Lista de Exercícios para a P1 de EB-I 2016Introdução 1.1.) Purificação da Eritromicina Vocês são os engenheiros responsáveis pela produção e purificação da eritromicina Figura 1.1. Figura 1.1. Estrutura química da Eritromicina. Considerando a informação sobre a eritromicina disponibilidade pelo Merck Index, indique quais devem ser as operações unitárias para se proceder ao isolamento e purificação deste antibiótico? 1.2.) Purificação da Eritromicina A difusividade de uma proteína com um raio Stokes-Einstein de 2 nm em água é de 4.5 x 10-11 m2/s. Qual será difusividade de uma outra molécula com o dobro do raio StokesEinstein no mesmo líquido à mesma temperatura? tendo sido determinado a energia necessária para reduzir diferentes tamanhos da mesma massa de material: Média do raio inicial (microns) 6 Média do raio final (microns) 5.5 2. .7 4 3.5 20. 2.Rompimento Celular 2.8 5 4. A concentração do produto liberado na solução foi medida durante o processo: Tempo (s) 60 120 Concentração (mg/mL) 3.2.) Rompimento celular de leveduras por Sonicação Uma batelada de leveduras celulares foi rompida utilizando sonicação para liberar os seus produtos intracelulares.) Rompimento celular por sonicação para a recuperação de Antibiótico Um antibiótico intracelular foi recuperado por sonicação a partir de 5 litros de suspensão celular (15 g/L).56 Estime qual a concentração de produto final. Estime o tempo necessário para recuperar 90% do antibiótico. Experimentos anteriores mostraram que 50 % do antibiótico pode ser recuperado após 40 minutos.0 Calcule a quantidade de energia necessária para reduzir o raio médio do filamento de 5 microns para 1 micron para uma mesma massa de Penicillium. caso o processo de rompimento celular tenha sido realizado durante 240 segundos.5 8.1.5 Energia requirida (J) 1. 2.5 4.) Rompimento de filamentos de Penicillium Um moinho de bolas foi usado para romper filamentos de Penicillium.0 2 1.49 4.3.3 3 2. utilizando o mesmo moinho de bolas. o meio foi centrifugado a 4000 g durante 10 min e o pellet celular usado para preparação dos sistemas de rompimento.4. 2.5mm) e agitador tipo vórtice (Vixar BM 3000). aplicado o número de ciclos determinados anteriormente? 2. em tampão de lise foi adicionado em tubos tipo Eppendorf de 2 mL. na velocidade de ~3000 rpm.1 mm. condição na qual foi possível recuperar 85% do conteúdo proteico. as amostras foram resfriadas para aproximadamente 0oC em banho de gelo . Um ciclo adicional de rompimento (ciclo B) foi efetuado para a mesma suspensão celular em homogeneizador à pressão de 90 MPa.) Rompimento celular de células de Pichia pastoris Um grupo de pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo realizou estudo objetivando determinar a curva de rompimento celular de Pichia pastoris em moinho de bolas utilizando esferas de vidro. (Assuma que o processo de trituração segue a lei de Rittinger’s). de rompimento. seguidos de ciclos de resfriamento de 60 segundos em banho de gelo a -10°C. Um volume de 1 mL da suspensão celular. com uma única passagem pelo homogeneizador. na concentração de 250 mg/mL. Antes de iniciar o rompimento celular. ou seja. Estime a quantidade de energia necessária para efetuar uma redução posterior para 0. Após o cultivo as células da levedura foram rompidas em homogeneizador de alta pressão.) Rompimento celular de tecido animal Um tipo de derivado de tecido animal tem vindo a ser processado em moinho de bolas para recuperar uma enzima farmacêutica. visando à liberação a LAsparaginase intracelular. determine: a) Qual o número de ciclos de rompimento necessário para a recuperação de 90% das proteínas intracelulares caso o homogeneizador seja operado a uma pressão de 70 MPa? b) Qual a pressão operacional mínima para recuperar 90% das proteínas intracelulares.) Rompimento celular em fermentações em regime descontínuo Realizou-se uma série de fermentações em regime descontínuo. utilizando a levedura Candida utilis para a produção de diversas proteínas intracelulares. Inicialmente aplicou-se um ciclo de rompimento (ciclo A) com o homogeneizador operando à pressão de 60 MPa.6. tendo sido liberada 68% do total de proteína intracelular.5. os quais foram a seguir adicionados de 750 mg de esferas de vidro e submetidos a ciclos de agitação de 30 segundos em vórtice. Após o cultivo de uma cepa de Pichia pastoris GS115 com capacidade de expressar a L-asparaginase I de Saccharomyces cerevisiae. Estimou-se que seriam necessários 3000 J de energia para reduzir o tamanho médio da partícula de 1 mm para 0. conduzido em incubador rotativo (24 horas a 30 ºC e 250 rpm). Empregouse sistema laboratorial de rompimento com esferas de vidro (Ø 0.2.5 mm. De acordo com os valores de rendimento de proteína obtidos inicialmente para um processo simples. O compartimento contendo etanol é utilizado para monitorar a temperatura do banho.adicionado de cloreto de sódio (33% m/m) com capacidade para diminuir a temperatura a até –21 ºC com objetivo de garantir que o controle da baixa temperatura de rompimento.5). 750 mg de esferas de vidro. pH 7. O esquema do banho de gelo com NaCl e a forma de utiliza-lo é mostrado na Figura 2. (A) Esquema do sistema montado para rompimento de células com esferas de vidro em tubo de Eppendorf. Após cada ciclo de rompimento foram determinadas as seguintes variáveis: número de células intactas (nº cél/mL x 106) na suspensão após rompimento. Figura 2. estão apresentados na Figura 2. utilizado para o resfriamento do Eppendorf durante o rompimento celular. Curva de rompimento de células de Pichia pastoris recombinante (1 mL de suspensão celular de 250 g/L. (A) (B) Figura 2. concentração de Proteínas totais (μg) e atividade enzimática da L-Asparaginase (U/gcél) no meio clarificado após o rompimento.2. No total foram realizados 12 ciclos de rompimento celular. Os valores para cada uma das variáveis determinadas.2. de 30 segundos de agitação a 3000 rpm e 60 segundos de resfriamento em banho de gelo a -10°C cada ciclo.2. em função do número de ciclos. (B) Tubo de Eppendorf imerso em banho de gelo contendo solução de cloreto de sódio (33% w/w).1. Cada ciclo compreende . (♦) Número de Células intactas (■) Atividade Enzimática e (▲) Proteínas Totais.30 segundos de agitação a 3000 rpm e 60 segundos de resfriamento em banho de gelo a 10°C. b) Indique quais procedimentos alternativos poderiam ser realizados para aumentar a eficiência do processo de rompimento celular testado pelo grupo de pesquisa? . responda às seguintes questões: a) Quantos ciclos de rompimento celular devem ser realizados para romper as células de Pichia pastoris? Justifique a sua resposta. Com base nos resultados apresentados na Figura 2.2. 0 μm e uma densidade de 1.) Centrifugação de E. . a) Calcule a velocidade de sedimentação (vg) das células. 3. a agitação do tanque foi parada. assumindo que os microcarregadores atingem a velocidade máxima de sedimentação.7 cm e comprimento de 73. e a distância do fundo do cilindro ao eixo é de 10 cm.02 g/cm3 e diâmetro de 150 μm.5. Após o crescimento. com um diâmetro de 8. Estes grânulos celulares ou “microcarregadores” tem uma densidade (ρ) de 1. o fluido livre de microcarregadores (sobrenadante) foi então retirado para isolar a vacina. A razão altura (l) vs diâmetro (d) do líquido no tanque é 1. O fluido da suspensão celular tem propriedades próximas da água pura.Clarificação – Centrifugação e Sedimentação 3.1 cP.3. A velocidade da centrífuga é 16. Após a sedimentação.coli antes do rompimento celular.) Separação de células crescidas num suporte Células animais foram cultivadas na superfície externa de grânulos de dextrana.) Centrifugação de células de levedura Uma centrífuga de laboratório foi utilizada para recolher células após a fermentação.2. Um tanque agitado de 50 L foi utilizado para cultivar as células nos microcarregadores e produzir uma vacina viral. e os microcarregadores sedimentaram. coli utilizando uma centrífuga tubular Uma centrífuga tubular foi utilizada para concentrar uma solução de E.05 g/cm3. b) Estime o tempo necessário para atingir essa velocidade máxima. O fluido livre de microcarregadores tem um ρ de 1. O tubo tem um raio interno de 12. a) Estime qual é o tempo de sedimentação necessário. Durante a centrifugação a distância entre a superfície do líquido e o eixo de rotação é de 3 cm.0 cm.1. Quanto tempo tem de ser efetuada a centrifugação para que ocorra uma separação completa das células de levedura? 3.00 g/cm3 e uma viscosidade (μ) de 1. As células de levedura podem ser assumidas como esféricas. b) Depois do rompimento o diâmetro do lisado é cerca de metade do tamanho original de cada célula e a sua viscosidade aumentou cerca de 4 vezes. Estime a capacidade volumétrica (Q) da mesma centrífuga operando com estas novas condições. A centrífuga deve ser operada a 500 rpm.000 rpm e tem uma capacidade volumétrica de 200 L/h. Essa centrífuga é composta por um número de cilindros que giram perpendicularmente em torno de um eixo de rotação. . Após o crescimento pretendemos destruir a biomassa passando uma corrente diluída de células através de uma centrífuga de discos. Planejando operar a centrífuga a 6000 rpm.7 cm. A velocidade de sedimentação (vg) para estas células foi medida como 1.3.) Centrifugação de Chlorella utilizando uma centrífuga de discos Células de Chlorella foram cultivadas num lago aberto. estime qual a capacidade volumétrica (Q) desta centrífuga.4.07 x 10-4 cm/s. A centrífuga tem 80 discos com um ângulo de 40º. e um raio interior de 6 cm. e um raio exterior de 15. ) Filtração de meio fermentado contendo protease Uma suspensão de Bacillus subtilis foi utilizada para fermentar uma protease.2.3 x da concentração de biomassa de um auxiliar de filtração (Celatom). .080 0.6 (m/m) % de sólidos. Tempo de filtração.015 kg de torta seca por litro de meio filtrante.) Filtração de Streptomyces a partir de um meio fermentado de Eritromicina Utilizando um filtro de teste. O filtrado tinha uma viscosidade (μ) de 1. e uma área (A) de 37. com uma viscosidade (μ) de 6. para um meio fermentado contendo o antibiótico eritromicina e auxiliares de filtração. nós adicionamos o equivalente a 1.6 cP. Para separar a biomassa.000 L/h de um meio fermentado de eritromicina utilizando um filtro de tambor rotativo a vácuo.095 O papel de filtro tem uma área total (A) de 0.2 m2.1. Hg de vácuo.Filtração Convencional 4. t (s) 5 10 20 30 Volume de filtrado.3.1 ft2.) Filtração de Streptomyces erytheus a partir de um meio fermentado de Eritromicina É pretendido filtrar 15. O meio fermentado pré-tratado forma uma torta incompressível com uma resistência idêntica ao exercício 4. b) Tempo de lavagem (tw).040 0. A queda de pressão (∆P) foi de 20 in de mercúrio. O filtro opera sob 20 in. obtendo um meio fermentado contendo um rendimento final de 3. 4.055 0.1: ???? ? ) = (?? ) ?∆? ??? ( Considerando que queremos obter uma torta apenas com 1% de sólidos remanescentes. calcule: a) Tempo de filtração por ciclo (tc).1 cP. e esperando uma eficiência de lavagem será de 70%. O fluido de entrada contém 0. Utilizando um funil de Buchner de 5 cm de diâmetro ligado a um aspirador (sob vácuo). Nosso filtro tem um tempo de ciclo (tc) de 50 s. encontramos a seguinte informação exibida na Tabela abaixo. 4. Determine a resistência específica da torta (α) e a resistência do meio (RM). V (L) 0. e que um 1% de filtrado fique retido. A resistência dos filtros é muito menor que a da torta de filtração. os quais foram coletados em 30 min. o que acaba por ser uma vantagem porque podemos filtrar todo o fermentado sem encher as prensas (reduzindo o risco de contaminação). x 1 in.5 psi = 0. Foi observado uma resistência desprezível neste novo meio filtrante. Quanto filtrado seria recolhido em 30 min a uma pressão de 100 kPa. O espaço entre as placas pode ser aumentando. de espessura) do filtro de prensas necessário para realizar essa filtração? b) Estime o tempo necessário para filtrar 63 kg de uma batelada deste esteróide. assumindo que RM é insignificante. (∆P = 3. a) Quanto tempo demorará a filtração a uma pressão de 50 psi? b) Quanto tempo irá demorar se reduzirmos esta pressão para metade? Justifique se é mais ou menos vantajoso efetuar essa redução de pressão. . e a queda de pressão total que pode ser utilizada é de 65 psi. 4.) Filtração cristais de esteróides incompressíveis Pretendemos filtrar um resíduo de sitosterol a uma pressão constante.08 cm Profundidade da torta – 12.4. cada uma com uma área de 3520 cm2.5 cm Volume da torta – 253.25 kg/cm2) Nestes cálculos assuma que a bomba de pressão induz 10 psi e que a essa pressão o filtrado pela prensa pode ser aumentado até a um equivalente de 15 ft da entrada. e com base no teste de laboratório: a) Determine o número de placas (30 in. Esta prensa tem 15 placas. utilizando um meio de filtração constítuido por uma tela de suporte montada no final de um tubo de Pirex. estudos anteriores para este tipo de meio fermentado mostraram que o mesmo tem um comportamento de torta compressível com um s igual a 2/3. Agora precisamos de filtrar 3000 L deste material numa planta de instalação piloto com um filtro de prensas. x 30 in. Contudo. Alguns testes em laboratório com este equipamento permitiram adquirir os seguintes valores: Massa de cristais – 62 g Pressão da filtração – 15 psi Diâmetro do filtro – 5.3 cm3 Tempo de filtração – 163 min Considerando que a torta é essencialmente incompressível. 4.) Filtração de suspensão inorgânica Utilizou-se um filtro de vidro sinterizado para filtrar 50 litros de uma suspensão inorgânica.5. com uma queda de pressão de 50 kPa.conseguimos filtrar 100 cm3 deste meio em 24 min. 7. e uma espessura de 1 mm. qual seria a taxa de filtração para uma queda de pressão de 150 kPa? 4.6. mas em contrapartida é incompressível e permeável: ???? ?? ? = ?∆? ??? Se a torta reter 7% do filtrado. com células de levedura com uma densidade de 800 kg/m3. e tem um tempo de ciclo de 75 s. A torta formada apenas tem uma eficiência de lavagem de 60%. O filtro tem uma área de 0.1 m2. Se utilizássemos um filtro do mesmo material mas com um diâmetro de 5 cm e espessura de 3 mm para filtrar o etanol. Os testes de laboratório indicaram que a resistência específica da torta é de 40 m/kg. composto por um filtro com uma área de 18. sendo a viscosidade do filtrado de 2.) Filtração de ácido cítrico a partir de um meio fermentado num filtro de tambor rotativo a vácuo Para se processar 3000 L/h de um meio fermentado com 6% de ácido cítrico utilizou-se um filtro de tambor rotativo a vácuo. determine: a) Tempo de filtração (tf)? b) Tempo de lavagem (tw)? 4. e sendo pretendido que a torta seja lavada até se ter apenas 10% do ácido cítrico original.4.) Filtração de células de levedura Uma suspensão de células de levedura foi filtrada a uma taxa constante de 50 L/min.s.8. Quando utilizada uma queda de pressão de 100 kPa para realizar a filtração. A suspensão tem um teor de sólidos de 70 kg/m3 de suspensão. sendo a resistência do meio negligenciável. a) Quanto tempo pode ser mantida a taxa de filtração antes de a pressão ultrapassar o 1 N/m2? b) Quais são os volumes da torta e filtrado recolhidos durante esse tempo? (ATENÇÃO: Notar que as equações de filtração são expressas em massa de sólidos por volume de filtrado e não por volume total de suspensão) . Este equipamento apresenta uma RM insignificante. operando com uma diferença de pressão aproximadamente de 1 atm.) Filtração de etanol Etanol puro foi filtrado através de um disco poroso com um diâmetro de 2 cm. a taxa de filtração alcançada foi de 10 mL/min.9 x 103 kg/m.1 m2. 3 m2. quando na suspensão laboratorial a concentração era de 0. ?? ?? ?.9.10.87 Para se obterem os dados experimentais utilizou-se um filtro com 89 cm2 de área e uma queda de pressão de 2. é respetivamente: bactérias: ???? = ?. determine o tempo necessário para filtrar 850 L do meio fermentado misto num filtro com resistência de meio filtrante insignificante. Contudo. Previamente determinou-se que a resistência específica da torta para cada das espécies. ? × ??? esporos: ???? = ?.6 m de H2O.28 g/cm3 de solvente. Quanto tempo irá demorar para filtrar a nova suspensão celular considerando a mesma queda de pressão? .) Filtração de cristais de aureomicina Um teste de laboratório mostrou que é possível filtrar cristais de aureomicina suspensos em acetona. esta nova suspensão tem uma concentração de cristais de 0.4. Agora é planejado filtrar uma concentração muito maior de cristais suspensos em 7300 L de solvente.3 x 10-4 cm).) Filtração de células bacterianas e esporos Pretende-se filtrar um meio fermentado contendo duas espécies: células bacterianas (d = 7 x 10-4 cm). ?? Outros testes experimentais demonstraram também que para a cultura mista: ? ???? = (∑ ∅? √?? ??? ?) ? Onde ∅? é a fração do soluto i em todos os solutos. utilizando-se para tal um filtro com uma área de 1. ? × ??? ?? ?.34 g/100 cm3. e um queda de pressão de 105 N/m2 e 4.50 20 0.71 30 0. t (s) V (L) 10 0.0 m2 de área (tf)? 4. esporos (d = 0. Se o nosso meio fermentado contém metade da concentração de bactérias e de esporos. utilizando um filtro com uma resistência neglegível (Valores experimentais presentes na tabela abaixo).