Disciplina: Docente: Dicente: Data: UNIVERSIDADE DE CAXIAS DO SUL - CCET Mestrado em Engenharia e Ciência dos Materiais Caracterização e avaliação de materiais por espectroscopia 30 junho de 2015 LISTA DE EXERCÍCIOS SOBRE FLUORESCÊNCIA 1. Por que a fluorimetria é potencialmente mais sensível que a espectrofotometria? Discuta detalhadamente a sua resposta. Aspectos sobre Fluorimetria Segundo Skoog, West, Holler e Crouch (2013)1, para espectroscopia por fluorescência, a intensidade da radiação fluorescente F produzida pelo analito é proporcional à intensidade do feixe de excitação absorvido pelo sistema. Podemos observar segundo a equação 1. F = K '.(P0 − P) ! (1) Sendo P0 a intensidade do feixe incidente sobre o analito e P sua intensidade após percorrer um determinado comprimento no meio. Na equação 2 podemos relacionar o comprimento do meio b, a constante de dependência da eficiência quântica de fluorescência K’, a concentração o analito c e a absortividade €. P = 10 −∈.b.c ! P0 (2) A equação 3 relacionando com a equação de Lambert-Beer para determinar a concentração c a partir da intensidade de radiação fluorescente F. −∈.b.c ) ! F = K '.P0 .(1− 10 (3) Aspectos sobre Espectrofotometria Em comparação com a absorvância, Skoog, West, Holler e Crouch (2013) 2 acrescenta que esta é independente da intensidade do feixe, sendo a absorvância medida sempre proporcional à razão das intensidades como podemos verificar na equação 4. ⎛P ⎞ c = k.A = k.log ⎜ 0 ⎟ ! ⎝ P⎠ ! (4) A equação 4 demonstra que não é possível aumentar a intensidade da absorvância aumentando a intensidade do feixe, já que teremos sempre uma razão entre as duas. Em adição, Skoog, West, Holler e Crouch (2013) 3 informam que a sensibilidade do sistema por fluorescência é cerca de três vezes maior quando comparado a espectroscopia de absorção 1 Skoog pg 786 (8th ed) 2 Skoog pg 786 (8th ed) 3 Skoog pg 783 (8th ed) contudo Skoog. A emissão da fluorescência se deve porque os processos de conversão interna e relaxação vibracional da figura 1b são muito mais rápidos quando comparados com o relaxamento da fluorescência da figura 1c. cruzamento de intersistema (kIS) e supressões que podem ocorrer em vários níveis de energia [kq(Q)]. Alguns tipos comuns de relaxação são descritos na figura 1. Cada estado eletrônico tem quatro níveis vibracionais. que apresenta 3 níveis eletrônicos de energia E1. E2 e o estado fundamental E0. A figura 1b representa a relaxação não radioativa. Na figura 1a. West. Figura 1 . que não apresenta radiação de fluorescência e na figura 1c ocorre a radiação da fluorescência que geralmente é observada de um estado eletrônico mais baixo E1 para o estado de eletrônico fundamental E0. Holler e Crouch (2013) Lakowicz (2006) 5 complementa que processos não radiativos competem com a radiação de fluorescência são apresentados na figura 2 e formulados na equação 5 são: conversão interna (kIC). West.Absorção e relaxação Fonte: Skoog. Holler e Crouch (2013)4 apresentam que algumas estruturas moleculares provêm caminhos de não emissão de radiação fluorescente na relaxação. ocorre a absorção de energia pela excitação da espécie com bandas de energia λ1 a λ5 e resulta na população dos cinco níveis vibracionais. Por que alguns compostos fluorescem e outros não? Comente.2. Principio da fluorescência pela troca de níveis eletrônicos Todas as moléculas absorventes poderiam radiar fluorescência. kF ! φF = k + k + k + k [Q] F IC IS q 4 Skoog pg 783 (8th ed) 5 Lakowicz pg 5 (4) . A fração ΦF é o rendimento quântico. Documento com Certificação Digital nº 0212136/CA 8 Skoog pg 786 (8th ed) Fonte: An Introduction to Fluorescence Spectroscopy . a fluorescência diminui com solventes contendo átomos pesados em sua estrutura.Processos radiativos de relaxamento os processos não radiativos sejam desprezíveis. Holler e Fonte: Diagrama de Jablonski (modificado de Lakowicz. Solventes com átomos pesados reduzem a emissão fluorescente Figura 3 . 2006). também define como a razão entre os fatos emitidos e os fótons absorvidos. 3. levando à maior probabilidade de relaxação colisional reduzindo a eficiência quântica da florescência. fluorescência e foto fosforescência. West. Skoog. 1-bromopropano ou 1-iodopropano? Explique. portanto. no solvente e a presença de outras espécies na amostra podem ter profundo efeito nas características de irradiação de florescência. Schulman (1977)7 acrescenta que alterações no pH. West. Skoog. rendimento quântico de fluorescência igual a 100%. Holler e Crouch (2013)8 acrescenta que uma diminuição na viscosidade do solvente acarreta ao aumento da frequência de colisões. 6 Skoog pg 785 (8th ed) 7 apud PUC RIO . isso quando o único mecanismo de relaxamento de níveis eletrônicos sendo o de radiação de fluorescência. Em adição. Crouch (2013)6 definem como rendimento quântico de fluorescência molecular como simplesmente a razão entre o número de moléculas que fluorescem e o número total de moléculas excitadas. A viscosidade do solvente tem influência na eficiência quântica da radiação fluorescente da solução. Em qual solvente a fluorescência do naftaleno deve ser maior: 1-cloropropano. na temperatura. Sumarizando. a fração ΦF tornasse igual a 1.Resolvendo a equação 2 para que todos Figura 2 .Absorção. estes solventes são utilizados quanto se desejam intensificar a radiação fotofosforecência. 973106 C3H7Br 1-iodopropano 169. o detector normalmente encontra-se disposto a 90º em relação à luz incidente? Fluorescência e sua irradiação para todos os lados Segundo Skoog.Abaixo foram ordenados de forma decrescente os solventes conforme a emissão de fluorescência.959229 C3H7I Fonte: ChemSpider 4. a intensidade de fluorescência emitida pela solução irradia em todos os ângulos. na maioria dos florímetros.Equipamento típico de fluorescência (2013)9. Skoog. Holler e Crouch Figura 4 . Tabela 1 . o detector de fluorescência não irá receber interferência provindas da fonte excitadora. 9 Skoog pg 765 (9th ed) 10 Skoog pg 765 (9th ed) Fonte: Skoog .Comparativo da massa molar dos solventes Solvente Massa Molar [ Da ] Fórmula Molecular 1-Cloropropano 78. em ângulos retos. Porque. sendo que. West. West.023628 C3H7Cl 1-bromopropano 121. Holler e Crouch (2013) 10 acrescenta que na maioria dos equipamentos a leitura é realizada em 90º e caso o detector esteja em ângulo alinhado com a fonte. a radiação da lâmpada de xenon ( bulbo de mercúrio ) deverá ser descontado do espectro detectado. A equação de LambertBeer nos fornece condições matemáticas para que de forma comparativa. tendo cx como as concentrações e Vx o volume total da solução. será utilizada inicialmente a equação 5.10 mol/L suficiente para fornecer 500 mL de solução.5L solução (10) Portanto.8 ! (6) Desta forma. 33mg ! Cx = V 0. 288 = 1.664 g foi dissolvido em HCl 0. Uma alíquota de 15 mL foi então diluída a 100 mL com o ácido. Uma solução padrão de 100 ppm de quinino registrou a leitura de 180 quando medida sob condições idênticas àquelas da amostra diluída. devemos agora equacionar para verificar a quantidade de analito antes da dissolução. O quinino presente em um comprimido antimalárico de massa igual a 1. A equação 8 apresenta uma forma simples de resolução.10 mol/L. é necessário o uso da equação 10 e relacionar com os valores fornecidos.c ! (5) Resolvendo a equação com os valores temos a equação 6: 180 = K '. F = K '.5 nm forneceu uma leitura igual a 288 em uma escala arbitrária.5. m m soluto ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ →1. a massa de quinino presente no comprimido antimalárico de massa total 1. ou seja a constante da reta. Para a resolução matemática. ! c1 . ! c1 . é possível saber qual a massa de quinino no comprimido? Se não. é possível retornar a equação 5 com os valores do analito.8. mostre por meio de cálculos. .V1 = c2 .066.664g é 533. K’ é a constante proporcional de eficiência quântica do processo de irradiação fluorescente e c a concentração da espécie fluorescente. Com base nessas informações.33mg de quinino. tendo F como intensidade de fluorescência. Primeiramente é verificando a intensidade de fluorescência da solução para determinar a eficiência quântica do padrão.c ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ → c = 160 mg L ! (7) O valor encontrado na equação 7 se refere a solução diluída.664g que foi diluido em HCl 0. Lei de Lambert-Beer para determinar concentrações De acordo com os dados fornecidos é possível mensurar a quantidade de quinino. seja possível quantificar a concentração de analito na solução.V2 (8) Prosseguindo com a resolução a partir dos dados fornecidos temos a equação 9.100 m L ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ → c1 = 1. qual é esse valor em miligramas. A intensidade de fluorescência para a amostra diluída a 347.67 mg L (9) Para determinar a massa do quinino contida inicialmente no comprimido de 1.67 mg L = soluto ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ → msoluto = 533.066.100 mg L ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ → K ' = 1.15 m L = 160 mg L . por quê? Se sim. e posteriormente substituir pela intensidade de fluorescência da solução do analito. k a constante proporcional de eficiência quântica de irradiação de fluorescência.a. As intensidades de fluorescência das quatro soluções mais um branco foram as seguintes: Com base nessas informações. Vt o volume total.50 53. Introdução ao método de mínimos quadrados de regressão linear Skoog. A equação 11 apresenta a formulação matemática.0 mL. Exatamente 5.5 5. West. responda as seguintes questões: Tabela 2 .00.00 mL de uma solução contendo excesso do complexo da alizarina granada R ácida com alumínio (altamente fluorescente) foram adicionados a cada amostra e as soluções foram diluídas a 50. ou absorvância. Explique no que se baseia o método apresentado para a determinação de F. ou absorvância.cs + Vt Vt (11) Calcule. Holler e Crouch (2013)11. por mínimos quadrados. quando a concentração x é zero. Quatro amostras de água de 10. m a constante da reta.00 39. 1.4 Fonte: Professor a. Método de adição múltipla do padrão interno Segundo Skoog.6. ! y = m.na amostra.0 ppb de F-.0 5.50 mL de uma solução padrão de NaF contendo 10.7 5. 3.50. k.00 1.00 0. West. A equação 12 é apresentada como uma reta que melhor se ajusta as respostas aos ensaios experimentais.50 26.Vu .00 4. foram adicionados 0.Tabela de volumes e leituras em fluorescencia Amostra Padrão [ mL ] Leitura [ u. é possível quantificar o analito. !F= b. x é a concentração padrão do analito e b é onde intercepta o eixo das ordenadas.00 66. Vu o volume da solução de concentração desconhecida. ] 5.00 3. sendo cu a concentração desconhecida.x + b 11 Skoog pg 185 (9th ed) 12 Skoog pg 172 (9th ed) (12) . Holler e Crouch (2013)12 utilizam este método para determinar a curva de calibração na análise química quantitativa. quando é difícil ou praticamente impossível dividir a solução de analito.0 mL. Os valores de y referem-se aos dados de fluorescência. os parâmetros de regressão da equação linear relacionando o decréscimo de fluorescência e o volume de reagente-padrão.cu k.00 e 4. cs eVs são os valores da solução padrão. matematicamente.Vs . esta é então adicionada em soluções padrão de concentrações conhecidas e. De maneira pertinente a uma análise experimental. x (20) . As médias x e y são calculadas pelas equações 17 e 18 respectivamente. 15 e 16. Skoog.⎛ y − y_ ⎞ ⎯reajustando 2 2 SS = ⎯⎯⎯ → x y − ∑ ∑ ! xy ⎝ i ⎠ ⎝ i ⎠ N (14) (15) Sendo xi e yi valores conhecidos. Holler e Crouch (2013) 13 acrescenta que o método dos mínimos quadrados ( least-squares ) não é recomendado quando existem incertezas nos valores de x. podem ser utilizadas as técnicas de análise ponderada de mínimos quadrados ( weighted leastsquares analysis ). Holler e Crouch (2013). Para este caso. N ! SSresid = ∑ ⎡⎣ yi − ( b + mxi ) ⎤⎦ 2 (13) i=1 Skoog. 2 _ SSxx = ∑ ⎛ xi − x ⎞ ⎯reajustando ⎯⎯⎯ →∑ x 2 − ! ⎝ ⎠ 2 _ SSyy = ∑ ⎛ yi − y⎞ ⎯reajustando ⎯⎯⎯ →∑ y 2 − ! ⎝ ⎠ (∑ x ) 2 i N (∑ y ) (13) 2 i N ∑ xi . fornecidos pelo ensaio.∑ yi ⎛ x − x_ ⎞ . West. _ ∑ xi x ! = N (17) _ ∑ yi y = ! N (18) Por fim. simplifica a equação com a resolução das equações 14. Sxy m = ! Sxx _ ! 13 Skoog pg 173 (9th ed) (19) _ b = y− m. West. os valores m e b são calculados com as equações 19 e 20 respectivamente. Equacionamento de mínimos quadrados de regressão linear A equação 13 apresenta o cálculo necessário. 63 2202. Padrão [ mL ] xi Leitura [ u.40 20.00 185.34 316.VF − + 66.00 4 4. minimizando erros de arredondamento.80 -8.25 904.00 66.96.51.51 Fonte: autor Finalizando.96.70 2.80 Soma 9.50 53. (21) Calcule a concentração de F.96 118.96 66.50 9497. Método de adição múltipla do padrão interno Skoog.Tabela de valores da ordenada e abcissa Unid.35 98. A equação 11 juntamente com a equação 12 provinda da lei de Lambert-Beer pode ser reajustada e apresentada conforme a equação 22.25 46.25 2883.x + b ⎯⎯⎯⎯ c. Tabela 3 .00 39.35 5. a equação 21 apresenta os resultados sumarizados.V x (22) Tendo os valores de cx como a concentração do analito a ser analisada.00 4395.Para realizar os cálculos foi desenvolvida a tabela 3. West.00 9.846 ppb de F − x ! −8.00 117.30 0.69 80.5 mL 14 Skoog pg 729 (9th ed) (23) . b.05 -100.00 2 1. cs a concentração da solução padrão conhecida e Vx o volume da solução do analito. contudo o programa calculou com todas as casas decimais que o convém.50 26. resolvendo → F = −8. ] yi xi2 yi2 xi2yi2 1 0.00 1521.na amostra em ppb.35 Média 2.51 ! y = m.78 Sxx Syy Sxy m b 11.cs ! cx = m.55 3 3.25 696. b e m os valores da reta da equação 21. Reajustando os termos temos a equação 23 resolvida.40 31.a. Os valores apresentados com duas casas decimais foram arredondados.10 ppb resolvendo c = ⎯⎯⎯⎯ → cx = −14.69 0. Holler e Crouch (2013) 14 apresentam uma resolução matemática simplificada para a determinação quantitativa de analito no método de adição interna. 66. 3.Devido a fluorescência do analito reduzir com a adição do analito.V 2 T 1 x (24) Resolvendo a equação. A1 .846 ppb de F-.4. não há como verificar a linearidade com apenas dois pontos.955 ppb de F-. West. Desta forma. podemos determinar a concentração de F.5 mL ⎯resolvendo ⎯⎯⎯ → cx = −14. 4.cS..do analito. Em adição. 15 Skoog pg 732 (9th ed) 16 Skoog pg 732 (9th ed) . Holler e Crouch (2013)16 afirmam que o cálculo utilizando a equação 24 é em sua essência mais arriscado quando comparado pelo cálculo com a utilização de múltiplos pontos. contêm uma deferência de 0.5 mL − 66.955 ppb F − 26. 3. West. o valor deve ser invertido em seu sinal resultando em 14.10 ppb. portando. com a aplicação de apenas duas medidas da adição de padrão interno. apesar de próximos. pois no primeiro caso.5 mL Retificando. isto ocorre devido o primeiro cálculo ser realizado a partir do equacionamento dos mínimos quadrados da regressão linear e o segundo cálculo utilizando apenas dois pontos.VS ! cx = A . dependendo fortemente da consistência do experimento que resultou nestes pontos.V − A . Skoog. para a resposta devemos inverter o sinal. Skoog. temos na equação 21 a constante da reta negativa. o valor final da concentração é de 14. Holler e Crouch (2013) 15 apresentam que o cálculo pode ser realizado utilizando a formulação da equação 24.109 ppb de F. (25) Os resultados. ! cx = 66. WEST. SKOOG. Practical Fluorescence. NIEMAN. Disponível em: <http://books. F.. Modern Analytical Chemistry.University of Maryland School of Medicine Baltimore. 938 p. Douglas A. Princípios de análise instrumental.ed. ed. 36 p. James. New York: Marcel Dekker. RS: Bookman. xv. LAKOWICZ. An Introduction to Fluorescence Spectroscopy.br/books? id=7eI3AVl4dDsC&pg=PA199&lpg=PA199&dq=Al-acid+Alizarin+Garnet+R +complex&source=bl&ots=0bSJKNDVj_&sig=vKTswNwkgfe1gM3CDext90EZdmI&hl=ptBR&sa=X&ei=8LWxU_-8LsjjsASSjIJ4&ved=0CBwQ6AEwAA#v=onepage&q=Al-acid Alizarin Garnet R complex&f=false >. Principles of Fluorescence Spectroscopy. ed.uci. Acesso em: 29 jun. USA..com. George G.: PerkinElmer.chem. xv. 840 p. 2013. SKOOG.aspx?q=1-1-bromopropane>.). Disponível em: http://www.google. 2013. Joseph R.th. 2000. 824 p. 2.chemspider.pdf. New York: McGraw-Hill.com/Search. 2000. Porto Alegre. Princípios de análise instrumental.REFERÊNCIAS GUILBAULT. 8. 798 p. Acesso em: 01 jul 2015. (Ed. Springer 2006. 2015. 1091 p. USA: Sengage. ___________.edu/~dmitryf/manuals/Fundamentals/Fluorescence %20Spectroscopy. Maryland. CROUCH. United Kingdom. 2. HOLLER. Belmont. 3. CHEMSPIDER. David. 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