Laporan Praktikum Evaluasi Nilai Biologis Komponen Pangan ISOLASI DAN KULTUR SEL LIMFOSIT DARI LIMPA TIKUSDosen: Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Sc Ir. Sutrisno Koswara, M.Si Asisten: Ni Nyoman Susi, S.P dan Dede Saputra, S.Pi Doddy Aryanto (F240800104), Efratia (F24080033), Eka Julianti (F24080100), Elva Hasna (F24080123), dan Euis Fujiarti (F24080064) Golongan/Kelompok: P1/2 Senin, 28 November 2011 ABSTRACT Lymphocytes are white blood cells which is associated with the immune system. The aims of this study is to know the number of lymphocyte proliferation from 4 treatment of rats. Lymphocyte proliferation was measured using the method tryphan blue. The results show that the highest number of lymphocyte proliferatiom was standard with secang 2.30x107 cells/ml, nonprotein 3.38x106 cells/ml, tempeh flour 1.53x106 cells/ml, and casein standard 1.21x106 cells/ mL. However, the results of study above can not be trusted because of the weaknesses of methods and condition of rats. Key words: lymphocyte, tryphan blue PENDAHULUAN Semua makhluk hidup membutuhkan zat-zat gizi maupun non gizi untuk dapat menjalankan fungsi normal kehidupannya. Zat-zat gizi yang dibutuhkan antara lain karbohidrat, protein, lemak, vitamin dan mineral. Zat non gizi seperti antioksidan juga diperlukan untuk melawan radikal bebas, baik yang masuk dari luar tubuh maupun yang terbentuk akibat metabolisme. Salah satu sumber antioksidan yang banyak diteliti adalah secang. Ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan L.) hasil penapisan mengandung lima senyawa aktif yang terkait dengan flavonoid baik sebagai antioksidan primer maupun antioksidan sekunder (Safitri, 2002). Telah diketahui ternyata flavonoid yang ter dapat dalam ekstrak kayu secang memiliki sejumlah kemampuan yaitu dapat meredam atau menghambat pembentukan radikal bebas hidroksil, anion superoksida, radikal peroksil, radikal alkoksil, singlet oksigen, hidrogen peroksida (Shahidi 1999; Miller 2002). Limfosit merupakan sel kunci dalam sitem imun. Limfosit adalah sel yang paling dominan di dalam organ dan jaringan sistem imun. Lokasi limfosit T adalah pada lien dan kelenjar limfa yaitu pada masing-masing daerah periarterioler, parakortikal dan perifolikuler. Jumlah ± 65%-85% dari total limfosit dalam darah. Limfosit berperan dalam sistem imun spesifik seluler (sel T) untuk pertahanan terhadap bakteri yang hidup intraseluler, virus, jamur, parasit dan keganasan. Kerusakan membran pada sel limfosit, yang antara lain dapat disebabkan oleh senyawa-senyawa radikal, berdampak pada penurunan responnya, antara lain penurunan proliferasi limfosit. Proliferasi limfosit merupakan penanda adanya fase aktivasi dari respon imun tubuh. Proliferasi limfosit ini berupa peningkatan produksi limfoblas yang kemudian akan menjadi limfosit di limpa. Secara makroskopis dapat terlihat dengan adanya pembesaran organ-organ limfoid. Limpa merupakan salah satu organ limfoid perifer dan bagian dari sistem imun (Khasanah 2009). alumunium foil. tip mikropipet. pipet tetes. tissue. dan mikroskop. Keutuhan membran sel sangat dipengaruhi oleh adanya prooksidan dan antioksidan karena sifat komponen makromolekul pada membran yang mudah teroksidasi yaitu protein dan asam lemak tidak jenuh (Krinsky 1992. larutan H2O2 10M steril. haemacytometer. gelas penutup. mikropipet. Hal ini disebabkan karena proliferasi sel bermula dari kontak antara membran sel dengan antigen atau dengan molekul aktivator lain. botol steril. pinset). penggerus. membran sel limfosit harus berada dalam kondisi untuh. tabung sentrifuse. Banyak bahan pangan yang diteliti mengenai aktivitasnya sebagai imunostimulan. alat sentrifuse. alkohol 70%. transfer pipet disposable steril. larutan mitogen steril. Secang merupakan bahan pangan yang memiliki komponen fenolik yang dapat berfungsi sebagai antioksidan. syringe 5 ml steril. alas/media bedah. kapas. gunting. dan larutan pewarna Trypan Blue. microwell plate. Fetal Bovine Serum. cawan petri steril. kloroform. sarung tangan disposable. RPMI lengkap steril. pipet volumetrik. Alat-alat yang digunakan terdiri dari peralatan bedah tikus (pisau. RPMI standar steril. botol semprot alkohol 70%. NH4Cl 0. METODOLOGI Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tikus putih. Oleh karena itu. Meydani et al 1995). Untuk dapat berproliferasi dan menghasilkan sel efektor atau sel imunokompeten. toples. media kultur PBS steril (Phosphate Buffer Saline).85% steril. . dalam percobaan ini akan dianalisis pengaruh pengkonsumsian secang terhadap proliferase sel limfosit pada tikus percobaan. TUJUAN Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian protein ransum terhadap jumlah proliferasi limfosit pada tikus percobaan. cell counter. beberapa diantaranya dipercaya mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit untuk meningkatkan sistem imunitas.Aktivitas proliferasi limfosit merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan untuk mengukur status imunitas karena proliferasi limfosit menunjukkan kemampuan dasar dari sistem imun (Roitt 1991). Cuci dengan PBS Masukkan ke botol berisi ± 5 ml PBS steril Tiriskan di kertas saring Ambil limpa dan masukkan ke cawan petri berisi 5 ml RPMi Steril Timbang Gerus dengan ujung syringe Hati dibungkus dengan aluminium foil dan di label Pindahkan seluruhnya ke tabung sentrifuse steril dengan pipet transfer. basahi badannya dengan alkohol 70 % 3 ekor tikus diambil limpanya 3 ekor tikus sisanya.Prosedur Percobaan Terminasi tikus dengkloroform Setelah mati. dan ginjalnya. Selaput jaringan tidak perlu dipindahkan Simpan di freezer untuk analisis MDA Sentrifus 1500 rpm 5 menit Buang supernatan (hati-hati dan jangan sampai teraduk lagi) . diambil hati. limpa. Pelet/endapan sel dijentik-jentik dengan jari supaya tidak pekat Hitung limfosit * 2 ml NH4Cl 0. Hitung jumlah sel hidup (bening) pada 2 kuadran I & III Sentrifus kembali pada 1500 rpm selama 5 menit ∑ Limfosit/ml = Rata-rata sel hidup per kuadran x FP x 1 Keterangan: Volume 1 kuadran = 10-4 m Buang supernatan Pelet sel dijentik-jentikan dan ditambahkan 5 ml RPMi Aduk dengan pipet (disebut sebagai suspensi sel) HASIL Hitung jumlah limfosit hidup * .85% ditambahkan untuk melisis eritrosit selama 2 menit tepat Ambil 50 µl suspensi sel ke dalam mikroplat Tambahkan segera 5 ml RPMi Tambahkan 150 µl trifan blue (FP 4x) Sentrifus sesegera mungkin pada 1500 rpm 5 menit Aduk dengan mikropipet dan segera dibaca karena Trifan Blue toksik Buang supernatan dengan hatihati Teteskan ke hemasitometer yang sudah diberi cover glass Pelet sel dijentik-jentikan Tambahkan 5 ml RPMi Baca pada pembesaran 400x. 14x106 5.38x106 3. Rata-rata sel limfosit /mL limfa dari tiap sampel Sampel Standar (P4) 1 3 6 Rata-rata Tempe (P3) 2 3 4 Rata-rata Non-Protein (P1) 1 4 5 Jlh limfosit/bid pdg Sel limfosit/mL 48 22 22 37 10 42 1.38x106 Non-Protein Secang Gambar 1.50E+07 2.30x107 2.50E+07 1.2.24x106 1.21x106 0.00E+07 5.06x106 1.00E+06 1.53x106 26 31 1.00E+00 Standar Tempe 1.70x106 6.53x106 3.62x106 139 130 83 98 .21x106 68 21 28 47 32 34 2.40x105 1.28x106 1.00E+07 1.30x106 1. 38x106 1.53 x 10 6 sel/ml dan yang terakhir yaitu tikus yang diberi perlakuan ransum standar dengan air putih sebesar 1.43x107 2. Suatu aktivitas pembentukan limfosit memang memerlukan protein karena tidak lepas dari pembentukan antigen dan antibodi yang penyusunnya didominasi rantai polipeptida yang dapat diutilisasi dari protein sehingga tanpa kehadiran protein memang akan sulit untuk membentuk sel limfosit yang cukup banyak.21 x 106sel/ml.30x107 Tabel 1. Urutan selanjutnya yaitu tikus dengan ransum non-protein yakni sebesar 3.70x106 sel/mL PEMBAHASAN Jumlah sel limfosit pada tubuh dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor. Perhitungan dilakukan dalam waktu kurang dari tiga menit untuk mencegah terjadinya penyerapan warna oleh suspensi sel hidup karena adanya afinitas yang kuat dari tryphan blue pada DNA. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa jumlah sel limfosit paling banyak dimiliki oleh tikus dengan perlakuan pemberian ransum standar yang diberi minum secang yakni sebesar 2. Melalui mikroskop dapat terlihat bahwa sel limfosit yang hidup berwarna bening. tikus dengan perlakuan pemberian ransum tempe sebesar 1. Rekapitulasi jumlah limfosit dari tiap sampel Contoh perhitungan (tikus standar no. Permasalahan yang mungkin terjadi sehingga tikus kelompok non-protein ini berada di peringkat kedua sel limfosit terbanyak dapat berasal dari kesalahan analisis saat menghitung di bawah mikroskop pada tikus kelompok lain sehingga seharusnya kelompok lain memiliki sel limfosit lebih banyak.38 x 106 sel/ml. Jenis tersebut telah banyak disebutkan sebagai salah satu immunomodulator. Kadar limfosit tertinggi memang benar dimiliki oleh kelompok ransum standar dengan minuman ekstrak kayu secang. dimana tripeptida dari kappa-kasein terbukti mampu meningkatkan proliferasi dari sel limfosit manusia secara in vivo dan C-terminal dari beta-kasein yang mengandung beta-casokinin-10 juga membuktikan hal yang sama pada tikus (Sofia et. tetapi tercatat lebih sedikit karena kontak waktu yang melebihi tiga menit sehingga sel banyak yang mati.al 2007). Kelompok ransum non-protein memang seharusnya berada di tingkatan paling bawah kadar limfositnya.67x107 2. sedangkan sel limfosit yang mati akan berwarna biru. Selain itu.1): Sel limfosit/mL = Rata2 jumlah limfosit/bid pdg x FP*104 = ((48+37)/2) x 4 x 104 = 1. Pada . ada pula yang tidak sesuai. kelompok tertinggi kedua seharusnya dimiliki oleh kelompok tikus perlakuan ransum standar dengan minum air putih. Ransum standar pada praktikum ini merupakan protein jenis kasein.Rata-rata Secang (P2) 3 5 6 Rata-rata 715 119 1393 0 710 506 3. Kemungkinan lain adalah limfosit alami dan utilisasi dari protein jaringan tubuh banyak terjadi di kelompok ransum ini dan juga dapat pula diduga tikus dalam kedaan kurang sehat sehingga tubuhnya memaksa memproduksi banyak limfosit untuk pertahanan diri. Namun. diikuti oleh kelompok ransum tepung tempe dan terakhir dengan ransum nonprotein. antara lain keberadaan antioksidan dan kandungan gizi lain yang terkandung dalam pangan. tryphan blue bersifat toksik terhadap sel sehingga kontak antara sel dan pewarna tryphan blue tersebut harus dibuat sesingkat mungkin. Hasil tersebut ada beberapa yang sesuai dengan teori.79x107 2.3 x 107 sel/ml. J. Hoyek. Antioksidan lainnya adalah jenis isoflavon yang terdapat pada tepung tempe.G. Holinesti R. Pend. Essential Immunology. ransum nonprotein 3. Puspaningrum R. Karakterisasi Sifat Antioksidan In Vitro Beberapa Senyawa Yang Terkandung Dalam Tumbuhan Secang (Caesalpinia sappan L.1 – 113 mg/L ekstrak kayu secang (Holinesti 2009). beberapa faktor seperti terdapatnya antioksidan dalam tepung tempe. Namun. M. I. London: Blockwell Scientific Publication. karena terdiri dari kasein murni.N. Studi pemanfaatan pigmen brazilein kayu secang sebagai pewarna alami serta stabilitasnya pada model pangan. 1991.1476 S Miller.53x106 sel/ml. 1992.04 – 0. KESIMPULAN Urutan jumlah sel limfosit/ml dari uji proliferasi limfosit dari limpa tikus dengan metode tryphan blue yaitu ransum standar 1. 55: 230-235. Institut Pertanian Bogor. Salah satu antioksidan yang terdapat pada praktikum ini adalah brazilein dari kayu secang. 2009. DAFTAR PUSTAKA Batubara I et.21x106 sel/ml. Wu D. Antioxidant and immune response in aged person overview of present avidience. S. A. Roitt. L. The Society for Experimental Biology an Medicine. Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella Sativa) Terhadap Respon Proliferasi Limfosit Limpa Mencit Balb/C Yang Diinfeksi Salmonella Typhimurium. sedangkan tepung tempe hanya memiliki bioavailibilitas sekitar 86% (Marsinah 2004). R. Am. Boston. Wood Sci. Pengaruh Ekstrak Kayu Secang Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Limpa Tikus dan Sel Kanker K-562 Secara In Vitro.al 2009). 2002. Program Pasca Sarjana Universitas Padjadjaran. Ransum standar kasein yang merupakan protein hewani. J. ransum tepung tempe 1. Santos. Hal tersebut menguatkan posisi ransum standar ditambah minum ekstrak kayu secang dapat meningkatkan kemampuan proliferasi sel limfosit.al. Mechanism of Action of Biologi Antioxidants..S. yang terdapat sekitar 70. kondisi kesehatan tikus ransum standar sangat baik sehingga limfosit tidak ditemukan banyak. Marsinah W. M. hasil percobaan tidak sepenuhnya sesuai teori karena alasan kelemahan-kelemahan metode dan kondisi tikus percobaan. 2002.38x106 sel/ml. memiliki bioavailibilitas mendekati 100%. J. 62. [skripsi]. Institut Pertanian Bogor. 2003. Hal tersebut menjelaskan seharusnya ransum standar menghasilkan kemampuan proliferasi sel limfosit lebih tinggi dibanding protein tepung tempe. Fakultas Teknologi Pertanian. dan Keluarga UNP 1(2): 11-22. lipase inhibition and antioxidant capacity. 2009. Fakultas Teknologi Pertanian. Namun. 1995. kesalahan pembacaan atau sensitivitas metode menentukan hasil menyimpang tersebut. Meydani. Antioksidan mampu melindungi membran sel limfosit agar tidak mudah rusak oleh radikal bebas atau serangan bakteri (Batubara et. seharusnya tikus dengan ransum tempe lebih tinggi dibandingkan ransum nonprotein karena memiliki kadar protein dan antioksidan lebih tinggi dan lebih rendah dibandingkan perlakuan ransum standar ditambah minum ekstrak kayu secang serta ransum standar dengan minum air putih. Pembuatan cookies berbahan dasar tepung tempe. Bogor. 2004. Bandung. Khasanah N. I.30x107 sel/ml. Nutr. Namun. 2009. Bogor. [Skripsi]. hal yang terjadi sebaliknya. . Antioxidant Flavonoid Structure Function and Clinical Usage. Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah.08 mg/g tepung tempe sehingga aktivitasnya tidak begitu signifikan (Marsinah 2004). 1462 S. Safitri.. Clin. Disertasi.percobaan melalui tikus diketahui bahwa semakin tinggi bioavailibilitas protein dalam saluran pencernaan maka semakin tinggi pula potensi kemampuan mendukung respon proliferasi sel limfosit dalam limpa. meskipun terdapat namun jumlahnya sedikit sekali hanya 0. Salah satu komponen aktif lain dalam pangan yang mampu memicu proliferasi limfosit adalah komponen antioksidan (Holinesti 2009). Screening anti-acne potency of Indonesian medical plants: anti-bacterial. dan ransum standar dengan minuman secang 2. Massachussets.). Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Krineky. Porto. Illionis. AOCS Press. Health Effects. 1996.Shahidi.al. Universadide Catolica de Portuguesa. Chemistry. 2007. Champaign. F. and Applicatins. . Caseins as Source of Bioactive Peptides. Natural Antioxidants. Sofia V et.