V IBEROLABGESTIÓN INTERNA DE LAS CEPAS UTILIZADAS COMO MATERIAL MICROBIOLÓGICO DE REFERENCIA EN UN LABORATORIO DE SERVICIOS ACREDITADO BAJO NORMA ISO/IEC 17025 R. J. Toselli1, M. Der Ohannesian1 y G. Cheminet1 1 Centro de Química Aplicada (CEQUIMAP) – Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba. Medina Allende y Haya de la Torre – Ciudad Universitaria. 5000 Córdoba, Argentina; e-mails:
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[email protected] RESUMEN. La validación, verificación e inclusión de controles positivos y negativos en las pruebas de tipificación en los ensayos microbiológicos requieren la utilización de cepas estándar de control de calidad que constituyen un material de referencia. El objetivo de este trabajo es presentar un modelo de gestión de dicho material que incluye su categorización en cultivos stock, semi-stock y de trabajo, los registros asociados y las pruebas de control de calidad que sobre ellos se efectúan. 2.- Categorización de los cultivos de las cepas de referencia Cultivo stock: Representa el verdadero banco de cultivos. Se mantiene en un sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica para evitar su potencial mutación. Uno de los métodos empleados en la conservación del cultivo stock es el ultracongelamiento a 80 ºC. En estas condiciones la cepa puede conservarse por largos períodos de tiempo. En el cultivo stock se definen dos grupos: -Cultivo “Stock A”: Es el cultivo stock de referencia. Este sólo se utilizará en casos de extrema necesidad. -Cultivo “Stock B”: Cultivo que se utiliza para generar un cultivo intermedio o semi-stock. Cultivo semi-stock: Es un cultivo que se mantiene durante un período de tiempo intermedio entre el cultivo stock, relativamente permanente y el cultivo de trabajo. Entre los métodos disponibles para preparar el cultivo semi-stock, el más práctico es el de congelamiento a -20 ºC. Este método permite la sobrevivencia de la cepa en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos 6 a 12 meses. En el cultivo semi-stock, al igual que en el stock, se definen dos grupos: -Cultivo “Semi-stock A”: Es el cultivo semistock de referencia que sólo se utilizará en casos de suma necesidad, garantizando de este modo que la cepa sufra la menor cantidad de modificaciones genéticas posibles. -Cultivo “Semi-stock B”: Cultivo que se utiliza para generar los cultivos de trabajo. Cultivo de trabajo: Es el cultivo control que se usa para el trabajo de rutina. El método de conservación empleado para este cultivo es el de refrigeración entre 1 y 4 ºC. El cultivo de trabajo se conserva durante un tiempo variable según el criterio de cada laboratorio. 1.- Introducción La validación y verificación de los procedimientos microbiológicos, como así también la inclusión de controles positivos y negativos en las pruebas de tipificación de ensayos microbiológicos de rutina, requieren la utilización de cepas estándar de control de calidad que constituyen un material de referencia. Existen varias colecciones internacionales de cepas utilizables como por ejemplo: ATCC (USA), NCIC (Inglaterra), JFCC (Japón), CCTM (Francia), RIA (Rusia), NCIB (Escocia) y DSM (Alemania). El procedimiento utilizado por un laboratorio para el mantenimiento y la conservación de las cepas de referencia, debe garantizar la sobrevivencia de las mismas con un mínimo de mutaciones, para lo cual, el crecimiento de los microorganismos y el número de repiques efectuados con ellos deben ser mínimos. Así, el proceso de gestión de las cepas estándar de referencia, que se utilizan en un contexto de control de la calidad en un laboratorio de microbiología, debe asegurar que dichas cepas mantengan sus características típicas y un comportamiento estable. El objetivo de este trabajo es presentar un modelo de gestión del material microbiológico de referencia, tal como se lleva a cabo en el Laboratorio de Microbiología de CEQUIMAP, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. Esta institución presta servicios a terceros desde hace más de 25 años y está acreditada bajo Norma IRAM 301:2005 (ISO/IEC 17025:2005). 3.- Reconstitución y multiplicación de las cepas de referencia Cuando el laboratorio adquiere una cepa de referencia, el ingreso de la misma se asienta en un registro específico del Sistema de Calidad cuyo formato se presenta en la Fig. 1. 1 2) De un cultivo “Semistock B” se toma en condiciones asépticas una ansada y se estría en un tubo en pico de flauta con agar nutritivo.R. Los controles de pureza y viabilidad en el material microbiológico de referencia se llevan a cabo cada vez que 2 . Fig. En los rótulos deben especificarse los siguientes datos: identificación de la cepa. El cultivo semi-stock se guarda en freezer a -20 ºC durante un tiempo máximo de un año.Preparación de los cultivos stock. y al cabo de ese tiempo se guardan en el refrigerador. caldo tripteína soya. etc. Fig. caldo tripteína soya. 4. Esta suspensión se homogeniza bien y se dispensa asépticamente en tubos Eppendorf o tubos para crioconservación estériles. Los tubos que constituyen el “Semi-stock B” se utilizan para generar los cultivos de trabajo. Estos deben llenarse hasta dos tercios de su capacidad para minimizar los riesgos de contaminación cuando sean manipulados. al. 2) En condiciones asépticas y con un ansa estéril se toman varias colonias de las obtenidas en el proceso de reconstitución y se suspenden en 50 mL de caldo de cultivo apropiado (caldo cerebro corazón. El cultivo de trabajo se conserva durante el período que el laboratorio crea conveniente. De un cultivo “Stock B” se toma en condiciones asépticas una ansada y se estría en un tubo en pico de flauta con agar nutritivo. tiende a garantizar la trazabilidad de las cepas de referencia. Los tubos rotulados como “Semi-stock A” constituyen el material de reserva. Los tubos inoculados se incuban durante 24-48 h a 37 ºC. La mitad de los tubos se rotula con la letra “Semi-stock A” y la otra mitad con la letra “Semi-stock B”. fecha de realización del cultivo de trabajo y fecha prevista para su disposición final. Los tubos que constituyen el cultivo stock se guardan en freezer a -80 ºC. De este modo. 4.3 Cultivo de trabajo La preparación de este cultivo debe asentarse en el registro correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. La suspensión se homogeniza bien y se dispensa asépticamente en tubos Eppendorf o tubos de crioconservación estériles.2 Cultivo semi-stock La preparación de este cultivo debe asentarse en el registro específico.1. dependiendo de la frecuencia de uso del mismo. La mitad de los tubos se rotula con la letra “Stock A” y la otra mitad con la letra “ Stock B”. A partir de este tubo se hace una suspensión en 50 mL de un caldo de cultivo apropiado (caldo cerebro corazón. Gestión interna de las cepas utilizadas como material microbiológico de referencia en un laboratorio de servicios acreditado bajo Norma ISO/IEC 17025. Formato del registro de generación de cultivos stock.) con glicerol al 20%.. Los tubos “Stock A” constituyen un banco de cepas de reserva las cuales se conservan durante años bajo condiciones de ultracongelamiento. fecha de realización de cultivo semi-stock y fecha prevista para la disposición final. agar tripteína soya ó agar cerebro corazón y se incuba 24-48 h a 37 ºC. correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. la elección del medio de cultivo y las condiciones de trabajo que se utilizan para reconstituir una cepa y obtener a partir de ella un cultivo stock. estéril. Estos deben llenarse hasta dos tercios de su capacidad para minimizar los riesgos de contaminación durante la manipulación. Formato del registro de ingreso de cepas de referencia También se archivan los certificados e instructivos que acompañan a la cepa de referencia. 2). 4. hasta obtener una suspensión visiblemente turbia. tipo y número de colección.Controles de pureza y viabilidad. se realiza según las especificaciones que brinda el proveedor de la misma. fecha de realización de cultivo stock y la fecha prevista para la disposición final. hasta obtener una suspensión visiblemente turbia. tipo y número de colección. tipo y número de colección... La centralización de toda esta información correspondiente a cada microorganismo adquirido por el laboratorio. Toselli et. correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. Los tubos “Stock B” se utilizan para preparar los cultivos semi-stock. número de lote.) con glicerol al 20%. semi-stock y de trabajo 4. número de lote. semistock y de trabajo para las cepas de referencia 5. etc. En los rótulos deben especificarse los siguientes datos: identificación de la cepa. estéril. agar tripteína soya o agar cerebro corazón y se rotula con los siguientes datos: identificación de la cepa. 2.1 Cultivo stock La preparación de este cultivo debe asentarse en el registro específico. número de lote. 4 ºC : Registros Fig. 5.. Modelo de gestión de cepas de referencia en un laboratorio de microbiología. Con el cultivo obtenido se evalúan los siguientes parámetros: -Viabilidad: se determina observando si hay crecimiento o no en la placa al cabo del tiempo de incubación. Se incuba a la temperatura y durante el tiempo específico para cada medio y se observan las características de las colonias. Rev. Las Fig. IRAM 301:2005 (ISO/IEC 17025: 2005): Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración. correspondiente al Sistema de Calidad (Fig. coli Bibliografía CGA-OAE-LE-MICRO. La fecha de descarte de los cultivos debe asentarse en el registro específico. -Pureza: se observa si las colonias que desarrollaron en la placa tienen las mismas características macroscópicas. 4. Adquisición CEPA DE REFERENCIA Reconstitución según instrucción proveedor Suspensión cultivo en caldo con glicerol al 20% Cultivo Cultivo STOCK B -80 ºC Cultivo SEMI-STOCK B -20 ºC A B STOCK A -80 ºC A Cultivo SEMI-STOCK A B -20 ºC Pruebas viabilidad y pureza Cultivo DE TRABAJO 1 . 2). agar cerebro-corazón o agar tripteína soya y se incuba 24-48 h a 37 ºC. 2004. -Tinción de Gram: Esta se realiza no sólo para verificar el comportamiento la cepa frente a esta técnica de tinción. 5. semistock y de trabajo deben descartarse. Formato del registro de control de pureza y viabilidad de una cepa de Salmonella enteritidis. 0. Section 9020: Quality assurance/Quality control. puede sintetizarse en el diagrama de flujo presentado en la Fig. SMW&W-APHA-AWWA-WEF: 2005. previa inactivación en autoclave. Toselli et. Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos. Fig. 3. en la fecha de disposición final prevista en cada caso. 6. Los resultados obtenidos en los controles de pureza y viabilidad de cada una de las cepas se asientan en un registro diseñado para tal fin. -Características de las colonias en medios selectivos y/o diferenciales: de la placa con agar nutritivo. respectivamente.Disposición final de los cultivos de referencia Los tubos que contienen los cultivos stock. Gestión interna de las cepas utilizadas como material microbiológico de referencia en un laboratorio de servicios acreditado bajo Norma ISO/IEC 17025. Part 9000: Microbiological Examination. la gestión de los microorganismos de referencia utilizados en el laboratorio de microbiología.R. Fig. sino también para detectar una eventual contaminación. agar cerebrocorazón o agar tripteína soya se toman con el ansa en condiciones asépticas colonias aisladas y se estrían en distintos medios selectivos y/o diferenciales apropiados para cada cepa. como son Escherichia coli y Salmonella enteritidis. al. se estría sobre una placa con agar nutritivo. En función de todo lo expuesto anteriormente. se genera un cultivo semi-stock y de trabajo. Formato del registro de control de pureza y viabilidad de una cepa de E. 3 y 4 muestran a modo de ejemplo el formato del registro de las pruebas de pureza y viabilidad para dos bacterias representativas. 3 . Del cultivo a ser evaluado se toma en condiciones asépticas una ansada.