UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOFACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA DEPARTAMENTO CIENCIAS BÁSICAS MÉDICAS CURSO DE BIOQUÍMICA LABORATORIO 02: DEMOSTRACIONDE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS Y ACTIVIDAD ENZIMATICA AUTORES ALVA CRUZ CHRISTIAN JOEL AVALOS MENDOZA WILLIAM ERICK AVILA RODRIGUEZ SUHEYLY BECERRA ULLOA RENZO ALEJANDRO BLAS CABRERA JESUS IRIGOIN MENDOZA NICOLLE LOYOLA GARCIA STEPANIE MENDOZA SANTA CRUZ ROSITA MONTOYA ROJAS ROBINSON RODRIGUEZ MIÑANO ALAN VARGAS CHICLAYO JONATHAN VERDE AREDO ELVIS VERGARA TAM RODRIGO DOCENTE DR: VALLADOLID ALZAMORA JUAN MANUEL TRUJILLO – PERÚ 2018 DESARROLLO DEL CUESTIONARIO DE LA PRACTICA N` 2 DEMOSTRACIONDE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS 1. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Espectrofotométricos: En el método espectrofotométrico puede seguirse el curso de una reacción observando cómo cambia la luz absorbida por la solución en la que se está dando la reacción. Para poder utilizar un método de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la única molécula de la mezcla de reacción que lo hace a la misma; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminución de la absorbancia dicha longitud de onda. Fluorimétricos: En el fenómeno de la fluorescencia una molécula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimétricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reacción enzimática. Calorimétricos: La calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por una reacción química. Estos ensayos son muy generales, ya que muchísimas reacciones llevan asociado algún cambio de calor y utilizando un microcalorímetro no es necesario utilizar grandes cantidades de enzima o sustrato. Estos ensayos pueden ser usados para medir reacciones imposibles de medir con otros métodos Quimioluminiscencia: La quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y ésta puede ser medida para detectar la formación de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede ser registrada en una película fotográfica por días e incluso semanas, pero al mismo tiempo son de difícil cuantificación, porque no toda la luz emitida por la reacción será detectada. 2. Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. Sistema A: TUBOS COMPONENTES I II Solución de almidón 1% pH 6.0 5 ml. 5 ml. Solución de cloruro de sodio 0.1M 1 ml. 1 ml. Agua destilada 4 ml. 3 ml. Al tubo II se le añadió 1ml de enzima y luego se llevó a baño de agua a ambos tubos a 37ºC. En el tubo I, al no haber enzima no se produjo reacción alguna de tal manera que el almidón queda intacto. En el tubo II, la enzima reacciono con el almidón obteniéndose productos como maltosa, glucosa. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL: TUBOS COMPONENTES I II Ácido clorhídrico 0.05 N 5 ml. 5 ml. De los tubos I y II: Etapa A 0.5 ml. 0.5 ml. Solución yodada 0.5 ml. 0.5 ml. La solución yodada permitió evidenciar la presencia de almidón. El tubo I se tornó de color morado, esto da muestra del sustrato residual (almidón) que se acoplo con el Yodo. El tubo II tenía una coloración amarilla-naranja debido a que se encontraban los productos de la hidrólisis del almidón los cuales no permiten el acoplamiento del yodo. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU): TUBOS COMPONENTES I II De los tubos I y II: etapa A 1ml. 1ml. Solución Cúprica alcalina 1ml. 1ml. Hervir 8 minutos Enfriar A continuación a los tubos I y II del sistema A se agregó solución cúprica alcalina (color celeste) para demostrar el carácter reductor de los productos. El tubo I permaneció con el color celeste de la solución, esto demuestra que el azúcar que se encuentra no es reductor (polisacárido almidón). El tubo II cambio de color a un anaranjado (color ladrillo) que se produjo por la reducción del ion cúprico a ion cuproso (Cu2+- Cu1+); esto evidencia que los azucares que se encuentran son reductores (maltosa, glucosa). 3. Elabore un grafica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato, donde se observe la energía de activación y el estado de transición. ENZIMAS Estado de transición Energía libre de activación sin enzima Energía libre de activación con enzima A B Progreso de la reacción Aceleran procesos biológicos (biocatalizadores). Son moléculas proteicas. Son muy pocas las reacciones que no son catalizadas por enzimas. La reacción debe ser termodinámicamente posible, la energía que tiene A es tal que permite transformarse en B (que queda con menos energía). La condición energética se llama energía libre. Se requiere una energía libre de activación. La enzima hace disminuir la energía de activación del reaccionante. Si la energía de activación se reduce a la mitad, no implica que el tiempo también se disminuye a la mitad. 4. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínelos. a) Sustrato: Es cualquier compuesto químico. Que subyace a otro y sobre el cual está en condiciones de Ejercer algún tipo de influencia. Por otra parte hace referencia a una capa o nivel de algo. Es una molécula sobre la cual actúa una enzima, dicho de otra forma, las enzimas se encargan de catalizar las reacciones químicas que involucran a su sustrato. A unión entre enzima y sustrato forma un complejo. En la práctica se utilizó el sustrato de almidón Figura#. Almidón b) Enzima Son proteínas complejas que producen cambios químicos específicos en algunas sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas. Como por ejemplo: las enzimas pueden convertir los almidones y azucares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar. La coagulación es otro ejemplo de las enzimas. Son esenciales para todas las funciones corporales se encuentran en la saliva, estomago, intestinos cada órgano y célula del cuerpo. La enzima utilizada es la amilasa salival. Figura#. Enzima amilasa c) Coenzimas Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos químicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos. Estas moléculas son sustratos de las enzimas y no forman parte permanente de la estructura enzimática. En el metabolismo, las coenzimas están involucradas en reacciones de transferencia de grupos (como la coenzima A y la adenosina trifosfato (ATP), y las reacciones redox (como lacoenzima Q10 y la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+). Las coenzimas se consumen y se reciclan continuamente en el metabolismo; un conjunto de enzimas añade un grupo químico a la coenzima y otro conjunto de enzimas lo extrae. Por ejemplo, las enzimas como la ATP sintasa fosforilan continuamente la adenosina difosfato (ADP), convirtiéndola en ATP, mientras que enzimas como las quinasas desfosforilan el ATP y lo convierten de nuevo en ADP. Las moléculas de coenzima son a menudo vitaminas o se hacen a partir de vitaminas. Muchas coenzimas contienen el nucleótido adenosina como parte de su estructura, como el ATP, la coenzima A y el NAD+. d) Sustancias activadoras Son sustancias o partículas que activan a proenzimas ( son enzimas inactivas). Electrolitos, ácidos. Figura#. Sistema Enzimático 5. ¿CÓMO SE PUEDE OBJETIVAR LA PRESENCIA DEL SUSTRATO RESIDUAL? En los ensayos de aspecto fotométrico puede seguirse el curso de una reacción observando cómo cambia la luz absorbida por la solución en la que se está dando la reacción, para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos a los productos algunos que absorba luz a una longitud de onda determinado y que sea de esta forma, se puede observar el aumento o la disminución de la observación a dicha longitud de onda. Cuando la luz absorbida se muestra en el espacio visible es posible observar un cambio en el color de la muestra y entonces hablaríamos del método calorímetro. 6. ¿Cómo repercute la modificación de la estructura proteica, producida por agentes físicos y químicos, sobre la actividad enzimática? La modificación de la estructura de las proteínas, es decir la desnaturalización, ocasiona que esta enzima se inactive y no tenga una actividad enzimática normal. Algunos agentes son más desnaturalizantes que otros, por ende la actividad de la enzima depende del agente que la desnaturalize. Agentes físicos Agentes químicos Calor Detergentes Disolventes orgánicos PH Fuerza iónica Por ejemplo la enzima estará más inactivada si es sometida a altas temperturas La desnaturalizan afecta a los distintos niveles: Desnaturalización de la estructura cuaternaria: las subunidades de proteínas se separan o su posición espacial se corrompen. Desnaturalización de la estructura terciaria implica la interrupción de: enlaces covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos, como los puentes disulfuros entre las cisteínas; enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de aminoácidos; enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas laterales no polares de aminoácidos. Desnaturalización de la estructura secundaria: se pierden todos los patrones de repetición regulares como las hélices alfa y adoptan formas aleatorias. Estructura primaria no es interrumpida por la desnaturalización Desnaturalización REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. D'Ocon Navaza MC, García-Saavedra MJ, Vicente García JC. (1999). Análisis de Muestras Biológicas. Madrid. Ed. Paraninfo. 2. Salve ML, Amich S, Prieto S, Casas A. (1994). Laboratorio Clínico. Madrid. Ed. Interameericana•McGraw-Hill ta 3. Berg J, Stryer L, Tymoczko J. Bioquímica. 6 ed. España: Reverte; 2008