DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS Y PROTEINASQuimbayo, P. (
[email protected]); Medina, Y (
[email protected]); . Guaza, H. (
[email protected]) Facultad de Ciencias Naturales Exactas, Departamento de Quimica Universidad del Valle Santiago de cali Septiembre 6 de 2011 Resumen Se realizaron pruebas cualitativas agregando a cada solución de albumina, glicina prolina y aspartame NaOH, luego se sometió a calentamiento con lo cual se confirmó la presencia de un grupo amino libre, dando un producto azul o purpura al contrario de la prolina cuya coloración final era amarilla. En la interacción de proteínas con osmolitos se tomaron dos tubos con albumina A y B, El tubo A con la albumina adicionando HNO3 luego NaOH, dándose la separación de dos capas una amarilla intensa encima y una más tenue abajo. El tubo B con la albumina adicionando (NH4)2SO4 la solución se tornó un poco lechosa y al añadirle urea tomo su color transparente, luego de calentar estas soluciones A y B, se observó turbidez en la solución. También se realizó un análisis cuantitativo de proteína por método Biuret, se prepararon cinco soluciones estándar a diferentes concentraciones de albumina de clara de huevo, a las cuales se les adiciono en un volumen igual de solución A NaOH + 25g de tartrato sódico-potásico en 500mL) y solución B (7,5g de CuSO4.5H2O en 500mL), la reacción de dicha proteína con sulfato de cobre en solución alcalina de una coloración purpura o violeta la cual se cuantifica a 550nm. Finalmente se realizo un análisis cualitativo por el método Biuret a dos soluciones de glicina y aspartame las cuales dieron azul claro y oscuro respectivamente. Abstract. Qualitative tests were performed by adding to each solution of albumin, glycine, proline and aspartame NaOH, then subjected to heat thereby confirmed the presence of a free amino group, giving a blue or purple product instead of proline which was final color yellow. The interaction of proteins with osmolytes took two tubes with albumin A and B, the tube with albumin after adding NaOH/HNO3, giving the separation of two layers deep yellow above and below a more tenuous. The tube B with albumin added (NH4)2SO4, the solution becomes milky and a bit by adding urea took its transparent color, then heating the solutions A and B, was observed turbidity in the solution. also performed a quantitative analysis of protein by Biuret method, five standard solutions were prepared at different concentrations of egg albumin, to which were added in an equal volume of solution A NaOH + 25g potassium sodium tartrate in 500 mL) and solution B (7.5 g CuSO4.5H2O in 500mL), the reaction of the protein with copper sulphate in alkaline solution of a purple or violet which is measured at 550nm. Finally a qualitative analysis was performed by the Biuret method to two solutions of glycine and aspartame which gave light and dark blue respectively. Introducción Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV b)para la formación de derivados quimicos o c) que estructuralmente no posee el grupo amino libre. sino un grupo imino. Métodos y Experimentos En la práctica se determinaron las propiedades cualitativas de las proteínas mediante la reacción de Ninhidrina.Café Violeta Oscuro Este cambio de color en las soluciones de aminoácidos se da debido a que poseen un grupo amino libre en su estructura lo cual le permite reaccionar con la Ninhidrina y formar dióxido de carbono. En este análisis se obtuvieron los siguientes resultados para cada método: Reacción de Ninhidrina: Para este método se adiciono una solución de Ninhidrina (0. cuyos resultados se presentan en la siguiente tabla: Tabla 1.la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes dichos métodos se basan en diferentes sensibilidades. En el caso de la prolina. para las cuales se obtuvo inicialmente un color amarillo en cada una de ellas. la prolina y el aspartame. amoniaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. la glicina. La albumina no reacciona con la Ninhidrina por ser una proteína. En este caso se utilizó los métodos Biuret el cual es poco sensible y se utiliza para la cuantificación de proteínas en muestras muy concentradas. la coloración final es amarilla. Soluciones Albumina Glicina Prolina Aspartame reaccionar con la Coloración Amarillo Claro Purpura Amarillo . Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o purpura. interacción de proteínas con osmolitos y efecto del calor. Resultados y Discusión En esta práctica se realizo el análisis cualitativo de aminoácidos y proteínas por tres métodos los cuales fueron la reacción de Ninhidrina. Coloración obtenida para cada solución de aminoácidos y proteínas al Ninhidrina.05g/25mL). pero este color cambio al ser sometidas las soluciones a un calentamiento en baño maría. interacción de proteínas con osmolitos y reacción con el calor y se realizó un análisis cuantitativo por el método de Biuret se usa normalmente este método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas en una muestra mediante espectroscopia ultravioleta visible a una longitud de onda de 540 nm. junto con una solución de NaOH al 10% a un conjunto de soluciones de aminoácidos y proteínas diferentes como son la albumina. A continuación se muestra el mecanismo general de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos con grupos amino libres: . la cual luego de adicionar NaOH presento la formación de dos fases: arriba una fase de color amarilla intenso y viscosa. (2) Por lo tanto. Para este método de análisis se adiciono albumina de clara de huevo a dos tubos de ensayo. condensa a través del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o purpura de Ruhemann. con liberación de amoniaco y gas carbónico y formación de la Ninhidrina reducida o hidrindrantina. de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan. (1) La Ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la formación del aldehído correspondiente. En otro (Tubo B) se añadió (NH4)2SO4 al 70% agitando suavemente y se observó que la solución de albumina se tornó un poco lechosa y al agregarle urea 6M se vuelve transparente de nuevo. Esta propiedad de las proteínas se denomina coagulación. excepto para la prolina. manifestando un color rojizo. Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre los grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina. En uno (Tubo A) se le añadió HNO3 concentrado agitando suavemente y se observó que la solución de albumina se tornó . mientras que abajo era de color amarillo claro y viscosa. hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. la tirosina y el triptófano. método conocido también como Salting Out. Las alteraciones que sufre la molécula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. (1) Interacción osmolitos: de proteínas con de un color amarillo lechoso. La molécula de hidridantina.Esquema 1. la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula como por ejemplo el aminoácido tirosina presente en la proteína albumina de la clara de huevo. ya que esta es muy soluble y el ion sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas y una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína. por la desnaturalización de esta por efecto del calor. (3) Luego se adiciona urea con el fin de reenaturalizar la proteína. en presencia de otra de Ninhidrina. Efecto del Calor: Luego de someter una solución de albumina a baño maría a una temperatura de 100ºC se observó turbidez en la solución debido a la precipitación de la proteína. ya que estos solutos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas. haciendo la proteína inestable. También se observa la formación de un precipitado amarillo. La formación de este precipitado se da por el efecto de la sal de sulfato de amonio. Mecanismo general de reacción de la Ninhidrina y los aminoácidos con grupos amino libres. cuyo color se desarrolla por la formación de un ion coordinado.8%. el color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos figura 1.245x-5. Esta reacción de Biuret sirve para diferenciar las proteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis • . Luego este valor se comparo con un valor teórico del contenido de proteína en la clara de huevo 11. Disolució n Color Inicial Incoloro Incoloro Color Final Azul Claro Azul Oscuro Figura 1. lo cual aumenta la interacción proteína-proteína. Complejo cúprico formado en la reacción de Biuret. Por último se realizó un análisis cualitativo del método de Biuret para las disoluciones de Glicina y aspartame. (5) para la muestra problema (0.1%.5g de CuSO4.También se realizó un análisis cuantitativo de proteína por método Biuret. Conclusiones • La sal de sulfato de amonio es muy soluble y el ion sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas. La ecuación de la recta para esta grafica es la siguiente: y=0. Color obtenido para cada disolución luego de adicionar el Reactivo de Biuret. el cual se cuantifica espectrofotométricamente a 555nm. para el cual se prepararon cinco soluciones estándar a diferentes concentraciones de albumina de clara de huevo.027) en la ecuación de la recta. tetracúprico. a las cuales se les adiciono en un volumen igual de solución A (20g de NaOH + 25g de tartrato sódico-potásico en 500mL) y solución B (7. por lo tanto al reaccionar la proteína con sulfato de cobre en solución alcalina se produce un color característico purpura o violeta.(4) donde se obtuvo un porcentaje de error de 65. con dos grupos amida adyacentes. Grafica de absorbancia vs concentración de proteína de las soluciones estándar.5H2O en 500mL). Este valor se determino al reemplazar el valor de la absorbancia obtenida El cambio a color azul de ambas disoluciones indica un resultado positivo para el método de Biuret. favoreciendo la precipitación de la proteína.4%. y teniendo en cuenta las correspondientes diluciones realizadas a la muestra problema en su preparación. para las cuales se obtuvo los siguientes resultados: Tabla 2. debido a la formación del complejo de cobre (II) que se forma.91×10-3 (1) A partir de la ecuación de la recta obtenida al graficar los datos de absorbancia y concentración de proteína de las soluciones estándar se calculo la concentración de proteína en la muestra problema (solución de clara de huevo) la cual fue de 18. (6) Luego de de determinar espectroscópicamente la absorbancia de cada solución patrón de albumina se obtuvo la siguiente gráfica y su correspondiente ecuación de la recta: Glicina Asparta me Grafica 1. el cual se debió a posibles interferencias en el análisis como la presencia del ion amonio el cual altera el desarrollo del color por ende el valor de la absorbancia. en donde se toma Y como el valor de la absorbancia y a X como el valor de la concentración de proteína. mientras que en la coagulación se ha producido un cambio en el estado físico y en la estructura química por eso es irreversible. ni por la sal marina y sulfato de . las albuminas? ¿Qué función tiene la albumina de suero sanguíneo? Son substancias solubles en agua y coagulables por el calor y se dividen en naturales y de transformación. inhiben la agregación irreversible y aumentan la temperatura de transición térmica de diversas macromoléculas. ¿Qué métodos se utilizan para determinar el peso molecular de una proteína? Cromatografía de tamizado molecular. Las diversas observaciones respecto al uso de ciertos osmolitos como estabilizantes. manitol y glicina. 3. utilizando el principio establecido por la ley de Beer. El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede determinar espectroscópicamente a 555nm. ¿Qué propiedades presentan 2. En las reacciones donde se obtuvo precipitación se debió a en el estado físico de la proteína. En general las reacciones coloridas nos ayudan a saber con qué grupo funcional está formada la proteína y así también de que aminoácido está formado. Dibuje la estructura del edulcorante de bajo aporte calórico conocido como aspartame ¿Qué tipo de compuesto biológico es? 5. Por tanto se probaron que estos osmolitos sorbitol. La cuantificación de la proteína se lleva a cabo con una curva patrón. 4. La aplicación de aditivos que modifican favorablemente el entorno de las proteínas. en la estabilización térmica de soluciones de inmunoglobulinas. la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa. La intensidad de la coloración en la prueba de Biuret es proporcional a la cantidad de proteínas de la solución. sus disoluciones no precipitan ni por los ácidos orgánicos o minerales debilitados. Que es un osmolitos? ¿Cómo se usan para la purificación de proteínas? Osmolito. compuesto que protege a las células de la desecación al mantener una alta osmolaridad intracelular (concentración osmótica). Electroforesis en geles de poliacrilamidas SDS. siendo la más común sencilla y eficaz. En la actualidad se plantean diversas estrategias de estabilización proteica. Y Preguntas 1. ¿Qué otros análisis de cuantificación de proteínas existen? Señale otras en adición al método Bradford? Método Kjeldhal. Lowry Espectrofotométrico. Han llevado a la conclusión de que estos compuestos previenen la perdida de la actividad enzimática.• • • • proteica. E.htm. E. pero si por el sulfato amónico en exceso. No es frecuente encontrar derivaciones de color.uam. etc. Pocas sustancias no proteicas interfieren con la reacción de Biuret Biuret y=0. ¿Cómo se realiza un perfil de aminoácidos? La determinación del perfil de aminoácidos consiste en romper la cadena proteica para obtener los aminoácidos individuales (hidrólisis). fármacos sustancias toxicas. S. UniSon. Teijón.027 y despejamos X se obtiene que: x=0.es/alimentosricos-proteinas. hidrólisis acida. 1ªed. en términos de sensibilidad Ventajas determinación proteínas método Biuret: de Referencias (1) Garrido. España. México.4552g/100mL: Desventajas método comparado con Lowry • Las altas concentraciones de sales de . Madrid..eng.org. Rápido (se puede completar en menos de 3 minutos). Revisado 01/09/2011 Revisado 01/09/2011 Anexos Cálculos: A partir de la siguiente ecuación se realizaron los respectivos cálculos para determinar la concentración de proteína en la clara de huevo: • • • • • Menos caro que el método Kjeldhal. Biomoléculas. además se une fácilmente a los lípidos.91×10-3 (1) Si tomamos Y e igual a 0.es/personal_pdi/cienci as/bolarios/BiologiaCCAA/Guiones/Prac tica1. Revisado 01/09/2011 (5) Battaner. esto requiere tres tratamientos separados.edu/~nsw/ench4 85/lab6a. Compare la técnica de cuantificación de proteína por Biuret con otro método de los que hallo en la pregunta 4. • • amonio interfieren en la reacción Puede ocurrir opalescencia en la solución final si están presentes altas concentraciones de lípidos o carbohidratos Debe estandarizarse el color mediante cantidades de proteína conocidas 6. J.magnesia saturado. Revisado 01/09/2011.htm. Método más simple de análisis de proteínas. L.umd.134mg/mL Proteina Teniendo en cuenta las correspondientes diluciones (4mL de albumina en 25mL de solución) al preparar la muestra problema de clara de huevo a partir de una concentración de 0. 2000. http://www. En el suero sanguíneo Posee propiedades de anti-oxidante y anti radicales libres. pp 67-68 (2) Vejar. 2006. Practicas de Bioquímica Descriptiva. hidrólisis con álcalis y previa oxidación de los aminoácidos azufrados.. pp 168 (3) Precipitación de proteínas. 7. M. A.. Tébar. pp 264 (6) http://www.. (4) http://proteinas. Universidad de Salamanca. Fundamentos de Bioquímica Estructural. Debido a la inestabilidad de algunos de ellos en las condiciones de reacción. 2ª ed.245x-5. 1%*100%=65.8% .1%11. se obtiene de error del experimental de proteína huevo el cual un porcentaje %E=Valorexp -ValorteóricoValorteórico*100% (2) %E=18.4% Proteina Y al comparar el valor con el valor teórico presente en la clara de es de 11.0.4%11.134mgmL*25mL4mL*100mL0.1%.45 52g*1g1000mg*100= =18. . .