoacidosis. Esto puede ser mortal en la diabetes sacarina no controlada. La forma más simple de cetosis ocurre en la inanición e implica la depleción de los carbohidratos disponibles, acoplada a la movilización de ácidos grasos libres. Ninguna otra situación en la cual la cetosis ocurre parece diferir cualitativamente de este patrón general del metabolismo; cuantitativamente, una excesiva producción de cuerpos cetónicos puede producir los estados patológicos asociados a la diabetes mellitus. Otras formas no patológicas asociados a la diabetes mellitus. Otras formas no patológicas de cetosis ocurren en condiciones de alimentación rica en grasas y bajas en carbohidratos y después de ejercicio fuerte en el estado de posabsorción. Las cetonas están usualmente presentes en la orina, pero por debajo del nivel de detección de los métodos de análisis de rutina. Sin embargo, se observan cuerpos cetónicos positivos en sujetos normales en ayunas y hasta en un 30% de las muestras de orina de la mañana en las mujeres embarazadas. 22 Los análisis de cetonas en orina que utilizan reactivos a base de nitroprusiato pueden dar falsos positivos en presencia de fármacos que contienen el grupo -SH, como es el caso del captopril, un fármaco antihipertensivo. Resultados falsos negativos también son posibles cuando las tiras reactivas han estado expuestas al aire durante un largo tiempo, o si las muestras de orina son muy ácidas, como ocurre después de la administración de grandes dosis de ácido ascórbico (vitamina C) Aunque en todas las consultas deben existir kits para la determinación de cuerpos cetónicos en la orina, el profesional deberá tener en cuenta que ninguna de las técnicas hoy disponibles permiten diagnosticar o monitorizar una cetoacidosis diabética. Existen métodos de determinación del ácido 3-hidroxibutírico, el cuerpo cetónico predominante, en la sangre y estos métodos son preferidos a los análisis de cuerpos cetónicos en la orina. Forma en que se realiza el examen: Niños o adultos: Para tomar la muestra de orina, la persona recoge una cantidad limpia ("de la mitad de la micción"). Para esto, los hombres y los niños deben tener limpia la cabeza del pene, mientras las mujeres y las niñas deben lavar el área que hay entre los labios de la vagina con agua y jabón y enjuagar muy bien. Cuando se inicie el proceso de eliminación de la orina, se debe dejar que una pequeña cantidad de ésta caiga a la taza del baño (así se limpia la uretra de sustancias contaminantes). Posteriormente, en un recipiente limpio se recomienda recoger aproximadamente una o dos onzas (30 a 60 ml) de orina y retirarlo. Finalmente, se debe entregar este recipiente. Bebés: Es necesario lavar completamente el área alrededor de la uretra y abrir una bolsa colectora de orina (bolsa plástica con una cinta adhesiva en un extremo) y luego colocarle la bolsa al bebé. A los niños se les puede introducir todo el pene dentro de la bolsa y el adhesivo se pega a la piel. A las niñas se les coloca la bolsa sobre los labios mayores. Se le puede colocar el pañal al bebé de la manera usual asegurándose de cubrir y asegurar la bolsa. Se recomienda revisar al bebé frecuentemente y retirar la bolsa después de que éste haya orinado en ella. Los bebés activos pueden desplazar la bolsa así es que puede necesitarse más de un intento para obtener una muestra. Finalmente, se debe verter la orina en un recipiente limpio y entregarla. Las cetonas urinarias se miden usualmente como una "prueba rápida" con una tirilla (tira de orina) que contiene una zona sensible al color impregnada de químicos específicos que reaccionan con los cuerpos cetónicos. Un cambio de color es un indicador cualitativo de la presencia de cetonas. Los tres cuerpos cetónicos se presentan casi siempre juntos en la orina y tienen esencialmente la misma significancia. Las pruebas usuales para la cetonuria investigan la acetona, el ácido acetilacético o ambos a la vez. La reacción de nitroprusiato 23 revelará cualquiera de estos compuestos, aunque con sensibilidad muy diferente. No existe un ensayo directo, sencillo y satisfactorio para el ácido beta-Hidroxibutírico de la orina. La reacción del cloruro férrico para el ácido acetilacético no la de la acetona, pero la reacción no es sensible ni específica por lo cual es poco aplicable a la clínica, salvo quizás como prueba confirmatoria que debe realizarse directamente con la orina. La reacción de nitroprusiato (en particular la variante de Rothera) es mucho más sensible (por lo menos cinco veces más) al ácido acetilacético que a la acetona. De aquí cuando se aplique directamente a la orina, el resultado dependerá en gran parte de las cantidades relativas de ambas sustancias. La orina fresca puede dar una prueba positiva, la misma orina dejada en reposo al poco tiempo ó después de la descomposición del ácido acetilacético y su transformación en acetona, puede dar una prueba negativa. La prueba no es completamente específica para los cuerpos cetónicos, pero cuando es positivo indica fuertemente su presencia. Es probablemente la prueba más usada en los trabajos clínicos para la cetonuria y se han propuesto infinidad de variantes en su técnica; con todo, no puede considerarse enteramente satisfactoria. BIBLIOGRAFÍA. 1. GÁRRIS. J, et al. Nuevo Manual Merck de Información Médica en General. España. Merck Sharp & DOHME. 2007. pp 990. 2. Manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica General y Bioquímica II. Guatemala: Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2003. pp 1619. 3. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 24 No. 6 DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SÉRICO El colesterol está presente en los tejidos y en el plasma como colesterol libre o almacenado, combinado con un ácido graso de cadena larga como éster de colesterilo. En el plasma, ambas formas son transportadas en lipoproteínas. El colesterol es un lípido anfipático y, como tal, es un componente estructural esencial de membranas y de la capa externa de las lipoproteínas plasmáticas. Se sintetiza a partir del acetil-CoA en muchos tejidos, y es el precursor de todos los otros esteroides en el cuerpo, como corticorsteroides, hormonas sexuales, ácidos biliares y vitamina D. Como un producto característico del metabolismo de los animales, el colesterol se encuentra en los alimentos de origen animal, el colesterol se encuentra en los alimentos de origen animal, como la yema de huevo, carne, hígado y cerebro. El origen del colesterol en el organismo tiene dos fuentes, la externa y el que produce el propio organismo. Debido a que el organismo puede producir su propio colesterol, existe la posibilidad que personas que no consuman colesterol, tengan niveles sanguíneos elevados por tener algún desorden genético-metabólico que conlleva a dicha elevación. Estos desordenes son más común de lo que se cree y son la principal causa de ateroma y de enfermedades vasculares, entre ellas el infarto agudo al miocardio. Por esto la importancia de determinar en forma precoz los niveles elevados de colesterol en los pacientes. Otros desórdenes en los cuales puede haber alteración del colesterol sérico son; diabetes, hipotiroidismo, y ciertos tipos de desórdenes renales. En el hipertiroidismo y desnutrición puede haber valores bajos. El hígado es el lugar de síntesis principal, pero la piel, glándulas adrenales, gónadas, intestino e incluso la aorta pueden efectuar la biosíntesis del colesterol. Se estima que el hígado puede producir 1.5 gr por día. El colesterol por ser una grasa es poco soluble en agua, por lo que si se transportara libre por la sangre sería en forma de gotas de colesterol y se vería en nuestra sangre como gotas de grasa. Pero el caso, es que la naturaleza ha ideado una manera de hacer soluble en agua al colesterol y transportarlo por la sangre y esto es por medio de lipoproteínas. Las lipoproteínas son complejos lipoproteicos mediante los cuales el colesterol, ésteres de colesterol, los triglicéridos y fosfolípidos son transportados a través de la sangre. Existen distintos tipos de lipoproteínas. Cada uno de estos tipos de tiene un propósito diferente y se descompone y se excreta de forma ligeramente distinta. Las principales lipoproteínas son los quilomicrones, las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL). El colesterol transportado por las LDL se denomina colesterol LDL, y el transportdo por las HDL se denomina colesterol HDL. 25 El cuerpo regula los niveles de lipoproteínas (y, por lo tanto, lo niveles de lípidos) incrementando o disminuyendo la velocidad de producción de las lipoproteínas. El organismo también puede regular la velocidad con que las lipoproteínas entran o son retiradas del torrente circulatorio. Los niveles de colesterol y triglicéridos varían considerablemente de un día a otro. De una medición a otra, los niveles de colesterol pueden variar alrededor de un 10%, y los niveles de triglicéridos pueden variar hasta un 25%. Método de medición: El colesterol y sus ésteres se liberan de las lipoproteínas con el uso de detergentes. Los ésteres son hidrolizados por la enzima colesterasa. Luego actúa la enzima colesterol oxidasa con producción de H2O2. El H2O2 puede medirse utilizándolo para la conversión de yoduro en yodo, el cual se valora espectrofotométricamente, o bien, puede reaccionar en presencia de peroxidasa con 4-aminoantipirina y fenol, formando un compuesto coloreado que es también medido. MUESTRA: Suero o plasma heparinizado. Si bien se recomienda procesar las muestras dentro de las 48/72 hs, las mismas pueden conservarse una semana en heladera y dos meses en congelador. Valores de Referencia: Hasta 200 mg/dl El HDL, sintetizad en el hígado, remueven el colesterol no utilizado por las células (dentro de ciertos límites de concentración), transportándolo hacia el hígado para su degradación. El HDL es conocido como un componente lípido protector contra las enfermedades coronarias. Valores de Referencia: Mujeres > de 35 mg/dl Hombrs > de 45 mg/dl Las LDL, producto del metabolismo de las VLDL en plasma, son las encargadas del transporte del colesterol exógeno (y en mucho menor proporción, endógeno) hacia el interior de las células. 26 Diversos estudios epidemiológicos han confirmado que el exceso de colesterol LDL con respecto a un valor crítico (190.0 mg/dl) debe ser considerado un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedad cardíaca coronaria, considerando que el efecto protector de las HDL sólo parece tener relevancia dentro cierto rango de concentraciones de colesterol circulante. Tales hallazgos permiten deducir que los valores aislados de colesterol HDL o de LDL no pueden tomarse como índices predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los valores de colesterol total, colesterol HDL y colesterol LDL. Entre más bajo sea el valor de colesterol LDL, es mejor para el paciente, esto significa que está transportando menos colesterol hacia los tejidos periféricos. Valores de Referencia < de 150 mg/dl. BIBLIOGRAFÍA. 1. GÁRRIS. J, et al. Nuevo Manual Merck de Información Médica en General. España. Merck Sharp & DOHME. 2007. pp 1100. 2. Manual de Bioquímica, LABOCLIP. Guatemala: Antigua Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2005. pp 07 - 09. 3. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. . 27 No. 7 DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS Triacileglicéridos o triacilgliceroles: son acilgliceroles un tipo de lípidos formados por una molécula de glicerol, que tiene esterificados, son el principal tipo de grasa transportado por el organismo. Recibe el nombre de su estructura química. Luego de comer, el organismo digiere las grasas de los alimentos y libera triglicéridos a la sangre. Estos son transportados a todo el organismo para dar energía o para ser almacenados como grasa. El hígado puede cambiar cualquier fuente de exceso de calorías en triglicéridos. La biosíntesis de triglicéridos La síntesis de triglicéridos tiene lugar en el retículo endoplásmico de casi todas las células del organismo, pero es en el hígado, en particular en sus células parenquimatosas, los hepatocitos y en el tejido adiposo (adipocitos) donde este proceso es más activo y de mayor relevancia metabólica. En el hígado, la síntesis de triglicéridos está normalmente conectada a la secreción de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, su acrónimo en inglés) y no se considera un sitio de almacenamiento fisiológico de lípidos. Por tanto, toda acumulación de triglicéridos en este órgano es patológica, y se denomina indistintamente esteatosis hepática o hígado graso. Por el contrario, el tejido adiposo tiene por principal función la acumulación de energía en forma de triglicéridos. Sin embargo, la acumulación patológica de triglicéridos en el tejido adiposo (obesidad) se asocia, aparentemente de forma causal, con una serie de anormalidades endocrinometabólicas, cuyas causas son actualmente motivo de intensa investigación, dado el impacto de ellas en la mortalidad global de la población contemporánea. Una mínima cantidad de triglicéridos son normalmente almacenados en el músculo esquelético y cardíaco, aunque solamente para consumo local. Causas de niveles altos de triglicéridos: Exceso de peso: los triglicéridos aumentan generalmente a medida que aumenta el peso. Los triglicéridos se elevan a medida que se aumenta de peso o se ingieren demasiadas calorías, especialmente provenientes de azúcar y del alcohol. El alcohol aumenta la producción de triglicéridos en el hígado. Los niveles de triglicéridos aumentan regularmente con la edad. Algunas drogas como los anticonceptivos, esteroides, diuréticos causan aumento en los niveles de los triglicéridos. Algunas formas de altos niveles de triglicéridos ocurren entre miembros de una misma familia. 28 Observaciones La medición es más precisa si no se ha comido en las 14 horas previas al examen. Si el colesterol tiene un valor normal, un nivel elevado de triglicéridos no parece ser un factor de riesgo de enfermedad cardiaca, pero sí puede ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis. MATERIALES • Jeringas • Liga • Alcohol • Algodón • Centrifuga • Tubos de ensayo plásticos • Micropipeta manual de 10 ml • Micropipeta manual de 1000 ml • Viales • Puntas plásticas • Espectrofotómetro • Rejilla plástica • Agua destilada • Reactivo de triglicéridos PROCEDIMIENTO • Se extrae el suero y se coloca en un vial de almacenamiento. • Con la Micropipeta de 1000 µl extraemos el reactivo de trigliceridos y lo colocamos en un vial. • Con la Micropipeta de 10 µl extraemos el suero y se agrega al reactivo de triglicéridos. Agitar. • Se incuba por 10 minutos a 37°C. • Se lee en el espectrofotómetro • Interpretación de resultado. Valores de referencia: < 200 mg/dL Los niveles de triglicéridos varían con la edad, y también dependen de qué tan reciente ingirió alimentos antes del examen. BIBLIOGRAFÍA 1. WADE l. G Jr. Química Orgánica. Prentice-Hall Hispanoamericana, S. A. 1993 pp. 1312, 1151 y 1152. 29 2. TAYLOS G. A. Química Orgánica para estudiantes de medicina y biología. 1era Ed. Editorial Alambra S. A. 1974 Barcelona, España. Pp 289, 223 a 226. 3. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 4. Curso de Bioquímica. 2do año de la Carrera de Médico y Cirujano. Centro Universitario de Oriente (CUNORI). Universidad de San Carlos de Guatemala. 2010. 30 No. 8 DETERMINACIÓN DE BILIRRUBINA EN SANGRE La bilirrubina es un producto de degradación de las proteínas que contienen el grupo hemo, como es la hemoglobina. El proceso de formación y metabolismo se explica a continuación: Los hematíes viejos, defectuosos o dañados, son retirados por unas células fagocíticas, llamadas macrófagos, que están situados, por ejemplo, en el bazo. Dentro de estos macrófagos la hemoglobina se metaboliza y el hemo se transforma en la bilirrubina, que es liberada a la sangre. Esta bilirrubina es muy poco soluble en agua y para su transporte en sangre va unida a la albúmina (bilirrubina no conjugada o indirecta, insoluble en agua). Una vez que llega al hígado esta bilirrubina es captada por el hígado. Allí el hígado la une al ácido glucurónico (bilirrubina conjugada o directa, insoluble al agua), de forma que la bilirrubina se hace más soluble. Este glucurónido de bilirrubina se secreta activamente en la bilis y se dirige hacia el intestino. Las bacterias intestinales metabolizan esta bilirrubina y la transforman en una serie de pigmentos denominados urobilinógenos. Estos pigmentos son los que le dan a las heces el típico color amarillo marrón. Una parte de estos urobilinógenos, dado que son más solubles en agua, se reabsorben hacia la sangre y son eliminados por los riñones a la orina. Cuando hay una elevación de bilirrubina directa en sangre, entonces se puede filtrar por el riñón y aparece en orina, con lo que ésta puede coger un color anaranjado. La presencia en orina de bilirrubina y urobilinógeno se puede detectar de forma fácil cualitativamente empleando tiras reactivas. Un aumento de la concentración en sangre de bilirrubina total conduce a una situación denominada ictericia. La ictericia se puede definir como una decoloración amarillo verdosa de la piel y membranas mucosas por una acumulación de bilirrubina. La ictericia se puede clasificar en 3 grupos fundamentalmente: 1. Ictericia prehepática. Por ejemplo la producida por una hemólisis. El incremento de la rotura de hematíes produce una hiperbilirrubinemia no conjugada que será superior a la capacidad de depuración del hígado. Habrá un aumento de bilirrubina indirecta en sangre y la bilirrubina directa será prácticamente normal. En orina habrá generalmente una elevación de urobilinógeno y no se detectará la bilirrubina, ya que la bilirrubina no conjugada, al ir fuertemente unida a la albúmina, no filtra por el riñón a la orina. 2. Ictericia posthepática. Por una obstrucción extrahepática como es una coledocolitiasis La obstrucción hace que la bilirrubina conjugada vuelva a la sangre y no pase al intestino. La hiperbilirrubinemia será fundamentalmente directa, con lo que habrá un aumento también de bilirrubina en orina. Al eliminarse poca bilirrubina hacia el intestino se forma muy poco urobilinógeno, con lo que las heces serán pálidas. Una vez retirada la obstrucción, las heces han de recuperar el color y la orina ha de ser positiva para urobilinógeno. 31 3. Ictericia hepática. Es un estado intermedio entre las dos anteriores. Puede ser debido a toxinas o infecciones como, por ejemplo, la hepatitis vírica o bloque de la excreción de la bilis. Pero el defecto se encuentra en le hígado en sí y puede ser heredado o adquirido. Habrá un aumento de bilirrubina directa e indirecta en sangre. En orina habrá una elevación de bilirrubina y el urobilinógeno estará poco aumentado o incluso puede estar disminuido Método de medición: La bilirrubina total y la Bilirrubina directa se miden por una reacción de diazotitización. Para ambas mediciones, la bilirrubina forma con el ácido sulfanílico diazoado un colorante azoico; en el caso de la bilirrubina total, se añade un catalizador (cafeína, benzoato de sodio, acetato de sodio), el cual permite la medición tanto de la bilirrubina directa como el de la indirecta, mientras que en la medición de la bilirrubina directa no se añade el catalizador, por lo que la bilirrubina indirecta no es medida. Es necesario trabajar con un blanco para cada muestra, para eliminar la coloración dada por sueros ictéricos. El valor de la bilirrubina indirecta se obtiene de la diferencia entre la bilirrubina total y la bilirrubina directa, así: Bilirrubina indirecta = Bilirrubita Total – Bilirrubina Indirecta Valores de Referencia • Bilirrubina Total hasta 1 mg/dl • Bilirrubina directa hasta 0.25 mg/dl • Bilirrubina indirecta hasta 0.85 mg/dl Observaciones La bilirrubina del suero no es muy estable. Las determinaciones deben hacerse tan rápido como sea posible. Si la muestra no puede ser procesada inmediatamente se debe guardar en la oscuridad y en refrigeración. Si se congela, será estable por varios meses. BIBLIOGRAFÍA. 1. GÁRRIS. J, et al. Nuevo Manual Merck de Información Médica en General. España. Merck Sharp & DOHME. 2007. pp 950. 2. Manual de Bioquímica, LABOCLIP. Guatemala: Antigua Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2005. pp 09 - 11. 3. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 32 No. 9 DETERMINACIÓN DE CREATININA La creatinina es un compuesto orgánico generado a partir de la degradación de la creatina, y es un producto de desecho del metabolismo normal de los músculos que usualmente es producida por el cuerpo en una tasa muy constante, y normalmente filtrada por los riñones y excretada en la orina. La medición de la creatinina es la manera más simple de monitorizar la correcta función de los riñones, pues si estos no funcionan adecuadamente la creatinina se acumula en la sangre. La importancia clínica radica en que puede indicar una posible disfunción o insuficiencia renal, incluso antes de que se presenten síntomas. La creatinina es una prueba diagnóstica esencial, ya que se ha observado que su concentración en sangre indica con bastante fiabilidad el estado de la función renal. Por esto la creatinina puede avisar de una posible disfunción o insuficiencia renal, incluso antes de que se presenten síntomas. Es un derivado de los aminoácidos muy parecido a ellos en cuanto a su estructura molecular. Se sintetiza de forma natural en el hígado, el páncreas y en los riñones a partir de aminoácidos como la arginina, la glicina y la metionina a razón de un gramo de creatina por día. Constituye la fuente inmediata y directa para regenerar ATP y proveer de energía a las células musculares. Gran parte de la creatina se almacena en todos los músculos del cuerpo (alrededor del 90%), se sabe que un adulto que tenga 70 kg de peso corporal posee cerca de 120 g de creatina. La finalidad del almacenamiento es la creación junto con el fósforo de la fosfocreatina presente en las células musculares de los vertebrados así como algunos invertebrados, se encuentra presente con la enzima creatina quinasa. Los músculos no son capaces de sintetizar la creatina y es por esta razón por la que la toman del torrente sanguíneo. . Materiales y Métodos • sangre • Aguja • Algodón • Alcohol • Liga • Tubos de ensayo sin coagulante • Centrífuga • Pipetas Automáticas de 5 a 50µ, 10 a 100µ y 100 - 1000µ. • Tips • Espectrofotómetro • Agua destilada • Viales Reactivos • Ácido Pícrico • Reactivo de Creatinina o Buffer. 33 Procedimiento Calibración del Espectrofotómetro: Cuando el espectrofotómetro esté listo, indicamos la casilla de lo que se quiere analizar, en este caso Creatinina, luego colocamos los parámetros para que pueda realizar el análisis, estos son: • Temperatura: 37 ºC • Longitud de Onda: 500 (reactivo pide 492 pero el espectrofotómetro nos da números complejos y buscamos el que mas se aproxime) • Volumen de Muestra: 25µ • Volumen de reactivo 1: 400µ • Volumen de reactivo 2: 100µ • Leer inmediatamente Preparación: • Tomamos 400µ del reactivo 1 y lo colocamos en un vial, luego añadimos 100µ de ácido Pícrico o reactivo 2y lo añadimos al mismo vial, luego 50µ de suero lo mesclamos rápidamente con la misma pipeta automática y lo pasamos por el espectrofotómetro. • Esperamos 80 segundos para que nos de el resultado. Los valores de referencia: Los resultados de las pruebas de laboratorio pueden variar dependiendo de la edad, género, historia clínica, el método usado para esta prueba y muchos otros factores. Hombres: 0.6 a 1.2 mg/dL Mujeres: 0.5 a 1.1 mg/dL Observaciones Los adultos con mucha masa muscular pueden tener más creatinina en la sangre que la población normal. Las personas ancianas, por otro lado, pueden tener menos creatinina en la sangre de lo normal. Algunos fármacos pueden producir una elevación anormal de las concentraciones de creatinina en sangre. Una concentración muy elevada de creatinina en la sangre puede indicar la necesidad de someterse a diálisis para eliminar las sustancias de desecho de la sangre. BIBLIOGRAFIA. 1. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. Moderno, México DF. 2007. 2. Inserto de reactivo. El Manual 34 No. 10 DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO De los solutos presentes en el plasma, las proteínas están en mayor concentración. Las proteínas tienen diversas funciones en el ser humano: • • • • • • Nutrición: constituyen una porción del fondo común de los aminoácios del cuerpo. Transporte: enlazando iones metálicos, hormonas y lípidos. Mantenimiento de presión osmótica coloidal: sirve para mantener un volumen normal de sangre y un contenido normal de agua en el líquido intersticial y los tejidos. Mantenimiento del balance ácido-base. Coagulación de la sangre y cicatrización de las heridas. Herencia. De las proteínas, la albúmina y globulinas alfa y beta y quizás globulinas gama no inmunes son sintetizadas en el hígado. Las globulinas gama inmunes (anticuerpos) son sintetizadas en los linfocitos B. Importancia clínica: En los estados patológicos el total de proteínas puede variar, por ejemplo: Aumento de proteínas (hiperproteinemia): Deshidratación: por la disminución del volumen de agua, existe una concentración de soluto alta. Mieloma múltiple: Presencia de niveles elevados de proteínas específicas de mieloma. Disminución de proteínas (hipoproteinemia): Síndrome nefrótico: se pierde albúmina en orina. Quemaduras graves, hemorragias extensas, heridas abiertas. Período largo de baja ingesta o deficiente absorción de proteínas. El médico puede solicitar un valor de proteínas totales o bien requerir los valores de las fracciones de albúmina o globulina y la proporción de ellos A/G. Métodos de Medición: El método más comúnmente utilizado es el de BIURET, según el cual, al tratar una solución de proteína con iones cobre, en un medio moderadamente alcalino, se forma un complejo quelato coloreado entre el ión cobre, en un medio moderadamente alcalino se forma un complejo quelato coloreado ente el ión cobre y los grupos carbonilo y amino de los enlaces peptídicos, dando un color púrpura. 35 Valores de Referencia: 6.3-8.3 g/dl. Observaciones: Las pruebas para la determinación de proteína no deben realizarse con sueros hemolisados, lipémicos ni ictéricos. BIBLIOGRAFÍA. 1. Manual de Bioquímica, LABOCLIP. Guatemala: Antigua Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2005. pp 03. 2. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 36 No. 11 DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO Los humanos convierten los principales nucleótidos de purina, adenosina y guanosina, en ácido úrico. La adenosina se desamina inicialmente a inosina por la adenosina desaminasa. La fosforólisis de los enlaces N-Glicosídicos de la inosina y guanosina, se cataliza por la nucleósido de purina fosforilasa: se libera ribosa 1-fosfato y una base de purina. Posteriormente la Hipoxantina y la guanina forman Xantina en reacciones catalizadas por la xantina oxidasa y la guanasa respectivamente. La xantina formada se oxida a ácido úrico en una segunda reacción catalizada por la xantina oxidasa. De esta forma, la xantina oxidasa proporciona un sitio potencial para la intervención farmacológica en los pacientes con hiperuricemia y gota. La cantidad de ácido úrico depende de la ingestión dietética de purinas y de la velocidad del catabolismo de las purinas endógenas, o sea las formadas en el interior del organismo. En situaciones normales se forman 5 gramos de purinas al día y solo 0.5 gramos se convierten en ácido úrico; por lo tanto, la mayor parte de las purinas formadas son reutilizadas. Vías de Eliminación. La excreción neta del ácido úrico total en personas sanas es, en promedio, de 400 a 600 mg/24h. , es eliminado por vía renal o por las heces. Muchos compuestos farmacológicos y naturales influyen en la absorción y la secreción renal de urato de sodio. La mayor parte del ácido úrico se disuelve en la sangre y viaja a los riñones, donde sale a través de la orina. Si el cuerpo produce demasiado ácido úrico o no lo elimina lo suficiente, la persona se puede enfermar. Los altos niveles de ácido úrico en el cuerpo se denominan hiperuricemia. Causas por las que aumenta o disminuye. La Hiperuricemia se debe principalmente a una alta ingesta de alimentos ricos en proteína como las carnes y también el alcohol, algunas enfermedades también pueden causar hiperuricemia como es el caso de la leucemia ya que hay un aumento del catabolismo purínico. También son numerosos los casos de hiperuricemia por trastornos genéticos del catabolismo debido a falta de enzimas específicas. La disminución del ácido úrico o Hipouricemia y la alta excreción de Hipoxantina y xantina se relacionan con la deficiencia de la xantina oxidasa, debido a un defecto genético o a un daño hepático severo. En la deficiencia grave de xantina oxidasa los pacientes pueden mostrar xantinuria y litiasis xantínica. Un buen tratamiento para bajar las concentraciones altas de ácido úrico seria la utilización del Alopurinol ya que es un inhibidor de la xantina oxidasa. Gota: La gota es una enfermedad metabólica persistente, que produce un aumento del ácido úrico circulante, este se deposita en las articulaciones produciendo: Depósitos de ácido úrico que se convierten en cristales afilados en las articulaciones o coyunturas, y frecuentemente se acumulan en el dedo gordo del pie. Depósitos de ácido úrico (llamados tofo gotoso) que aparece como un chichón debajo de la piel. Piedras (cálculos) renales debido a los cristales de ácido úrico en los riñones. En las personas con gota, el ácido úrico se acumula y forma cristales puntudos que se 37 pueden acumular alrededor de las articulaciones. Esto causa dolor e hinchazón en las articulaciones afectadas. Este problema se suele asociar también a la diabetes, obesidad y enfermedades renales. La gota tiene cuatro etapas: la asintomática (sin síntomas), la aguda, la intercrítica y la crónica. Reactivos Reactivo de ácido úrico: 1000µl Muestra de suero sanguíneo: 20µl Materiales • • • • • • • • • • • Liga Jeringa de 3cc Algodón Alcohol Espectrofotómetro Centrífuga 1 pipeta automática de 100-1000 µl 1 pipeta automática de 10 – 100 µl Tips Viales Tubos de ensayo Procedimiento • Colocar 1000 µl de reactivo de ácido úrico en un vial. • Colocar 20 µl de suero en el vial que contiene reactivo. • Mezclar ligeramente • Se deja reposar por 5 minutos. • Al transcurrir los 5 minutos se coloca en el espectrofotómetro para realizar la prueba. • Se leen los resultados y se interpreta la prueba. Valores de referencia Hombres: 3.4-7.0 mg/dl Mujeres: 2.4- 5.7 mg/dl 38 No. 12 DETERMINACIÓN DE UREA EN SANGRE Expiación del ciclo de la Urea: El hígado, es el principal órgano donde se forma la urea; tres aminoácidos, la ornitina, citruilina y arginina, promueven la formación de urea en rebanadas del hígado; la enzima arginasa hidroliza la arginina y la convierte en ornitina y urea. El amonio obtenido por la desaminación de los aminoácidos a través de la deshidrogenación glutámica, en el sustrato de la carbamilfosfato sintetasa, enzima que junto con el CO2 y el ATP, cataliza la formación de carbamilfosfato, que es el alimentador por excelencia del ciclo de la urea. La reacción se lleva a cabo en varias etapas y necesita de la N-Acetil glutamato como modulador alostérico positivo. NH4+CO2+“ATP+H2O H2N - C- O – PO3H2 + 2ADP + Pi O CARBAMILFOSFATO El gasto de dos moléculas de ATP desplaza el equilibrio de la reacción a la derecha y fuerza la síntesis del carbamilfosfato. La ornitina se convierte en citruilina directamente por el paso del carbamilo del carbamilfosfato a la ornitina en la reacción de transcarbamilación. La citrulina es, por lo tanto, una carbamilornitina, cuya síntesis se realiza en la mitocondria de la cual sale al citosol para continuar el ciclo. La formación de arginina es un proceso mas complejo que requiere la presencia de aspartato, ATP y Mg+2. El primer paso es la formación de argino-succinato por la consideración (en presencia de ATP y Mg+2) de citrulina y aspartato. El arginosuccinato se fragmenta en arginina (lista para ser atacada por arginasa) y fumarato, que entra al ciclo de krebs y permite la regeneración de aspartato. Finalmente, la arginasa hidroliza a la arginina en urea y ornitina, la cual queda disponible para penetrar a la mitocondria e iniciar el ciclo aceptando otro carbamilfosfato. Dada la toxicidad y la necesidad de manejar las concentraciones cambiantes de NH4+, el ciclo de la urea muestra una gran capacidad de ajuste pudiendo de acuerdo con la dieta, formarse y eliminarse, cada 24 horas en condiciones normales de 5 a 50 gramos de urea. Los mecanismos de ajuste pueden ser lentos, requiriendo de 3 a 4 días para instalarse, por depender de la cantidad de enzimas presentes, o rápidos, bajo control hormonal, instalados en minutos, en este caso en relación con mayor acopio de sustratos, sobre todo de acetilglutamato, el modulador alostérico positivo de la carbamilfosfato sintetasa que forma carbamilfosfato, alimentador del ciclo. Se conocen algunos cuadros clínicos por bloqueos parciales del ciclo de la urea. Se caracterizan por hiperamonemia, retraso mental, vómitos y aversión a comidas ricas en proteínas. Se mejoran si disminuyen las proteínas en la dieta y se suministran 39 cetoácidos correspondientes a los aminoácidos esenciales, pues estos al eliminarse disminuyen la hiperamonemia. Toxicidad del amoníaco y síntomas. El amoníaco generado por las bacterias entéricas se absorbe en la sangre de la vena porta, por tanto ésta contiene niveles mas altos de amoníaco que la sangre sistémica. Ya que un hígado sano metaboliza rápidamente el amoníaco de la sangre portal, la sangre periférica se encuentra virtualmente libre de amoníaco; esto resulta esencial, puesto que aún cantidades mínimas de amoníaco son tóxicas para el sistema nervioso central. En caso de que la sangre portal no pase por el hígado, el amoníaco en sangre sistémica puede elevarse a niveles tóxicos. Esto puede ser consecuencia de una disminución pronunciada en la función hepática, o al desarrollo de comunicaciones colaterales entre venas porta y sistémicas, como sucede en la cirrosis. Los síntomas de intoxicación por amoníaco incluyen temblor, lenguaje poco entendible, visión borrosa y en casos graves, coma y muerte. Estos síntomas se asemejan a los del coma hepático, que se presenta cuando los niveles de amoníaco en sangre y en cerebro se elevan en forma significativa. El tratamiento se orienta a la reducción de los niveles sanguíneos de amoníaco. La toxicidad del amoníaco parece residir en provocar, en el hígado y el cerebro, una disminución del α -cetoglutarato. Al disminuir el α -cetoglutarato, baja el ritmo de actividad del ciclo de Krebs, así como el de las oxidaciones de sustratos en las células, lo que acarrea una grave inhibición de la respiración en el cerebro y un aumento en la producción de cuerpos cetónicos por el hígado. Causas de disminución y aumento de urea en sangre: El cuerpo produce en promedio 25 a 30 gramos de urea al día algo más en personas que comen dieta rica en proteínas, menos en personas con dieta pobre en proteínas. Los dos factores principales que establecen el ritmo de excreción de urea son: 1. La concentración de urea en el plasma, y 2. La intensidad de filtración glomerular. Estos factores aumentan la concentración de urea principalmente porque la carga de urea que penetra en los túbulos proximales es igual al producto de la concentración plasmática de urea por la intensidad de filtración glomerular. Una elección muy importante, que debe aprenderse de estas relaciones, es que en pacientes con insuficiencia renal es importante considerar la intensidad de filtrado glomerular en valores altos. Cuando la intensidad de filtración glomerular disminuye 40 demasiado, la concentración proporcionalmente mayor. de urea en sangre aumenta hasta un nivel El nitrógeno está presente en otro químico llamado urea. La urea es un producto de desecho, producido cuando el cuerpo ha digerido las proteínas. La urea es llevada a través de la sangre a los riñones, los cuales filtran la urea de la sangre y la depositan en la orina. Las enfermedades renales muchas veces dificultan el filtrado correcto de la urea. Esto causa niveles altos de urea en sangre. El análisis también se realiza a pacientes que están sometidos a diálisis renal para ver si se está realizando bien esta función. Ciertos medicamentos alteran las funciones de ciertos órganos como el riñón y este estudio ayuda a monitorear si los medicamentos y la dosis son correctos. Este análisis se debe pedir cuando se sospecha de problemas renales, o cuando se quiere saber sobre la dieta del paciente, muchas veces alta en proteínas, aunque también es indicador de malnutrición en concentraciones bajas de urea. Concentraciones altas de urea pueden ayudar a diagnosticar, también fallo cardíaco, hemorragias gastrointestinales, hipovolemia (quemaduras y deshidratación), inanición, obstrucciones renales como cálculos o tumores. Concentraciones bajas de urea pueden ayudar a diagnosticar dietas pobres en proteínas, fallo hepático, embarazo y exceso de hidratación entre otras. Método de medición: En la actualidad se acostumbra reportar el valor del nitrógeno de urea en vez de la urea total. En presencia de tiosecarbazida: La urea forma un color rojo en solución de ácido diacetilmonoxima, lo que se mide espectrofotométricamente. Ureasa: Utiliza la enzima ureasa que pasa la urea a amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco en presencia de nitroprusiato forma un compuesto coloreado verde, cuya absorbancia es medida; o bien los iones amonio formados reaccionan con fenol e hipoclorito de sodio (reacción de Berthelot), formando un compuesto de color azul, medido también espectrofotométricamente. Valores de Referencia: Urea total: 10-50 mg/dl y nitrogeno de urea de 5-23 mg/dl. 41 BIBLIOGRAFÍA. 1. LAGUNA, J, et al. Bioquímica. 4ta edición. JGH RDITORES. Pp. 117 a 121. 2. MURRIA. RK, et al. Bioquímica de Harper. 15ª ed. Pastrana VM, trad. México: El manual moderno, 2007. pp. 365 373. 3. GUYTON: A,C. Fisiología Médica. 5ta edición. EDITORIAL INTERNACIONAL. Pp.460. 4. Murray, Robert et al. Bioquímica de Harper, 17ª. Edición. El Manual Moderno, México DF. 2007. 42 No. 13 PRUEBA DE EMBARAZO La hormona gonadotropina coríonica (HCG) es un glucoproteína producida por el sincitotrofoblasto de la placenta, órgano temporario presente solamente durante el embarazo, por lo tanto, es una hormona característica del embarazo. El máximo de eliminación se produce cerca de los 60 días de amenorrea, para luego estar presente en cantidades mínimas durante todo el embarazo. Cerca de un 60% de HCG sérica se elimina por los riñones; la excreción urinaria empieza unos pocos días de la primera falta de menstruación, continua aumentado y alcanza un nivel medio de 5UI/ml. La importancia de esta hormona es que se utiliza para confirmar un embarazo, en toxemia y diabetes los niveles HCG sérica son más elevados que los encontrados en la orina, la complicación renal presente en estas pacientes sería una consecuencia de tal diferencia, por una inadecuada eliminación hormonal. La concentración urinaria de HCG en pacientes con mola hidatiforme es 3 veces superior a la encontrada en el embarazo normal. En el coriocarcinoma, trofoblastoma de origen maligno que puede desarrollarse a partir de una mola hidatiforme, existe una persistencia de HCG en sangre y en orina, con títulos hormonales superiores a los de la mola hidatiforme. Método de medición: Existen varios métodos, los cuales pueden ser biológicos; estos no se realizan actualmente debido a que tienen variantes al utilizar animales de laboratorio. Hay dos métodos inmunoquímicos para la detección de HCG en la orina: 1. Aglutinación directa en partículas de látex, que consiste en la reacción inmunoquímica entre HCG y partículas de látex ligadas a anticuerpos antiHCG; una aglutinación visible se interpreta como prueba positiva, la falta de aglutinación es negativa. 2. Inhibición de la aglutinación, donde la muestra de orina se mezcla con la preparación que contiene anticuerpos monoclonales contra HCG. Luego se agrega partículas de látex unidas a HCG. Si la muestra no contiene HCG los anticuerpos monoclonales reaccionarán con las partículas de látex-HCG. Existe un método para la detección temprana del embarazo, el cual se denomina prueba de embarazo en sangre. En el procedimiento se agrega 3 gotas de la muestra (orina u suero); a medida que la muestra avanza a través de la membrana se moviliza el complejo de anticuerpos anti-alfa hCG-coloide, luego atraviesa la región de captura de anticuerpos inmovilizados anti-beta hCG y alcanza entonces el extremo de la membrana. Si la hCG está presente el la muestra a niveles iguales o superiores a 25mUI/ml aparecerá como positivo en la ventana de resultados, en ausencia de hCG aparecerá como negativo. La barra horizontal es como un control de calidad, al demostrar el reconocimiento del anticuerpo y otra barra es la del paciente. Puesto que los niveles de hCG de 25mUI/ml han sido observados 10 a 12 días después de la concepción, la hCG puede detectarse antes de la primera falta de menstruación. 43 Cuando la prueba se realiza en muestras de orina, y esta resulta negativa, se le recomienda a la paciente que de persistir la amenorrea la repita unos días después. La prueba de embarazo en sangre no puede realizarse con plasma ni con suero hemolizados. BIBLIOGRAFÍA. 1. Manual de Inmunoserología, LABOCLIP. Guatemala: Antigua Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia (USAC). 2005. pp 12 y 13.