Biotecnología de plantasRafael Salgado Garciglia, Rodolfo López Gómez, Mauro M. Martínez Pacheco y Abraham García Chávez Cuerpo Académico de Biotecnología de Plantas Resumen El Cuerpo Académico de Biotecnología de Plantas desarrolla diversas líneas de in- vestigación relacionadas con la biotecnología vegetal moderna. El principal interés es la propagación, conservación y mejoramiento genético de plantas, el uso de las técni- cas de biología molecular para la certificación genética, para esclarecer la filogenia y sistemática de plantas, para la identificación de genes relacionados con la defensa de las plantas a patógenos (marcadores moleculares) y en la genómica funcional de ma- duración de frutos, así como la búsqueda de metabolitos bioactivos. Actualmente se realizan investigaciones relacionadas con la propagación y conservación in vitro de especies de importancia agrícola, forestal, medicinal y en riesgo de extinción; el uso de las técnicas de biología molecular para estudios filogenéticos, certificación de es- pecies, mejoramiento genético y el aislamiento e identificación de genes relaciona- dos con defensa y procesos fisiológicos; la obtención de extractos vegetales con propiedades antimicrobianas e insecticidas, contra patógenos de plantas y humanos; biotecnología de aguacate, la investigación central del grupo, con estudios de biolo- gía molecular, resistencia a patógenos, micropropagación y conservación in vitro. Abstract The Academic Group of Plant Biotechnology develops diverse lines of investigation related to the modern plant biotechnology. The main interest is the propagation, con- servation and genetic improvement of plants, the use of the techniques of molecular biology for the genetic certification, to clarify phylogeny and systematic of plants, for the identification of genes related to the defense of the plants to pathogens (molecular markers), in functional genomic on maturation of fruits, as well as the search of bioacti- ve metabolites. Different research lines are related to the propagation and conserva- tion in vitro of agricultural, forest, medicinal and in extinction-risk plants; the use of the techniques of molecular biology for phylogenetic studies, certification of species, ge- Ciencia Nicolaita No. 48 65 Octubre de 2007 netic improvement and the isolation and identification of genes related to defense and physiological processes; the obtaining of plant extracts with antimicrobial and insecti- cide properties, against plants and human pathogens; biotechnology of avocado, the central research line of the group, with studies of molecular biology, resistance to pat- hogens, micropropagation and in vitro conservation. Introducción La biotecnología vegetal ha tenido un mayor desarrollo en los últimos años y se pre- senta como una alternativa de resolución de un gran número de problemas relacionados con el mejor aprovechamiento de las plantas por parte del hombre; constituyendo una herra- mienta invaluable para incrementar tanto la cantidad como la calidad de los alimentos de ori- gen vegetal, así como para obtener nuevos productos con diversas aplicaciones a partir de las plantas (Pierik, 1990). Con el cultivo de tejidos vegetales se han hecho aportaciones su- mamente valiosas al conocimiento científico y tecnológico, y se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas de la biotecnología vegetal, ya que permiten la regeneración de plantas, la conservación, la colección in vitro de germoplasma y la aplicación de técnicas en conjunto para el mejoramiento (Drew, 1997). Las herramientas de la biología molecular, como la de marcadores moleculares, la de construcción de bancos genómicos y la genómi- ca funcional, son técnicas modernas que apoyan al esclarecimiento filogenético de las es- pecies, a la genética de poblaciones, a la certificación de plantas de valor comercial y para el aislamiento e identificación de genes expresados durantes las etapas de desarrollo y en la defensa de las plantas o bien para la elucidación de genomas (Flavell, 1995). Con el propósito de hacer uso de estas herramientas biotecnológicas, se han pro- puesto cuatro líneas de generación y/o aplicación del conocimiento (LGAC): 1) Propaga- ción, conservación y mejoramiento genético de plantas; 2) Marcadores moleculares; 3) Genómica funcional de maduración de frutos; 4) Metabolitos vegetales biocidas. Principal- mente se realizan proyectos de investigación y desarrollo biotecnológico orientados a la utili- zación, mejoramiento y conservación de los recursos naturales renovables del país, así como a la formación de recursos humanos especializados que puedan fortalecer los progra- mas de investigación de la propia Institución o del país. En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal se desarrollan tres líneas en particular: propagación, conservación y mejoramiento genético in vitro; búsqueda de metabolitos ve- getales con actividad biocida; y estudios de filogenia, certificación molecular de especies co- merciales, genética de poblaciones e identificación de genes de defensa. En el laboratorio de Fisiología Molecular de Plantas también se han establecido tres líneas de investigación: genómica funcional en procesos de desarrollo y maduración de fru- tos tropicales; mejoramiento genético en frutales; producción de proteínas inmunógenas en plantas y genómica de aguacate. Biotecnología de Plantas Octubre de 2007 66 Ciencia Nicolaita No. 48 En el laboratorio de Fisiología Celular, las líneas son: Estudio de la vía de síntesis de folatos en aguacate y hongos; producción de enzimas extracelular de origen fúngico; y bús- queda de principios activos biocidas en plantas medicinales. CUADRO 1 Plantas micropropagadas y bajo conservación in vitro. Nombre común Especie (Familia) Referencia Limoncillo Euchile citrina (Orchidaceae) Becerril, 2003 Flor de corpus Laelia speciosa (Orchidaceae) Ortega, 2003 Aguacate Hass Persea americana Mill. Cv. Hass (Myrtaceae) Leal-Nares, 2003 Aguacate criollo Persea americana Mill. Var. Drymifolia (Myrta- ceae) Ángel-Palomares, 2003 Helechos arbóreos Sphaeropteris sp. S. Myosuroides (Cyatheaceae) Aguilar-Coria, 2003 Geranios aromáticos Pelargonium spp. (Geraniaceae) Cárdenas, 2003 Phalaenopsis Phalaenopsis amabilis Luchia Lady (Orchida- ceae). Malagón-Quintana, 2004 Flor de muertos Laelia autumnalis (Orchidaceae) Huapeo, 2004 Cempasúchil Tagetes erecta (Asteraceae) Tovar-Almanza, 2004 Tilia Tilia mexicana (Tiliaceae) Atrián-Mendoza, 2005 Algodón silvestre Cochlospermum vitifolium (Cochlospermaceae) Mendoza-Juárez, 2005 Paulonia Paulownia fortunei P. Imperiales (Schrophularia- ceae) Morales, 2005 Ahuehuete Taxodium mucronatum (Taxodiaceae) Sántiz-Méndez, 2005 Papayo Carica papaya L. Cv. Maradol Carreto et al. 2006 Oreja de burro Oncidium cavendishianum (Orchidaceae) Luviano, 2006. Pitayo de mayo Stenocereus quevedonis (Cactaceae) Villalobos-Jarquín et al. 2007 Propagación, conservación y mejoramiento genético de plantas Dentro de las principales aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales destacan la mi- cropropagación (propagación clonal masiva), la conservación de germoplasma y el mejora- miento genético (Dodds y Roberts, 1995). Micropropagación.- La micropropagación se aplica a especies vegetales con el fin de obtener su propagación masiva en el menor período de tiempo posible. Se le conoce Biotecnología de Plantas Ciencia Nicolaita No. 40 67 Abril de 2005 como una biotecnología de “respuesta rápida”, puesto que se logran resultados en períodos de 3 a 6 meses. Gran cantidad de plantas se propagan con éxito por este método, principal- mente ornamentales, hortícolas, frutales, forestales y algunas en riesgo de extinción (Salga- do-Garciglia et al. 1997). Conservación in vitro.- Con la utilización de cultivos in vitro se ha logrado la conser- vación de germoplasma vegetal, mediante sistemas de conservación a través del almace- namiento en condiciones de crecimiento mínimo y la criopreservación. Con esta herramienta biotecnológica es posible establecer cultivos in vitro de plantas completas, seg- mentos de éstas (yemas, ápices, meristemos) y cultivos celulares, con los cuales se pueden llevar a cabo programas de conservación de germoplasma en períodos a corto, mediano y largo plazo (Bajaj, 1991). El almacenamiento se realiza bajo condiciones de cultivo que inhi- ban o disminuyan el crecimiento, con la utilización de medios de cultivo mínimos e incuba- ción en intensidades bajas de luz y temperatura (20, 10, 0, -20, -80, -196°C) (Villalobos, 1990). Esta técnica se ha desarrollado sólo para unas cuantas plantas, por lo que existe la necesidad de realizar estudios de conservación in vitro para todas aquellas que requieren sistemas alternativos de conservación (Villalobos y Engelmann, 1995). Mejoramiento genético.- Con la biotecnología moderna, la manipulación genética abarca desde el cultivo de protoplastos (células sin pared celular), células y tejidos in vitro hasta la manipulación directa del ADN, que incluyen diferentes técnicas como el cultivo y fu- sión de protoplastos, micropropagación, selección in vitro frente a agentes bióticos o abióti- cos adversos e inserción de genes por transformación genética (Pérez-Ponce, 1998). Con estos métodos se han conseguido plantas mejoradas con diferentes características como resistencia a patógenos, a sequía, salinidad, aumento de valor nutrimental, mayor vida de anaquel de flores o frutos, cambios de color de frutos y flores y producción de metabolitos. Una de las aplicaciones más novedosas de la transformación genética es la de utilizar a las plantas como biofábricas o biorreactores, al introducir genes deseados y regular la expre- sión dentro de éstos, para la producción de fármacos, proteínas terapéuticas, pigmentos y vacunas comestibles, etc. (Lindsey y Jones, 1989, Borojevic, 1990, Pérez-Ponce, 1998). En los últimos cinco años, en los diferentes laboratorios se han establecido cultivos in vitro de especies de interés ornamental, forestal, medicinal, hortícola y de plantas en riesgo de extinción (Cuadro 1). En la figura 1 se muestran cultivos in vitro de la orquídea Oncidium cavendishianum Batem., de la cactácea Stenocereus quevedonis ‘J.G. Ortega’ Bravo (pita- yo de mayo) y de aguacate criollo mexicano (P. americana Mill. Var. drymifolia). Actualmente se realizan investigaciones en colaboración con el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio para la propagación y conservación in vitro de orquídeas, así como para el cultivo de la or- quídea Laelia speciosa para su aprovechamiento como fuente de mucílago para la elabora- ción de figuras de pasta de caña de maíz, con artesanos de la Casa de los Once Patios de Pátzcuaro, Michoacán. También se mantienen bajo conservación in vitro 15 especies de or- quídeas, cinco especies de helechos arbóreos, cinco medicinales, tres cactáceas y una fo- restal, todas ellas en alguna categoría de riesgo de extinción (Ochoa-Ambriz, 2005; Ávila-Díaz y Salgado-Garciglia, 2006; Valdez-Partida, 2007). En cuanto al mejoramiento ge- Biotecnología de Plantas Octubre de 2007 68 Ciencia Nicolaita No. 48 nético, se han establecido sistemas de transformación genética en aguacate, alfalfa, papa- yo, pitayo y en la orquídea Phalaenopsis amabilis, con el objetivo de obtener plantas transgénicas resistentes a fitopatógenos (Zavala-Corona, 2003; Suárez-Rodríguez, 2006; Herrera-Rodríguez, 2007; Malagón-Quintana et al., 2007). Particularmente en tabaco, se han obtenido plantas transgénicas con el gen de la proteína HSP65 de Mycobacterium le- prae, logrando la expresión del gen (Fierro-Aguilar et al., 2006; Rodríguez-Narciso et al., 2006). Biotecnología de Plantas Ciencia Nicolaita No. 48 69 Octubre de 2007 Figura 1. Cultivos in vitro de algunas especies micropropagadas: A, plántula de Phalaenopsis amabilis Luchia Lady (Orchida- ceae); B, brotes de Stenocereus quevedonis ‘J.G. Ortega’ Bravo (pitayo de mayo); C, plántula de Taxodium mucronatum Ten. (ahuehuete). Marcadores moleculares en plantas Dentro de las técnicas de biología molecular más usadas para caracterizar y evaluar la diversidad genética existente en los bancos de germoplasma de plantas, se encuentra la amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), marcadores basados en la hibridación del ADN en plantas con los polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción de ADN (RFLP), amplificación selectiva de fragmentos de restricción (AFLPs), microsatélites (SSR) y marcadores moleculares estrechamente relacionados con genes de resistencia a enfermedades, conocidos como RGAPs (Resistance Gene Analog Polymorphism), con los cuales se ha logrado identificar genes de resistencia a enfermedades ocasionadas por hon- gos (Collins et al., 2001; Chen, 2002). Otra de las aplicaciones del uso de marcadores mole- culares es la certificación genética que permite, además, esclarecer la filogenia y sistemática del grupo de plantas de interés comercial y de aquellas que presentan dificulta- des en la clasificación taxonómica tradicional. Con estas técnicas, se han realizado estudios con la finalidad de detectar la variabili- dad genética en helechos arborescentes, un grupo de plantas con problemas de ubicación taxonómica, para esclarecer su filogenia. El estudio se ha hecho con el uso de los genes ri- bosomales y sus regiones espaciadoras asociadas, ITS1-5.8s-ITS2 (Región ITS), detectan- do fragmentos de ADN polimórficos que permitieron establecer relaciones de parentesco entre las diferentes especies de los helechos, ubicando a los taxones Cyathea mexicana y Sphaeropteris myosuroides como cercanos genéticamente dentro de la familia Cyathea- ceae (Valdez-Partida, 2007). Secuencias de ITS obtenidas de los helechos arborescentes se han reportado en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI): EU090937, Alsophila firma; EU090939, Cyathea myosuroides; EU090940, Dicksonia sello- wiana y EU090941, Lophosoria quadripinnata. Para la certificación de plantas de interés co- mercial, se estudian con la misma técnica, genotipos de aguacate criollo mexicano y plantas medicinales de la región. Genómica funcional de maduración de frutos El desarrollo y la maduración del fruto son procesos únicos en las plantas y represen- tan un componente importante en la dieta humana y animal (Giovannoni, 2004). En las plan- tas superiores, los procesos biológicos tales como la maduración del fruto y la senescencia están regulados por una compleja expresión diferencial de genes. Para entender estos pro- cesos es indispensable identificar, clonar y caracterizar los genes involucrados. El entendi- miento de cómo los genes coordinan el crecimiento y desarrollo de los organismos vivos es de gran importancia en muchas áreas de la ciencia y la tecnología. En la última década, los proyectos de secuenciación e identificación de genes de organismos en general, han gene- rado miles de secuencias génicas. Es así como la información genética ha revolucionado a la genética generando una nueva área en las ciencia biológicas llamada genómica (Koncz, 2003). El conocimiento básico de cómo funciona un organismo provee una información in- valuable para el desarrollo biotecnológico. Como complemento al conocimiento de los geno- Biotecnología de Plantas Octubre de 2007 70 Ciencia Nicolaita No. 48 mas de plantas han surgido los proyectos de ESTs (Expressed Sequence Tags) los cuales consisten básicamente en secuenciar un gran número de cADNs obtenidos de bancos de cADNs generados de diferentes estructuras y estadios de desarrollo de plantas. Esta técni- ca explota los avances recientes en la tecnología de secuenciación automatizada y de ma- nejo del ADN. Los análisis comparativos de las bases de datos de los ESTs facilitan también la detección de secuencias conservadas entre diferentes organismos, lo que permite cono- cer secuencias esenciales para los seres vivos (Olmedo et al., 2005). Con estas técnicas, se han generados bancos de ESTs de plántulas de papayo (Cari- ca papaya L. Cv. Maradol) y de frutos de aguacate criollo mexicano (Persea americana Mill. Var. drymifolia), con la finalidad de obtener las secuencias de los genes que participan en el desarrollo de la planta y durante el desarrollo de frutos, respectivamente (Torres-Cárdenas, 2006). Biotecnología de Plantas Ciencia Nicolaita No. 48 71 Octubre de 2007 Figura 2. Efecto inhibitorio del extracto etanólico de la planta Artemisia ludoviciana Nutt. (Estafiate) sobre el crecimiento del oomiceto Phytophthora capsici: A, tratamiento control (50 mL etanol absoluto); B, tratamiento control positivo (100 mg/L de mefenoxam, antioomiceto comercial); C, 50 mL extracto etanólico (ensayo por difusión en placa); D, 50 mL extracto etanólico (ensayo de disco impregnado). CUADRO 2 Plantas con actividad biocida y sus respectivos metabolitos activos. Especie (Nombre común, Familia) Actividad: Organismos blanco Metabolito(s) activo(s) Referencia Melia azaderacht (Pa- raíso, Meliaceae) Insecticida: Culex stigmastosoma Azadiractina Sánchez-Díaz et al. 2003 Pelargonium spp (Ge- ranios aromáticos, Ge- raniaceae) Insecticida: Culex stigmastosoma Limoneno Geraniol Barrera-Ponce et al. 2003 Heliopsis longipes (Chilcuague, Astera- ceae) Fungicida: Candida albicans Mucor circinelloides Sporotrix schenckii Afinina Decatrienato de bornilo Morales-López, 2003 Lippia berlandieri (Oré- gano, Labiatae) Bactericida: Escherichia coli Salmonella sp. Shigella flexneri Staphylococcus aureus Timol Carvacrol Serrato et al. 2005 Satureja macrostema (Nurite, Labiatae) Fungicida: Fusarium oxysporum Phytophthora capsici Pulegona García-Chávez et al. 2006 Tagetes lucida (Santa María, Asteraceae) Bactericida: Vibrio cholera Escherichia coli Proteus mirabilis Fungicida: Trichophyton mentagrophytes Rhizoctonia solani Cumarina Umbeliferona Escopoletina Escoparona Céspedes et al. 2006 Artemisia ludoviciana (Estafiate, Asteraceae) Fungicida: Candida albicans Collethotrichum gloesporiodes Phytophthora spp Borneol Verbenol Terpineol Damián-Badillo, 2007 Ageratum corymbosum (Servilletilla, Astera- ceae) Fungicida: Sporotrix schenckii b-Pineno b-Mirceno 2-Careno Eugenol Álvarez-Rodríguez et al. 2007 Metabolitos con actividad biocida Sin lugar a dudas, las plantas son una fuente importante de productos químicos, co- nocidos como metabolitos secundarios. Al respecto, la biotecnología ofrece como una alter- nativa el empleo de compuestos de origen vegetal, como agentes potenciales en el combate Biotecnología de Plantas Octubre de 2007 72 Ciencia Nicolaita No. 48 y control de enfermedades que afectan los cultivos de valor agronómico (Covián y Salga- do-Garciglia, 1999). Con este fin, se han realizado investigaciones para la búsqueda de me- tabolitos con acción biocida; a la fecha se han estudiado más de 20 especies vegetales, principalmente de la familia Asteraceae, y algunas de éstas presentan actividad insecticida, bactericida o fungicida, de las cuales se han identificado los compuestos activos (Cuadro 2). Recientemente se ha determinado el efecto del aceite esencial de estafiate (Artemisia ludo- viciana Nutt.) sobre cinco especies de Phytophthora (P. cactorum, P. capsici, P. cinnamomi, P. infestans y P. mirabilis), encontrandoun100%deinhibiciónsobreel crecimientodel mice- lio en ensayos in vitro. Los metabolitos responsables de dicho efecto son borneol, verbenol y terpineol, los cuales actúan en mezcla y no por sí solos (Damián-Badillo, 2007). En la figura 2, se muestra el efecto de este extracto sobre el crecimiento de P. capsici a los 8 días de cul- tivo, al inocular segmento de micelio de 0.2 cm 2 en el medio de papa-dextrosa-agar a 25°C. El crecimiento de P. capsici no fue afectado por la adición de etanol absoluto, alcanzando su máximo crecimiento a los 8 días del cultivo (Figura 2A). Un 100%de inhibición fue observa- do en los dos tipos de ensayos probados con el extracto etanólico de A. ludoviciana (Figuras 2C y 2D), efecto similar al ejercido por el antioomiceto comercial (Figura 2B). Biotecnología del aguacate El aguacate (Persea americana Mill.) es en la actualidad uno de los cultivos más im- portantes en México, no sólo por la gran cantidad de toneladas producidas que lo ubica como el productor más importante a nivel mundial, sino también porque es un cultivo que ge- nera miles de empleos directos e indirectos, y permite una alta entrada de divisas por la ex- portación de su fruto (Salazar y Lazcano, 2001). Apesar de su importancia económica, poco se sabe de su genética y es significativo que la mayoría de los problemas de producción más importantes tienen una base genética. Aunque el aguacate es un árbol de gran talla, su ge- noma es pequeño, aproximadamente 907 Mpb (millones de pares de bases), sólo seis ve- ces mayor comparado con el genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana y 2.5 veces el de papayo (Carica papaya L.) (Cui et al., 2007). Dentro de la problemática más importante de este frutal, están la falta de protocolos óptimos para su propagación clonal, lo cual está re- lacionado con la baja eficiencia para obtener plantas transgénicas, las cuales pudieran pre- sentar resistencia a patógenos, principalmente a hongos y al oomiceto Phytophthora cinnamomi, una necesidad urgente y necesaria. Asimismo, se desconoce la fisiología del fruto de aguacate, lo cual origina un mal manejo de poscosecha, causando considerables pérdidas económicas (Sánchez-Pérez, 2001). La biotecnología de aguacate es la parte central de las investigaciones del Cuerpo Académico Biotecnología de Plantas, en la cual confluyen las diferentes LGACque se desa- rrollan, con la participación de todos los investigadores que lo integran. Biotecnología de Plantas Ciencia Nicolaita No. 48 73 Octubre de 2007 Perspectivas Actualmente se está generando el banco de germoplasma in vitro de genotipos de aguacate criollo mexicano (P. americana Var. drymifolia), la selección y caracterización quí- mica y molecular de genotipos resistentes a P. cinnamomi, para finalmente realizar pruebas de resistencia al patógeno, en invernadero y campo. También se ha iniciado el estudio de la vía de síntesis de folatos en aguacate y hongos, con fines de analizar sus propiedades en la salud humana, ya que su carencia ocasiona anemia, otros trastornos hematológicos y defi- ciencias a nivel de síntesis y reparación de ADN. Bajo este nombre se agrupan un gran nú- mero de compuestos similares al ácido fólico, como son los folatos, la folacina y el pteroilmonoglutamato (Suárez de Ronderos, 2003). Mediante el uso de marcadores mole- culares (ITSs) se están desarrollando trabajos para determinar diversidad genética y paren- tesco entre materiales de aguacate criollo mexicano. Asimismo, se está realizando una colaboración con el LANGEBIO (Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad) para participar en el desarrollo del proyecto del genoma de aguacate el cual consistirá en realizar la secuenciación del genoma completo de esta importante planta. Literatura citada Aguilar-Coria, M.A. 2003. Regeneración in vitro de plántulas de helechos arborescentes (Sphaeropteris sp. y S. myosuroides: Cyatheaceae) por el cultivo in vitro de esporofi- tos jóvenes. Tesis de Licenciatura, Facultadde Biología. U.M.S.N.H., MÉXICO. 66 p. Álvarez-Ramírez, M.T., Zurita-Valencia W., Bello-González M.A., Hernández-García A., García-Chávez A., Molina-Torres J., Martínez-Pacheco M.M. y Salgado Garciglia R. 2007. 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