levaduras y biotecnologiao.pdf

2.MARCO TEÓRICO Los microorganismos ruminales llevan a cabo un complejo proceso de fermentación, esencial para el mantenimiento de la nutrición y digestión del alimento en el animal hospedero (Bryant y Burkey, 1953). En años recientes se ha incrementado en forma considerable la adición de agentes microbianos suplementados en forma directa en la alimentación de vacas lecheras de alta producción gracias a la biotecnología y la industria de las fermentaciones que han hecho posible el desarrollo a gran escala de productos microbianos, basados principalmente en cultivos de levaduras que actúan simultáneamente como probióticos, prebióticos y cofactores (Orpin y Joblin, 1997; Nagaraja et al., 1997). 2.1 MICROORGANISMOS RUMINALES Desde el punto de vista evolutivo, los rumiantes son considerados como la especie animal de mayor desarrollo en el sistema digestivo. Las adaptaciones anatómicas dieron como resultado la compartimentación del tracto digestivo y las fermentaciones pre-gástricas desarrolladas, condujeron a una relación simbiótica del animal hospedero y su ecosistema microbiano (García, 2004). El rumen es una de estas adaptaciones altamente especializada del tracto digestivo que facilita el almacenamiento y procesamiento de los diferentes nutrientes consumidos en la dieta de las vacas (García, 2004). La digestión de los forrajes, depende en gran parte de la estructura y composición química de las plantas (Arcos y Díaz, 2004), las cuales poseen en su pared celular carbohidratos estructurales formados principalmente por celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina. Estos compuestos no son digeribles por el animal huésped sino por 24 los microorganismos que viven en el rumen y en el intestino, siendo así los únicos capaces de digerir las paredes celulares de las plantas (celulosa y hemicelulosa) para producir azúcares simples (glucosa) y ácidos grasos volátiles (AGV) que cruzan las paredes del rumen y sirven como fuente de energía (Davis, 1993). Estos microorganismos gastrointestinales, pueden además, prevenir infecciones disminuyendo o suprimiendo el crecimiento de poblaciones patógenas en el tracto digestivo (Reid et al., 1990; Sen y Babu, 2004). Cualquier cambio abrupto en la dieta, estrés o terapia antibiótica puede trastornar este balance microbiano, haciendo al hospedero susceptible a enfermedades y provocando una disminución en la eficiencia del uso de la comida (Sen y Babu, 2004). Las tres grandes poblaciones que predominan en el ecosistema ruminal son las bacterias, los protozoarios y los hongos. Estos microorganismos funcionan de manera sinérgica y competitiva debido a su diversidad, y en simbiosis se adaptan a sobrevivir en condiciones de anaerobiosis, altas diluciones, altas densidades de células y de predación protozoaria (García, 2004). Las bacterias son los microorganismos más abundantes dentro del ecosistema ruminal, alrededor de 10 billones por mililitro, que representa el 50% de la masa microbiana total del rumen. Se encuentran en gran variedad de géneros y especies (por lo menos 28 especies funcionalmente importantes), las cuales se agrupan de acuerdo a su actividad. La mayoría son anaerobias estrictas, aunque también se encuentran presentes organismos facultativos. Entre sus funciones se encuentra, la degradación de la fibra, la digestión de la pared celular (hemicelulosa, almidones y celulosa), la producción de aminoácidos, la fermentación de azúcares solubles y la producción de ácidos grasos volátiles AGV. Las 3 especies bacterianas celulolíticas predominantes son la Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens y R. albus (Mojica, 1993; Mayorga, 2002). 25 Los protozoarios se encuentran en menor proporción que las bacterias aunque tienen un mayor volumen individual. Estos microorganismos no son indispensables en el desarrollo y funcionamiento metabólico, pero pueden tener efectos en la productividad final del hospedero. Son importantes en la digestión de carbohidratos y proteínas. Además, contribuyen con la producción de AGV’s y tienen control sobre su rata de producción. Se ha comprobado que algunos de los protozoos que tienen presencia en el rumen incluyen los géneros Eudiplodinum, Polyplstron, Epidinium, Entodinium e Isotricha (Mojica, 1993; Mayorga, 2002). Los hongos ruminales anaeróbicos (HAR) están directamente relacionados con el contenido en la fibra de la dieta, y su proporción disminuye en raciones ricas en almidón o azúcares solubles. Están asociados con la colonización, debilitamiento y reducción de tamaño de las partículas fibrosas. Algunas especies como Neocallimastix frontalis, Piromyces comunis y Orpinomyces joyonii son eficiente en la digestión de polisacáridos estructurales como las especies bacterianas más activamente celulolíticas (Mojica, 1993; Mayorga, 2002). 2.2 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae, más conocida como “la levadura de la cerveza” es un hongo ambiental común y es un componente transitorio de las microbiotas digestiva y cutánea humanas. Taxonómicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la Clase Hemiascomycetes, del Orden Saccharomycetales y de la Familia de las Saccharomycetaceae. Es un hongo levaduriforme de pared lisa en su interior, que presenta células alargadas, globoides a elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales, ascos con hasta cuatro ascosporas esféricas o elipsoides en un rango de 5 a 10 µm de diámetro externo y de 1 a 7 µm de diámetro interno (Hongos-alergénicos, 2006; Feldmann, 2005). 26 núcleo. Feldmann. pan y en investigación principalmente de aplicaciones industriales y médicas. 2005). forma y color. cerveza. extienden y dividen de la misma manera. que presentan diversidad respecto al tamaño celular. además de citosol. aparato de golgi. En cuanto a su estructura (figura 1). y está constituida principalmente por una pequeña cantidad de péptido y polisacáridos principalmente ß-glucanos y mananoligosacáridos (MOS). benéficas para la vida humana. Se consideran como organismos facultativos. Feldmann. 2001. mitocondria. retículo endoplasmático. Durante años ha sido usada para la elaboración de vino. debido principalmente a la alteración de las condiciones físicas y químicas en el ambiente. convirtiéndose en la referencia de comparación para las secuencias de humanos. vacuola. vesícula secretora (S) y peroxisoma (Ramírez y Pedroza. En 1980 fue utilizada para la producción de la vacuna de hepatitis B y en 1996 se convirtió en el primer organismo eucariota al cual pudo establecérsele la secuencia genómica completa. genes animales o vegetales y múltiples organismos unicelulares (Feldmann.De las levaduras. aun tratándose de células individuales de una misma cepa. 2005). cerevisiae es la más estudiada. 1920. Viven en estado aislado hasta que adquieren el tamaño adecuado para dividirse. unicelulares. los cuales tienen impacto en el sistema inmunológico y en la capacidad de prevenir la colonización de 27 . que a su vez se separan. 2005). produciendo células hijas. Generalmente son de forma esférica u ovalada y miden entre 5 y 10 micras. la especie S. un espacio periplásmico y una pared celular. la levadura está compuesta por la envoltura de la célula que incluye la membrana plasmática. lo cual significa que pueden sobrevivir y crecer con o sin oxígeno (Guilliermond. La pared celular tiene una estructura semirrígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensíl en la cual se desarrollan las marcas de nacimiento durante la división celular. Las levaduras son hongos microscópicos. las levaduras reúnen características favorables para uso en alimentación animal (Glucos Internacional.bacterias patógenas en el tracto gastrointestinal (Ramírez y Pedroza. 2001. 28 . aunque la levadura seca es una buena fuente de proteína (aproximadamente el 40% del peso de la levadura). 2006). a pesar de que son variables. vitamina D (ergosterol). 2005 Entre los constituyentes micromoleculares de la levadura. 2006). Riboflavina. Figura 1. 2005). Pared Celular Periplasma Membrana plasmática Peroxisoma Vacuola Aparato de S Golgi Mitocondria S Núcleo S Marca de nacimiento Invaginación Retículo endoplasmatico Fuente: Feldmann. Hongos- alergénicos. polifosfatos y ácidos nucleicos (Feldmann. grasas (lípidos). Niacina y Ácido Pantoténico). Por este alto contenido de nutrientes de alto valor nutricional que se encuentran fácilmente disponibles. minerales y aminoácidos (niveles sobresalientes de lisina y metionina). Estructura y organelos de una célula de levadura. Las levaduras proporcionan vitaminas del complejo B (principalmente Tiamina. predominan los hidratos de carbono (polisacáridos) y en menor proporción se encuentran proteínas (glicoproteínas). en cambio. 2005. La producción de energía en forma de ATP es acompañada de la generación de intermediarios y disminución de energía en forma de NADH para las vías biosintéticas. con una tasa de consumo limitado de oxígeno y un bajo rendimiento en la producción de biomasa.2. El uso del piruvato en la generación de energía puede darse mediante la respiración en presencia de oxígeno (aerobiosis). 1990. la tasa de transporte del piruvato a la mitocondria es igual al trasporte de azúcar a la célula. cerevisiae la mayor fuente de energía es la glucosa y la glucólisis es la principal vía para la conversión de la glucosa a piruvato. 29 . se alimenta. Estos procesos usan NADP o NAD como cofactores respectivamente (Barford. El metabolismo de las levaduras como en los demás organismos. cerevisiae es igual al de las plantas. 2005). Mediante procesos reductivos usa los azúcares para la producción de material celular nuevo. se remueven electrones del sustrato o se usan intermediarios para generar energía. 2005). En la producción de levadura S. Bajo condiciones anaeróbicas (catabolismo).2. o fermentación en ausencia o represión (anaerobiosis) de oxígeno (figura 2) (Feldmann. 2000). En fermentaciones aeróbicas (anabolismo) el metabolismo de S. esta mediado por reacciones enzimáticas (Feldmann. se produce dióxido de carbono como el mayor metabolito con poca generación de etanol y ocurre una alta tasa de consumo de oxígeno y sustrato.1 Metabolismo La mayoría de levaduras usan azúcares como su principal fuente de carbono y energía. Feldmann. Parakulsuksatid. respira y se multiplica. la tasa de consumo de azúcar es mas alta que la tasa de transporte del piruvato a la mitocondria y el metabolismo favorece la producción de etanol y CO2. 2. En el ambiente ruminal. La mayoría de los cultivos de levadura con fines de nutrición animal. tienen una habilidad limitada para hacerlo (Miller et al. 2004). Metabolismo de la levadura bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas RESPIRACION AEROBICA RESPIRACION ANAEROBICA Azúcar Glucosa-6-fosfato Azúcar Glucosa-6-fosfato NADH Glicerol Triosas Fosfato Piruvato Piruvato CO2 Ciclo del Ácido Cítrico Etanol Etanol Oxígeno Fosforilación + Oxalacetato Oxidativa CO2 CO2 Succinato Succinato CO2 CO2 ATP Fuente: Feldmann. 2002..2 Uso de levaduras en alimentación animal Durante los últimos años se ha aumentado de manera considerable el uso de aditivos microbianos que se suplementan en forma directa en sistemas de alimentación animal. las levaduras son capaces de sobrevivir durante cortos periodos de tiempo y aunque se desconocen los factores por los cuales las levaduras pueden crecer. 30 .. vacas altas productoras. formulados principalmente a partir de cepas de bacterias y hongos altamente celulolíticos (García et al. Arcos y Díaz. Múltiples estudios se han llevado a acabo (ganado lechero de lactancia temprana. Bach et al.Figura 2. 2. se derivan del género Saccharomyces y especie cerevisiae (Nagaraja et al.. 2004. 1997).. 2005. novillos. vacas lecheras en estabulación libre) con el fin de demostrar los beneficios que presenta la suplementación directa de levaduras tipo S. 2004). se aumenta la producción de AGV’s y se altera la relación acetato/propionato (Miller.3 FERMENTACIÓN DE LEVADURAS La práctica de la fermentación es una de las más viejas tecnologías descubiertas por el hombre. 2002. Además. 1991). Aunque algunos autores no han encontrado ventajas significativas (Arambel y Kent. 1990) otros han podido determinar una mejora en la ingestión de materia seca y producción diaria de leche (Bach et al. 2004). 2. 2002) que permite reducir el riesgo y la severidad de la acidosis ruminal (Bach et al. 31 . La adición del cultivo de S.C. y los productos lácteos fermentados tales como queso y yogur fueron desarrollados tempranamente en la historia (Scragg. Incrementan la digestión y el flujo de proteína microbiana al duodeno (Kamalamma et al. aumentando el aprovechamiento de los pastizales y repercutiendo en un mayor desempeño productivo de carne... leche o ganancia de peso (Salazar. logrando mayor aporte de energía para mantenimiento y producción. por otro lado. los metabolitos alimentan los microorganismos ruminales. Bach et al. 2002). García et al. mejorando la digestión de la fibra presente en ellos. 1996) proporcionando grandes valores de nutrientes al hospedero.. La capacidad fermentable de los microorganismos se ha utilizado por miles de años.. 2004... Kamalamma et al.. 2004).. 2004). 2004). se ha presentado como una alternativa para la sustitución de los antibióticos empleados como promotores de crecimiento (Lynch y Martin. cerevisiae en diferentes sistemas de alimentación de ganado lechero estabiliza y optimiza la función del sistema digestivo bovino. 1996) lo que genera una aumento del pH (Miller et al.cerevisiae (Miller et al.. Además. 2002 et al. estimulando el metabolismo especialmente de la población celulolítica (Salazar. 2004). El cultivo actúa por dos vías: una parte de los metabolitos son saborizantes que estimulan el consumo de forraje. Las levaduras fueron utilizadas para elevar el pan en Egipto a partir del 4000 A. los cuales se producen durante el crecimiento de los microorganismos (Hensirisak. 1997). 1998). El microorganismo va aumentando su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman los productos. proceso conocido como biotransformación (Hensirisak. se pueden clasificar en tres grupos generales: Los que reproducen las células microbianas (obtención de las células mismas).000 litros) como estudio preliminar para la generación de procesos industriales que permitan el desarrollo de productos comerciales. los que se generan debido al metabolismo celular (productos finales que se producen durante la fermentación) y los que modifican un compuesto agregado a la fermentación. 1997). Estos fenómenos de crecimiento y formación de producto que tienen lugar durante el desarrollo del proceso pueden ocurrir de forma simultánea o independiente (Duarte. mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y/o biomasa. Este proceso es esencialmente una serie de reacciones bioquímicas que se llevan a cabo en un recipiente llamado fermentador o biorreactor. se ha extendido para describir cualquier proceso químico catalizado por los sistemas microbianos enzimáticos.Tradicionalmente se definía una fermentación como el proceso de producción de etanol o ácido láctico a partir de glucosa: Levadura C6H12O6 2C2H5OH+2CO2 Enzimas C6H12O6 2CH3CHOHCOOH El término “fermentación” tiene diversos significados en la práctica y su significado bioquímico se relaciona con la generación de la energía por el catabolismo de compuestos orgánicos. El uso de biorreactores ha permitido resultados de laboratorio para hacer el escalamiento (hasta 100. 32 . Los productos de la fermentación. mientras que su significado en microbiología industrial tiende a ser mucho más amplio. A nivel industrial. levaduras o bacterias. 2001). Las levaduras son los microorganismos que mas se usan en la bioindustria. Las características del crecimiento de S. Strittmatter (1957) y Bruver. (1975a.3. Los procesos de fermentación con levaduras pueden ser anaeróbicos o aeróbicos. et al. cerevisiae son variables dependiendo de las condiciones a la que están sujetan las células. 1982). 33 . En general este proceso requiere oxígeno para una máxima producción celular (Hensirisak. modificado (Hensirisak.1 Producción industrial de levaduras A nivel industrial. (1975) y Tustanoff y Bartley (1964) investigaron la adaptación de la levadura a la variación en la concentración del azúcar. 2. El crecimiento aerobio de S. Muchos investigadores han estudiado los factores que afectan los patrones de crecimiento bajo condiciones aerobias. Livense y Lim. 1997). Slonimski (1953) divulgó la influencia de la aireación en el crecimiento de la levadura.Antes de que se establezca un proceso de fermentación.. 1975b) definieron los diversos patrones de crecimiento para diferentes fuentes de carbono. la producción de levaduras S. Orlowski y Barford. 1991. 1987. 1990. por su papel en la fabricación de bebidas alcohólicas (Ramírez y Pedroza. 1997). cerevisiae se lleva a cabo mediante fermentaciones aeróbicas. Ball et al. cerevisiae en los azúcares fermentables se ha estudiado principalmente en la panadería (Scragg.. dependiendo de las condiciones ambientales y del producto final que se desee obtener. Barford. La fermentación a gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos. el microorganismo generalmente debe ser aislado y algunas veces. Safriet. es de uso inmediato y se utiliza principalmente en la industria panadera y la seca o deshidratada que es para uso doméstico. cerevisiae) casi 100% pura enriquecida con selenio. cerevisiae en su medio de cultivo. es principalmente de 2 tipos: la levadura fresca o comprimida (crema) que contiene un 70% de humedad. Diamond V XPC™ Cultivo de levaduras S. En la tabla 1 se presentan algunos de los productos de este tipo que actualmente se encuentran disponibles en el mercado. 1998). Tabla 1. SelenoSource AF 2000 Levadura (S. que contiene 5% de humedad y no necesita rehidratarse (Parakulsuksatid. EMPRESA PRODUCTO DESCRIPCION Cultivo de Levaduras Fermentando seco de cereales y levadura de Diamond V XP™ panadería (S. Diamond V 34 . contiene vitaminas del complejo B y otros productos de fermentación. cerevisiae) con su medio de cultivo. aunque se producen de manera similar. número de células viables presentes. Los productos comerciales de levadura existentes para uso en alimentación animal. Esta última se somete a un proceso de secado después de ser procesada y es desarrollada a partir de varias cepas. CNMA. Compuesta en su mayor parte por seleniometionina (fuente de selenio orgánico) Cultivo de levaduras S. varían ampliamente en la cepa. modo de acción y formulación. es sólida y debe diluirse en agua tibia antes de su uso o deshidratada instantánea. 1994. cerevisiae en su medio de cultivo. Productos de levadura para uso en alimentación animal. 2000.La levadura de panadería. para producir levadura deshidratada de dos clases: activa que contiene 8% de humedad. disponibles en el mercado. que se produce industrialmente a nivel mundial. El contenido de este recipiente se utiliza para inocular el primero de varios fermentadores donde se van a producir sucesivamente los inóculos para las fases siguientes. fed-batch o continuo. La etapa final de producción puede consistir en fermentadores con volumen superior a los 500 L y puede operarse en batch. para aumentar la digestión y la eficiencia alimenticia. Levadura activa seca (S. cerevisiae). A medida que se asciende en escala de volumen. 1994). otros blend for ruminants microorganismos y enzimas que hidrolizan Diamond V XP DFM almidón. Lallemand y Alltech. beneficia el tracto gastro intestinal Selenio de levadura enriquecido para aumentar el desarrollo animal (aditivo alimenticio natural) Cultivo vivo de levadura S. triglicéridos y rompen celulosa y pectina. Mantiene un alto nivel de microorganismos en el rumen mejorando absorción de compuestos. cerevisiae) para uso probiótico o alimentación microbial directa en rumiantes Activo de levadura seca (S. cerevisiae. 2006 La producción industrial de levaduras en su etapa inicial se lleva a cabo en el laboratorio donde un inóculo primario se deja crecer en un volumen entre 500 y 1000 mL durante 2 a 4 días. Direct fed microbial Mezcla de cultivo de levadura. Las etapas intermedias del proceso generalmente se llevan a cabo en lotes de 10 a 100 L cuya duración esta entre 11 y 14 horas. las condiciones de aireación y agitación se hacen más exigentes (Safriet. cerevisiae boulardii) para uso probiótico en nutrición animal Derivado de una cepa especifica de levadura (S. En cultivos batch. Fuente: Diamond V. el sistema se caracteriza por ser un sistema cerrado ya que no se añade ni se retira medio de cultivo y el microorganismo crece a partir de una limitada 35 . 2005. En 36 . S. aunque no es fácil lograr el equilibrio entre las tasas de alimentación y consumo de glucosa por la levadura. Los nutrientes (glucosa) se adicionan intermitentemente durante la fase de producción. las enzimas intermediarias de la respiración se inhiben favoreciendo la producción de etanol (Parakulsuksatid. En cultivos fed-batch se controlan dos elementos: la velocidad del flujo de alimentación y la concentración del nutriente limitante. 2000). (1983). 2005. la concentración de azúcar en la fermentación será cerca de cero. la alimentación de glucosa se incrementa como se incrementa el número de células. En fermentaciones aeróbicas tipo batch. Sepúlveda. Según Furukawa et al. represión catabólica e inhibición por productos.. 2000). 2001). Aunque el sistema batch tiene muchas limitaciones. si la concentración de glucosa es mayor al 5% en el medio. 2001). Ramírez y Pedroza. mientras que una concentración alta de glucosa en la corriente de alimentación disminuye el crecimiento celular. pero en la práctica las fermentaciones solo manejan una tasa de alimentación. Desde que el número celular de levaduras crezca. El crecimiento se puede analizar realizando una gráfica de concentración celular ( x ) contra el tiempo de incubación (t). causando una oxidación completa de toda la glucosa. Este efecto presenta la mayor desventaja a gran escala de las fermentaciones fed-batch (Parakulsuksatid. En este estado estable.cantidad de nutrientes hasta que se agota un componente esencial o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que gradualmente inhiben el crecimiento (Sepúlveda. cerevisiae solo puede producir una cantidad limitada de enzimas de la respiración. Ramírez y Pedroza. es necesario alcanzar y mantener un flujo permanente y constante hasta alcanzar un estado estable donde la velocidad de dilución se iguala a la velocidad especifica de crecimiento. La glucosa se alimenta a la levadura a una tasa casi igual a la cual se consume. 2000. En fermentaciones continuas. Esta técnica es efectiva particularmente en procesos en los cuales hay inhibición por sustrato. este sistema sigue siendo utilizado para la producción a escala industrial (Parakulsuksatid. conformados básicamente por etanol (80%) y acetaldehído (compuesto contaminante). 2000). aireación. el pH. reduciendo el rendimiento en formación de biomasa. la concentración de oxígeno. debe establecerse el proceso de separación y purificación (Hensirisak. con el fin de monitorear el transcurso de la fermentación. dado el alto gasto económico implicado en ellos. especialmente en los fermentadores industriales. ácidos orgánicos y acetatos (CNMA. otros subproductos incluyen alcoholes como butanol. se deben verificar las condiciones ambientales (temperatura. sino también controlar parámetros ambientales (temperatura. alcohol isopropílico. En las fermentaciones aeróbicas que se llevan a cabo para la producción industrial de levadura.3-Butanadiol. se generan residuos líquidos y emisiones de compuestos orgánicos volátiles (COV) principalmente como subproducto del proceso de fermentación. Es en este punto donde las estrategias de control en la fermentación aerobia industrial son de gran importancia. pH. 2. 1998). 1997).presencia de exceso de glucosa. pero si el objetivo de la fermentación es obtener una conversión alta de glucosa a masa celular. la levadura convierte una parte de esta a etanol. Igualmente se debe llevar a cabo el escalamiento del proceso para garantizar unas condiciones de operación a nivel industrial que generen la máxima condición de productividad (Safriet. En la mayoría de los casos es necesario no solo medir el crecimiento y la formación del producto. cada vez que se quiera implementar un nuevo proceso con una cepa diferente. Aunque las condiciones de operación para diferentes levaduras son muy similares. 1994) y posterior diseño de planta para obtener un producto en cantidades comerciales. es necesario que la concentración de glucosa en la fermentación permanezca cerca de cero y se adicione continuamente nueva glucosa (Parakulsuksatid. requerimientos nutricionales y disponibilidad de los nutrientes) apropiadas que permitan la adaptación de los microorganismos al medio para alcanzar un adecuado desarrollo de la fermentación (Hensirisak. 1997). la masa celular y la 37 . También. Esta temperatura suele encontrarse muy cerca de la temperatura máxima soportada y varía según la clase de microorganismo (Gómez. 2004).concentración del producto) que se van alterando a medida que el proceso transcurre. Cada microorganismo presenta un rango de pH donde su crecimiento es posible e incluso algunos presentan un pH óptimo. Tiene además influencia en la inhibición por pH debido al efecto que esta variable tiene sobre los centros activos de las enzimas. por lo tanto.2. puesto que cambios en el pH son causantes de la desnaturalización de enzimas y de problemas en el intercambio de iones en la membrana celular. Ramírez y Pedroza. y las máximas entre 34 y 47 ºC (Parakulsuksatid.3 y 0. Guilliermond. En las levaduras la temperatura afecta la capacidad de éstas para desdoblar los azúcares. una variable significativa en la producción de biomasa (Sen y Babu.5 ºC. 2001. con temperaturas mínimas permisibles entre 0.2 pH.3. la reproducción y el crecimiento celular.3. debido a que desde el punto de vista microbiológico los microorganismos presentan temperaturas óptimas para su crecimiento donde se obtiene el mayor rendimiento.1 Temperatura. cerevisiae son exotérmicas. 2000. en la variación en las proporciones de los constituyentes del 38 . 1998).2.3. El pH es. el fermentador debe enfriarse para mantener la temperatura en el rango óptimo para el crecimiento (CNMA. Las fermentaciones aeróbicas de S.2 Efecto de las condiciones ambientales sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae 2. 2. 1920). al igual que la temperatura. 2. La temperatura es un factor relevante en los procesos de fermentación. 2003). el microorganismo. 2001). consumiendo o produciendo sustancias ácidas o básicas que acidifican o basidifican el medio (Gómez. el cual constituye un factor determinante para lograr un alto rendimiento en el crecimiento de los microorganismos aeróbicos. 2. cerevisiae dependiendo de la presencia de oxígeno y otras fuentes de carbono (Feldmann. en el conjunto de las floculaciones coloidales y en las características organolépticas del medio de cultivo tales como color y sabor (Ramírez y Pedroza. 2001). por lo tanto.5 y 5 (CNMA. En la producción industrial de S.3 Aireación y Agitación. 2001). 2005). 2001. debido a que la inversión de la sacarosa se acelera a pH bajos (Ramírez y Pedroza. la secreción de enzimas y la velocidad de fermentación al inicio del proceso. La actividad celular. 2003. debido a que cuando el suplemento de aire se reduce. 1920). 1920). el pH se ajusta entre 4. permitiendo un crecimiento más rápido que en las bacterias. por lo tanto se tiene la ventaja de operar una fermentación con un menor riesgo de contaminación. es conveniente airear el medio hasta el máximo. este inconveniente puede superarse en parte si se logra una agitación adecuada dentro del fermentador (Ramírez y Pedroza. En la fermentación de levaduras. Gómez. Por este motivo la mayoría de estudios se basan en hallar un 39 . Si se usa sacarosa como fuente de carbono el sistema es más sensible al pH que al utilizar glucosa. 1998).3. dependen estrechamente de las condiciones de aireación. Generalmente la aireación del medio se realiza mediante el suministro de oxígeno (gas). Aunque este proceso se dificulta por la poca solubilidad del gas en el medio de cultivo (líquido).2. La mayoría de microorganismos son neutrofilos y crecen en un rango de pH entre 5 y 9 donde el pH varía durante el crecimiento a causa de las reacciones metabólicas que se llevan a cabo. deja o suprime casi completamente su multiplicación (Guilliermond. Guilliermond.producto final de una fermentación. los valores de pH entre 3 y 6 generalmente favorecen el crecimiento y la actividad fermentativa (Ramírez y Pedroza. 2003). cerevisiae para uso en panadería. La glucosa puede ser utilizada de muchas maneras por S. 2003).4 Medio de Cultivo. es conveniente considerar un diseño de medio de fermentación que genere las mejores garantías de crecimiento. Los nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma (Ramírez y Pedroza.2.equilibrio adecuado entre oxigenación y agitación que permitan el mayor rendimiento para el crecimiento del microorganismo (Gómez. En la tabla 2 se muestran los requerimientos básicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos. Por lo tanto. requiere además de unas condiciones ambientales óptimas. 2003). 2. el mejor desarrollo para el microorganismo y el máximo rendimiento de producción. dependen de la estequiometría de crecimiento y formación de producto (Duarte. La determinación de los requerimientos nutrimentales. 40 . de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gómez. además de las restricciones técnico-económicas para minimizar los costos de separación y purificación. 2001). 1998). La producción de levadura. ambiéntales y la composición.3. El medio debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo. Compuestos orgánicos Oxígeno H2O. (NH4)2SO4. de sangre. que aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramírez y Pedroza. CoCl2. Una primera aproximación a estos cálculos lo proporciona el contenido de la composición de biomasa del microorganismo respecto al porcentaje de nutrientes y minerales que son necesarios para su nutrición. ZnCl2. malato. Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes. extracto de carne. Na2Se4 Madigan et al. de pescado. La formulación del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos. NiCl2. harina de soya. extracto de levadura. estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. macerado de maíz. NH4Cl Fósforo Na2HPO4. peptona Hidrógeno H2O. en cuya composición intervienen sustancias de origen animal y vegetal. medios complejos como extracto de Carbono levadura. como peptonas. FeCl3. O2. Compuestos orgánicos Orgánicos: aminoácidos y bases nitrogenadas. N2. KH2 PO4 Azufre Na2SO4. 1999.. piruvato. 2001). entre otros. Na2MoO4. Para promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los medios de cultivo como ciertos aminoácidos y vitaminas (Ramírez 41 . KH2PO4 Magnesio MgSO4. MgCl2 Sodio NaCl Calcio CaCl2 Hierro Quelatos de hierro. en: 1) medios sintéticos o también llamados medios químicamente definidos y 2) medios complejos. H2S Potasio KCl. acetato. Nitrógeno Inorgánicos: KNO3.Tabla 2. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo NUTRIENTE FORMA QUÍMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO Glucosa. FeSO4 Micronutrientes MnSO4. CuCl2. inositol.4 CINÉTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA Una fermentación aeróbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como un sistema cerrado. zinc. para su desarrollo ésta requiere de nutrientes como el nitrógeno (sales de amonio. y un ácido o base para el control del pH. Sin embargo. CNMA. 2. debido a su alto contenido de azúcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa. 1995. un agente antiespumante. La composición del medio de cultivo.y Pedroza. y la concentración del metabolito cambia constantemente como resultado del metabolismo celular. con el fin de garantizar las condiciones óptimas de operación que permitan obtener una alta concentración celular. A nivel de laboratorio S. fósforo (fosfato diamónico y ácido fosfórico). 1920. En el transcurso de toda la fermentación. la composición de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentación (Ramírez y Pedroza. 2001). 2001). la concentración de biomasa. azufre. Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield. En el transcurso de la 42 . 1998). cerevisiae se cultiva en medios complejos que aportan a la célula los nutrientes necesarios para su crecimiento. sulfato de amonio y urea). ácido pantotenoico y tiamina (Asenjo. En el tiempo inicial el medio de cultivo estéril dentro del fermentador se inocula con microorganismos y la incubación se da bajo condiciones fisiológicas óptimas. magnesio (sales de magnesio). potasio. hidrocarburos y trazas de hierro. calcio. En el caso de la célula de levadura. glucosa y fructosa (CNMA. 1998). cobre. entre los que se destacan YM. Para la fabricación industrial de levadura de panadería las principales materias primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caña que constituye la principal fuente de carbono del medio de cultivo. 1998). CNMA. manganeso y molibdeno (Guilliermond. En cuanto a las vitaminas son necesarias la biotina. solo se adiciona oxígeno (en forma de aire). 2003. el cual debe tener una edad tal que la mayor parte de las células que contiene deben encontrarse en fase exponencial y metabólicamente activas (Barrera. Fase Fase Fase Fase de Lag Log Estacionaria Muerte NUMERO DE MICROORGANISMOS TIEMPO Fuente: Gale. Figura 3. 1998). fase estacionaria y fase de muerte (Sánchez. no hay inicialmente un incremento en el número de células. Es recomendable utilizar inóculos entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de reducir el tiempo de latencia (Soto. como se muestra en la figura 4: fase lag. por las cuales pasa el microorganismo a través el tiempo. Curva de crecimiento de los microorganismos. Durante esta fase los microorganismos se toman un tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoquímico y en ocasiones se sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Sánchez. Duarte.fermentación hay 4 fases de crecimiento. La duración de esta fase puede variar dependiendo del crecimiento de las células en el inóculo. 2004). Cuando las células son transferidas de un medio a otro. 2004). 2003). 43 . fase exponencial. 2001 Fase Lag o de adaptación: también llamada fase de latencia. Fase Exponencial o log: Al finalizar la fase lag. A través de esta fase las células alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando los productos metabolizados. y la constante especifica de sustrato K s . Esta relación puede ser expresada por medio de la ecuación de Monod (2): S µ = µ max (2) Ks + S La velocidad máxima de crecimiento específico µ max es de considerable importancia a nivel industrial. donde a medida que aumenta la densidad de población decrece la concentración del sustrato limitante del crecimiento. es generalmente una función de tres parámetros: la concentración del sustrato limitante S . La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad de crecimiento específico µ y la concentración de células x [células/ mL] según la ecuación número 1. dx = µx (1) dt La velocidad de crecimiento específico µ . causando un descenso de µ .5 µ max ). En este punto las células se reproducen sin limitación de sustancias nutritivas a velocidad máxima. 44 . El crecimiento de las células se puede describir cuantitativamente como la duplicación del número de células o biomasa por unidad de tiempo. en cuya concentración se obtiene la mitad de la máxima velocidad específica de crecimiento ( µ = 0. relacionando la dependencia de los microorganismos con las condiciones del fermentador. debido a que es en este punto donde se obtiene el valor máximo de µ a niveles de saturación de sustrato. El crecimiento permanece constante durante esta fase. las células se han adaptado a las nuevas condiciones de crecimiento. la tasa de crecimiento máxima µ max . Fase estacionaria: ocurre cuando se agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado.5 ESCALAMIENTO DE FERMENTACIONES Escalamiento significa un cambio en la escala de volumen de proceso. Fase de muerte: también llamada fase de decaimiento. Este cambio generalmente viene acompañado de dificultades debido a que muchos de los parámetros de proceso se encuentran directamente relacionados con el tamaño y geometría del reactor. temperatura y concentración de oxígeno disuelto. En esta fase la reserva de energía de las células se ha acabado. 1998). La biomasa incrementa sólo gradualmente o permanece constante durante la fase estacionaria. aunque la composición de las células puede cambiar (Sánchez. 2003. 1998). 2004). Duarte. El tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del microorganismo y el proceso utilizado (Sánchez. evitando que se reduzca su productividad (Parra. este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular. El crecimiento celular desciende lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar ocurriendo crecimiento. 2003. 2. Duarte. debido a condiciones de inanición o como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas células. cuando se han formado sustancias tóxicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH. Dependiendo de las necesidades. El objetivo principal es cambiar la escala de una reacción biológica aumentando o disminuyendo el volumen de trabajo. el escalamiento puede hacerse desde un resultado de laboratorio o desde determinadas condiciones ambientales obtenidas a 45 . Quintero. A nivel de laboratorio se opera en frascos agitados (∼ 500 mL) o pequeños fermentadores. tanto en sus variables fisicoquímicas como biológicas. Los diferentes escenarios que pueden presentarse son: un proceso nuevo y una planta nueva. pH y composición del medio de cultivo). donde se buscan nuevos productos. Si se selecciona el segundo criterio. que posteriormente pueda trasladarse a escala industrial. termodinámica y los fenómenos de transferencia de masa. En los fermentadores de producción (5.nivel de producción industrial. El problema del paso de una escala a otra (escalamiento) es uno de los de mayor importancia no sólo en fermentación sino en la industria en general. En la planta piloto (5-500 L). es necesario determinar el tamaño mínimo a utilizarse a nivel de laboratorio o planta piloto. 2004. conocer las herramientas de trabajo que se tienen a disposición para iniciar el escalamiento. un proceso nuevo en un equipo existente. Por lo general el escalamiento consta de tres etapas. 2003). 1981). En el caso de la fermentación aeróbica. 1981). el predecir resultados a escala de producción basados en el escalamiento de datos obtenidos en el laboratorio o en la planta piloto requiere un análisis cuidadoso de cada una de las escalas. Para entender el proceso de escalamiento se deben tener en cuenta todos los fenómenos que ocurren en el biorreactor como la cinética de las reacciones. temperatura y control de pH. se mejoran las cepas de producción y se ajustan las condiciones óptimas para el crecimiento del microorganismo (temperatura. se estudian mecanismos de control. Es además necesario. se selecciona un parámetro de escalamiento y se estudian efectos de aireación. y esa manera dependerá a su vez del tipo de problema particular que se trate (Quintero. En el caso en el que se tienen los equipos y se pretende trasladar las condiciones de operación de uno a 46 . 2003). agitación.000 L) se validan los resultados obtenidos en la planta piloto y se debe operar siguiendo un calendario fijo (Jiménez y Rojas.000- 400. La solución de estos problemas depende de la manera que se escoja para atacarlos. calor y fluidos (Jiménez y Rojas. o la modificación del equipo existente para lograr una optimización del proceso (Parra. aunque esta no es una tarea fácil debido a las limitaciones dimensionales y económicas que restringen los procedimientos de escalamiento (Quintero. 1981). En biotecnología es común el uso de las reglas empíricas. sus necesidades y las limitaciones que se presentan en la fermentación y el valor en el cual se debe mantener constante se selecciona cuando el valor de la variable de respuesta se vuelve independiente de este o presenta un máximo.otro (revoluciones por minuto. cuando la transferencia de oxígeno juega un papel fundamental en el proceso y la velocidad en la punta del agitador cuando los microorganismos son sensibles a esfuerzos cortantes (Jiménez y Rojas. lo importante es establecer relaciones entre las variables que aseguren la similitud en el medio ambiente al cambiar de escala. Para la selección de este parámetro es necesario estudiar el efecto que este presenta sobre el rendimiento de la variable de respuesta a evaluar en el producto final de la fermentación. 1998).) del fermentador y procurar que se mantengan las mismas condiciones de mezclado. El parámetro de operación se elige de acuerdo a cada microorganismo. número de impulsores. 2003). etc. La metodología del cambio de escala se fundamenta en la selección de una estrategia con el propósito de predecir el comportamiento de las variables no controladas y su consecuencia sobre el diseño global del proceso (Duarte. Desde el punto de vista de diseño se debe tratar de delinear las variables físicas (geometría. agitación y aireación. 47 . análisis de régimen (análisis de proceso para encontrar las etapas limitantes). Dentro de estas metodologías se encuentran los métodos fundamentales (ecuaciones de microbalances de transferencia de momento. Entre los más utilizados se encuentran el k L a . masa y calor). semifundamentales (ecuaciones simplificadas de transporte). análisis dimensional (basada en analogías de las ecuaciones generadas de los balances de momento. masa y calor) y reglas empíricas (de acuerdo con la experiencia se fijan condiciones que son factores limitantes del proceso). cantidad de aire por minuto. potencia por unidad de volumen). que consiste en mantener constante el valor de un parámetro de operación en ambas escalas. velocidad de agitación y concentración de nutrientes) (Duarte. disminuye la potencia por unidad de volumen en la misma proporción que aumenta la escala del fermentador. agitación y aireación (Asenjo . generando altos costos de operación. el número de Reynolds y el tiempo de mezclado no son buenos criterios de escalamiento. según Quintero (1981). puede verse perturbado por las condiciones que afectan el crecimiento de los microorganismos y la formación de productos en un proceso bioquímico (temperatura. 2. pH. y en el segundo se requiere un consumo de potencia muy alto.6 CONDICIONES Y CRITERIOS DE ESCALAMIENTO Existen diversos criterios de escalamiento. presión. que se encuentran directamente vinculados con las variables que afectan de manera importante el sistema de producción. Shuler. velocidad en la punta del impulsor. provocando que el k L a disminuya (Quintero. entre otros.1995. siendo necesarios sistemas más eficientes de calentamiento. Sin embargo. Las variables más críticas son la temperatura y la concentración de oxígeno porque al incrementar el volumen se hace más difícil la transferencia de calor y la transferencia de masa. Entre estos se encuentran: número de Reynolds. tiempo de mezcla. 1998). Escalar utilizando como criterio la velocidad de la punta del impulsor cuando las células microbianas o agregados celulares pueden afectarse por grandes esfuerzos constantes. potencia por unidad de volumen (P/V).El escalamiento. coeficiente volumétrico de transferencia de masa ( k L a ) y similitud geométrica del reactor. 1981). 2001). En el primer caso porque P/V es demasiado pequeño y no aseguraría una buena translación. 48 . lo que se ve interferido por su baja solubilidad en agua. Difusión desde la fase gaseosa hasta la interfase gas-líquido 2.1 Transferencia de masa Para suministrar aireación al medio de cultivo. Transporte a través de la segunda región de líquido no mezclada asociada con las células 6. Transporte a través de la membrana celular para obtener una reacción intracelular. Difusión del soluto a través de la región líquida no mezclada alrededor de la burbuja.6. debe pasar a través de una serie de resistencias de transporte (figura 4). que es del orden de 9 ppm a una presión de 1 atm y 20 °C (la solubilidad de los gases disminuye al aumentar la temperatura) (Gómez. 2003. Transporte del soluto a través de la fase líquida hasta una segunda región de líquido relativamente no mezclada alrededor de la célula. en la mayoría de los casos se utiliza aire como fuente de oxígeno debido a su disponibilidad y bajo costo.De acuerdo con lo anterior. 2003): 1. 2003). 1981). Jiménez y Rojas. 5. 2005). Movimiento a través de la interfase gas-líquido 3. Adicionalmente. como se mencionan a continuación (Sánchez. sin embargo. Transporte por difusión en la pared celular 7. para que el oxígeno pueda ser transferido desde una burbuja de gas a una de fase líquida que contiene células. 4. esta provisión tiene que ser lo suficientemente alta para satisfacer la demanda de los microorganismos (Sepúlveda. 2. 49 . al parecer los mejores criterios para pasar de una escala a otra son la relación P/V y el k L a (Quintero. Figura 4. Regiones de estancamiento Burbuja Cultivo de gas celular Reacción bioquímica Célula Fase líquida Membrana celular Interfase Interfase gas-líquido líquido-célula Fuente: Parakulsuksatid. 2000 Para que no existan limitaciones de transferencia de oxígeno. Transporte de oxígeno de una burbuja de gas hasta el interior de la célula. o en un caso crítico. igual a la demanda de oxígeno ( OUR ). La transferencia de oxígeno (masa) está dada por la ecuación numero 3 (Jiménez y Rojas. 2003): Na = k L a (C * − C ) = OTR (3) Donde: Na : Velocidad total de transferencia de oxígeno por unidad de volumen kL : Coeficiente de transferencia de oxígeno en la fase líquida (estancamiento o frontera) a: Superficie de intercambio específico k L a : Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno C * : Concentración de aire disuelto en la fase frontera gas-líquido C: Concentración de aire disuelto en el seno de la solución OTR : Velocidad de transferencia de oxígeno 50 . la velocidad de transferencia de oxígeno a los microorganismos ( OTR ) siempre debe ser mayor. En fermentaciones aeróbicas. adicionalmente. 2003). el oxígeno se presenta en una condición no limitante para el crecimiento de los microorganismos. OUR se incrementa y como consecuencia la concentración de oxígeno disuelto disminuye. aun cuando las células pueden estar respirando a su máxima velocidad de demanda específica de oxígeno ( QO2 max ). A partir de este valor un incremento en la biomasa ya no dispone del oxígeno que necesita para su desarrollo normal (Jiménez y Rojas. A unas concentraciones de operación definidas. la concentración de oxígeno en el medio ( C O2 ) se incrementa y se aproxima al valor de saturación ( C * O2 ). 51 . la transferencia de masa esta determinada por el valor del coeficiente de transferencia de oxígeno o k L a . una alta concentración celular hará que el valor de oxígeno disuelto alcance la concentración crítica de oxígeno ( Ccrit ) cuyo valor depende de las características fisiológicas de los microorganismos. A medida que la concentración de biomasa se incrementa.Y la demanda de oxígeno por la ecuación 4: OUR = QO2 x (4) Donde QO2 es la demanda específica de oxígeno y x es la concentración de biomasa. Es importante tener en cuenta que este factor es función de muchas variables relacionadas en diferentes correlaciones. A Ccrit el cultivo aún cuenta con la cantidad de oxígeno demandada por la concentración celular presente. que como se mencionó anteriormente. generalmente se constituye en el criterio de escalamiento. A bajas concentraciones celulares la OTR es baja. Así. que incluyen el diámetro. 1981). esfuerzos cortantes y producción de espuma (Parra. y depende tanto de variables de operación como la agitación y la aireación. potencia y densidad. 2005. 2004). se usa para medir la capacidad de aireación de un reactor. viscosidad y composición del medio de cultivo. concentración de oxígeno disuelto. cambia en el transcurso de la fermentación. agente antiespumante y temperatura (Sepúlveda. provocando turbulencia y homogenización del cultivo. El propósito principal de la aireación es poner en contacto el gas que generalmente es oxígeno con el líquido o caldo fermentativo. 2003). estructura del microorganismo. así como del diseño y las condiciones de operación del mismo. 2003). debido a que puede ocurrir que se elija un k L a menor que el necesario y al hacer el cambio de escala. Sánchez. Por otra parte el burbujeo también sirve como medio de agitación (Jiménez y Rojas. temperatura. mientras que la agitación pretende dispersar las burbujas del gas para disminuir su tamaño (a menor tamaño de burbuja mayor área de contacto y aumento de la transferencia de masa). generando al mismo tiempo una variación en las condiciones de operación como la disponibilidad de nutrientes. La aireación y agitación son los parámetros ambientales que se encuentran directamente relacionados con el coeficiente de transferencia de masa y por lo tanto son los que pueden alterarlo.El coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno o k L a es considerado como un parámetro crítico para el funcionamiento del biorreactor. Al emplear como criterio el k L a deben especificarse las condiciones ambientales y tiempo de fermentación en el que fue determinado. descubrir que no es suficiente (Quintero. tasa de agitación. 52 . pH. capacidad. diseño de eliminación de gas. Taguchi. Westertep y Hatch. 1981). entre otros (Quintero. La tasa de transferencia de oxígeno. 1981). disminuir la viscosidad. se encuentran el método dinámico. Hospodka. Cuando se desea modificar el k L a para aumentarlo. Richards. Fukuda. Entre ellas se encuentran la de Cooper . cambiar el diámetro del impulsor o el número de bafles. variar el tamaño del inóculo o aumentar la potencia por unidad de volumen (P/V) (Quintero. 2003). la aireación o la presión. la medición directa de la tasa de transferencia volumétrica de oxígeno y el método indirecto o de desgasificación (Sánchez.1 Determinación de la transferencia de oxígeno. Entre los diferentes métodos experimentales. N). algunos de ellos son: diluir el caldo de fermentación. el método del sulfito.1.2. Humphrey. puede determinarse mediante correlaciones empíricas o métodos experimentales. aumentar la agitación (revoluciones por minuto. 53 .6. pueden realizarse diferentes cambios. Las correlaciones de k L a son muy abundantes pero ninguna es de uso general y casi todas se basan en la oxidación del sulfito de sodio (Na2SO3) y por lo tanto solo sirven como una guía. Mosquera. las demás fermentaciones y pruebas se realizaron en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad EAFIT en la ciudad de Medellín. y en el laboratorio de Investigaciones en Microbiología del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. Cundinamarca.2 MICROORGANISMO La cepa empleada durante la investigación es un aislado nativo de levadura tipo Saccharomyces spp. ubicada en el Centro de Investigación Tibaitatá. 54 .1 UBICACIÓN Las fermentaciones preliminares fueron llevadas a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ruminal del programa de fisiología y nutrición animal de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA). perteneciente al banco de germoplasma de microorganismos con interés en control biológico de CORPOICA y que fue donado a la empresa ALQUERIA S. 3.A para el desarrollo de un proyecto de innovación tecnológica. MATERIALES Y MÉTODOS 3. 3. 3. peptona universal (5 g/L) (Merck).
YM modificado con melaza: compuesto por extracto de malta (3 g/L) (Oxoid). peptona universal (5 g/L) (Merck) y dextrosa (10 g/L) (Driver). extracto de levadura (3 g/L) (Oxoid). peptona universal (5 g/L) (Merck) y dextrosa (30 g/L) (Driver).1 Medios de cultivo
YM sólido: compuesto por extracto de malta (3 g/L) (Oxoid). Los medios de cultivo fueron previamente esterilizados durante 15 minutos a 121 ºC y 15 psi en una autoclave horizontal EASTERN modelo EA-620T antes de su uso. extracto de levadura (3 g/L) (Oxoid).3.
YM Líquido: compuesto por extracto de malta (3 g/L) (Oxoid). extracto de levadura (3 g/L) (Oxoid). dextrosa (10 g/L) (Driver) y agar (20 g/L) (Merck). peptona universal (5 g/L) (Merck) y melaza (30 g/L). 55 . extracto de levadura (3 g/L) (Oxoid).3 MATERIALES 3.
YM modificado: compuesto por extracto de malta (3 g/L) (Oxoid). De este volumen. 3. Fuente: Autor. a los cuales se ajustó el pH a 4. en medio YM sólido después de 48 h de incubación (cultivo de reserva). incubándolo por 48 h a 30 ºC en una incubadora digital WTC Binder. se tomó el 10 % en un erlenmeyer de 50 mL para el preinóculo y el otro 90 % en un erlenmeyer de 1000 mL 56 .3. luego se almacenó a 4 ºC y fue subcultivado cada mes para mantener su viabilidad.3 Preparación del pre-inóculo e inóculo Se prepararon 200 mL de medio YM líquido.5 con soluciones de HCl (10 %) y NaOH (2 N). se realizó un cultivo de reserva en cajas petri con el mismo medio.2 Activación de la cepa La cepa activa fue suministrada directamente por ALQUERIA S.3. Fotografía de la cepa de levadura Saccharomyces spp.3.A en caja petri con medio YM sólido y se encontraba en fase de crecimiento adecuada para repicarse. Para obtener la cepa de trabajo (figura 5). Figura 5. consistió en introducir el agitador orbital New Brunswick Scientific C1 Classic series dentro de una incubadora a una temperatura constante.3.1 Condiciones de operación Para determinar el tiempo total de cultivo y evaluar los diferentes medios.4 Biotransformaciones 3.3. poseen controladores manuales que permiten regular las revoluciones de trabajo y temperatura deseada. 3.4. El montaje realizado con el fin de garantizar las condiciones de temperatura y agitación necesarias.3. 57 . al cabo de las cuales el cultivo fue depositado en el erlenmeyer de 1.2) y fue llevado a un agitador orbital New Brunswick Scientific C1 Classic series. Tanto el volumen del pre-inóculo como el de los inóculos corresponde al 10% del volumen de trabajo en cada fermentación. a 120ºC por 15 minutos.1.1 Fermentaciones Preliminares En esta etapa se estableció la cinética de crecimiento para determinar el tiempo total de cultivo y posteriormente se llevaron a cabo fermentaciones para evaluar la producción de biomasa en los diferentes medios de cultivo propuestos por Manovacía y Moreno (2005). 3. Tanto el agitador como la incubadora.3.para el inóculo y se llevaron a esterilización en un autoclave horizontal EASTERN modelo EA-620T. El preinóculo se preparó adicionando una azada proveniente de la caja petri con medio YM (numeral 3.000 mL bajo las mismas condiciones de agitación temperatura y tiempo. a 150 RPM y 28 ºC por 12 horas.4. se realizaron fermentaciones en erlenmeyers de 500 mL con 250 mL de medio. 3. Las muestras fueron congeladas a -10 ºC y posteriormente procesadas para determinar la concentración celular por conteo en cámara de Neubauer y por la técnica del peso seco. Los ensayos se realizaron por duplicado cada uno con 3 repeticiones. Con el fin de determinar el mejor crecimiento celular en los diferentes medios de cultivo. Las muestras fueron congeladas a -10 ºC y posteriormente procesadas para determinar la concentración celular por la técnica del peso seco y el sobrenadante se conservó para determinarle la concentración de azúcares reductores por la técnica del DNS. la fermentación se llevó a cabo durante 22 h.4. 25 ºC y 150 RPM.2 Toma de muestras Para establecer la cinética de crecimiento se tomaron muestras antes y después de la inoculación (tiempo 0) y cada 2 horas durante 24 h.5 en medio YM modificado con melaza.1.3). después de la inoculación (tiempo 0) y a las 24 h. quienes previamente habían trabajado con la cepa utilizada en esta investigación. a pH 4. se realizaron fermentaciones en medio YM líquido. YM modificado y YM modificado con melaza durante 24 h.3. Para determinar el mejor medio de cultivo. a 25 ºC y 150 RPM las cuales fueron inoculadas con una cantidad de células necesarias para obtener una concentración celular inicial de 1*107 células/mL. ajustados según un previo conteo realizado en cámara de Neubauer como lo sugirieron Manovacía y Moreno (2005).Para establecer la cinética de crecimiento se prepararon el pre-inóculo e inóculo (numeral 3. se tomaron muestras al medio antes de la inoculación. 58 .3. Según el diseño de experimentos (ver numeral 3.1 Condiciones de operación Las fermentaciones se llevaron a cabo en erlenmeyers de 1.54 cm a diferentes velocidades de agitación.4.3. El pH fue ajustado al medio de cultivo (YM modificado con (numeral 3.4) se estableció la velocidad de agitación y el pH del medio de cultivo 59 .000 mL con un volumen de trabajo de 250 mL.4.3. 3.2.3) y se llevó a agitación durante 12 h a una temperatura de 28 ºC ± 2 ºC. Figura 6.2 Fermentaciones en frascos agitados Los erlenmeyers se ubicaron en un agitador orbital New Brunswick Scientific C1 Classic series con diámetro de orbita de 2.3. Montaje de las fermentaciones en frascos agitados Fuente: Autor.3. 60 . las muestras se congelaron a -10 ºC hasta su procesamiento para determinar la producción de biomasa por el método de peso seco y el consumo de azúcares por DNS.3. temperatura. En cada toma de muestra se registró el pH mediante un pH metro ex situ marca Metrohm. espuma. en el tiempo 0 y cada 2 horas.2.3. pH.2 Toma de muestras Se tomaron muestras al medio antes de la inoculación. Este equipo está equipado con un controlador de agitación.4.4.3. oxígeno disuelto. Se utilizaron 2 turbinas tipo rushton de 6 aspas planas.3 Fermentaciones en biorreactor Para las fermentaciones batch se utilizó el biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 (figura 7) de 3 L con un volumen de trabajo de 2 L. nivel del recipiente y flujo de bombas peristálticas. 3. Los ensayos se realizaron por duplicado y con 3 repeticiones. 3. una agitación de 150 y 200 RPM. 3.3.3. el cual no se controló durante la fermentación. 61 .2 Toma de muestras Se tomaron muestras al medio antes de la inoculación.4. 3.4. Las muestras se congelaron a -10 ºC hasta su procesamiento para determinar la producción de biomasa por el método de peso seco y el consumo de azúcares por DNS. Fuente: Autor. aireación de 1vvm y a un pH inicial de 4. En cada toma de muestra se registró la temperatura mediante el controlador del equipo y el pH con un pH metro ex situ marca Metrohm.Figura 7. Biorreactor BIOENGINEERING CH 8636. en el tiempo 0 y cada 2 horas durante 12 horas.3.1 Condiciones de operación El equipo se trabajó con un volumen de 2 L. una temperatura de 28º C. 3. En la primera se realizaron fermentaciones en agitadores orbitales para confirmar la formulación del mejor medio de cultivo para la producción de biomasa de un aislado de levadura según lo reportado por Manovacia y Moreno (2005). Este diseño de experimentos consistió en un arreglo de 2 factores (pH y agitación) y 3 niveles cada uno por triplicado.4 DISEÑO METODOLÓGICO La metodología experimental se llevó a cabo en 3 etapas. Diseño de experimentos para la evaluación en agitadores orbitales pH Agitación (RPM) 4 100 5 100 5.5 150 4 200 5 200 5. En la tabla 3. En la segunda etapa se llevaron a cabo fermentaciones en un agitador orbital para determinar los efectos del pH y la agitación sobre la cinética de producción de biomasa y de consumo de sustrato.5 100 4 150 5 150 5.5 200 62 . se muestran los valores para cada nivel y la combinación en que fueron evaluados. Tabla 3. A partir de estos resultados se evaluó la producción de biomasa mediante 2 técnicas diferentes: la técnica del peso seco y conteo celular en cámara de Neubauer y se eligió el medio más adecuado para realizar las etapas siguientes. 63 . para establecer en cual medio de cultivo de los utilizados hubo una mayor producción de biomasa.4.0.A partir de la evaluación de la cinética de producción de biomasa y consumo de sustrato se evaluó la máxima velocidad específica de crecimiento ( µ max ) por medio del modelo exponencial y el rendimiento de sustrato en biomasa. se ajustaron las condiciones del proceso y se llevó a cabo una tercera etapa. En la primera etapa se realizó un análisis de varianza unifactorial (ANOVA).
Hipótesis del pH: no ejerce un efecto significativo sobre la variable de respuesta. En la prueba ANOVA se establecieron 3 hipótesis nulas:
Hipótesis de interacción: no hay efecto de interacción entre el pH y la agitación (RPM). con el fin de determinar si el pH y la agitación ejercieron un efecto significativo sobre la variable de respuesta del sistema.1 Análisis estadístico Los análisis estadísticos se realizaron con ayuda del software STATGRAPHICS PLUS 5. De acuerdo con la información obtenida en el agitador orbital. Para la segunda etapa se realizaron pruebas de análisis de varianza multifactorial (ANOVA). 3. Esta última consistió en escalar el proceso fermentativo a un biorreactor de 3 L por medio del método de k L a constante con el fin de reproducir la concentración final de biomasa (g/L) obtenida en el agitador orbital.
Hipótesis de las RPM: no ejercen un efecto significativo sobre la variable de respuesta. Para las comparaciones múltiples de medias, se utilizó la prueba Student- Newman- Keuls y se chequeó la homogeneidad de varianzas mediante la prueba de Barttlet’s. El nivel de significancia usado en las pruebas fue de 0,05. 3.5 MÉTODOS ANALÍTICOS 3.5.1 Concentración celular por conteo Este método indirecto para determinar los microorganismos viables, consiste en poner una alícuota de 20 µL proveniente de una dilución 103 sobre la cámara de Neubauer, posteriormente se realiza un conteo con ayuda del microscopio. El conteo fue realizado en 5 campos por cada cuadrante. Para obtener la concentración celular, fue necesaria aplicar la ecuación 5:  ∑ 5campos  Celulas = 16 * 10 4 × Factor.de.diluciòn × promedio  (5)   20  3.5.2 Determinación de biomasa La cantidad de biomasa se determinó mediante Densidad Óptica (DO) a una longitud de onda de 600 nm en un espectrofotómetro marca Cole Parmer, Helios Gamma, y se relacionó con el peso seco (PS) mediante una curva de calibración. La concentración celular se expresó en gramos por litro [g/L]. (Ver anexo A) 64 3.5.3 Cuantificación de consumo de sustrato Para determinar el consumo de sustrato se realizó la cuantificación de los azúcares reductores mediante la técnica del DNS (Acido 3, 5 Dinitro Salicílico) (Miller et al., 1958). Mediante una curva de calibración se relacionan la absorbancia leída en un espectrofotómetro marca Cole Parmer, Helios Gamma a 540 nm y la concentración de azúcares [g/L]. (Ver anexo B). 3.6 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS 3.6.1 Máxima velocidad de crecimiento especifico Para determinar la cinética de crecimiento del microorganismo, se asumió una reacción de orden uno y se graficó el logaritmo natural de la concentración celular (Ln x ) contra el tiempo (t) de la fase exponencial. La pendiente de esta línea corresponde a la máxima velocidad especifica de crecimiento ( µ max ) y el intercepto al logaritmo natural de la concentración celular en el tiempo 0 (Ln x0 ). 3.6.2 Rendimientos observados El rendimiento observado se calculó al graficar la concentración de la biomasa [ x ] contra la concentración del sustrato [S] obtenidos durante todo el tiempo de fermentación. La linealización de los resultados permite determinar la pendiente que es equivalente al rendimiento observado para la biomasa en el sustrato (Y’ x s ), según se describe en la ecuación 6. dx rx Y `x s = − = (6) dS rS 65 3.7 ESCALAMIENTO 3.7.1 Desde frascos agitados hasta biorreactor Después de determinar las mejores condiciones de pH y RPM a nivel de frascos agitados, se escaló el proceso teniendo como parámetro de escalamiento el k L a y mediante la ecuación planteada por Maier et al., (2001). A partir de estos resultados y con ayuda de una caracterización realizada al biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 a partir de la cual se obtuvo una gráfica que correlaciona el k L a con las RPM, fue posible establecer las condiciones a utilizar en el equipo. Como la biomasa obtenida al final de esta etapa presentó diferencias estadísticamente significativas en relación a las de los frascos agitados, se decidió realizar una nueva fermentación en el biorreactor a las mejores condiciones encontradas en la escala anterior. De este último ensayo, se obtuvieron valores consistentes con los encontrados en el caso de frascos agitados, por lo tanto estas fueron las condiciones utilizadas para la etapa siguiente. 3.7.2 Biorreactores. Teniendo las mejores condiciones de cultivo para la cual se obtuvo una buena cantidad de biomasa a nivel de biorreactor a 2 L, se procedió a realizar el escalamiento conceptual utilizando la correlación del k L a reportada por Van’t Riet (1979) como criterio de escalamiento hasta un volumen de trabajo de 100 L. Este escalamiento se realizó en 2 etapas con el fin de mantener las relaciones del sistema, para esto fue necesario determinar los datos de operación y diseño según las correlaciones reportadas por Doran para cada volumen (1999) (Anexo H) como el diámetro interno del reactor, diámetro del impulsor, altura del líquido, altura del fondo del reactor al impeler, ancho del impeler, alto del impeler y ancho del bafle. Adicionalmente, fue necesario determinar algunas propiedades del medio de cultivo como la densidad y viscosidad, y el valor experimental del k L a , determinado por el 66 El valor del k L a se determina mediante un balance de masa para el oxígeno disuelto en un medio líquido en estado inestable (Parakulsuksatid. según se describe en el numeral 3. Teniendo toda la información pertinente se llevó a cabo un proceso de cálculo que se detalla en los resultados.7. 3. 2005).2. aireación. caudal de aire y potencia necesarias para el buen desempeño de la fermentación que permita obtener una cantidad de biomasa análoga a la generada tanto en frascos agitados como a nivel de biorreactor a un volumen de 2 L.2.1. mediante el cual fue posible determinar las condiciones adecuadas para cada escala garantizando una agitación. 2000).7.método dinámico por Llano (2006) en una fermentación de levaduras comerciales Saccharomyces cerevisiae.1 Determinación del coeficiente volumétrico de transferencia de masa ( kL a ) El coeficiente de transferencia de masa se determinó para las fermentaciones realizadas en el biorreactor a las 12 horas de cultivo mediante el método dinámico de eliminación de gas. En esta técnica la estimación del k L a se lleva a cabo durante la fermentación. y por lo tanto la valoración de la eficiencia del reactor es más real (Sepúlveda. (Ver anexo C) 67 . al cabo del cual el microorganismo ya se encontraba en fase estacionaria. Primero se realizaron fermentaciones preliminares para determinar el tiempo de cultivo y el mejor medio de cultivo para la producción de las levaduras nativas.1 BIOTRANSFORMACIONES Los experimentos se llevaron a cabo en tres etapas.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4. 4. Saccharomyces spp. De estas curvas independientes entre sí. Posteriormente se realizaron fermentaciones en frascos agitados a temperatura constante y diferentes niveles de agitación y pH para determinar las mejores condiciones que permitieran obtener la mayor cantidad de biomasa posible.1. se estableció un tiempo de cultivo de 12 horas. 68 . presentó un comportamiento exponencial el cual se puede observar en la figura 8. La cinética de crecimiento celular para Saccharomyces spp.1 Fermentaciones preliminares Las fermentaciones preliminares se realizaron con el fin de determinar el medio de cultivo adecuado para producir una mayor cantidad de biomasa. obtenida en el medio de cultivo YM modificado con melaza en agitador orbital. 4. Finalmente se realizó un escalamiento en biorreactor de 2 L para comprobar las condiciones de la escala anterior. (Anexo D). Curvas de crecimiento preliminares para Saccharomyces spp. se determinó el consumo de sustrato y se obtuvó una concentración que paso de 43 g/L (hora 0) a 8 g/L (hora 12). en medio YM modificado con melaza. por lo tanto la producción de biomasa es baja. se muestra el promedio de la concentración celular al cabo de 24 h de fermentación para cada medio y por los dos métodos evaluados con sus respectivos errores estándar (barras verticales). Con respecto a la evaluación del mejor medio de cultivo para la producción de biomasa (figura 9) se determinó que el mejor medio de los estudiados para llevar a cabo las fermentaciones fue el YM modificado con melaza.Figura 8. mientras que se favorece la producción de etanol. Aunque los valores encontrados por las dos técnicas fueron muy diferentes. para confirmar que este tiempo era el adecuado. el mejor crecimiento siempre se presentó en el medio YM modificado con melaza (Anexo D). concentración a la cual las células presentan un metabolismo respiro- fermentativo. En la figura 9. lo cual se comprobó al determinar la biomasa tanto por el método del peso seco como por conteo en cámara de Neubauer. Adicionalmente. debido a que el crecimiento celular presenta un mejor desempeño con respecto a los demás medios estudiaos. 69 . Evaluación de los medios de cultivo para el crecimiento de la levadura nativa. la producción de biomasa se afecta significativamente (P. lo que confirma que aunque el microorganismo presenta un crecimiento para todos los medios estudiados. indicando que el análisis de varianza es válido debido a que hay homogeneidad en los datos. Se llevó a cabo un análisis estadístico para la biomasa determinada únicamente mediante la técnica del peso seco. a partir de la cual.05.05) por el medio de cultivo empleado para su crecimiento. de acuerdo con los cuales. es posible 70 . Este análisis se realizó no solo para corroborar que el mejor medio fue el YM modificado con melaza. que arrojó un P.valor superior a 0. sino para observar si es relevante el uso de diferentes medios de cultivo en la producción de este tipo de levaduras. ya que esta fue la técnica que se utilizó en todas la etapas de la investigación. Inicialmente se utilizó la prueba de Bartlett’s para comprobar la variabilidad de los datos. por las técnicas de peso seco y conteo en cámara de Neubauer. Saccharomyces spp. Esto se comprobó realizando la prueba de las medias esquematizada en la figura 9.. Posteriormente se realizó la prueba unifactorial ANOVA tomando como variable dependiente la biomasa (g/L) y el medio como factor. En la tabla 4 se muestran los resultados.Figura 9.valor < 0. se adapta mejor a la formulación con mayor cantidad de fuente de carbono. 50302 6 0.afirmar que para el medio de cultivo con melaza el crecimiento celular fue mucho mejor y presenta valores significativamente mayores que los arrojados por los medios YM líquido y YM modificado. presentando como grupos homogéneos a los ensayos realizados con medio YM líquido y YM modificado (Anexo D). la concentración inicial fue 1. La sacarosa puede sufrir una hidrólisis pasando de ser azúcar no reductor a reductor. solo se muestran las fermentaciones de cada ensayo que presentaron un mejor 71 . Análisis de Varianza para el mejor medio de cultivo. esta formulado con 30 g/L de melaza y de acuerdo con el DNS realizado para las fermentaciones preliminares (Figura 8). La prueba Student-Newman-Keuls confirma esta hipótesis. 2005).5783 69. sin embargo.1566 2 40. Suma de Cuadrado Fuentes GL F-Ratio P..583837 Total (Corr.1.2 Fermentaciones en frascos agitados Los resultados obtenidos en las fermentaciones fueron reproducibles. Tabla 4.valor cuadrados de medias Between groups 81. glucosa y fructosa (Jaramillo y Millán. Saccharomyces spp.50 0.) 84. esto permite concluir que a una concentración inicial entre 30 y 40 g/L de melaza es posible obtener un crecimiento celular adecuado de las levaduras nativas estudiadas. 4.0001 Within groups 3.43 veces mayor. La causa puede deberse a que la melaza no es un compuesto homogéneo producto de su alta viscosidad y a la presencia de diferentes azúcares como la sacarosa. Sin embargo. este último reconocido por la técnica de empleada para la determinación del consumo de sustrato.6596 8 Teóricamente el medio de cultivo YM modificado con melaza. La cinética de crecimiento y consumo de sustrato de Saccharomyces spp. principalmente glucosa. mientras que en la fase exponencial se consumió el sustrato hasta llegar a la fase estacionaria (Anexo E). 72 . Los cultivos batch que se llevaron a cabo en frascos agitados. Posteriormente el microorganismo inició la fase de crecimiento exponencial. Durante la fase de latencia no se observó un consumo de sustrato apreciable. es decir en el período exponencial de crecimiento. La evolución del consumo de sustrato durante el desarrollo de cada fermentación se debió a la disminución en la concentración inicial de azúcares reductores. en medio YM modificado con melaza a diferentes agitaciones y pH en frascos agitados. las curvas independientes de biomasa (figuras 10 A-C) mostraron una fase de latencia de 1 hora aproximadamente. la cual tuvo una duración de 8 horas. y finalmente 4 horas de fase estacionaria.1 Producción de biomasa y consumo de sustrato. y resultó consistente con la aparición de la fase estacionaria en las curvas de crecimiento. motivo por el cual.2. el comportamiento del pH y los parámetros cinéticos son los correspondientes a estas mismas fermentaciones. iniciaron con un inóculo correspondiente al 10 % del volumen total de trabajo de elevada actividad.1. Con esto último se pretendió minimizar el tiempo total de la fermentación. Los valores presentados para representar el consumo de sustrato. se pueden observar en las figuras 10 A-C. al cabo de la cual el microorganismo se encontró adaptado a su medio de cultivo. 4.desempeño en cuanto a la producción de biomasa a los diferentes pHs y agitaciones. La producción de biomasa y consumo de sustrato se cuantificaron en g/L (Anexo E). inhibición por producto o alta concentración celular y por ende poca disponibilidad de oxígeno en el medio de cultivo. la concentración de azúcares disminuyó en un 70% aproximadamente.Debido al consumo de la fuente de carbono demandada por el microorganismo. Producción de biomasa y consumo de sustrato (A) 100 RPM. (B) 150 RPM y (C) 200 RPM. A partir de este punto el microorganismo cesó su crecimiento probablemente por múltiples factores: disminución del pH. A B 73 . Figura 10. agotamiento de los nutrientes. sin embargo esta variación fue tan baja que estos valores no presentaron una diferencia significativa. 2005). glucosa y fructosa (Jaramillo y Millán. Estos azúcares reductores son reconocidos por la técnica de DNS empleada para la determinación del consumo de sustrato. De una concentración inicial de alrededor de 1. que a pesar de que el medio de cultivo se preparó de la misma forma. la única diferencia. 2005). Cabe anotar. Estos resultados son confiables ya que de los errores estándar presentaron valores muy pequeños. C Aunque las fermentaciones en frascos agitados presentaron comportamientos reproducibles. su posterior esterilización posiblemente provocó un ligero aumento en la concentración de azúcares reductores.7 g/L es posible obtener aproximadamente 20 g/L bajo las mejores condiciones de agitación y pH. La melaza es una fuente de carbono con diferentes azúcares entre los que se encuentran la sacarosa. Una de las principales variables para la regulación del metabolismo de las levaduras bajo diferentes condiciones nutricionales es la concentración de glucosa (Frick y Wittmann. y parte de la sacarosa pudo sufrir una hidrólisis pasando de ser azúcar no reductor a reductor. es decir a pH inicial de 4 y 200 RPM. se debió a la variación en concentración de biomasa en la fase estacionaria. 74 . 05.5250 18.6108 19.8040 5.3533 5.8083 19.5 16. RPM Biomasa (g/L) pH 100 RPM 150 RPM 200 RPM 4 18. el pH y la agitación (Tabla 6).5 18.9670 18.2504 5 18.7911 19.9544 20.8170 5 17.2890 4 18.8426 18.Debido a que la fase estacionaria se presentó únicamente durante las 3 últimas horas de fermentación.8040 5 19. Promedio de la fase estacionaria de las fermentaciones que presentaron la mayor producción de biomasa en cada ensayo.0657 18.2547 18. la producción de biomasa máxima se tomó como el promedio de los valores pertenecientes a las 2 últimas horas de fermentación (10 y 12 h) (Tabla 5).7822 17.0059 19. que arroj{o un P.1472 17.4606 18.8941 18. Tabla 5.6838 5. Para comprobar la variabilidad de los datos se utilizó la prueba de Bartlett’s.5 18.6021 18.6108 4 19. indicando que el análisis de varianza es válido debido a que hay homogeneidad en los datos.7824 75 .1131 18.valor superior a 0. Posteriormente se realizó la prueba multifactorial ANOVA para 2 factores.6237 18.1774 19. 05) arrojado por el análisis estadístico. Esta prueba (Anexo E) indica que las fermentaciones realizadas a pH inicial de 4 y 5 son grupos homogéneos es decir que los resultados obtenidos con respecto a la biomasa no presentan diferencias significativas.694133 2 0. mientras que la variación de las revoluciones no produce un efecto significativo en la variable de respuesta de interés.89965 18 0.347067 0.valor cuadrados de medias EFECTO DE LAS MEDIAS A:pH 5.91 0.07 0.14 0. Esto se comprobó realizando una prueba de rango múltiple por el método de Student-Newman-Keuls que consiste en un procedimiento de comparación múltiple para determinar que tratamientos presentan diferencias significativas con respecto a los demás. y al P.383314 TOTAL (corregido) 13.valor (> 0. A pH constante y un aumento de 100 a 150 RPM se logra un leve incremento en la producción de biomasa principalmente a pH 4 y 5. es posible concluir que la producción de biomasa en las fermentaciones depende únicamente del pH.0287455 0.5. Análisis de varianza para la Producción de Biomasa Suma de Cuadrado Fuentes GL F-Ratio P. a diferencia de las obtenidas a pH 5. no hay interacción entre el pH y RPM.47374 2 2. Con respecto a las RPM.9889 RESIDUAL 6.73687 7. mientras que cuando se realiza una variación de 150 a 200 RPM. o cuáles de ellos son homogéneos.1825 26 De acuerdo con el análisis de varianza. las diferencias son tan poco significativas que todos los tratamientos presentan homogeneidad 76 . las modificaciones en la biomasa son casi cero en todos los casos.Tabla 6. esto puede observarse claramente en la figura 11.4220 INTERACCIONES AB 0.0052 B:RPM 0. Adicionalmente.114982 4 0. Figura 11. Interacciones entre el pH y las RPM teniendo como variable de respuesta la producción de biomasa. puede observarse que el valor del error estándar es pequeño. donde es posible producir 19. Adicionalmente.8 17.2389 g/L de células de levadura nativa. de la cual puede decirse que la mayor cantidad de biomasa se obtiene a pH 4 con una cantidad de 19. lo cual indica que no hay diferencias relevantes entre los datos experimentales.4 17 100 150 200 RPM En la tabla 7 se muestran los valores arrojados por el análisis estadístico.6 5.5 18.8216 g/L. Interaction Plot 19.4 pH 4 19 5 Biomasa 18.2 17. 77 . y que a su vez esta es la mejor combinación.187 g/L y a 200 RPM con 18. 5 vvm obteniendo alrededor de 3 y 4.357451 4 200 3 19.357451 5.0859 0.1034 0. Sobre la producción de biomasa con S. 900 RPM y 0. (1968).4778 0.206375 5 9 18.5 200 3 18.8239 0..5 9 18.206375 200 9 18.357451 5.5235 0.2 g/L respectivamente. 30 ºC. En la investigación realizada por Hensirisak (1997). quienes cultivaron S.5. en un medio sintético a pH 5.5 g/L de S.8231 0.Tabla 7.9929 0. Nivel Cantidad Medias Error Estándar GRAND MEAN 27 18.2131 0.8216 0.357451 A través de los años.1870 0. cerevisiae ATCC 4111 en medio YM líquido en un cultivo 78 .2361 0.2389 0.206375 5. cerevisiae existen muchas investigaciones.206375 pH by RPM 4 100 3 19.5 100 3 17.5 150 3 18.2732 0.206375 RPM 100 9 18.7045 pH 4 9 19.357451 5 150 3 18. se obtuvo una concentración máxima de 3.357451 4 150 3 19. cerevisiae LBGH 1022 en sistema batch y continuo a diferentes concentraciones de glucosa.357451 5.206375 150 9 18.357451 5 100 3 18.9528 0.8140 0. se han realizado múltiples estudios con levaduras con fines diferentes. Medias y error estándar para la producción de biomasa con un intervalo de confianza del 95%. Entre ellas se encuentra aquella realizada por Beck et al.357451 5 200 3 18. a pH 4. pH y con 1. pH 6. De otro lado. Para las fermentaciones batch en frascos agitados 79 . trazas de metales.30 ± 0.1 vvm de aireación variando las concentraciones de glucosa y galactosa en el medio de cultivo. Parakulsuksatid (2000).10-0. pH y temperatura en un Bioflo III con un volumen de trabajo de 1 L y 476 RPM y se obtuvo una producción máxima de biomasa de alrededor 6 g/L.48 ± 0. a 35 ºC. Manovacia y Moreno (2005) quienes realizaron fermentaciones batch en frascos agitados y trabajaron con la misma cepa y medio de cultivo utilizados en esta investigación. Con una cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae SU50 Calado et al.46 ± 0.. (NH4)2SO4.76 mg/mL. (2000). 600 RPM y un aireador dispersador de microburbujas (Microbubble dispersión-MBD).11 h-1 para la roja.01 g/g respectivamente.08-0. llevaron a cabo fermentaciones de 2 cepas de levaduras comerciales: “azul” y “roja”. 30ºC y 200 RPM en medios compuestos por glucosa. 25 ºC y 150 RPM durante 24 horas obtuvieron una producción de biomasa de 4.02 g/g respectivamente. y en biorreactor a las mismas condiciones de temperatura. realizó fermentaciones batch con la misma cepa.26 ± 0. K2HPO4 y MgSO4.02 g/g y 0. galactosa. agitación.02 g/g y 0. a pH 5 y 30 ºC en un medio de cultivo compuesto por glucosa. sistema de aireación. Los valores aproximados para las velocidades específicas de crecimiento durante la fase de crecimiento exponencial. Adicionalmente Rudolf et al. Como una continuación de este trabajo. El proceso se llevó a cabo en dos etapas: la primera parte se realizó en condiciones batch donde al transcurrir 40 h se obtuvo alrededor de 12 g/L de biomasa con rendimientos de sustrato en biomasa de 0.12 h-1 para la azul y de 0. realizaron fermentaciones batch y fed-batch en frascos agitados a pH 6. extracto de levadura y peptona. (2003).batch. fueron de 0.5. y en la segunda el proceso fue fed-batch y tardo 25 h al cabo de las cuales fue posible alcanzar una biomasa de 65 g/L con Y x s de 0. se obtuvo alrededor de 12 g/L de biomasa a una concentración de 40 g/L de galactosa. 30°C. donde para optimizar la producción de biomasa se requieren altas velocidades de crecimiento especifica y rendimientos de biomasa (Hoek et al.0927 h-1. con un rendimiento de 0. Generalmente la producción de biomasa de este tipo de microorganismos se realiza a nivel industrial mediante fermentaciones fed batch.26 g biomasa/g de glucosa y 0. De otro lado Llano (2006) quien utilizó el mismo biorreactor que se empleó en este estudio. 200 RPM y 1vvm. 1998).50 g biomasa/g de galactosa y velocidades especificas de crecimiento de 0. de donde se obtuvo 4. un rendimiento de 0. De lo anterior.058 h-1 en glucosa y galactosa respectivamente. puede decirse que aunque cada microorganismo presenta una actividad biológica diferente.. 80 . trabajó con levaduras comerciales Saccharomyces cerevisiae y llevó a cabo fermentaciones de 2 L en un medio de cultivo compuesto por melaza y urea a pH inicial 6.741 g/L de biomasa. mientras que en la fermentación fed-batch precedida de una fase batch se alcanzó aproximadamente 36 g/L de biomasa a una concentración de 20 g/L de glucosa y galactosa. a una concentración de 20 g/L de glucosa con 25 g/L de galactosa en biorreactor se produjo cerca de 25 g/L de biomasa con rendimientos de 0.30 g biomasa/g fuente de C y una µ max de 0.1077 g/g y una velocidad máxima de crecimiento especifico de 0.39 y 0. las levaduras nativas estudiadas contaron con los nutrientes y cantidades adecuadas que permitieron satisfacer las necesidades del microorganismo demostrando el alto potencial que posee para la producción de biomasa.025 h-1. 1. ya que de acuerdo con Vicente et al. (1997) en fermentaciones de levaduras. en ocasiones hasta alcanzar una inhibición por pH. mientras que la producción de etanol no contribuye significativamente a la producción de protones.5).2 Comportamiento del pH El pH es un factor fundamental en la producción de biomasa de levaduras.. debido a que durante el crecimiento a causa de las reacciones metabólicas se consumen o producen sustancias que generalmente acidifican el medio. (B) 150 RPM. puede observarse que al aumentar el tiempo de fermentación y biomasa celular. A 81 . la actividad metabólica es la causa principal del intercambio de protones en el medio y la cantidad de ácido o base consumidos se debe a la asimilación del nitrógeno bajo condiciones respiratorias. Este comportamiento es normal.2. (C) 200 RPM. Comportamiento del pH durante las fermentaciones (A) 100 RPM. que es más marcado en las fermentaciones que iniciaban en el mayor pH (pH 5. Por lo anterior. Figura 12. se produce un descenso en el pH.4. es un parámetro importante que debe monitorearse durante las fermentaciones. En las Figuras 12 A-C se presentan los resultados para las curvas que presentaron un mejor desempeño de todas las estudiadas a todas las combinaciones y durante todo el tiempo de la fermentación. En general. 82 . Adicionalmente. Los rendimientos dan una guía sobre la factibilidad económica del proceso.3 Parámetros cinéticos Los rendimientos y la máxima velocidad de crecimiento específico son parámetros importantes que permiten conocer mejor el sistema estudiado.2. debido a que la producción de biomasa dependen principalmente del costo de la materia prima y un microorganismo con un elevado rendimiento de sustrato en biomasa favorece la productividad del proceso. B C 4. 1998). disminuyendo el costo por remoción de calor (Duarte. la velocidad especifica de crecimiento.1. se constituye en una medida de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación del sustrato durante la fase exponencial de crecimiento del microorganismo (Duarte. Parámetros cinéticos para las fermentaciones (A) 100 RPM. (Anexo F). (C) 200 RPM. Figura 13. En las figuras 13 A-C. se determinaron los rendimientos observados de sustrato en biomasa (Y’ x s ) y la máxima velocidad de crecimiento específico ( µ max ) de las curvas que tuvieron el mejor comportamiento para cada ensayo. (B) 150 RPM. Las barras de colores oscuros corresponden al promedio de los µ max (eje izquierdo) y los claros pertenecen a los rendimientos esperados (eje derecho).1998). A B 83 . se presenta el promedio de las medias de los mejores ensayos realizados para todos los pHs y agitaciones estudiadas. Por lo anterior. A partir de estos resultados se realizó un análisis estadístico para cada parámetro. En la tabla 8 y 9 se muestran los resultados para los rendimientos de biomasa en sustrato observados (Y’ x s ) y la máxima velocidad de crecimiento específico ( µ max ). lo que indica que cualquier combinación es válida. respectivamente. que arrojó un P. los factores estudiados no afectan significativamente los parámetros cinéticos y no hay interacción entre ellos (Figuras 14 y 15). que presentaron homogeneidad en los grupos estudiados (Anexo F). indicando que el análisis de varianza es válido debido a que hay homogeneidad en los datos. C Se realizó la prueba de Bartlett’s para comprobar la variabilidad de los datos.valor superior a 0. 84 . De acuerdo con los resultados arrojados por el análisis estadístico. Posteriormente se utilizó la prueba multifactorial ANOVA para 2 factores. el pH y la agitación.05. puede observarse que tanto para los rendimientos observados como para la máxima velocidad de crecimiento específica. Esto se comprobó realizando pruebas de rango múltiple para cada factor y para los dos parámetros cinéticos. mientras que a pH 5.132293 18 0.00230007 2 0.00734963 TOTAL (corregido) 0. 85 . Contrario a lo que sucede en el caso de la biomasa.048155 2 0.0240775 3.2357 B:RPM 0.valor cuadrados medias EFECTO DE LAS MEDIAS A:pH 0.18 0.009494 18 0.000527444 TOTAL (corregido) 0. Análisis de varianza para Y’ x s Suma de Cuadrado de Fuentes GL F-Ratio P.99 0.0139521 26 En la figura 14. se observa un comportamiento similar para todos los pHs estudiados.9981 RESIDUAL 0.0000623704 4 0. donde de 100 a 150 aumenta y de 150 a 200.valor cuadrados medias EFECTO DE LAS MEDIAS A:pH 0.1661 B:RPM 0.214146 26 Tabla 9. Análisis de varianza para µ max Suma de Cuadrado de Fuentes GL F-Ratio P.0000155926 0. permanece casi constante para todos lo pHs.03 0. se puede observar que un aumento de las revoluciones de 100 a 150 RPM produce.0612 INTERACCIONES AB 0.0115211 1.00115004 2.28 0. Cuando el cambio de las revoluciones se da de 150 a 200 RPM.8321 RESIDUAL 0.1419 INTERACCIONES AB 0.5 hay un aumento.36 0.00209563 2 0.Tabla 8.0106555 4 0.00266387 0. una disminución en los rendimientos observados.0230423 2 0. en el caso de los pHs 4 y 5. los rendimientos aumentan.00104781 1.57 0. 5 0. Interaction Plot 0.25 h-1 es un valor típico para cultivos respirativos de S. con la cual se obtuvo el mejor rendimiento con una media de 0.53 5 5. Interacciones entre el pH y las RPM teniendo como variable de respuesta Y’ x s . Según Verduyn et al.41 0.10 y 0.521889 g biomasa/g sustrato.550667 g biomasa/g sustrato.37 100 150 200 RPM La prueba de las medias (figura 13 A-C) (Anexo F) para los rendimientos observados arroja que a pH 5 y agitación de 200 rpm se obtienen los mayores rendimientos..49 g biomasa/g glucosa que se encuentra a velocidades especificas de crecimiento (o tasas de dilución para cultivos en quimiostato) entre 0. (1991).45 0.5 y 200 RPM. con valores de medias de 0. pero que la mejor combinación es pH 5.Figura 14. cerevisiae.57 pH 4 0.49 Yxs 0.519889 y 0. Esta puede ser una de las razones por las cuales la combinación que arrojó la mejor producción de biomasa correspondiente a pH 4 y 200 RPM. un rendimiento de 0. respectivamente. 1965). Una ligera disminución es probablemente debido a un incremento en la contribución de energía de mantenimiento requerida por todos los procesos (Pirt . 86 . no fue la misma que presentó el mayor rendimiento observado. que a mayor agitación y pH fue posible obtener un µ max mayor. la prueba de las medias (figuras 13 A-C) (Anexo F) arrojó que el mejor pH es 5. y a su vez esta es la mejor 87 . mientras que a pH 5. respectivamente.33 0.335222 h-1.De la figura 15. donde la mayor variación se da de 100 a 150 RPM. es posible afirmar.3 100 150 200 RPM Aunque la velocidad especifica de crecimiento máxima µ max presentó. El comportamiento de la biomasa en cambio es totalmente contrario a la de µ max . aunque los valores no presente una variación muy significativa.5 y la mejor agitación 200 RPM con µ max de 0. para todas las combinaciones estudiadas. En general. se puede decir que a pH 4 y 5.5 u max 0. a diferencia del comportamiento que se presenta para todos los pHs cuando las revoluciones aumentan de 150 a 200 RPM. lo que se observa es una pequeña disminución de este parámetro.34 5 5. ya que hay un incremento de la máxima velocidad de crecimiento especifica.331667 h-1 y 0.5 el cambio de 100 a 150 RPM implica un leve aumento en la máxima velocidad de crecimiento especifica.32 0. Interaction Plot 0. Interacciones entre el pH y las RPM teniendo como variable de respuesta µ max . valores homogéneos. Figura 15.31 0.35 pH 4 0. 42 h-1 (Hoek et al. 1998). es necesario conocer la relación entre la velocidad de crecimiento específica y la capacidad fermentativa del microorganismo (Hoek et al.345333 h-1. presentó la mayor velocidad de crecimiento especifico. donde las velocidades máximas de crecimiento especificas están alrededor de 0. 88 . siendo el grupo de datos no homogéneos en relación a los otros pH estudiados.combinación con una media de 0. A valores mayores se favorece la formación de etanol y acetato. la máxima velocidad de crecimiento especifica de una cepa de levadura de panadería industrial DS28911 en un medio definido con glucosa. es decir a pH 5. Para optimizar el perfil de la velocidad específica de crecimiento. indicando que el metabolismo sigue siendo principalmente respirativo. mientras que a velocidades superiores una cantidad mayor de glucosa se involucra en vías fermentativas. se presentaron fermentaciones principalmente respirativas que favorecen la producción de biomasa aunque no se evitó la producción de subproductos principalmente etanol.. que de acuerdo con el análisis estadístico. que se puede afirmar debido al olor característico que presentaban las fermentaciones.3 h-1. minerales y vitaminas fue de µ = 0.5 y 200 RPM. Este análisis concuerda con la combinación.30 h-1 cerca del 25 % de la glucosa se utiliza en fermentación. cerevisiae es totalmente oxidativo. indicando la ausencia de productos de la fermentación y un alto rendimiento de biomasa. (2005) determinaron que el metabolismo de S. A velocidades de crecimiento especificas cercanas a 0.20 h-1 Frick et al. Esto permite concluir que en los ensayos realizados tanto a nivel de frascos agitados como en el biorreactor. 1998) lo que indica que los valores obtenidos en los sistemas estudiados no se alejan mucho de este valor. que al mismo tiempo es el pH al cual se presenta la menor producción de biomasa. Para una µ = 0.. Todas las medias se calcularon con un intervalo de confianza del 95%.. En cultivos batch como los estudiados. (2000) y Calado et al. la cantidad de biomasa producida por las levaduras nativas Saccharomyces spp. Las fermentaciones en biorreactor de 2 L que se operaron a 1vvm.02 g/g con una µ max = 0.05) lo que puede deberse principalmente al cambio de escala y más específicamente a la transferencia de masa dentro del sistema (Anexo G). se procedió a calcular el k L a para estas condiciones y se utilizó como criterio de escalamiento. respectivamente (ver numeral 4.1. 28 ºC y pH 4. quienes bajo condiciones diferentes alcanzaron 12 g/L de biomasa al final de la fermentación. fue superior. (2003) quienes lograron un rendimiento 0.2.30 g biomasa/g fuente de C con una µ de 0.12 h-1 y 0. En la figura 16.10-0. En el numeral 3. Estas fermentaciones en biorreactor presentaron un comportamiento análogo a los frascos agitados.9286 g/L.30 ± 0.2 de este capítulo se describe detalladamente cuales fueron los pasos a seguir para realizar el escalamiento. (2000) y Calado et al. aunque se puede notar que la biomasa al final de la fermentación fue de 18. 4. y determinar las mejores condiciones para las cuales se obtuvo una mayor cantidad de biomasa.3 Fermentaciones en Biorreactor. puede decirse que tanto los rendimientos observados como las velocidades máximas de crecimiento específico halladas en esta investigación están por encima de los valores reportados por los autores mencionados. (2003). 150 RPM.4. Después de realizar las fermentaciones en frascos agitados para diferentes niveles de pH y agitación. Así mismo.6065 g/L. estos valores presentan diferencias estadísticamente significativas (p–valor < 0..1)..1. 89 .025 h-1. se muestra el promedio de los datos con sus respectivos errores para la producción de biomasa y consumo de sustrato cuantificados en g/L.Al realizar una comparación con las fermentaciones batch reportados por Rudolf et al. ya que se obtuvo alrededor de 1... levemente menor a la que se obtuvo a en la etapa anterior de 19. Sin embargo.7 veces más biomasa que la producida por Rudolf et al. más cercana a la que se obtuvo a nivel de frascos agitados (19.05). análoga a la empleada en la escala anterior de frascos agitados (Anexo G). 2000).4822 g/L. Producción de biomasa y consumo de sustrato en biorreactor de 2 L de trabajo.Figura 16. a partir de la cual es posible afirmar que bajo estas condiciones la cantidad de biomasa al final de la fermentación es de 19. En la figura 17. Sin embargo.valor > 0. 90 . Barras verticales: error estándar. 150 RPM.9286 g/L). estos valores tienen diferencias muy poco significativas (P. incrementa la dispersión del gas en el medio de cultivo. 1vvm y 28ºC. se concluyó que la agitación es más relevante para la producción de biomasa de levaduras que la aireación. probablemente debido a que el oxígeno disuelto en los dos sistemas se encontraba cerca del valor crítico y una alta cantidad de sustrato se consumió (Parakulsuksatid. se muestra el promedio de los datos con sus respectivos errores para la producción de biomasa y consumo de sustrato cuantificados en g/L. Por lo tanto se decidió realizar una nueva fermentación en el biorreactor a las mismas condiciones de aireación. debido a que una buena agitación permite la dispersión de las burbujas al medio durante un tiempo de residencia largo. En el trabajo realizado por Parakulsuksatid (2000). pH y temperatura pero para una agitación de 200 RPM. Un aumento en la velocidad de agitación. pH 4. la tasa especifica de crecimiento de los microorganismo aeróbicos es constante (Shuler y Kargi.1 Desde frascos agitados hasta biorreactor. al igual que los rendimientos presentaron valores de 0. Lo que comprueba que la mayor diferencia que se presenta entre los experimentos realizados en el fermentador a diferentes agitaciones.2. por lo 91 . 1vvm y 28ºC. pH 4. es debida a la dispersión del oxígeno en el medio de cultivo que provoca un incremento en la concentración de oxígeno disuelto que se traduce en un leve aumento de la concentración celular. 200 RPM. 1992).2 ESCALAMIENTO DEL PROCESO 4. Debido a que la potencia que un agitador orbital entrega a un erlenmeyer es diferente a la que un impeler entrega al medio de cultivo en un biorreactor. Se ha demostrado que cerca del valor critico de oxígeno disuelto. no es correcto utilizar las mismas condiciones de agitación para los dos sistemas. 4.528 h-1.Figura 17. La tasa máxima de crecimiento específico en las fermentaciones realizadas a 150 RPM y 200 RPM fue la misma con un valor de 0. Barras verticales: error estándar. Producción de biomasa y consumo de sustrato en biorreactor de 2 L de trabajo.372 g biomasa/g sustrato. como se describe a continuación: −0 .tanto es necesario adoptar un método de escalamiento para determinar cuáles deben ser las condiciones en el biorreactor de acuerdo con las mejores obtenidas a nivel de frascos agitados. Suponiendo que todo el oxígeno disuelto en el medio es consumido por los microorganismos. la concentración de oxígeno disuelto C . 25 0 .. la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) que se encuentra afectada por la resistencia a la transferencia de oxígeno en la superficie gas-líquido entre la burbuja y el líquido está definida como: OTR = k L a (C * − C ) (8) Donde: OTR : Velocidad de transferencia de oxígeno kLa : Coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno C* : Concentración de oxígeno disuelto en la fase frontera gas-líquido C: Concentración de oxígeno disuelto en el seno de la solución. Para esta etapa se utilizó la ecuación desarrollada por Maier et al. se hace cero. (2001). 27 d0 (7) Donde: OTRmax : Capacidad máxima de transferencia de oxígeno [mmol/L/h] n: Frecuencia de agitación [RPM] VL : Volumen de llenado [mL] d0 : Diámetro de agitación [cm] d: Diámetro mayor de los erlenmeyers [m] Teóricamente.84 OTRmax ≈ n 0. así 92 .84VL d −1. 200. 2006). se puede determinar el valor del k L a para realizar el escalamiento.54 d (m) 0.2682*10-3 s-1. Los datos utilizados se muestran en la tabla 10: Tabla 10. Se utilizó una aproximación leyendo directamente en la gráfica para determinar cuáles 1 Solubilidad del oxígeno en agua a 28 ºC y 1 atm. A partir de este valor y la figura 18 que muestra el comportamiento del k L a con respecto a diferentes revoluciones de agitación determinados mediante una caracterización del biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 que se llevó a cabo realizando mediciones del k L a en 2 L de agua mediante el método dinámico para 4 agitaciones (100.igualando las ecuaciones 7 y 8. 93 . 27 n 0. Datos obtenidos de las fermentaciones en frascos agitados para determinar el k L a a partir de la ecuación desarrollada por Maier et al. n (RPM) 200 VL (mL) 250 d 0 (cm) 2.84 d −1.84VL d0 kLa ≈ (9) C* A partir de los datos que se tienen para las fermentaciones en frascos agitados y teniendo la concentración de oxígeno en la interface gas-líquido que se encuentra reportada en la literatura. Doran 1999. (2001). 300 y 400 RPM) y 1vvm de aireación (Villegas. se puede calcular el k L a como se muestra en la ecuación 9: −0 . arrojando un valor de 7.1308 C * (mmol/L) 0. 25 0 .5181 1 Al aplicar la ecuación 9 se determinó él k L a .. se determinó que el fermentador debía trabajar a 150 RPM. Caracterización de biorreactor BIOENGINEERING CH 8636 Así. 4. aunque esto no se constituye en un problema. pues algunos autores como Quintero (1990).2. que no fue posible mantener la similitud geométrica debido a que el biorreactor de 2 L utilizado BIOENGINEERING CH 8636 no conserva las relaciones geométricas reportadas en la literatura y sobre las cuales se basan las gráficas de potencia necesarias para el cálculo del k L a . Figura 18. se pretende realizar un escalamiento conceptual a escala de laboratorio escalando el volumen del líquido 50 veces desde un biorreactor con un volumen de trabajo de 2 L. a otro con un volumen de 100 L. 1 vvm y bajo las mismas condiciones de pH (pH 4) y temperatura trabajadas en la etapa anterior (28 °C). afirman que en la práctica es difícil mantener la geometría 94 .eran las revoluciones a utilizar en el biorreactor que correspondieran al k L a encontrado en frascos agitados.2 Biorreactores En esta etapa. Cabe anotar. debido a que el valor que se obtiene con esta correlación se acerca más al k L a experimental.026 g  (vs )0.1 Determinación de los parámetros de escalado A partir de las correlaciones reportadas en la literatura para calcular el k L a . en una fermentación de levaduras S. es un parámetro determinante en la producción de biomasa de microorganismos aerobios como las levaduras.4 P  k L a = 0. El k L a que se constituye en el criterio de escalamiento tanto para la etapa anterior como para esta. En la ecuación 10.2. 4. 1995): 0 . cerevisiae comercial. El valor experimental utilizado en esta etapa se determinó por triplicado mediante el método dinámico (Ver Anexo C) por Llano (2007).para realizar un escalamiento basado en métodos de análisis dimensional y que algunos estudios han demostrado ventaja al escalar sin obedecer a la similitud geométrica.2. se seleccionó la de Van’t Riet (1979).5 (10) V  Donde: kLa : Coeficiente volumétrico de transferencia de oxigeno Pg : Potencia gaseada V: Volumen del líquido vs : Velocidad superficial del gas 95 . se presenta la correlación de Van´t Riet (Duarte. 0071 Tabla 12. así como las propiedades del medio de cultivo y datos básicos de diseño de los biorreactores a utilizar en la escala siguiente.167 Li (m) 0.6667 Hi/ Di 3.3333*10-5 V (m3) 2*10-3 Wi/ Di 0. En las tablas 11. 12 y 13 se presenta esta información.015 Wi (m) 0.9645 96 .0122 Wb (m) 0.2711 D/ Di 2. µ (P) 0.0242 Viscosidad. Datos de operación y diseño del biorreactor de V=2 L. es necesario conocer algunos datos de operación y de diseño del biorreactor utilizado.7111 vs (m/s) 2.Antes de realizar el escalado.045 Hi (m) 0.12 Di (m) 0.0457 Nb 4 ni (RPM) 150 nis (rps) 3. ρ (Kg/m3) 1.3333 3 FA (m /s) 3.2760*10-3 kLa experimental (s-1) 0. Tabla 11. Propiedades del medio de cultivo para Densidad. Dt (m) 0. Datos de diseño de los biorreactores de 50L y 100L (Doran. 1999).1677 HL (m) 0.0335 Wb (m) 0. Parámetro Biorreactor de 50 L Biorreactor de 100 L Dt (m) 0.1331 0. Nomenclatura y dimensiones para un tanque agitado. Dt: Diámetro interno del reactor Di: Diámetro del impulsor HL: Altura del líquido Hi: Altura del fondo del reactor al impeler Li: Ancho del impeler Wi: Alto del impeler Wb: Ancho del bafle Nb: Número de bafles Fuente: Doran.3333 0.3993 0.5031 Hi (m) 0.5031 Di (m) 0.Tabla 13.0333 0.3993 0.0399 0.1331 0.1677 Li (m) 0.0266 0.0419 Wi (m) 0.0503 Nb 4 4 Hi/D 1 1 Di/ D 0. 1999 97 .3333 Figura 19. 2006) FA 6. se procede a realizar el proceso de escalamiento. Relación entre la potencia Pg 0. 1999) µ 3. Velocidad de giro del 0.5 impulsor (nG) π   VP  1.7   =    nP   DiP  98 . Cálculos para realizar el escalamiento de los biorreactores. 1999) 5.026 G  (vsG ) 4  0.Conociendo toda la información necesaria. Factor de corrección para 2 sets de impulsores P = P0 * 2 (UNAL.5 2 0. 1. 2006).4  n 3D 2   4  K L aP  PP   P iP   nP DiP 0. Potencia disipada por el P0 = N pc * ρ * nis * Di 3 5 impulsor sin aireación (Doran. Tabla 14.67) Na (Bailey. Reynolds.65 gaseada y la no gaseada = 0. según como se plantea paso a paso en la tabla 14.4 P  0. Obtención y corrección Debe utilizarse el gráfico que relaciona el número de del número de potencia potencia Vs.35 + P0 1 + (16.4  n D  K L aG V  G  n 3 D  π G iG = =  G iG    8.3 −  nG   DiG  1. Número de aireación (Na) Na = 3 Di * nis 7. G = reactor grande P = Reactor pequeño 0.5 0. 1986) Determinación de los parámetros de operación (UNAL. Caudal del aire (FA) FA = niV 2. (Ver anexo H) (Np) 4.026  (vsP )  0. Número de Reynolds (Re) nis Di ρ 2 Re = (Doran. Potencia PG  nG   DiG  =    PP  n P   DiP  Para verificar si la correlación escogida para calcular el k L a es adecuada. para un k L a constante hay una disminución considerable en la velocidad de giro del impulsor al igual que en la aireación debida al aumento de la escala que implica un volumen y equipo de dimensiones mayores.4552* 10-3. De otro lado. Como se observa en la tabla 15. Potencia por unidad de P   3 2  V  G  nG    DiG    volumen = P  nP   DiP    V P 3 5 12. Volumen de aire por Q    V  G nG volumen de medio por = Q nP minuto (vvm)    V P 11. 3 9. 99 . se calculó con la ecuación 10 para las condiciones experimentales en el biorreactor de 2 L y se comparó con el dato obtenido experimentalmente. lo que corrobora que la correlación empleada representa de manera adecuada el sistema. Caudal de aire (QG):  QG   nG  DiG    =     QP   nP  DiP  10. El porcentaje de error fue de 1. el caudal de aire necesario es prácticamente el doble al trabajar a un volumen 50 veces mayor desde 2 L hasta 100 L. 37 Potencia (W) 0. las levaduras tipo S.9560 2.67*10-4 6.44 0.Tabla 15.0071 Velocidad de giro 200 88 74 (RPM) Caudal de aire (m3/s) 3. cerevisiae se usan para la producción de etanol. Biorreactor de 100 Parámetro Biorreactor de 2 L Biorreactor de 50 L L k L a (s-1) 0.4384 de volumen (W/m3) A nivel industrial. motivo por el cual es importante entender sus funciones metabólicas debido a que es capaz de presentar simultáneamente respiración y fermentación aunque se encuentre bajo condiciones totalmente aeróbicas (Frick y Wittmann.33*10-5 3.0071 0.1206 21. ya que está relacionado con el suministró de oxígeno.9671 19. condición vital que favorece la producción de biomasa. antibióticos o biomasa. 100 . se constituye en el mejor criterio de escalamiento para el sistema estudiado. 2005).15*10 -4 vvm 1 0.0071 0.1438 Potencia por unidad 20. Por esta razón él k L a . Parámetros de operación de los biorreactores. proteínas recombinantes. donde la formación de subproductos de la fermentación es indeseable.0419 0. 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