Comité organizor Prof(a). Vilma Llovera Ing. Agro. Nohants Rumbos Prof. Juan Barroyeta Prof(a). Irma F Agrela Prof(a). María Chacón Prof(a). Johanny Ruíz Prof. Carlos Rodríguez Prof (a). Vianellys Hernández Prof(a). Clara Nancy Gutiérrez Prof(a). Sandra Abou Orm Saab Aux. Lab. Maira Bermúdez Aux. Lab. Eustaquia Díaz Sra. Ligia Padrino Ba. Marioxys Montero Ba. Valerie González 2 TALLER MANEJO DE LA MUESTRA Y TECNICAS DE COLORACION EN MICROBIOGÍA INDICE I.- PROGRAMA TEÓRICO Responsable (s) -Verificación de Inscripciones Comité Organizador Prof. Johanny Ruíz y Ing Agro. Nohants Rumbos Lugar y Hora Salón Dorado 7:30-8:30 am Salón Dorado 8:30-9:00 am Página -- -Bienvenida Instituciones participantes: Departamento de Microbiología Instituciones participantes: Sociedad Venezolana de Microbiología, capitulo Aragua -Manejo de la muestra: bioseguridad y preservación -Procesamiento de muestras y técnicas de coloración en el área de micología -Consideraciones acerca de la práctica de algunas tinciones en microbiológica -Refrigerio -Preparación de medios de cultivos y reactivos empleados en microbiología II.- PROGRAMA PRÁCTICO -- 4 5 Salón Dorado 9:00- 9:30 am Salón Dorado 9:30-10:00 am Salón Dorado 10:00-10:30 am Salón Dorado 10:30-11:00am Salón Dorado 11:00–11:30am Laboratorios de Microbiología 11:30 – 12:30 Prof(a). Vilma Llovera Prof. Juan Barroyeta Prof(a).Vianellys Hernández Aux. Lab. Maira Bermúdez Prof(a). Johanny Ruíz Prof. Carlos Rodríguez Prof(a) Sandra Abou Orm S Prof(a). María Chacón Prof(a). Clara N Gutiérrez Aux. Lab. Eustaquia Díaz Laboratorio 1 Prof. Juan Barroyeta 7 Prof. Johanny Ruíz y Prof. Carlos Rodríguez Prof. (a) Vilma Llovera Suárez Comité Organizador Prof(a) María Chacón 13 18 -24 -Tinciones en microbiológica -Procesamiento de muestras y técnicas de coloración en el área de micología -Preparación de medios de cultivos y reactivos empleados en microbiología Laboratorio 2 Laboratorio 3 3 4 . Microbiología II y Microbiología para Enfermería y para el actual periodo lectivo atiene a un total de 1. ejecutar. técnico y humanístico como centro de la Educación Superior Universitaria.DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA. Inmunología-Medicina. Tecnología e Industrias Intermedias por ser éstas prioritarias para el desarrollo de la nación. Cabe destacar. en nuestro departamento funciona el “Laboratorio de Diagnóstico Micológico” el cual es un laboratorio especializado en el diagnóstico de las enfermedades causadas por hongos y representa un laboratorio de referencia a nivel regional y que no sólo ofrece sus servicios a las comunidades ubicadas en las zonas cercanas a nuestra casa de estudio sino también recibe pacientes procedentes de los diferentes estados de la región central y atiende un promedio de 150 pacientes anuales. desarrollar y difundir conocimientos innovadores competitivos y socialmente pertinentes para la formación ética. Además dentro del departamento se desarrollan actualmente ocho líneas de investigación las cuales fueron aprobadas por el Consejo de Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Carabobo y se encuentran enmarcadas en las Necesidades de Investigación señaladas por el Ministerio del Poder Popular para la Ciencia. Planificar. Medicina y Enfermería en los programas teórico-prácticos de las asignaturas de Microbiología Médica. Inmunología-Bioanálisis. FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD. Microbiología I. que apoyen el progreso de la región y del país para la consolidación del bienestar personal y colectivo de la sociedad dentro del contexto científico. Planificar y desarrollar líneas de investigación enmarcadas dentro de las áreas de la Microbiología de acuerdo con las necesidades de la región y del país. planificar. programar. coordinar. MISIÓN: Crear. Sede Aragua dicta docencia efectiva para los estudiantes de las Escuelas de Bioanálisis. Estas líneas de investigación han generado un número importante de trabajos de investigación los cuales ya han sido publicados o están en vías de publicación así como también sus resultados han sido presentados en congresos de investigación a nivel nacional e internacional. Así mismo. SEDE ARAGUA UNIVERSIDAD DE CARABABO El Departamento de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis. integral y actualizada de profesionales y técnicos a nivel de pregrado y postgrado en el área de la salud en general y de la Microbiología en particular. que actualmente en el Departamento de Microbiología se realiza la Asesoría y/o Tutoría de 13 trabajos de investigación (11 pregrado y 2 de postgrado). supervisar y evaluar los programas docentes adscritos al departamento. ESCUELA DE BIOANÁLISIS.178 estudiantes. 5 . SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGÍA CAPÍTULO ARAGUA La Sociedad Venezolana de Microbiología (SVM) es una asociación profesional multidisciplinaria autónoma. tecnológica. investigación y extensión y servicio. MISIÓN Fomentar y difundir la investigación científica y tecnológica. la enseñanza y el aprendizaje. Carabobo. la enseñanza y el aprendizaje. ¿DE DÓNDE NACE LA SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGÍA? La Sociedad Venezolana de Microbiología (SVM) nace un 14 de Abril de 1953. cada uno dirigido por una Junta Directiva Capitular y coordinados por la Junta Directiva Nacional. Mérida. Guayana. Actualmente la SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGIA tiene unos 500 miembros. Aragua. que sería órgano consultivo técnico de las instituciones que lo solicitasen y que tendría como prioridad levantar el espíritu científico y contribuir al progreso de la enseñanza de la Microbiología en Venezuela. en un contexto ético para contribuir al bienestar de los venezolanos y de la humanidad. distribuidos en toda la geografía nacional y 10 Capítulos: Anzoátegui. Metropolitano. que contribuya al bienestar de los venezolanos y de la humanidad. cónsonas con las necesidades de la región y del país. así como el asesoramiento en la microbiología en Venezuela. Sucre y Zulia. a fin de discutir la posibilidad de conformar una Sociedad que tuviera como objetivos agrupar a los profesionales especialistas en las diferentes áreas de la microbiología. cuando 16 profesionales especializados en diferentes ramas de la Microbiología. Planificar y ejecutar actividades de extensión y servicio con la finalidad de ofrecer exámenes diagnósticos especiales a la comunidad regional y nacional. Centro-Occidental. que tiene por objeto fomentar y difundir la investigación científica. se reunieron en el Instituto Nacional de Higiene. así como el asesoramiento Microbiológico en Venezuela. con personalidad jurídica propia. Falcón. de carácter exclusivamente científico y tecnológico. VISIÓN: Ser una dependencia de alto valor académico que desarrolle y coordine actividades de docencia en pregrado y postgrado. bioéticos y humanistas. dirigidas al logro de las metas y objetivos de los proyectos relacionados con el área de la Microbiología. sin fin de lucro. Manteniendo un alto criterio ético en beneficio de la población y el perfeccionamiento continúo del profesional en sus aspectos científicos. Juan Barroyeta Secretario de Publicaciones Lcda. referente para la comunidad nacional y sus autoridades. que cuente con tecnología de avanzada a fin de garantizar un servicio de alta calidad en beneficio de la ciudadanía. El solicitante cancelará igualmente la cuota de inscripción fijada periódicamente para la Asamblea Anual (equivalente a dos (2) unidades tributarias).VISIÓN Ser una Sociedad Científica con un elevado nivel de credibilidad ante la sociedad. Agro. Nayesda Fragenes Secretaria General Lcdo. se requiere: a) Envíe su curriculum vitae. d) Una vez estudiada y aprobada la solicitud por la junta directiva capitular. b) Solicitud por escrito dirigida a la junta directiva del capítulo.svmicrobiologia.com/ http://www. Interinstitucionales Información: e-mail: svmcapituloaragua@gmail. http://svmcaragua. Nohants Rumbos Presidenta Lcda. Valerie González Secretaria de Actas Lcdo. Junta Directiva capítulo Aragua Ing. los cuales se comprometerán a acompañar al aspirante en la próxima reunión capitular para su presentación. Carolina Méndez Secretaria de Rel. ¿QUIENES PODRÁN PERTENECER A LA SVM? Podrán ser miembros asociados de la Sociedad Venezolana de Microbiología los profesionales que se dediquen a cualquiera de las disciplinas microbiológicas REQUISITOS PARA INSCRIPCIÓN Para ingresar como miembro asociado de la Sociedad Venezolana de Microbiología.org/ 6 . Claudio Medina Secretario de Finanzas Br. c) Respaldo de la solicitud con la firma de dos miembros titulares. Ysvette Vásquez Vicepresidenta Ing.com. la cual incluye la cuota anual del período en curso.blogspot. Agro. y los datos epidemiológicos de interés como la profesión. citostáticos y medicamentos de acción directa sobre la respuesta inmunitaria. indicando las enfermedades de base.MANEJO DE LA MUESTRA: BIOSEGURIDAD Y PRESERVACIÓN Prof. la fase previa tiene una importancia capital para la calidad final de los resultados. los factores predisponentes de infección si existen. en particular antibióticos. hay que señalar la obtención de la muestra en condiciones apropiadas según las especificaciones del laboratorio. Es imprescindible que la muestra para análisis llegue al laboratorio con un papel de petición perfectamente cumplimentado con los datos de filiación y clínicos del paciente. el volumen recomendable y la necesidad o no de introducir el material en un medio de transporte 7 . es muy importante conocer la medicación prescrita al paciente. transporte y la conservación adecuada del material recogido. hepatitis y otros procesos patológicas con riesgos de contagia para el personal del laboratorio. 2. señalando las características del proceso patológico que está en estudio. La toma de muestra debe cumplir con cinco principios básicos: 1. su correcta rotulación para evitar errores de identificación. 4. no se recomienda usar esta estrategia dado que todo material biológico debe ser considerado potencialmente contaminado y se deben manipular bajo las normas de precauciones universales (Tabla 1). Entre los factores cruciales de esta etapa. Que el transporte al laboratorio o área de procesamiento sea rápido. Que la cantidad sea suficiente. En la solicitud debe figurar claramente el nombre del médico que la ha efectuado y su teléfono para poder consultarle personalmente cuando sea necesario. 5. Hace algunos años se recomendaba identificar las muestras de pacientes con sida. Que la contaminación por flora comensal se reduzca al mínimo. los hábitos que comportan riesgo de infección. Es fundamental que la persona que efectué la toma de muestra conozca el método de recogida. 3. los viajes y otros. TOMA DE MUESTRA Es importante que el personal que tomará o recibirá la muestra contacte personalmente con el microbiólogo para informarse y acordar el método de recogida de las muestras. Asimismo.com En todo procedimiento analítico. preferiblemente del margen activo de la lesión. Siempre que sea posible realizar la obtención por punción y no por escobillado. En la actualidad. Que la muestra seas representativa del tejido afectado. Juan Barroyeta jrbarroyeta@gmail. preferiblemente en sobres impermeables. (2006). Los recipientes han de estar correctamente rotulados para facilitar su identificación. 4. transporte y manipulación de muestras en el laboratorio entrañan un riesgo de infección para el personal. Normas de precauciones universales 1. entre otros) deben ser estériles y de cierre hermético. fumar ni llevar ningún objeto a la boca en el laboratorio. Utilizar siempre bata. en particular el punzante. de plástico. Recoger y limpiar las superficies de trabajo al inicio y fin de la jornada. 3. preferiblemente. sino por separado. desinfectándolas cuidadosamente con alcohol isopropílico al 70 – 80% o glutaraldehído al 1-2%. liquido ascítico. En el exterior del recipiente no debe quedar ningún material. 6. Los formularios de petición de examen de la muestra no se colocarán alrededor de los recipientes. Véase tabla 2. debido a que la recogida. Desechar el material. Deben ser fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapón estén correctamente colocados. recepción de las muestras y la apertura de los envases/embalaje RECIPIENTES PARA MUESTRAS Los recipientes para muestras pueden ser de vidrio o. Lavarse las manos después de cada procedimiento y al final de la tarea aunque se hayan utilizado guantes. 8 . TÉCNICA PARA EL MANEJO DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO El mayor porcentaje de los accidentes de laboratorio y las infecciones conexas se debe a los errores humanos. exudado pleural. 2. No pipetear con la boca. Con el fin de evitar o reducir al mínimo los accidentes más comunes provocados por esos factores es importante considerar una Manipulación segura de muestras en el laboratorio. en recipientes adecuados. 5. Es por ello que se deben evaluar: los recipientes para las muestras. procedimientos y medidas para el transporte de muestras dentro de la instalación.Tabla 1. las técnicas de laboratorio incorrectas y el mal uso del equipo. heces. MATERIAL PARA LA TOMA DE MUESTRA Los frascos y tubos para recoger el material fluido y secreciones (orina. Microbiología clínica. Ponerse guantes siempre que se manipule material biológico. Fuente: Prats. Usar propipetas o pipetas automáticas. No comer. M. parasitos. Máx. Frasco sin MT. 24h Orina Bacterias. Recogida. Frasco sin MT. 5-15 mL hepático. Máx. Máx. Máx. 24h 4°C. hongos Parásitos Absceso abdominal. Máx. Máx. 2h TA. Frasco sin MT. 24h 4°C. Frotis de gota gruesa o extendidos de sangre con EDTA Tubo con heparina de litio 4°C. Escobillón con MT Stuart Siembra inmediata en MP TA. Frasco sin MT. Máx. Hongos y 10-20 mL virus Heces Bacterias y hongos 2-5 mL Parásitos Virus Esputo Exudado ótico Exudado faríngeo Baterías Virus Escamas cutáneas. 24h TA. 24h 9 . Máx. SPS. 24h 4°C. Frasco sin MT. 24h Escobillón con MT para TA. Escobillón con MT Stuart Escobillón con MT Stuart Escobillón con MT Hanks Placa de Petri o frasco TA. 24h TA 4°C. 24h TA. 24h TA. Máx. cabello y uñas Material de Hongo raspado o cortado Líquido Cefalorraquídeo Bacterias y hongos 1-3 mL Virus 1 mL Líquidos Pleural/pericárdico 5-15 mL Ascítico 5-15 mL Articular 1 mL Exudado vaginal/endocervical Bacterias. 24h anaerobios Virus 1-5 mL Frasco con poliatenol sulfato sódico. 24h 4°C. Máx. Máx. Máx. Máx. transporte y almacenamiento de muestra para microbiología Muestra clínica Volumen Recipiente frasco sin MT Temperatura 4°C. Máx. 72h 4°C. Tubo sin MT. pancreático y peritoneal Sangre bacterias y hongos 10-20 mL (hemocultivo) Parásitos Frasco con MT Cary-Blair Frasco con fijador (formol) Frasco sin MT. 24h 4°C.Tabla 2. Máx. de modo que los recipientes que contienen las muestras se mantengan en posición vertical. Estas medidas descritas han surgido por la aplicación de seguridad biológica desde hace más de tres décadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS). A partir de esta publicación. Es. contra otros elementos que no son estrictamente de origen biológico. la protección del material microbiológico contra el robo. Los recipientes primarios de las muestras deben abrirse en una cámara de seguridad biológica. el cierre debe tener una junta que garantice la estanqueidad. con el objeto de alentar a los países a aceptar y aplicar conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos nacionales de prácticas para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. legítimo pensar que dentro de este campo tiene también cabida la protección. de preferencia. pero deben poderse tratar en autoclave o ser resistentes a la acción de los desinfectantes químicos. por tanto. deben utilizarse envases/embalajes secundarios (por ejemplo. la pérdida o la desviación para evitar que esos agentes se puedan utilizar de forma indebida con el fin de atentar contra la salud pública. La bioseguridad o Seguridad biológica es el término utilizado para referirse a los principios. Los recientes acontecimientos mundiales han puesto de manifiesto la existencia de nuevas amenazas para la salud pública derivadas de la liberación o el uso indebido deliberados de agentes y toxinas microbianos. APERTURA DE LOS ENVASES/EMBALAJES El personal que recibe y desempaqueta las muestras debe conocer los riesgos para la salud que entraña su actividad y debe estar capacitado para adoptar precauciones normalizadas. Deberán descontaminarse periódicamente.TRANSPORTE DE MUESTRAS DENTRO DE LA INSTALACIÓN Para evitar fugas o derrames accidentales. Por consiguiente. RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS Los laboratorios que reciban un elevado número de muestras deben destinar un local o zona especial con este propósito. 10 . o su liberación accidental. Los envases/embalajes secundarios pueden ser de metal o de plástico. es decir. técnicas y prácticas aplicadas con el fin de evitar la exposición no intencional a patógenos y toxinas. Se dispondrá de desinfectantes. particularmente cuando manipule recipientes rotos o con fugas. es importante considerar la bioprotección. muchos países han seguido la orientación especializada que se ofrece en el manual para elaborar esos códigos de prácticas. cajas) equipados con gradillas. Infrarrojo. Antibióticos y otros fármacos. 11 . Manejo de Hormonas. nos referimos a las medidas de protección en el manejo de las siguientes situaciones: 1. Usos de la tecnología del ADN Recombinante. Descontaminación y protección ambiental. guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos. tampoco pueden excluirse las medidas tendientes a eliminar el riesgo de factores físicos. son depositados y eliminados sin riesgo. Quemaduras 6. 5. Vibraciones 4. Ultrasonido 3. Manejo de Energizantes. mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. Manejo de tóxicas. En una visión lo más amplia posible del problema de protección. Ruidos 5. Medios de eliminación de material contaminado: comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en la atención de pacientes. 3. Universalidad: las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los servicios. 2. La utilización de barreras (ej. 2. Manipulación del material infeccioso. Los objetivos específicos de Bioseguridad comprenden una serie de acciones tendientes al control del riesgo que encierran las actividades en las siguientes áreas: 1. 4. Uso de barreras: comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes. estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del paciente. Rayo Láser 2.pero que si son capaces de constituir riesgo y agresión. Radiaciones no ionizantes (Luz ultravioleta. tales como: 1. Todo el personal debe seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas. Estas precauciones. Microondas). independientemente de conocer o no su serología. Manejo de Cancerígenos. Manipulación de microorganismos patógenos. 3. deben ser aplicadas para TODAS las personas. 3. 2. pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente. Exposición prolongada a altas o bajas temperaturas PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD 1. independientemente de presentar o no patologías. en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes. (2003).4. R. la población. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. Seguridad biológica en la preservación y el transporte de muestras biológicas obtenidas en el ámbito de las enfermedades respiratorias y destinadas a la investigación. riesgo poblacional bajo Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio. Archivo de Bronconeumonología. GRUPO DE RIESGO 4 Riesgo individual y poblacional elevado Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro. directa o indirectamente. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología. 5. M. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Microbiología clínica. pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. riesgo poblacional bajo. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave. 2-5. Medidas de protección del ambiente. Madrid: Panamericana. Mazzali. el componente más importante es el juicio profesional. N. 187–195. Somoza. el ganado o el medio ambiente. REFERENCIAS Prats. Esta clasificación por grupos de riesgo se utilizará exclusivamente para el trabajo de laboratorio. GRUPO DE RIESGO 3 Riesgo individual elevado. probado o no bien definido. GRUPO DE RIESGO 1 Riesgo individual y poblacional escaso o nulo. radiaciones y elementos químicos de efecto dañino en el hombre. clasificados por grupos de riesgo según la OMS. y Tora M. Notas sobre bioseguridad. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Aunque existen muchas herramientas para ayudar a evaluar el riesgo que comporta un procedimiento o un experimento determinado. (2009). GRUPO DE RIESGO 2 Riesgo individual moderado. (2006). nivel 1 de bioseguridad. 45 (4). El pilar de la práctica de la bioseguridad es la evaluación del riesgo. Uso de fármacos. Usualmente se hace referencia a los peligros relativos que entrañan los microorganismos infecciosos. 12 . 23 (1). Johanny Ruíz nannyruiz@hotmail. montaje de examen directo y coloración. de los equipos y materiales requeridos. entre otros: Centrífuga Mechero Pinzas de depilar Tijeras. examen directo.PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y TÉCNICAS DE COLORACIÓN EN EL ÁREA DE MICOLOGÍA Prof. Palabras clave: Procesamiento de muestra. para tomar las muestras de piel y sus anexos es necesario realizar la limpieza del área. identificación del microorganismo aislado y reporte de resultados. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Para procesar los distintos tipos de muestras biológicas dentro de un laboratorio clínico y/o de investigación. cuero cabelludo. Carlos Rodríguez leogod1985@hotmail. Luego en la fase de montaje del examen directo en fresco es preciso tener conocimiento y destreza para lograr visualizar los microorganismos potencialmente patógenos y así emitir un resultado que en algunos casos es el diagnóstico definitivo de una infección o enfermedad. Este proceso consta de cinco fases: toma de muestra. micología. aislamiento en cultivo. se debe contar con un área adecuada además.com INTRODUCCIÓN El procesamiento de las muestras biológicas. especialmente las que provienen del animal y el hombre para el diagnóstico microbiológico. sangre. el personal encargado de cada área debe tener conocimiento para realizar el procesamiento de la muestra de manera correcta. líquidos. esputo. Cada muestra biológica tiene un procesamiento distinto. exudados. orina. uñas. Previo a la toma de la muestra es pertinente realizar un interrogatorio al paciente para recabar datos socio-demográficos y epidemiológicos que contribuyan a orientar el diagnóstico de laboratorio y confirmar o no el diagnóstico clínico. básicamente es sencillo.). cucharilla de Brocq u hojas de bisturí Láminas portaobjetos y cubreobjetos Tinta Parker azul negra con solv X KOH (10 a 40%) Asa de platino Tubos de ensayos Hisopos estériles Aplicadores de madera Jeringas Nevera o refrigerador Autoclave o esterilizador 13 . aspirados y tejidos (piel. etc.com Prof. particularmente. En esta oportunidad se dará especial atención a la fase de procesamiento de las muestras y montaje directo en fresco. básicamente se trabaja con muestra de heces. depilar con pinzas o hacer raspado con hoja de bisturí y colocarlo en envase estéril Uñas Previa limpieza del área seleccionada. aspirados de yodado u otro tipo de antiséptico abscesos. A continuación daremos una breve descripción para cada una: Muestra Obtención Obtenidas por punción Limpiar la zona de la punción con alcohol.Nevera o refrigerador Autoclave o esterilizador Estufa Baño de María OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Para realizar una adecuada obtención de muestra para el área de microbiología se deben tener consideraciones específicas dependiendo del área a estudiar (Bacteriología.). obtención por cinta adhesiva transparente (adherir la cinta sobre la piel. despegar y posterior colocarla en lámina portaobjeto con adhesivo en dirección a la lámina) o por raspado con hoja de bisturí en el área de mayor descamación y recolección en envase estéril Pelos Previa limpieza del área seleccionada.R. se corta la uña de interés y se toma el material o detrito que se ubica entre la uña y la piel Biopsias Muestra obtenida por personal médico autorizado y por lo general es enviada al laboratorio ya en medio de conservación 14 .C. tubos secos o con anticoagulante según sea el caso etc. Colectarla en envase estéril Esputo Explicar al paciente expectorar la mayor porción de moco posible y colectarlo en envase estéril Exudados o cepillados Se colecta con hisopos estériles. porción con mayor moco macroscópicamente o hisopo rectal si hay impedimento de evacuación espontánea Escamas de piel Previa limpieza del área seleccionada. explicar al paciente la limpieza de genitales y descarte del primer chorro. alcohol (sangre. Orina Preferiblemente la primera de la mañana y de ser parciales las de tiempo de retención. líquido pleural. colocarlo en gel de transporte o en tubo seco dependiendo del caso Heces Se recolecta en recipiente estéril. secos o humedecidos de mucosas con solución salina estéril. Virología o Micología) y dependiendo del tipo de muestra. líquido Aspirar con jeringa estéril. (Aspirados de nódulos y cefalorraquídeo abscesos se pueden transportar en ella) colocarlos en (L. así como todo lo relacionado con su recogida. presencia de coágulos. número de secuencia o registro e iniciales del paciente MOTIVOS DE RECHAZO DE MUESTRAS La muestras de esputos con mayor contenido de saliva.).). pleural. tanto para el personal como para la muestra. utilizando el medio de cultivo y la temperatura de incubación más adecuada. Comprobar que la identificación de la muestra es la correcta 2. articular. 4. consistencia.ANTES DEL PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA 1.R. olor.) deben concentrarse por centrifugación aspirados de abscesos.500-2. pleural. Mantenimiento de transporte inadecuado PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Muestra Procesamiento Líquidas obtenidas por Los líquidos orgánicos (LCR. Liquido Se trabaja con el sedimento. Tiempo de toma de muestra prolongado. punción (sangre. Durante el procesamiento. peritoneal. Se deben identificar bien las láminas y placas con: fecha. El tipo de procesamiento y los medios utilizados dependen de las características de cada muestra. (1. etc. 6. transporte y conservación.500 g durante 10 min) Se debe separar el sobrenadante (no descartar) Se trabaja con el sedimento. color.C. Poca cantidad de muestra (dependiendo del tipo de muestra). etc. Excepto que la turbidez de la orina sea abundante Esputo Exudados o cepillados de mucosas Heces Explicar al paciente expectorar la mayor porción de moco posible y colectarlo en envase estéril Se hace un extendido en la lámina porta objeto de la porción mucosa Se hace un extendido en la lámina porta objeto de la porción mucosa o se toca con aplicador de madera y el material se disuelve en una gota de solución salina en la lámina portaobjeto 15 .500 g durante 10 min) Líquido cefalorraquídeo Se debe separar el sobrenadante (no descartar) (L. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible para garantizar la viabilidad del patógeno. Orina Deben concentrarse por centrifugación (1. etc. deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias. 3. 5.500-2. Registrar toda la información necesaria que pudiera contribuir a orientar el diagnóstico (aspecto. Tener en cuenta las precauciones ya citadas. MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON SOLUCIÓN SALINA Para realizar el examen directo sobre la lámina portaobjeto se coloca una o máximo dos gotas de solución salina fisiológica estéril luego se coloca la muestra y se tapa con un una laminilla o cubreobjeto Evitar que la preparación se seque ya que se perdería el material biológico. Luego se coloca una gota pequeña de tinta Parker azul negra con solv X sobre la laminilla o cubreobjeto. de exudados o heces. 16 . se gira con rapidez y se coloca sobre la lámina portaobjetos con la muestra con el KOH. puede ser colocar en cámara húmeda hasta el momento del análisis. 10 a 40%) y una gota del sedimento en el caso de los líquidos. se colocan sobre la lámina porta objeto se concentran en la porción central de la lámina y se procede a la aplicación del colorante y KOH al 40% Por lo general vienen adheridas a la lámina portaobjeto debido a lo delicado del corte. Flamear la preparación con el mechero para acelerar la acción del KOH. El KOH disuelve más rápidamente los elementos celulares que los hongos (protegidos por la pared celular). reactivo y si se analiza bajo estas condiciones se corre el riego de reportar resultados erróneos. De ser necesario. se colocan sobre la lámina porta objeto se concentran en la porción central de la lámina y se procede a la aplicación del colorante y KOH al 10% Las escamas y pelos se colocan sobre la lámina porta objeto se concentran en la porción central de la lámina y se procede a la aplicación del colorante y KOH al 20% Las escamas de detrito obtenidas por raspado. MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON KOH Puede utilizarse para examinar muestras clínicas con abundantes células y restos celulares. listas para la tinción.Escamas de piel Pelos Uñas Biopsias Las obtenidas por cinta adhesiva transparente despegar de la lámina portaobjeto y proceder a colocar el colorante Las obtenidas por raspado con hoja de bisturí. MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON KOH Y/O TINTA PARKER AZUL NEGRA Sobre la lámina portaobjeto se coloca una gota de KOH (% adecuado. La muestra de escamas tomadas sobre la lámina se recogen en el centro y luego se les añade una o dos gotas de KOH. tiempo. . La cantidad de tinta no debe ser ni excesiva ni escasa. El color de la preparación deberá ser marrón. E. (2006). Brooks. S. Butel. 17° ed. entre otras). Microbiología Médica. REACTIVOS Tinta china de buena calidad (nigrosina. Es importante manipular con cuidado el frasco de tinta evitando todo contacto con la muestra clínica que pueda contaminarlo y así producir falsos positivos. PROCEDIMIENTO GENERAL Se deposita el material a examinar en una lámina porta y se añade una gota de la solución de KOH. G..V México. Editorial el Manual Moderno. E. Si no se utiliza con colorantes. ELSEVIER. España. EXAMEN DIRECTO CON TINTA CHINA Es la técnica más ampliamente conocida como tinción negativa usada para poner de manifiesto la cápsula del hongo levaduriforme Cryptococcus neoformans. El efecto clarificador del KOH puede aumentarse calentando ligeramente la preparación. J. mezclarlas bien evitando formar burbujas y colocar el cubreobjeto. glicerol 20 ml.. Por ejemplo: (KOH 10 g.. el riesgo de visualizar artefactos se incrementa. y Ornston. exhibiendo un nítido contraste. La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una levadura redonda. la preparación se examina al microscopio en objetivo de 10X y 40X. tinta Pelikan India Ink o Parker Black Ink. Adelberg.. Microbiología Médica. delimitado por las partículas de carbón en suspensión coloidal de la tinta china. en ambos casos. agua destilada 80 ml). REFERENCIAS Arenas G.. La preparación se examina al microscopio en objetivo de x10 y x40 La presencia de formas redondas rodeadas de un halo grande y transparente son sugestivas de C.. no negro. 17 . REACTIVOS Solución de KOH al 10%. Tras un periodo de tiempo (5-10 min) para permitir el aclaramiento de la muestra por el KOH. Mezclar por agitación. se mezclan bien y se coloca el cubreobjetos. 2° ed. (2001). D. México. N. Micología Médica Ilustrada.A de C. Rosenthal KS. Murray. Mc Graw-Hill. (2003). neoformans. J. PROCEDIMIENTO Depositar sobre una lámina portaobjeto limpia y desengrasada una gota de LCR y una de tinta china. Jawetz. 5° ed. PR. Pfaller MA.F. Melnick. R. ya que. las preparaciones deben estudiarse con un microscopio convencional con luz reducida para aumentar el contraste o con un microscopio de contraste de fases. Para ello. en vez. en la actualidad. contribuir activamente con el paciente.com Esta reflexión acerca de la práctica de algunas tinciones en el área de la microbiología tiene por objeto razonar acerca de la práctica del proceso de colorear extendidos para hacer diagnóstico en el área de la microbiología. lo cual permite a la bacteria teñirse con uno u otro de dos colorantes (violeta /safranina) con ayuda de la solución yodada. propongo: poner en práctica el pensamiento crítico repasando algunas preguntas que pueden servir de guía para apuntalar o no el diagnóstico del clínico y. Es la coloración más importante en el área de la bacteriología. no se debe intercambiar reactivos entre estos. permitió la primera clasificación bioquímica de las bacterias en dos grandes grupos y. en muchos casos. Albert Einstein. (a) Vilma Llovera Suárez vjllovera@gmail. constituye la base para instalar un tratamiento antimicrobiano. 18 . ¿De dónde partir? Integrar la ética con el conocimiento teórico y la experiencia práctica. El pensamiento crítico nos exige plantearnos: ¿Por qué? y ¿para qué? hacemos una tinción. De manera que. en respuesta a la necesidad de teñir las bacterias para diferenciarlas del tejido infectado. así. que puede cambiar el curso de la infección y la enfermedad en un ser humano o animal. específicamente a la cantidad de peptidoglucanos (mureína o mucopéptidos) que poseen. aquellos organismos que se tiñen de color azul/violeta son llamados Gram positivos (G+) y los que se colorean de rosado con la safranina Gram negativos (G-) Existen algunas variantes en relación con los colorantes y el alcohol a utilizar que deben tenerse en cuenta al poner en práctica esta tinción en el laboratorio. de limitarnos a realizar el procedimiento de tinción de manera pasiva como si fuese sólo una receta. ya que.CONSIDERACIONES ACERCA DE LA PRÁCTICA DE ALGUNAS TINCIONES EN MICROBIOLÓGICA Prof. ¿Qué protocolo (receta) seguir o elegir para hacerla? ¿Cuales condiciones de bioseguridad se necesita para preparar los reactivos sí son necesarios? ¿Existe un momento particular durante el curso del proceso infeccioso en el cual es útil la tinción? ¿Qué tipo de muestra se debe utilizar y la cantidad? ¿Cuál es el tipo de frotis/extendido apropiado para hacerla? ¿Cómo fijar la muestra a la lámina portaobjeto? ¿Cómo revisar el frotis y cuántos campos recorrer? ¿Dónde vamos a buscar lo que nos piden investigar? ¿Cómo se puede hallar lo que no se está buscando? ¿Cuándo descartarlas? ¿Cómo descartar estas láminas coloreadas? “La suerte favorece a las mentes lúcidas”…. TINCIÓN DE GRAM Fue desarrollada por el médico patólogo danés Hans Christian Joachim Gram en 1882 (publicado en 1884). Está basada en la diferencia de la composición de la pared celular de las bacterias. D. Lavar brevemente Contracolorear con safranina 10 segundos. Añadir agua. 100mL. 100mL) Con experiencia cualquiera de los tres da buenos resultados. Lavar brevemente. colocar una gota de aceite de inmersión y examinar con objetivo de 100X. pocos mililitros por vez y moler bien después de cada adición hasta lograr una solución. C. Los microorganismos Gram positivos se verán azul/violeta y los Gram negativos rosa/rojo. Guardar 24 horas antes de usar.COLORANTE DE GRAM A. Inundar el frotis con solución de iodo dejar reposar 1 minuto.0 mL Mezclar las soluciones A y B. Decolorar hasta que el solvente fluya incoloro del portaobjeto.5 g 100. Filtrar a través de papel directamente en la botella de colorante. Cristal violeta de Hucker modificado Solución A: Cristal violeta (certificado) 2 g Alcohol etílico 95% 20 mL Solución B: Oxalato de Amonio 0. Secar por absorción o al aire. Enjuagar la solución en un frasco de vidrio color ámbar con el resto del agua destilada.0 mL 10 mL 90 mL E. Decolorantes *Alcohol etílico 95%: el agente más lento *Acetona: el agente más rápido *Acetona-alcohol (1:1)l: intermedio (Alcohol etílico 95%. acetona. Lavar brevemente con agua corriente y drenar el exceso de agua.8 Agua destilada 80. Procedimiento de coloración Cubrir el frotis con un chorro de la solución de cristal violeta dejar reposar 1minuto. Iodo de Gram Iodo 1g Ioduro de potasio 2g Agua destilada 300 mL Mezclar el iodo seco y el ioduro de potasio en un mortero. 19 . Lavar brevemente con agua corriente y drenar el exceso de agua. Contra colorante Solución stock Safranina O (certificada) Alcohol etílico Solución de trabajo Solución stock Agua destilada 2. B. Los microorganismos Gram positivos se verán azul/violeta y los Gram negativos rosa/rojo. Procedimiento de coloración Colorear con cristal violeta durante 2 minutos. Streptomyces y Corinebacterium tienen ácidos micólicos de cadena corta y son parcialmente acido alcohol resistentes. de manera que los denominados ácido alcohol resistentes se colorean de color fucsia y el fondo se tiñen con el colorante de contraste azul. Agregar la solución de violeta al filtardo. Basada en la composición de la pared de algunos microorganismos que contiene ácidos micólicos (ácidos grasos de cadena larga (50-90C) con múltiples uniones cruzadas.5 g/100 mL de alcohol de 95%) Agua 10 mL 90 mL D. Enjuagar la solución en un frasco de vidrio color ámbar con el resto del agua destilada. Las bacterias del género Micobacterium y los parásitos coccidios como Cryptosporidum sp son acido-alcohol resistentes. Iodo de Gram Iodo 1g Ioduro de potasio 2g Agua destilada 300 mL Mezclar el iodo seco y el ioduro de potasio en un mortero. Otros géneros de bacterias como Nocardia. Lavar y secar Decolorar con alcohol de 95% durante 30 segundos. Añadir agua. los cuales tienen la particularidad de hacerlas resistentes a la mezcla ácido-alcohol por lo que retienen el colorante de Zielh. Esta tinción utiliza fucsina fenicada.Coloración de Ziehl-Neelsen. bacteriólogo y Friedrich Neelsen. patólogo. C. B. Safranina Safranina. Filtrar a través de cuatro capas de papel humedecido con agua. Lavar y secar Aplicar iodo Gram 1 minuto. solución alcohólica saturada 114 mL Agitar la anilina y el agua en un recipiente cerrado hasta que se mezclen. pocos mililitros por vez y moler bien después de cada adición hasta lograr una solución. TINCIÓN DE ZIELH NEELSEN Esta coloración fue descrita por dos médicos alemanes Franz Zielh. Lavar Contracolorear con safranina 30 segundos y secar. que requiere el calentamiento de la muestra para 20 . solución alcohólica saturada (unos 2. hay dos procedimientos que emplean este compuesto: . Solución de anilina-violeta en cristales Anilina 40 mL Agua 1L Violeta cristalino.COLORANTE DE GRAM PARA ACTINOMICETOS Y OTRAS BACTERIAS A. Solución de fuscina fenicada de Zielh *Solución A: fucsina básica 3g alcohol etílico 95% 100mL tritura la fucsina básica en un mortero hasta pulverizarla luego ir agregando el alcohol *Solución B: Fenol fundido 5 mL Agua destilada 95 mL Mezclar 10 mL de la solución A con 90 mL de la solución B B. Solución de Alcohol Acido: Decolorante Acido clorhídrico (conc) 3 mL Alcohol etílico 95% 97 mL C. Secar al aire. 20 mL.fijar la fucsina a los lípidos de la pared celular. añadir fenol y el agua.3 g 100 mL D. 100 mL Disolver la fucsina en alcohol. cristales de fenol 8 g. Contracolorante Solución stock de verde de malaquita 21 . Decolorante 3 mL de HCl concentrado en 97 mL de alcohol etílico 95% C. COLORACIÓN ACIDÓFILA DE KINYOUN PARA MICOBACTERIAS A. Contracolorante Azul de metileno hidrosoluble Agua destilada 0.Coloración de Kinyoun. en agua destilada. evitando el calentamiento. Contracolorear con azul de metileno 1 minuto. Lavar. COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN. B. manteniendo la lámina siempre cubierta con colorante y vapores. Carbolfucsina de Kinyoun Fucsina básica 4 g. A. que aumenta la concentración de fucsina básica y de fenol. Lavar con agua corriente Decolorar en varias porciones sucesivas hasta que no aparezca más color (±2min o más) Lavar con agua corriente. alcohol 95%. . Procedimiento de coloración Cubrir con carbolfucsina calentar por 5 minutos hasta la emisión de vapores. Teñir con carbolfucsina 3 minutos.Verde de malaquita 4g y 50 mL de alcohol 95% Solución de trabajo de verde de malaquita Solución stock de verde de malaquita 20 mL Agua destilada 180 mL D. Lavar con agua. Filtrar antes de usar. Cubrir con azul de metileno 30 segundos. Taponar fuertemente. Dejar sedimentar toda la noche en campana de desecación para prevenir absorción de humedad. Almacenar durante 2 semanas. Enfriar y agregar el alcohol metílico. el primero tiñe los componentes ácidos como el núcleo y el ARN y el segundo la eosina tiñe los componentes básicos. 22 . La coloración de Giemsa es útil en el diagnóstico de infecciones causadas por microorganismos de diversos géneros como Histoplasma (hongo). Lavar suavemente. mezcla de azul de metileno y eosina. Chlamydia (bacterias) y Plasmodium (parásitos). Procedimiento de coloración Cubrir con carbolfucsina por 3 minutos sin calentar. Decolorar 5 a 10 segundos con ácido-alcohol.5% en alcohol etílico 95% como contracolorante. mantener esa temperatura durante 1 ½ a 2 horas. como la hemoglobina de rojo. TINCIÓN DE GIEMSA Solución madre de colorante de Giemsa Polvo de Giemsa (puro) 0. escurrir y TINCIÓN DE GIEMSA Algunos microorganismos son diagnosticados en sangre periférica y/o medula ósea razón por la cual son útiles en microbiología los colorantes de Romanoswki. COLORANTE ACIDÓFILO DE KINYOUN PARA ACTINOMICETOS Las soluciones son las mismas ya descritas excepto que se usa azul de metileno 2. Mezclar. Borrelia.5 g Glicerol (c. agregar lentamente el colorante en polvo agitando. Repartir en frascos de 30 mL. sin calor. Lavar. Erlichia. La tinción popular Romanoswki es conocida como MayGruenewald-Giemsa. Secar al aire.p) 33 mL Alcohol metílico 33 mL Preparación Calentar el glicerol a 55° C. lavar con suavidad con agua corriente Decolorar con alcohol ácido hasta que no aparezca más color (±2min) Contracolorear con verde de malaquita por 30 segundos. Lennette y cols. Gutiérrez J. Morse S y Mieetzner T. Procedimiento: Fijar la lamina del extendido con metanol. REFERENCIAS: Brooks G..Solución de trabajo 2 gotas de policromato por cada mL de agua. (1982). (2007). OMS. Davis B. 25° ed. Campos A. Ginebra. Laboratorios Bristol de Venezuela. Mc Graw-Hill. Editorial Panamericana. Cooperativa editorial Magisterio.3°ed. Análisis Microbiológico del Agua: Laboratorio Virtual y casos prácticos. Mc Graw-Hill. Esbozo histórico. Salvat. Gram. 3° ed. (2005). Buenos Aires. Melnick y Adelbert. 23 . Microbiología Médica. (2005). Crocker J y Burnett. Jawetz. Presentado en: I Congreso Venezolano de Patología Clínica y IV Congreso Venezolano de Microbiología.J. Médico que marco época con su famoso método de coloración. Hans C. Curso Virtual. Eisen H. Tratado de Microbiología. Lavar y dejar secar. (2006). Carrol K. 3° ed. Dejar secar Colorear con policromato (giemsa) por 20 minutos. Pensamiento Crítico. Ginsberg H. La ciencia del diagnóstico del laboratorio. Universidad de Salamanca. (1986). Microbiología Médica. 2° ed. Chordi A (comp).. (1984). Dulbecco R. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Bogotá. Técnicas para su desarrollo. (2010). MEDIOS DEFINIDOS O SINTÉTICOS: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en selectivo. de parte de órganos o tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. En ellos no se conocen todos los componentes. CONSTITUYENTES HABITUALES DE UN MEDIO DE CULTIVO AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. Usualmente contienen una o más 24 . Generalmente se usan en trabajos de investigación. PEPTONAS se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales. (a) María Chacón zoiret. SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisódicos y bipotásicos) se utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal. éstos se clasifican en: MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular.com MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes. EXTRACTOS son concentrados en polvo. INDICADORES DE pH son indicadores ácido-base con el objeto de detectar variaciones de pH. deshidratado. AGENTES REDUCTORES se añaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.chacon@gmail. De acuerdo al uso del medio de cultivo.PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS EMPLEADOS EN MICROBIOLOGÍA Prof. las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se añaden a los medios de cultivo porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos microorganismos exigentes. Son muy ricas en péptidos y aminoácidos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. MEDIOS DIFERENCIALES: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Los medios de cultivo que no poseen agar ni gelatina se pueden disolver en agua fría o bajo ligero calentamiento. Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: 1. 3. Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada. se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Después se incorpora la cantidad de agua restante. 25 . Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada con el propósito de eliminar totalmente eventuales residuos de otras sustancias. En el caso de los medios de cultivo que no deben ser sometidos a ulterior esterilización en autoclave es imprescindible prestar atención a su disolución completa. Los medios de cultivo que poseen agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolución. Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad y cuya reacción sea lo más cercana posible a pH neutro. Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos. 6. 4. MEDIOS SELECTIVOS: son parecidos a los de enriquecimiento. Los recipientes destinados a la preparación de medios de cultivo deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepare pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. 8.sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar. 2. además de simplificar el trabajo. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se añade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea. 9. 5. 7. 10. Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque. aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial. La absorción de agua produce cambios de pH. ni otra fuente de calor o vapor.11. en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo (excepto placas de Petri). decoloraciones del polvo. Si las normas de preparación no indican otra cosa. viscosa. ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO Antes de su esterilización. a 121 °C. perjudican la calidad del medio de cultivo. llenos con medio de cultivo esterilizado. Puede reconocerse que ha alcanzado la disolución completa cuando. durante 15 min. hornos. resbala libremente. lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados. Previamente hay que remover bien el medio de cultivo haciendo oscilar en sentido circular su recipiente. la esterilización se lleva a cabo en autoclave. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado. se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. Y una superficie inclinada de iguales dimensiones. ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante.. al agitar. El medio se deja solidificar en la posición inclinada. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°C). de tal forma que se genere una capa de aproximadamente 3 cm. por ejemplo. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz. con tapa de baquelita o con tapa de algodón. no se adhiere a la pared interna del recipiente partícula alguna de agar y la solución. Sin embargo. debe agregarse en ellas el medio de cultivo a una temperatura de 45-55°C. formación de grumos. todavía líquido. TUBOS DE AGAR INCLINADO Los tubos de ensayo. Temperaturas más altas y calentamientos más prolongados de lo previsto. con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los 26 . se colocan en una posición inclinada. etc. es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones más pequeñas. para asegura la distribución uniforme de dicho medio. o por periodos mayores a 12 -15ºC. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan “abanicando” brevemente la superficie con la llama no luminosa del mechero de Bunsen. VERTIDO EN PLACAS Para evitar la formación de gotitas de condensación de agua en la tapa de las placas de Petri. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón. Otro punto importante a tomar en cuenta. Envase mal cerrado Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de la fecha de vencimiento Turbidez. precipitación Turbidez en el medio que provoque observaciones deficientes. etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.mismos. se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). Por lo general. en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas (apariencia. es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad. es posible su conservación durante 1 a 2 semanas a temperatura ambiente. pH. son consideradas defecto Agua insuficientemente desionizada Recipientes sucios pH incorrecto o desajustados Sobrecalentamiento durante la preparación Ocasionado por el material de muestra Perdida de agua por evaporación en el medio de cultivo preparado Punto de solidificación Excesiva proporción del medio de cultivo demasiado elevado deshidratado Agar inadecuado Escasa estabilidad del gel Insuficiente proporción del medio de cultivo deshidratado No se disolvió completamente el medio de 27 . Posibles defectos en la preparación y manipulación de los medios de cultivo Almacenamiento de los Conservación en atmósfera excesivamente medios de cultivo húmeda deshidratados El envase permaneció abierto demasiado tiempo El envase no fue adecuadamente cerrado después de su uso El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de la fecha de vencimiento Desviación del valor de pH Agua NO neutra. (nunca por debajo de 0ºC porque se destruye la estructura del gel). en el agua de preparación. pigmentos alterados. en el caso de medios que contengan indicador de pH Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación. azúcar caramelizado El recipiente donde se preparó no estaba lo suficientemente limpio Esterilización insuficiente Contaminación accidental posterior a la esterilización. uso de tubos o placas no estériles o contaminadas Residuos de sustancias inhibidoras de crecimiento en los recipientes de preparación de cultivos. en el material de ensayo Gérmenes alterados en el material de ensayo pH incorrecto Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparación En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados En el caso de medios de cultivo mezclados: adición de la muestra efectuada a temperatura demasiado elevada Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparación. En caso de cultivos confeccionados por el usuario. con la consiguiente destrucción de sustancias inhibidoras selectivas En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados Medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo Superficie del medio de cultivo demasiado húmeda 28 . cantidad de agar escaso o inadecuado Valor erróneo de pH. debido a impericia en el vertido de placas. en su recipiente de preparación. cuando fue vertido a las placas. en los casos de pH demasiado bajos No se agitó lo suficiente el medio.Desviación del color Medios de cultivo (listos para su uso) contaminados Crecimiento demasiado pobre de gérmenes Crecimiento demasiado intenso de gérmenes Colonias inconcretas o desleídas cultivo deshidratado Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparación. lo que da lugar a: Medio de cultivo oscuro. 29 . o defectuosamente preparado El medio de cultivo deshidratado está muy pasado de la fecha de vencimiento El medio de cultivo utilizado ha permanecido almacenado durante tiempo excesivo. en química. Esta clasificación viene dada en el envase del reactivo y depende del tratamiento que se le haya dado. denominadas productos de reacción o simplemente productos. detergentes). por tratarse del concepto de reactivo la clasificación más adecuada en este caso sería la de características de su uso. exactitud y error absoluto que se ha de tener en la operación química a realizar. Sin embargo.Crecimiento atípico Superficie del medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparación. dependiendo de si son reactivos sólidos o líquidos. características del uso del reactivo. de su pureza que determina el uso químico que se le va a poder dar. PREPARACIÓN DE REACTIVOS LÍQUIDO Para preparar un reactivo hay que contar con el protocolo y asegurarse de tener todos los detalles relativos a la elaboración del reactivo. los reactivos se pueden clasificar según muchas variables: propiedades físico-químicas. Se utilizan diferentes métodos para preparar reactivos. toda sustancia que interactúa con otra en una reacción química que da lugar a otras sustancias de propiedades. de su riqueza. envejeciendo o deteriorándose Condiciones de cultivo no conforme con las normas Residuos de sustancias extrañas: en los recipientes de preparación o de cultivo (por ejemplo. con la consiguiente destrucción de sustancias inhibidoras selectivas Medio de cultivo erróneo. teniendo en cuenta la precisión. en el agua o material de ensayo REACTIVOS QUÍMICOS Un reactivo es. características y conformación distinta. según la cual se clasifican en el uso al que están destinados los reactivos. el grado de agua u otro disolvente requerido. reactividad en reacciones químicas. por ejemplo. Por tratarse de compuestos químicos. Muchos reactivos requieren de un calentador y/o un agitador magnético para ayudar a disolver los productos químicos.htm 30 . los compuestos químicos necesarios e instrumentos de medida. Dulbecco R. Etiquetar los frascos con el nombre del reactivo. Salvat. Completar cada paso del proceso de mezclar el reactivo antes de pasar a la siguiente etapa del proceso. Eisen H. balanza. REFERENCIAS Davis B.uv. 3° ed.Tratado de Microbiología. Esto incluye material de vidrio de tamaño adecuado para contener la cantidad de los reactivos a preparar. Documento en línea: http://www.es/gammmm/Subsitio%20Operaciones/2%20REACTIVOS. vasos precipitados. cilindros. Manual de medios de cultivo MERCK. las concentraciones de los reactivos son tan bajas que se debe preparar una solución de mayor concentración que luego se dluye a una menor concentración antes de que esté terminada. 1994 Reactivos. pipetas. Realizar la dilución final del reactivo hasta el final para obtener la concentración correcta. la concentración y la fecha en que se preparó. A menudo. Ginsberg H.Buscar todos los implementos necesarios para preparar el reactivo. por ejemplo. Guías multimedia del Gamm. Universitat de Valencia. (1984).