PRACTICAS DE BIOLOGÍA IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLECULASINTRODUCCIÒN Dentro de las características emergentes de los seres vivos encontramos la organización y complejidad de su estructura, lo que les permite cumplir con diferentes procesos metabólicos para fijar o liberar energía necesaria para la vida. El metabolismo es la suma de todas las reacciones químicas necesarias para satisfacer las necesidades primarias. Dentro del metabolismo se encuentran los procesos del anabolismo (formación de sustancias) y el catabolismo (degradación de sustancias). Las sustancias involucradas en estos procesos son comúnmente conocidas como biomoléculas. Dentro de las biomoléculas encontramos las inorgánicas y las orgánicas; Las inorgánicas son aquellas que no son formadas por los seres vivos, entre estas se encuentran el agua, gases y sales y por el contrario las orgánicas son las elaboradas en los diferentes procesos fisiológicos. El agua es la sustancia más abundante en la célula viva y llega a representar más del 70% de su peso. Esta molécula es de gran importancia pues la mayor parte de las reacciones intracelulares se llevan a cabo en ambiente acuoso y todos los organismos se han diseñado alrededor de las propiedades del agua, tales como su carácter polar, su capacidad para formar enlaces de hidrógeno y su alta tensión superficial (González et. al 2006). La célula, además de hacer uso del agua, utiliza varios elementos en la formación de las biomoleculas: macroelementos, microelementos y oligoelementos. Los macroelementos son: Carbono, Hidrogeno, Oxigeno y Nitrógeno; el principal es el carbono, que debido a su propiedad tetravalente, es decir la facilidad de formar enlaces covalentes sencillos y dobles, forma cerca de medio millón de compuestos orgánicos. Los macroelementos representan hasta un 95% del peso seco de los seres vivos. Los microelementos son: Ca, P, K, S, Cl, Na y Mg, estos hacen parte de entre el 0,3 y el 5% del peso seco y suponen casi el 10% de la biomasa. Los oligoelementos o trazas (B, F, Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Mo y I, entre otros) están presentes en cantidades muy pequeñas (Conrado, 2010). Las biomoléculas orgánicas son los carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, cada uno de ellos con características definidas y funciones especificas, propiedades que adquieren por la variedad de grupos funcionales que poseen. La biomoléculas al romperse liberan energía la cual es utilizada en el proceso del metabolismo para el funcionamiento celular. Las biomoléculas están presentes en una gran variedad de alimentos que a diario consumimos en nuestra alimentación. Carbohidratos Los carbohidratos son las moléculas de obtención de energía rápida, se conocen con el nombre de glúcidos o azucares y generalmente son de origen vegetal, su forma de reserva en los organismos es la glucosa presente en las células vegetales y el glucógeno en las células animales. 1 La clasificación de los carbohidratos depende de la complejidad en sus estructuras químicas, los hay sencillos como los monosacáridos y disacáridos que se diferencian en el número de carbonos presentes, los monosacáridos por su parte poseen máximo 7 carbonos, y los disacáridos son la unión de dos monosacáridos; los hay también complejos como los polisacáridos almidón, glucógeno y celulosa que presentan una cadena ramificada de unidades de glucosa. En contraste con los monosacáridos, los polisacáridos poseen miles de unidades de glucosa. Algunos ejemplos de monosacáridos son la glucosa, hexosa (elemento compuesto por 6 carbonos) que constituye la primera unidad de energía y la ribosa y desoxirribosa, pentosas que hacen parte fundamental del material genético ADN Y ARN. Dentro de los disacáridos están la sacarosa (azúcar de mesa), la lactosa y la maltosa. Lípidos Los lípidos son moléculas formadas principalmente por cadenas lineales de Carbono e Hidrogeno y tienen como característica principal el ser insolubles en agua, su clasificación general se basa en la consistencia a temperatura ambiente, de esta manera están las grasas que son sólidas y los aceites que son líquidos. De la misma manera que la glucosa es la unidad fundamental de los carbohidratos, en algunos lípidos la unidad fundamental son ácidos grasos unidos a un glicerol. Los lípidos son la segunda fuente de energía, y sus funciones son variadas, se encuentran como barrera física en plantas y animales, son los responsables de que haya un equilibrio hídrico y térmico, están presentes como parte estructural de las membranas celulares y son precursores de hormonas y vitaminas liposolubles. Algunos ejemplos son los triglicéridos, fosfolípidos, ceramidas, colesterol, testosterona y vitaminas A, D, K y E. Proteínas Las proteínas son moléculas de mayor tamaño formadas por aminoácidos, estos poseen en su estructura química un grupo amino y uno carboxilo unidos mediante un enlace peptídico; la organización de los aminoácidos puede ser sencilla o formar estructuras mas complejas; toda proteína en su inicio consta de una secuencia de aminoácidos dispuestos en forma lineal y va mostrando una mayor complejidad al encontrar plegamientos continuos de los aminoácidos formando estructuras tridimensionales conformadas por varias subunidades como es el caso de las enzimas. La clasificación de las proteínas puede hacerse desde varios puntos de vista, estructural, morfológica, por su composición o función biológica; todas las proteínas independientemente de su clasificación son indispensables para los seres vivos; algunas de ellas hacen parte estructural de los tejidos, otras como la hemoglobina y mioglobulina son proteínas que participan en el transporte de oxígeno en sangre y en músculo respectivamente, de igual manera existen proteínas específicas para el transporte de electrones en mitocondrias y cloroplastos, y las hay con función de catalizadores orgánicos , las cuales se conocen comúnmente como enzimas. Ácidos nucléícos La cuarta y última biomolécula son los ácidos nucleícos, éstos tienen como característica principal el ser los portadores de la información genética y no ser productores de energía. El ácido nucleíco conocido como ADN (Ácido 2 DesoxirriboNucleico) es el encargado de transmitir los rasgos genéticos de padres a hijos, permitiendo a los organismos su permanencia en el tiempo y el espacio. El ADN consta de dos hebras antiparalelas constituidas por nucleótidos que están formados a su vez por un azúcar pentosa, un grupo fosfato y las bases nitrogenadas Adenina, Timina, Citosina y Guanina. Por su parte el ARN (Acido RiboNucleico) es quien colabora con el proceso de lectura de la información genética para el proceso de la síntesis de proteínas. Su principal diferencia con respecto al ADN es que consta únicamente de una hebra y que reemplaza la base nitrogenada Timina por otra conocida como Uracilo. Identificación de biomoléculas En el estudio de las biomoléculas existen diferentes pruebas químicas que permiten determinar su presencia (pruebas cualitativas, basándose principalmente en sus propiedades fisico-químicas, como por ejemplo las pruebas colorimétricas. Carbohidratos Dentro de las pruebas para identificar carbohidratos, esta la prueba de Fehling que determina la presencia de azucares reductores, mediante una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre; la presencia del azúcar reductor se confirma por la aparición de un color anaranjado intenso. La prueba con lugol es utilizada en la determinación de polisacáridos, los cuales toman una coloración azul-violeta en presencia del Yodo. Proteínas La prueba de Biuret es utilizada en la determinación de proteínas, en ella se utiliza el reactivo Biuret, de color azul, que en presencia de enlaces peptídicos cambia a una coloración violeta. La reacción Xantoprotéica permite evidenciar la presencia de proteína de una forma indirecta, pues las proteínas al desnaturalizarse, es decir, perder su estructura cuaternaria y terciaria precipitan en forma de un coloide fácilmente visible, para esta prueba es usado el acido nítrico concentrado. Lípidos La determinación de lípidos se realiza mediante la prueba de Sudan III, que al igual de la de polisacáridos con lugol no se trata de una reacción química sino de afinidad por los grupos de ácidos grasos. Su coloración positiva se torna a un color naranja-rojizo. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Se pueden encontrar en los alimentos carbohidratos, lípidos y proteínas? HIPÓTESIS En los alimentos se encuentran presentes los carbohidratos, los lípidos y las proteínas. OBJETIVOS General Determinar de forma cualitativa la presencia de biomoléculas en diferentes alimentos. Específicos - Identificar la presencia de carbohidratos, lípidos y proteínas en alimentos de origen vegetal y animal. -Comprender los procesos químicos que se llevan a cabo en cada uno de las pruebas. 3 VARIABLES Cambio en la coloración de las muestras obtenidas de diferentes alimentos, después de aplicar pruebas químicas específicas para la identificación de biomoléculas. PREGUNTAS QUE DEBEN RESOLVERSE ANTES DE LA REALIZACIÓN DEL LABORATORIO - Indague sobre los diferentes métodos por los cuales se puede evidenciar la presencia de las diferentes biomoléculas en los alimentos. - Revise los fundamentos de cada uno de los métodos, propuestos en esta guía, para la identificación de biomoléculas en alimentos de origen vegetal y animal. MATERIALES Grupo de estudiantes: - Material orgánico: manzana, naranja, papa, pan, huevo, leche, aceite. - Lápiz marcador o cinta de enmascarar. - Toallas de papel - Gradilla para tubos - Pinzas para tubos - Pipeteadores. - 13 Tubos de ensayo - Grupo general - vasos de precipitado de 50 y 100 ml - vasos de 250 ml - pipetas de 5 mililitros - pipetas Pasteur plásticas - cuchillos Equipos - Baño María a 80º C Reactivos - Reactivo de Fehling A y Fehling B - Lugol - Biuret - 30 ml Acido nítrico concentrado - 50 ml Hidróxido de sodio 30% - Sudan III - 50 ml Solución de Glucosa 1% - 50 ml Solución de albúmina 10% - 50 ml Solución de almidón 20% - ácido oléico METODOLOGIA Los estudiantes deben llevar al laboratorio y preparar las diferentes muestras sugeridas por el profesor de acuerdo a las tablas 1 y 2. Pueden utilizarse alimentos diferentes. 4 Cada grupo procesará una serie completa de tubos con las diferentes muestras y controles y realizará la prueba asignadas para la identificación de las biomoléculas presentes en cada alimento. Con el propósito de obtener replicas por lo menos dos grupos realizaran la misma prueba; esta distribución se consignará en la tabla 3, en la cual además, serán consignados los resultados de los grupos para su posterior análisis y discusión. Tabla 1. Asignación de preparación de muestras por grupo. Grupo 1 Papa Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Pan Grupo 5 Leche Grupo 6 Huevo Grupo 7 Aceite vegetal Manzana Naranja Preparación de muestras Rotular los vasos de precipitado para cada muestra a procesar. Papa y manzana Retirar la corteza del alimento, partir en cuadrados y macerar en el mortero agregando agua en pequeñas cantidades, cuando se encuentre una masa homogénea filtrarla por medio de gasa sobre un vaso de precipitado de 100 ml. Pan Disgregar el pan, colocarlo en vaso de precipitado de 100 ml y humedecerlo de manera que quede como una masa suave y homogénea. Naranja Cortar, exprimir y filtrar el jugo de naranja; colocarlo en vaso de precipitado de 50 ml. Huevo Separar con cuidado la clara de la yema. La clara debe diluirse en 20-30 ml de suero fisiológico o agua, homogenizar y colocarlo en vaso de precipitado de 50 o 100 ml. Leche y aceite vegetal La leche y aceite vegetal deben de colocarse sin ningún tratamiento dentro de vasos de precipitado de de 50 ml. Las muestras preparadas deben colocarse sobre el mismo mesón, una seguida de otra con su respectiva pipeta, con el fin de evitar contaminación y en ningún momento deben ser retiradas del sitio. Identificación de Biomoléculas Cada grupo debe rotular los tubos con el nombre de las diferentes muestras que se van a utilizar para la identificación de las biomoléculas como se indica en la tabla 2. Debe homogenizarse cada muestra antes de proceder a medir la cantidad requerida para la prueba. Control negativo para todas las pruebas: agua Controles positivos: - azucares reductores: glucosa 1%. 5 - polisacáridos: almidón 20% - proteínas: albúmina al 10%. - grasas: ácido oleico. Tabla 2. Distribución de las muestras y controles en los tubos de ensayo para cada grupo de trabajo. Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 Tubo 10 Tubo 11 Tubo 12 Tubo 13 Papa Manzana Naranja Pan Clara huevo Yema huevo leche Aceite vegetal Agua Glucosa (Control 1% negativo) Almidón Albúmina 20% 10% Ácido Oleico Carbohidratos Azucares reductores - Añadir 2 ml de cada una de las muestras en los tubos rotulados del 1 al 11. - Agregar 1 ml de Fehling A e inmediatamente agregar 1 ml de Fehling B. - Homogenizar la muestra. - Llevar a baño María de 80 ºC de 3 a 5 min. - Observar cambio de coloración en el precipitado (prueba positiva= anaranjado intenso). Polisacaridos - Añadir 2 ml de cada una de las muestras en los tubos rotulados del 1 al 11. - Agregar 2-5 gotas de lugol. - Mezclar fuertemente hasta homogenizar la muestra. - Observar cambio de coloración (prueba positiva= color morado oscuro o violeta). Proteínas Biuret - Añadir 2 ml de cada una de las muestras en los tubos rotulados del 1 al 12. - Agregar 2 ml de Biuret. - Agitar suavemente en forma de 8, dejar en reposo. - Observar cambio de coloración a los 5 min. - Observar cambio de coloración (prueba positiva= color morado). Reacción Xantoproteica - Añadir 2 ml de cada una de las muestras en los tubos rotulados del 1 al 8 y 12. - Agregar 1 ml de ácido nítrico concentrado. - La presencia de precipitado (amarillo) indica que la prueba es positiva. Lípidos - Añadir 2 ml de cada una de las muestras en los tubos rotulados del 1 al 8 y 13 - Agregar 2 ml de agua y dejar en reposa hasta que se formen dos fases. - Añadir de 3-5 gotas de Sudan III y agitar. - Dejar en reposo y observar cambio de coloración entre 2 a 5 min (prueba positiva= color naranja). 6 BIBLIOGRAFÍA Universidad de Cordoba. Conrado, M.V. 2010. Identificación de algunos grupos funcionales orgánicos de interés bioquímico. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanale. Cordoba. Obtenido el 10 de febrero de 2010 en http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/19%20GRUPOS%20FUNCIONALES.pdf. González, T., Perea, M., Campos, H., Cogua, J. 2006. Los Seres Vivos. Morfología, fisiología, genética, ecología y Biotecnología. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología. Pag 26. - Guia elaborada por Janeth Camacho Docente de cátedra. Departamento de Ciencias Básicas 7 Tabla 3. Registro de resultados obtenidos en el laboratorio Respuesta de la muestra ( + / - ) 1 n (Grupo) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Prueba extracto extracto jugo papa manzana naranja pan clara de yema de aceite huevo huevo leche vegetal agua glucosa almidón albumina ácido oleico Carbohidratos (Fehling) Total positivos (+) Carbohidratos (lugol) Total positivos (+) Proteínas (reacción xantoprotéica) Total positivos (+) Proteínas (Biuret) Total positivos (+) Lípidos (Sudan III) Total positivos (+) 8 9